CN113504364A - 基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，具体为：使用第一类金属离子编码微球，编码后的微球与捕获抗体结合，形成微球‑第一类金属离子‑捕获抗体结构的微球免疫复合物；使用第二类金属离子标记检测抗体；分别将所述微球免疫复合物和标记过的检测抗体加入待测样本中，抗原抗体反应，形成微球‑第一类金属离子‑捕获抗体‑待测物‑检测抗体‑第二类金属离子的结构；使用质谱技术检测样本悬液，分别获得第一类金属离子和第二类金属离子的含量；利用获得的金属离子含量及映射关系得到待测样本的信息，所述映射关系是金属离子含量与样本信息间的对应关系。本发明具有检测准确度高、快速等优点。
Description
技术领域
本发明涉及胞外游离蛋白检测，特别涉及基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法。
背景技术
细胞外蛋白是由细胞合成后分泌出去的蛋白，比如蛋白质激素、抗体、酶类等，这些细胞外游离蛋白的含量，通常随着人体生理、病理的情况而转变，因此检测某些特定的细胞外游离蛋白，在人体的健康检测、疾病筛查等方面有着重要作用。
比如肿瘤标志物(Tumor Marker,TM)就是在恶性肿瘤的发生和增殖过程中，由肿瘤细胞本身所产生的或是由机体对肿瘤细胞反应而异常产生和(或)升高的，反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶(同工酶)等，可存在于患者的血液、体液、细胞或组织中。此外，感染病毒、疾病后，血清中也可以检测到对应抗体，心衰疾病的患者，肌酸激酶同工酶、脑利钠肽等蛋白的含量也显著异于常人。因此检测这些特定胞外蛋白的含量，对于临床上疾病诊断、病情监控、预后评估具有重要意义。
目前检测胞外游离蛋白的方法有酶联免疫法、化学发光法、液相芯片技术等。酶联免疫法检测方便快捷，检测成本较低，但是检测的线性范围较小；化学发光法是目前体外诊断常用的检测方法，但是其缺点在于发光不稳定，多为间断、闪烁性发光，发光峰值很快衰减，导致反应结果不稳定；液相芯片技术是以磁性微球作为载体，根据两种染料的不同比例编码100种不同的微球，一般情况下，分辨这些不同荧光的微球并不难实现，但是将其交联上抗体并最终形成免疫复合物之后，仪器对微球的检出效率会大幅度下降，不同微球的光谱也会产生相互干扰和拖带，从而影响检测结果。
质谱流式细胞技术(Mass Cytometry)是利用质谱原理对单细胞进行多参数检测的流式技术，主要使用各种金属离子作为待测物的标签，检测手段为电感耦合等离子体-飞行时间质谱。用于质谱流式标记的金属离子标签是通过金属螯合聚合物实现与抗体的共价偶联，这种金属螯合聚合物与细胞组分的非特异性结合极低，同时选择作为标记的金属大部分为稀有金属，在细胞中含量基本为零，因此检测背景极低，目前发现的金属元素已超过100种，可以用于标记的金属元素超过40种。质谱流式细胞技术一次可以同时检测上百个不同的参数，且相邻通道之间干扰较小，解决了流式细胞检测时荧光串色的问题，不需要再额外调节荧光补偿，同一样品不同时间检测结果的变异系数较小，检测结果稳定可靠。目前，质谱流式细胞技术只能基于细胞作为载体，去检测细胞表面或细胞内的蛋白，并不能检测细胞外游离的蛋白，使其在临床上的应用范围受到了限制。
发明内容
为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，所述基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法为：
使用第一类金属离子编码微球，编码后的微球与捕获抗体结合，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体结构的微球免疫复合物；
使用第二类金属离子标记检测抗体；
分别将所述微球免疫复合物和标记过的检测抗体加入待测样本中，抗原抗体反应，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体-待测物-检测抗体-第二类金属离子的结构；
使用质谱技术检测样本悬液，获得第一类金属离子和/或第二类金属离子的含量；
利用获得的金属离子含量及映射关系得到待测样本的信息，所述映射关系是金属离子含量与样本信息间的对应关系。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
1.检测准确度高、分辨率高；
形成了微球-第一类金属离子-捕获抗体-待测物-检测抗体-第二类金属离子的结构，从而能够检测胞外游离蛋白，如肿瘤标记物的检测；
在调试中，精准地同步调节竖直炬管和线圈的空间位置，达到每个工况下的最佳位置，获得最准确的检测数据；
实现炬管在三个维度上微调，三个方向的位置精度和重复精度可以达到0.01mm，实现炬管火焰与锥口达到最佳位置；
本发明的飞行时间质谱分析器可对更宽的离子初始位置分散实现二阶时间聚焦，质量分辨率显著提升；
2.灵敏度高；
采用双脉冲推斥技术可以减小对高压脉冲的技术要求；本发明专利采用正脉冲推(推斥电极)和负脉冲拉(牵引电极)的双推斥方式，高压的需求会降低一半，故上升沿较陡和脉冲波形均可得到改善；
在双脉冲推斥中间增加等电势的第一栅网和第二栅网，可减小加速区对离子调制区的电场渗透效应；
第一栅网和第二栅网直接接地，没有额外增加电压，调节难度小；
可实现对较宽的调制区，提高离子通量与灵敏度；
3.可靠性好；
炬管为竖直设置，且和线圈保持相对静止，炬管和线圈同步移动，防止炬管移动时与线圈靠的过近而烧坏炬管，解决了采样锥被烧变形的问题；
利用转换模块和转换件，使得马达的转动可靠地转换为转换件的竖直移动，多个导向件的使用，使得承载件及转换件仅有竖直方向移动，有效地防止了承载件倾斜，确保了炬管定位的准确度和可靠性；
附图说明
参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
图1是根据本发明实施例的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法的流程图；
图2是根据本发明实施例的质谱仪的结构示意图；
图3是根据本发明实施例的承载单元的结构示意图；
图4是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图；
图5是根据本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图。
具体实施方式
图1-5和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了解释本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
实施例1：
图1给出了本发明实施例的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法的流程图，如图1所示，所述基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法为：
使用第一类金属离子编码微球，编码后的微球与捕获抗体结合，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体结构的微球免疫复合物；
使用第二类金属离子标记检测抗体；
分别将所述微球免疫复合物和标记过的检测抗体加入待测样本中，抗原抗体反应，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体-待测物-检测抗体-第二类金属离子的结构；
使用质谱技术检测样本悬液，获得第一类金属离子和/或第二类金属离子的含量；
利用获得的金属离子含量及映射关系得到待测样本的信息，所述映射关系是金属离子含量与样本信息间的对应关系。
为了实现微球编码，进一步地，编码微球的方式为：
在化学活化试剂作用下，活化磁性微球表面的羧基或氨基，之后加入金属螯合剂反应；
加入金属盐并反应，去除过量的金属盐。
为了标记检测抗体，进一步地，标记检测抗体的方式为：
在交联剂作用下，第二类金属离子和金属螯合剂结合；
使用TCEP对检测抗体进行巯基修饰；
在缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的第二类金属离子与巯基修饰后的检测抗体结合。
为了进行抗原抗体反应，进一步地，抗原抗体反应的方式为：
在待测样本中加入微球免疫复合物，孵育，去除未结合的抗原和杂质；
加入标记过的检测抗体，孵育，去除多余的标记过的检测抗体。
为了建立准确的映射关系，进一步地，所述映射关系的获得方式为：
制备具有梯度浓度的抗原标准品；
使用所述检测方法检测所述抗原标准品，获得金属离子含量，从而得到金属离子含量和抗原浓度间的对应关系。
为了提高检测准确度，进一步地，在质谱检测中，离子化的具体方式为：
马达转动，转换模块将马达的转动转换为滑动件的直线移动；
将所述滑动件的直线移动转换为转换件的竖直移动，从而带动与所述转换件连接的承载件沿着多个导向件竖直移动，设置在所述承载件上的承载单元随着所述承载件竖直移动；炬管竖直地设置在所述承载单元上，线圈固定在所述承载单元上，并与所述炬管保持相对静止；
在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在二维调节单元上，所述二维调节单元设置在所述承载件上；
样本悬液进入所述炬管内，通过所述线圈激发成等离子体，从而形成离子；
所述离子穿过采样锥后进入质谱分析单元。
为了提高检测准确度，进一步地，在质谱检测中，使用飞行时间质量分析器，所述飞行时间质量分析器包括推斥极、无场飞行区和检测器，所述无场飞行区包括第一入射栅网；所述飞行时间质量分析器还包括：
牵引电极，所述牵引电极和所述第一入射栅网间形成第一离子加速区；
第一栅网和第二栅网，所述第一栅网和第二栅网间电势差为零；所述推斥极和第一栅网间，以及第二栅网和牵引电极间形成第二离子加速区；离子依次穿过第一栅网、第二栅网、牵引电极、第一入射栅网和无场飞行区，被所述检测器接收。
所述飞行时间质量分析器还包括：
反射区，所述反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网和反射电极，第二反射场包括所述反射电极和反射板；从所述无场飞行区出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器接收。
为了实现二阶聚焦，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：
E1、E3、E4、E5分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z0、dG、d2、d3、d4、d5分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离、第二入射栅网和反射电极间的距离、反射电极和反射板间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
为了实现二阶聚焦，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：
E1、E3分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z0、dG、d2、d3分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
实施例2：
根据本发明实施例1的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法在肿瘤标志物检测中的应用例。
在该应用例中，基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法：
样本准备：采集病人的血液，对血样离心后获得血清；
试剂准备：在化学活化试剂作用下，活化磁性微球表面的羧基或氨基，之后加入金属螯合剂反应；
加入镧系金属盐溶液(第一类金属离子)并反应，反应结束后通过洗涤去除过量的金属盐，实现了微球的金属编码；
在交联缓冲液作用下，编码后的微球与捕获抗体结合，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体结构的微球免疫复合物；
使用第二类金属离子标记检测抗体：在交联剂作用下，第二类金属离子(与第一类金属离子不同)和金属螯合剂结合；
使用TCEP对检测抗体进行巯基修饰；
在缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的第二类金属离子与巯基修饰后的检测抗体结合；
将所述微球免疫复合物加入待测样本(即血清)中，混匀，在37度环境下孵育30分钟，利用磁分离洗掉未结合的抗原和杂质；
加入标记过的检测抗体，混匀，在37度环境下孵育8分钟，去除多余的标记过的检测抗体，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体-待测物-检测抗体-第二类金属离子的结构；
使用质谱技术检测样本悬液，分别获得第一类金属离子和/或第二类金属离子的含量；
利用获得的金属离子含量及映射关系得到待测样本的信息，所述映射关系是金属离子含量与样本信息间的对应关系；所述映射关系的获得方式为：
制备具有梯度浓度的抗原标准品，本实施例是AFP、CA125、CEA、CA135、CA199，混合相同浓度的五种标准品；
在抗原标准品中分别加入微球免疫复合物以及金属标记的检测抗体，混匀和孵育，去除多余物质，利用质谱检测技术获得金属离子含量，从而得到金属离子含量和抗原浓度间的对应关系。
检测阶段：将上述处理好的样本悬液送入ICP-TOF-MS中检测，首先离子化，使金属离子得以释放并被进一步送入飞行时间检测室中进行检测，样本被逐个离子化，使标签金属离子得以释放并被进一步送入飞行时间检测室中进行检测；微球上标记的金属离子可以区别出所检测的不同类型的蛋白指标，而二抗上标记的金属离子的含量，可以间接反映各个目标蛋白的表达量；检测器会精确记录设计并换算为各种标签同位素的精确含量，并通过适配软件分析输出数据；
ICP-TOF-MS的具体结构为：
如图2所示，炬管101和线圈102分别设置在承载单元的不同部件上，炬管101和线圈102保持相对静止；
如图3所示，承载单元包括固定部301、第一安装部302、第二安装部303和连接部304；第二安装部303水平地固定在第一调节单元201上，固定部301固定在所述第二安装部303上侧，连接部304竖直设置，下端固定在第二安装部303上，上端固定水平设置的第一安装部302；炬管101竖直地设置在所述第一安装部302上，线圈102的一端固定在所述固定部301上，另一端环绕炬管101；
如图2所示，第二调节单元固定在底盘100上，包括电机401、螺杆402、螺母、导轨404、滑动件405和轴承，电机401驱动水平设置的螺杆402转动，螺母利用螺纹套在所述螺杆402上，滑动件405设置在与螺杆402平行设置的导轨404上，螺母连接滑动件405，使得单元螺杆402转动时，驱动滑动件405沿着导轨404水平直线移动；轴承设置在滑动件405的顶端；承载件503的四个角分别具有允许竖直设置的导向件504穿过的通孔，通孔的内径和导向件504的外径差别很小，使得承载件503仅能沿着导向件504竖直移动；转换件具有竖直部分501和倾斜部分502，竖直部分501的下端连接所述承载件503，上端连接倾斜部分502，所述倾斜部分502被所述轴承顶着，滑动件405在倾斜部分502下侧水平直线移动，使得倾斜部分502仅有竖直移动；
第一调节单元201采用电动二维移动平台，实现在水平方向的二维调节，设置在所述承载件503上；
图4给出了本发明实施例的飞行时间质量分析器的结构示意图，如图4所示，所述飞行时间质量分析器包括：
推斥极11、无场飞行区30和检测器51，所述无场飞行区30包括第一入射栅网31；
牵引电极12，所述牵引电极12和所述第一入射栅网31间形成第一离子加速区；
第一栅网21和第二栅网22，所述第一栅网21和第二栅网22间电势差为零；所述推斥极11和第一栅网21间，以及第二栅网22和牵引电极12间形成第二离子加速区；所述牵引电极12具有允许离子穿过的槽孔，或者具有允许离子穿过的栅网结构；离子依次穿过第一栅网21、第二栅网22、牵引电极12、第一入射栅网31和无场飞行区30，被所述检测器51接收；第一栅网21和第二栅网22接地，保证了第一栅网21和第二栅网22等电势；
所述牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压；牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区的电场强度均匀；电源给推斥极11施加正脉冲电压，给牵引电极12施加负脉冲电压。
为了实现二阶聚焦，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：
E1、E3分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z0、dG、d2、d3分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网21和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离；L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场飞行区中飞行的长度。
上述单细胞离子化的方式为：
马达转动，驱动螺母携带滑动件405在导轨404上水平直线移动；
滑动件405在转换件的倾斜部分502下侧水平直线移动，从而转换为转换件的竖直移动(转换件仅有竖直移动)，从而带动与所述转换件连接的承载件503沿着多个导向件504竖直移动(承载件503仅有竖直移动)，设置在所述承载件503上的承载单元随着所述承载件503竖直移动；炬管101竖直地设置在所述承载单元的第一安装部302上，线圈102固定在所述承载单元的固定部301上，并与所述炬管101保持相对静止；
利用第一调节单元201，在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在第一调节单元201上，所述第一调节单元201设置在所述承载件503上；可见，在承载单元的三维调节中，所述炬管101和线圈102保持相对静止；
样品在进入所述炬管101内，通过所述线圈102激发成等离子体，从而形成离子；
所述离子穿过采样锥103后进入质谱分析单元。
实施例3：
根据本发明实施例1的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法在肿瘤标志物检测中的应用例。
在飞行时间质量分析器中，如图5所示，第一栅网21和第二栅网22接地，保证了第一栅网21和第二栅网22等电势；牵引电极12和第一入射栅网31间具有允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区的电场强度均匀；电源给推斥极11施加正脉冲电压，给牵引电极12施加负脉冲电压；
反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网32和反射电极41，第二反射场包括所述反射电极41和反射板42；从所述无场飞行区30出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器51接收；
在第一离子加速区以及第一反射场和第二反射场内，设置允许离子穿过的多片电极，并利用分压电阻对多片电极分压，使得第一离子加速区、第一反射场和第二反射场内的电场强度均匀；
为了实现二阶聚焦，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：
E1、E3、E4、E5分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z0、dG、d2、d3、d4、d5分别是入射离子和第一栅网21间的距离、第一栅网21和第二栅网22间的距离、第二栅网22和牵引电极12间的距离、牵引电极12和第一入射栅网31间的距离、第二入射栅网32和反射电极41间的距离、反射电极41和反射板42间的距离；L是离子在第一入射栅网31和检测器51间无场飞行区中飞行的长度。
在ICP中，与实施例2不同是：
1.不再设置第二安装部和连接部，固定部直接固定在第一调节单元上，第一安装部水平地固定在固定部上；
2.螺杆和导轨间保持平行，且相对水平面倾斜设置；
3.转换件包括水平部分和竖直部分，水平部分被滑动件支撑；当倾斜直线移动的滑动件在转换件的水平部分下侧移动时，转换件随之竖直移动，且仅有竖直移动。
Claims (10)
1.基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，所述基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法为：
使用第一类金属离子编码微球，编码后的微球与捕获抗体结合，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体结构的微球免疫复合物；
使用第二类金属离子标记检测抗体；
分别将所述微球免疫复合物和标记过的检测抗体加入待测样本中，抗原抗体反应，形成微球-第一类金属离子-捕获抗体-待测物-检测抗体-第二类金属离子的结构；
使用质谱技术检测样本悬液，获得第一类金属离子和/或第二类金属离子的含量；
利用获得的金属离子含量及映射关系得到待测样本的信息，所述映射关系是金属离子含量与样本信息间的对应关系。
2.根据权利要求1所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，编码微球的方式为：
在化学活化试剂作用下，活化磁性微球表面的羧基或氨基，之后加入金属螯合剂反应；
加入金属盐并反应，去除过量的金属盐。
3.根据权利要求1所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，标记检测抗体的方式为：
在交联剂作用下，第二类金属离子和金属螯合剂结合；
使用TCEP对检测抗体进行巯基修饰；
在缓冲液作用下，结合了金属螯合剂的第二类金属离子与巯基修饰后的检测抗体结合。
4.根据权利要求1所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，抗原抗体反应的方式为：
在待测样本中加入微球免疫复合物，孵育，去除未结合的抗原和杂质；
加入标记过的检测抗体，孵育，去除多余的标记过的检测抗体。
5.根据权利要求1所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，所述映射关系的获得方式为：
制备具有梯度浓度的抗原标准品；
使用所述检测方法检测所述抗原标准品，获得金属离子含量，从而得到金属离子含量和抗原浓度间的对应关系。
6.根据权利要求4所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，在样本悬液的质谱检测中，离子化的具体方式为：
马达转动，转换模块将马达的转动转换为滑动件的直线移动；
将所述滑动件的直线移动转换为转换件的竖直移动，从而带动与所述转换件连接的承载件沿着多个导向件竖直移动，设置在所述承载件上的承载单元随着所述承载件竖直移动；炬管竖直地设置在所述承载单元上，线圈固定在所述承载单元上，并与所述炬管保持相对静止；
在水平方向上二维调节所述承载单元的位置，所述承载单元设置在二维调节单元上，所述二维调节单元设置在所述承载件上；
样本进入所述炬管内，通过所述线圈激发成等离子体，从而形成离子；
所述离子穿过采样锥后进入质谱分析单元。
7.根据权利要求1所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，在质谱检测中，使用飞行时间质量分析器，所述飞行时间质量分析器包括推斥极、无场飞行区和检测器，所述无场飞行区包括第一入射栅网；所述飞行时间质量分析器还包括：
牵引电极，所述牵引电极和所述第一入射栅网间形成第一离子加速区；
第一栅网和第二栅网，所述第一栅网和第二栅网间电势差为零；所述推斥极和第一栅网间，以及第二栅网和牵引电极间形成第二离子加速区；离子依次穿过第一栅网、第二栅网、牵引电极、第一入射栅网和无场飞行区，被所述检测器接收。
8.根据权利要求7所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，所述飞行时间质量分析器还包括：
反射区，所述反射区包括第一反射场和第二反射场，所述第一反射场包括第二入射栅网和反射电极，第二反射场包括所述反射电极和反射板；从所述无场飞行区出射的离子被所述反射区反射，之后被所述检测器接收。
9.根据权利要求8所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，所述第二离子加速区和第一反射场、第二反射场满足：
E1、E3、E4、E5分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区、第一反射场和第二反射场的电场强度，z0、dG、d2、d3、d4、d5分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离、第二入射栅网和反射电极间的距离、反射电极和反射板间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
10.根据权利要求7所述的基于金属编码技术的胞外游离蛋白检测方法，其特征在于，所述第一栅网与第二栅网的距离和无场飞行区满足：
E1、E3分别是所述第二离子加速区、第一离子加速区的电场强度，z0、dG、d2、d3分别是入射离子和第一栅网间的距离、第一栅网和第二栅网间的距离、第二栅网和牵引电极间的距离、牵引电极和第一入射栅网间的距离；L是离子在第一入射栅网和检测器间无场飞行区中飞行的长度。
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