CN113509554A - 一种抑制mtr4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用 - Google Patents

一种抑制mtr4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抑制MTR4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用，属于基因治疗药物技术领域。本发明提供了敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。本发明利用siRNA脂质体复合物敲低急性髓系白血病PDX动物模型体内MTR4，降低MTR4在白血病细胞中的表达，有效延长了急性髓系白血病PDX动物模型的生存期。同时体外实验分析通过MTR4敲低对白血病细胞的影响，由此证明，本发明提供了以MTR4为靶点来治疗白血病，阐明其对白血病发生发展的作用，为临床应用奠定基础。

Description

一种抑制MTR4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病 的药物中的应用
技术领域
本发明属于基因治疗药物技术领域，具体涉及一种抑制MTR4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
背景技术
癌基因与抑癌基因的发现是人们开始从分子水平认识肿瘤的开端，癌基因可在体内外引起正常细胞转化，从而促进肿瘤发生的一类基因，癌基因的深入研究，有助于临床上选择对肿瘤的诊治方案，有广阔的应用前景。
白血病作为常见的血液系统恶性肿瘤，严重威胁着人类的健康。然而，目前临床上对于白血病的基本治疗手段仍是化学治疗，由于化疗药物的非特性，化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也损害了正常组织和细胞，严重影响了治疗后患者的生活质量。此外，由于白血病的具有易复发的特性，且复发患者常常对常规的化疗药物出现耐药，因此常规的化疗很难提高疗效。因此，开发针对白血病细胞的靶点和特异性抑制剂，选择性杀伤肿瘤细胞，减少毒副作用已成为研究热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用，本发明利用基因治疗手段通过降低MTR4基因的表达，实现白血病的治疗。
本发明提供了一种敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
优选的，所述MTR4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，所述敲低MTR4的试剂包括抑制MTR4基因表达的试剂和/或抑制MTR4蛋白表达的试剂。
优选的，所述抑制MTR4基因表达的试剂包括siRNA；
所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述抑制MTR4基因表达的试剂还包括阳离子脂质体；所述阳离子脂质体包裹所述siRNA形成siRNA脂质体复合体。
优选的，所述白血病包括急性髓系白血病。
本发明提供了一种用于敲低MTR4的试剂的siRNA脂质体复合体，包括siRNA和阳离子脂质体，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述siRNA和阳离子脂质体的摩尔浓度比为1:(2.5～3)。
本发明提供了所述siRNA脂质体复合体的制备方法，包括以下步骤：
1)将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯混合，在有机溶剂的条件下超声，再在真空条件充分搅拌，得到的沉淀物在超纯水条件下超声，得到稳定的阳离子脂质体混合物；
2)将所述阳离子脂质体混合物和siRNA混合，将所得混合物和聚乙二醇-2000混合，经超声和水浴，获得siRNA脂质体复合体。
优选的，步骤2)中所述混合物和聚乙二醇-2000的摩尔质量比为1：1。
优选的，步骤1)中(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯的摩尔质量比为(1～3):1。
本发明提供所述siRNA脂质体复合体或所述制备方法制备的siRNA脂质体复合体在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
本发明提供了一种敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。MTR4基因在白血病细胞中过表达，本发明以MTR4基因作为靶标在制备治疗肿瘤药物中应用，具体实验表明通过特异性降低MTR4基因的表达，可有效延长急性髓系白血病人源肿瘤异种移植模型PDX模型的生存期。由此可见，敲低MTR4基因为白血病的治疗提供了新思路。
进一步的，本发明提供了敲低MTR4的试剂为siRNA脂质体复合体。利用siRNA脂质体复合体敲低急性髓系白血病PDX的体内MTR4基因，降低MTR4基因在白血病细胞中的表达，有效地延长急性髓系白血病PDX模型的生存期。同时体外实验，通过MTR4敲低对白血病细胞的影响，阐明其对白血病发生发展的作用，为临床应用奠定基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中siRNA脂质体复合物的结构示意图；其中图1A为siRNA脂质体复合物的制备过程示意图，图1B为本发明制备的脂质体复合物的电镜图；图1C为本发明制备的脂质体的电位及粒径参数；
图2为本发明实施例1中阳离子脂质体复合物在原代AML细胞和AML细胞系动物模型中敲低MTR4的表达水平结果；图2A为脂质体复合物对siRNA的包覆效率，图2B为白血病原代细胞中MTR4表达情况；图2C为人白血病细胞系动物模型中MTR4表达情况；
图3为本发明实施2中利用siRNA脂质体复合物对AML细胞PDX模型治疗各组小鼠的生存期结果；图3A为NSG小鼠成功注入白血病原代细胞的流式细胞结果图，图3B为注射包含敲低MTR4的脂质体复合物的PDX动物模型的生存时间结果，NC为阴性对照组，KD为MTR4敲低组。
具体实施方式
本发明提供了一种敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
在本发明中，所述MTR4基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。所述敲低MTR4的试剂包括抑制MTR4基因表达的试剂和/或抑制MTR4蛋白表达的试剂。所述抑制MTR4基因表达的试剂优选包括siRNA；所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2(5'-GGAAGGATTTCCGATGGATTT-3')所示。所述白血病优选包括急性髓系白血病。所述siRNA能靶向MTR4基因，特异性敲低MTR4基因在白血病细胞中的表达，有效地延长急性髓系白血病PDX模型的生存期。所述抑制MTR4基因表达的试剂优选还包括阳离子脂质体。所述阳离子脂质体包裹所述siRNA形成siRNA脂质体复合体。与常规的转染试剂(例如Lipofectamine2000)相比，本发明提供的阳离子脂质体具有类似的RNA包覆和转染效率，但成本更低，大大降低了大批量制作的成本。因此，本发明明确了以MTR4基因作为靶标为治疗白血病提供了新途径和新思路。
本发明提供了一种用于敲低MTR4的试剂的siRNA脂质体复合体，包括siRNA和阳离子脂质体，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述siRNA和阳离子脂质体的摩尔浓度比为1:(2.5～3)，更优选为1:2.75。
本发明提供了所述siRNA脂质体复合体的制备方法，包括以下步骤：
1)将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺(DOTAP)与胆固醇酯混合，在有机溶剂的条件下超声，再在真空条件充分搅拌，得到的沉淀物在超纯水条件下超声，得到稳定的阳离子脂质体混合物；
2)将所述阳离子脂质体混合物和siRNA混合，将所得混合物和聚乙二醇-2000混合，经超声和水浴，获得siRNA脂质体复合体。
本发明将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯混合，在有机溶剂的条件下超声，再在真空条件充分搅拌，得到的沉淀物在超纯水条件下超声，得到稳定的阳离子脂质体混合物。
在本发明中，所述(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯的摩尔质量比为(1～3):1，更优选为1～2:1，更优选为1:1。所述有机溶剂优选包括三氯甲烷。所得混合物和有机溶剂的质量优选为1：100～200，更优选为1：150。所述超声的功率为100～200W，更优选为150W。所述超声的温度优选为50～70℃，更优选为60℃。所述超声的时间优选为8～15min，更优选为10min。
在本发明中，所述真空条件的真空度优选为-80～-100kPa，所述充分搅拌的时间优选为30～45min，更优选35～40min。所述沉淀物和超纯水的质量比优选为1：50～100，更优选为1：60。
得到阳离子脂质体混合物后，本发明将所述阳离子脂质体混合物和siRNA混合，将所得混合物和聚乙二醇-2000混合，经超声和水浴，获得siRNA脂质体复合体。
在本发明中，所述阳离子脂质体混合物和siRNA的质量比优选为2.75：1。所述混合物和聚乙二醇-2000的摩尔质量比优选为1：2。所述超声的功率优选为145～155W，更优选为150W，所述超声的温度优选为3～5℃，更优选为4℃。所述超声的时间优选为0.5～1.5min，更优选为1min。所述水浴的温度优选为45～55℃，更优选为50℃。所述水浴的时间为25～35min，更优选为30min。
在本发明中，所述siRNA脂质体复合体对siRNA的包覆率为95％以上。
本发明提供所述siRNA脂质体复合体或所述制备方法制备的siRNA脂质体复合体在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
分别以原代白血病细胞和人白血病细胞系动物模型为研究对象，分别注射siRNA脂质体复合体，结果表明，与对照组相比，注射脂质体复合物的小鼠模型，体内MTR4表达水平明显下降。同时根据siRNA脂质体复合体对人白血病PDX动物模型的治疗效果可知，与对照组相比，注射脂质体复合物的PDX动物模型，其总生存时间明显延长。由此可知，本发明提供的siRNA脂质体复合物具有靶向敲低MTR4基因的作用，并且具有对人白血病，尤其对人急性髓系白血病具有良好的治疗效果。
下面结合实施例对本发明提供的一种抑制MTR4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种抑制MTR4基因的siRNA脂质体复合物的制备方法
1、实验材料
试剂：DOTAP(美国sigma公司)，胆固醇酯(瑞士Corden Pharma公司)，2,3-二油酰基-丙基和聚乙二醇-2000(DSPE-PEG2000,中国西安瑞喜公司)，三氯甲烷(中国广州化学试剂厂)，人血清(美国AB公司)；siRNA购自广州艾基生物公司人IL3/IL6/SCF/FLT-3ligand细胞因子购于Peprotech公司；IMEM培养基、超纯水、PBS均购于Gibco公司)。
仪器：超声破碎仪(美国Qsonica公司)、旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)、低速台式自动平衡离心机(Eppendorf 5702)倒置荧光显微镜(NIKON-Ti-U)、荧光酶标仪(美国BioTek公司)。
2、实验方法
S1按照将DOTAP与胆固醇酯按照摩尔质量比1:1的比例混合均匀。
S2将步骤S1获得的混合物置于三氯甲烷中，在60℃，150W条件超声分散1min后，得到混合液1。
S3将步骤S2的混合液1在真空度为-90kpa的条件下旋转35min，旋转结束后得到沉淀物。
S4向步骤S3的沉淀物中加入超纯水，在60℃，150W条件超声分散1min后，得到沉淀物，然后转移至EP管中，在150w，4℃的条件下进行超声，得到混合液2。
S5将步骤S4中的混合物进行动态光散射检测其粒径和Zeta电位大小，得到稳定的阳离子脂质体混合物；所得阳离子脂质体混合物的粒径大小为100～150nm，Zeta电位为55～65mV。
S6将步骤S5中的阳离子脂质体混合物与siRNA按照质量比为3：1的比例混合，静置5min后，按质量比为1：2的比例加入浓度为10mg/ml的DSPE-PEG2000，超声分散1min，在50℃的条件下水浴30min，得到包含特定siRNA的脂质体混合物。
所述siRNA包括两种siRNA，一种为敲低MTR4基因，其siRNA序列如GGAAGGATTTCCGATGGATTT(SEQ ID NO:2)所示，记为敲低MTR4的siRNA；另一种作为对照，其siRNA序列如所示，具体为uucuccgaacgugucacgudTdT(SEQ ID NO:3)，记为对照siRNA。制备得到两种siRNA脂质体复合物，分别为敲低MTR4的siRNA脂质体复合物和对照siRNA脂质体复合物。
实施例2
体外实验验证
收集确诊为急性髓系白血病的患者骨髓标本，通过密度梯度离心法分离单个核细胞，取1×106/孔至12孔板中，按2μg/ml分别加入实施例1制备的两种siRNA脂质体复合物，72小时后，收集细胞进行qPCR和Western-blotting检测MTR4的表达。其中qPCR的检测方法如下：
MTR4引物：
上游序列：GCCTTATTTGCCACGGAGACCT(SEQ ID NO:4)；
下游序列：TCCTTCCAGCACGACCAGACAT(SEQ ID NO:5)；
内参actin引物：
上游序列：CAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC(SEQ ID NO:6)
下游序列：CATCCATGGTGAGCTGGCGGCG(SEQ ID NO:7)。
提取细胞中RNA，经反转录得到cDNA，反转录反应的体系如下：
Figure BDA0003162322240000061
Figure BDA0003162322240000071
反应程序为：37℃15min，85℃5s，4℃forever。cDNA于-20℃储存，以备后续进一步实验。
将稀释cDNA，按照总量的1:10倍稀释，以稀释的cDNA为模板，配制qPCR的反应体系，具体如下：
Figure BDA0003162322240000072
反应程序为：95℃2min；95℃5s，60℃34s(40个循环)；95℃5s，读数并分析结果。
Western-blotting检测方法参考现有技术(Wang CQ,Li YM,Yan S,Hao Wang H,Xianfeng ShaoXF,Xiao MM,Yang BC,Qin GX,Kong RR,Chen RB,Ning ZhangN.Interactome analysis reveals that lncRNA HULC promotes aerobic glycolysisthrough LDHA and PKM2.Nat Commun,2020.22；11(1):3162.)。
结果见图2B-图2C。原代白血病细胞经敲低MTR4的siRNA脂质体复合物处理后，与对照组相比，细胞内MTR4基因和蛋白的表达均降低。
实施例3
体内实验验证
将6～8周龄体重20～25g的NOD-Prkdcem26Il2rgem26/Nju小鼠(由南京大学-南京生物医药研究院提供)，分为对照组和实验组，两组分别进行如下处理：对照组：加入照siRNA(NC)的脂质体复合物；实验组：加入敲低MTR4基因的siRNA脂质体复合物。
1.本发明制备的siRNA脂质体复合物对白血病细胞系KG1a模型的治疗效果
取6只小鼠(20～25g/只)，收集人白血病细胞系KG1a，按照5×106细胞/只，通过尾静脉注射到小鼠体内，通过流式细胞术检测小鼠外周血CD45的表达，植入成功后，将小鼠随机分成对照组和实验组。两组通过腹腔分别注射对照的脂质体复合物和敲低MTR4基因的siRNA脂质体复合物，注射时间为0，12，24小时，48小时后，收集小鼠的脾脏和骨髓细胞，通过qPCR和Western-blotting检测MTR4的表达，具体操作同上。
结果
脂质体复合物对siRNA的包覆效率可达95％以上(图2A)(参考文献：Wang X,WangXP,Sun J,Fu S.An enhanced RRM2 siRNA delivery to rheumatoid arthritisfibroblast-like synoviocytes through a liposome-protamine-DNA-siRNA complexwith cell permeable peptides.Int J Mol Med.2018 Nov；42(5):2393-2402.)；在人白血病细胞系动物模型(图2C)中敲低MTR4表达，结果表明注射包含敲低MTR4的脂质体复合物的小鼠模型与对照组相比，其MTR4表达水平明显下降。
2.本发明的脂质体复合物对白血病PDX模型的治疗效果
收集急性髓系白血病患者的骨髓标本，通过密度梯度离心的方法分离单个核细胞，将获得的细胞通过尾静脉注入NSG小鼠体内，细胞数量为3～7×106个/小鼠。4周后，通过流式细胞术检测小鼠外周血中CD45，出现CD45阳性细胞群视为建模成功，为P1；未检测到CD45者，每周继续检测。P1小鼠濒死前处死，取骨髓和脾脏，分离单个核细胞，再次移入NSG小鼠体内，每只小鼠植入的细胞数视分离的单个核细胞而定，一般为3～7×106个/小鼠。同样地，定期检测小鼠外周血中CD45的表达，检测到CD45者为植入成功，计为P2。P2小鼠濒死前处死，取骨髓和脾脏，分离单个核细胞，再次移入NSG小鼠体内，每只小鼠植入的细胞数视分离的单个核细胞而定，一般为3～7×106个/小鼠。同样地，定期检测小鼠外周血中CD45的表达，具体方法如下：于小鼠的尾静脉取血约30μL，加入红细胞裂解液将红细胞裂解后，PBS洗3遍，加入CD45流式抗体，通过流式细胞术检测CD45的表达。
检测到CD45者为植入成功，计为P3，P3的小鼠用于实验。
在P3的小鼠植入细胞的第7天(移植当天为第0天)，将小鼠随机分成对照组和实验组，按5mg/kg通过腹腔分别注入对照脂质体和敲低MTR4基因的脂质体，每3天注射一次，直到共注射10次为止。实验观察的终点为小鼠的总生存时间。P3小鼠濒死前处死，取外周血、骨髓和脾脏，通过流式检测CD45的表达，未检测到CD45者为植入失败，不纳入结果分析。
脂质体复合物对人白血病PDX动物的治疗效果，结果如图3所示，图3A表明原代细胞在NSG小鼠内成功注入，图3B表明注射包含敲低MTR4的脂质体复合物的PDX小鼠模型总生存时间明显延长。
本发明实施例结果表明：本发明制备的敲低MTR4的脂质体复合物具有对人急性髓系白血病PDX模型有良好的治疗效果，可见敲低MTR4有望成为急性髓系白血病的新治疗手段。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州珈安华钰生物科技有限公司
<120> 一种抑制MTR4基因表达的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttgagtcgc cagctgcctg ccacacgcca ggcgccacgc gccgccctcg ctctttatcc 60
actgagcagc ttatccactt taggtcggaa aggaaaggaa agaaaagcag gaaaaaaaaa 120
aaaagtcagg ggaacatttt tgtcggctgc gcgactcgac tacttttgtc tcctgcgggc 180
cactgttgag ccttcacgag acgtcactgt cttcggtcgc ggggcatcgt gggtaggagg 240
gagatttgct ctcactgctc ccaaaaatgg cggacgcatt cggagatgag ctgttcagcg 300
tgttcgaggg cgactcgacc actgcggcgg gaaccaaaaa agacaaggaa aaggacaagg 360
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cagctagaac tgttttattt acaaatgccc gcaaatttga tgggaaggat ttccgatgga 1800
tttcttctgg tgaatacatt cagatgtctg gtcgtgctgg aaggagagga atggatgata 1860
gaggaattgt aattcttatg gtagatgaaa agatgagccc aacaattgga aaacaattac 1920
ttaagggctc cgctgatcct ctaaatagtg ctttccattt gacctacaac atggttttga 1980
acttactacg tgtagaagaa attaatcctg agtacatgtt ggaaaaatcc ttctaccagt 2040
ttcagcatta tagagcaatt ccaggagtag tagagaaggt aaagaattca gaagaacagt 2100
ataataaaat agtaattccc aatgaagaaa gtgtggttat ctattataag attagacagc 2160
agcttgccaa attgggtaaa gaaattgaag aatatattca caaaccaaaa tactgcttac 2220
cttttctaca accaggtcgt ttggtaaagg taaagaatga aggagatgac tttggctggg 2280
gagtagtggt gaatttctca aaaaagtcaa atgttaagcc taactctggt gaactggatc 2340
ctttgtatgt agtagaagta cttctgcgct gtagcaaaga gagcttgaaa aattcagcta 2400
cagaagctgc aaaaccagct aaacctgatg agaaaggaga gatgcaggtt gtcccagttt 2460
tggtgcatct cctgtctgct atcagcagtg ttaggcttta cattcctaaa gaccttcggc 2520
cggtggacaa tagacagagt gttttaaaat caatacagga agttcagaaa cgttttcctg 2580
acggcatccc cttattagac cctattgatg atatgggcat tcaagatcaa gggctgaaaa 2640
aagtcattca gaaagtagaa gcttttgagc atcgaatgta ttctcatcca cttcacaatg 2700
atccaaattt ggaaactgtg tatacgcttt gtgaaaaaaa agcacagatt gcaatagata 2760
ttaaatctgc aaagcgagaa ctgaagaaag caagaacagt cctacaaatg gatgaactca 2820
aatgtcgcaa acgtgtttta agaaggttgg gatttgctac ttcttctgat gtaatagaga 2880
tgaaaggacg agtggcttgt gagataagca gtgctgatga gctccttcta actgagatga 2940
tgtttaatgg ccttttcaat gacctttctg cagaacaggc aacagcatta ttaagctgct 3000
ttgtgtttca agagaattct agtgagatgc ccaaattaac agaacaatta gcaggaccac 3060
ttcgtcaaat gcaggaatgt gctaaaagaa ttgcaaaagt ttcagcagaa gccaaattgg 3120
aaattgatga ggaaacttat ctaagctcat ttaaacctca cttaatggat gtagtatata 3180
cctgggcaac tggagctaca tttgcccata tctgcaaaat gacagatgtc tttgaaggca 3240
gcataattcg ttgtatgagg cgcctggaag aattgcttcg acaaatgtgt caagcagcaa 3300
aagccattgg aaacactgag ctggaaaata aatttgcaga aggaatcacc aaaatcaaga 3360
gagatattgt gtttgctgcc agcctctact tgtagagtca gctaaaggaa tgtgagattt 3420
taaattattg accacctgtt tgattacagt tgactacaaa tgcctgcaag tgtggatttg 3480
gttctcccat acattttaat atgtattata tttaaatcaa acatcattca tagaaagcat 3540
attacataca tgtttataca taagcattac atttttttaa taaaaatgta tacaggtggg 3600
gcactgtttt ggtggaaggc ttggagtttt tttaatgagt ttagagctat tagataacca 3660
ctgagttaaa ggtaactatg tacacacaaa gtgtgcatcc aagaggcata gcagcagcag 3720
aagtctttaa aggcttgtac accaggaaga aagatgcatc ctcttgcctt gtggcaatca 3780
ttttccttta gaaaacaggc cagcttcacc tgggcaccct gctgcctttc aaggctggtg 3840
attgctcgga tagtgattcc cagttgttgg tgtttcatgc agagttgtat gagagtcctc 3900
ctcttttctt tctttaaaag aagttctttc tttgaagaaa tccgatacat atacagccta 3960
cagtgcaaaa tatttaatgg tataatttag atcaagttaa aaactacata caaagttgtg 4020
atcaacagca tcctaagata aatataaaca aaaggatata ctttgaggtg tacagattaa 4080
gcatataaaa aattagagac taactgggat tttttaaaga ttattccaaa ttaagagttg 4140
ctttgttatg ccttcagcaa atagcttcat tttgccaata ctgaataaaa gagttatttc 4200
tacaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 4222
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaaggattt ccgatggatt t 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> n=dT
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> n=dT
<400> 3
uucuccgaac gugucacgun n 21
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccttatttg ccacggagac ct 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tccttccagc acgaccagac at 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cagagcctcg cctttgccga tc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
catccatggt gagctggcgg cg 22

Claims (10)

1.一种敲低MTR4的试剂在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述MTR4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述敲低MTR4的试剂包括抑制MTR4基因表达的试剂和/或抑制MTR4蛋白表达的试剂。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述抑制MTR4基因表达的试剂包括siRNA；
所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑制MTR4基因表达的试剂还包括阳离子脂质体；所述阳离子脂质体包裹所述siRNA形成siRNA脂质体复合体。
6.根据权利要求1～5任意一项所述应用，其特征在于，所述白血病包括急性髓系白血病。
7.一种用于敲低MTR4的试剂的siRNA脂质体复合体，其特征在于，包括siRNA和阳离子脂质体，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述siRNA和阳离子脂质体的摩尔浓度比为1:(2.5～3)。
8.权利要求7所述siRNA脂质体复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯混合，在有机溶剂的条件下超声，再在真空条件充分搅拌，得到的沉淀物在超纯水条件下超声，得到稳定的阳离子脂质体混合物；
2)将所述阳离子脂质体混合物和siRNA混合，将所得混合物和聚乙二醇-2000混合，经超声和水浴，获得siRNA脂质体复合体。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于，步骤2)中所述混合物和聚乙二醇-2000的摩尔质量比为1：1；
步骤1)中(2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺与胆固醇酯的摩尔质量比为(1～3):1。
10.权利要求7所述siRNA脂质体复合体或权利要求8或9所述制备方法制备的siRNA脂质体复合体在制备预防和/或治疗白血病的药物中的应用。
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周德生: "《中医偏方全书（珍藏本）豪华精装版》", 31 August 2018, 湖南科学技术出版社 *

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