CN113499479A - 改性生物材料的制备方法及得到的改性生物材料 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备改性生物材料的方法及得到的改性生物材料，所述方法包括表面改性步骤和交联处理步骤。本发明通过增加表面改性步骤，使用低温等离子体对生物材料引入活性基团，使生物材料表面的胶原蛋白分子的活化位点增多，降低了生物材料的活化能，大大提高了与戊二醛的结合能力，以及交联过程中戊二醛的转化率。因此，使用本发明提供制备改性生物材料的方法，为达到相同的交联效果，只需加入更低浓度、更少量的戊二醛，改性后生物材料中残余的戊二醛含量也明显降低，减少了戊二醛对生物材料的毒性，改性后生物材料的抗钙化性能大幅提升。

Description

改性生物材料的制备方法及得到的改性生物材料

技术领域

本发明涉及生物医用材料技术领域，进一步涉及一种改性生物材料的制备方法及得到的改性生物材料。

背景技术

心血管疾病是世界范围内的头号健康杀手。我国心血管疾病患者目前已接近3亿人。据不完全统计，每年约300万人因心血管疾病而死亡，占所有疾病致死总人数的45％。临床上，常见的心血管疾病主要包括冠心病和心脏瓣膜疾病。心脏瓣膜疾病是我国常见的一种心脏病，其中，以风湿热导致的瓣膜损害最为常见。随着人口老龄化加重，老年性瓣膜病以及冠心病、心肌梗死后引起的心脏瓣膜疾病变也越来越常见。

据流行病学调查统计，我国心脏瓣膜病的发病率为2.5％-3.2％，其中超过75岁的老年人瓣膜性心脏病的发病率高达13.3％。对于症状轻微的瓣膜性心脏病可以采用药物治疗，但是对于重度情况，只能采取手术的办法更换瓣膜。

传统的外科手术要进行开胸，同时需要心脏停跳，建立体外循环系统，这类手术创伤大，后期恢复时间长，不是所有的患者(特别是老年患者)都可以耐受。经导管主动脉置换术(TAVR)，通过在股动脉或其他合适的血管上穿刺，利用输送系统将生物瓣膜输送到病变的主动脉瓣处，其属于微创手术，手术创伤小，手术过程短、术后恢复快。

目前TAVR置换术已成为心血管疾病治疗最为有效的手段和主流趋势。生物瓣膜相较于传统的机械瓣膜，更适用于年龄较大的患者，具有流动力学好、抗凝相关并发症低、患者术后生活质量高等优点。但是现有的生物瓣膜容易钙化致其使用寿命有限，影响市场推广。

本领域常用戊二醛对生物材料进行表面化学处理(戊二醛作为交联剂，使生物材料的表面接枝大分子或基团)，促使生物材料中的胶原分子交联，并进而降低生物材料的免疫原性，提高其稳定性和耐久性。但是经戊二醛处理后的生物材料因残留的戊二醛易水解且戊二醛具有毒性，从而使得生物材料易钙化，因此生物材料的寿命不能得到提高，且戊二醛本身具有一定的毒性，这都给戊二醛及生物材料的应用造成很大的困扰。

发明内容

针对现有技术戊二醛交联处理的生物材料易钙化的技术问题，本发明的目的在于提供一种新的制备改性生物材料的方法。

本发明的制备改性生物材料的方法依次包括如下步骤：

S1、漂洗步骤，所述漂洗步骤是指采用生理盐水漂洗所述生物材料；例如漂洗2～3次；

S2、表面改性步骤，所述表面改性步骤是指采用低温等离子体对所述生物材料进行表面改性；

S3、交联处理步骤，所述交联处理步骤是指采用戊二醛对所述生物材料进行交联处理，得到改性生物材料。

进一步的，所述表面改性步骤采用低温等离子设备进行表面改性，低温等离子设备可为市售的等离子体装置，包括低频或中频高压电晕放电或频辉光放电。优选的，所述的等离子体设备选择低频或中频高压电晕放电设备。

进一步的说，所述表面改性步骤的反应条件为：压力为5-200Pa，如8Pa、80Pa、100Pa等；放电功率为10-500W，如15W、100W、300W等等；处理时间为5-90min，如10min、50min、80min。优选地，所述低温等离子体处理生物材料的反应条件为：压力为10-50Pa，如20Pa、40Pa；放电功率为20-50W，如30W、40W等；处理时间为20-40min，如30min等。

进一步的说，所述表面改性步骤采用的低温等离子体是指二氧化硫、氨气、氧气、空气和水中的一种或者几种气体的等离子体，低温等离子设备采用的工作气体为氮气、二氧化硫、氨气、氧气、空气和水中的一种或者几种。

进一步的说，所述交联处理步骤是指生物材料浸泡于戊二醛溶液中进行浸泡，浸泡温度为20-45℃，浸泡时间为1-100h；戊二醛溶液的pH值为6.5-8.5。

进一步的说，所述交联处理步骤中戊二醛溶液的质量分数为0.05％-0.3％，如0.1％、0.2％、0.3％等。

所述交联处理步骤，将经过低温等离子体处理后的生物材料浸泡于浓度为0.05-0.3％的戊二醛溶液浓度中，且在戊二醛溶液中的温度为20-45℃下交联处理1-100小时；优选的，交联时间为1-24小时，更优选的交联时间为3-15小时，如4小时、5小时，8小时、10小时、12小时等。其中，戊二醛溶液的pH值为6.5-8.5，如6.8、7.2、8.2等，优选为pH值为7-8。

进一步的说，所述生物材料可以为心包、瓣膜、脑硬膜、肠粘膜、真皮、韧带、肌腱、巩膜、血管和带瓣管道中的一种或几种。

本发明的另一目的在于提供一种改性生物材料，本发明的改性生物材料采用本发明所述的方法制备得到。

进一步地说，所述改性生物材料是指具有抗钙化的改性生物材料。

与现有的技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明通过在交联改性步骤之前增加对生物材料进行表面改性步骤，使用同样量或更低量的戊二醛，即可保证交联效果，同时降低戊二醛的残留量，既发挥了戊二醛交联改性的优势，同时因降低戊二醛残留量而降低了戊二醛的毒性等危害。

2、低温等离子体对生物材料的胶原纤维表面进行改性，提高其活性，增加了交联位点，使得更多的单点结合趋向多点结合，减少醛基残留，提高生物材料的抗钙化性。

本发明通过使用低温等离子体对生物材料引入活性基团，使生物材料表面的胶原蛋白分子的活化位点增多，降低了生物材料的活化能，大大提高了与戊二醛的结合能力，以及交联过程中戊二醛的转化率。因此，使用本发明提供的制备改性生物材料的方法，为达到相同的交联效果，只需加入更低浓度、更少量的戊二醛，改性后生物材料中残余的戊二醛含量也明显降低，减少了戊二醛对生物材料的毒性。另外，由于低温等离子体处理大大提高了戊二醛与胶原纤维的双点或多点结合，有效减少了改性后生物材料内的羧基，改性后生物材料的抗钙化性能大幅提升。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

等离子体是继固态、液态、气态之后的物质第四态，当外加电压达到击穿电压时，气体分子被电离，产生包括电子、离子、原子和原子团在内的混合体。利用等离子体对蛋白生物材料表面进行改性可以在材料表面引入新的活性基团或者通过接枝的方式引入新的官能团。

实施例1

首先用浓度为质量分数为0.9％的生理盐水漂洗新鲜的牛心包N＝2次，对牛心包进行预处理。然后在压力为P＝100Pa，放电功率为W＝200W，氨气氛围条件下用低温等离子体处理经预处理的牛心包t₁＝60min。最后T＝常温条件下在于质量分数为C＝0.3％，pH值＝6.5的戊二醛溶液中浸泡t₂＝12h，使戊二醛溶液与经低温等离子体处理的牛心包发生交联反应。

实施例2

选择新鲜的牛心包，将新鲜的牛心包经过生理盐水漂洗3次，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将牛心包放入低温等离子体设备中，在氧气氛围下，设定压力为80Pa，放电功率是200W，处理时间为10min。

将经过低温等离子体改性处理后的牛心包浸泡于质量浓度为0.1％的戊二醛溶液中，浸泡温度为30℃，交联时间为3h，其中戊二醛溶液的pH为6.8。

实施例3

选择新鲜的牛心包将新鲜的牛心包经过生理盐水漂洗，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将牛心包放入低温等离子体设备中，设定压力为80Pa，放电功率是300W，处理时间为10min。

将经过低温等离子体改性处理后的牛心包浸泡于浓度为0.2％的戊二醛溶液浓度中，浸泡温度为45℃，交联时间为72h，其中戊二醛溶液的pH为8.5。

实施例4

选择新鲜的牛心包将新鲜的牛心包经过生理盐水漂洗，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将牛心包放入低温等离子体设备中，设定压力为20Pa，放电功率是15W，处理时间为10min。

将经过低温等离子体改性处理后的牛心包浸泡于浓度为0.3％的戊二醛溶液浓度中，浸泡温度为25℃，交联时间为3h，其中戊二醛溶液的pH为7.3。

实施例5

选择新鲜的猪脑硬膜，将新鲜的猪脑硬膜经过生理盐水漂洗2次，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将猪脑硬膜放入低温等离子体设备中，设定压力为20Pa，放电功率是15W，处理时间为90min。

将经过低温等离子体改性处理后的猪脑硬膜浸泡于质量浓度为0.3％的戊二醛溶液中，浸泡温度为25℃，交联时间为100h，其中戊二醛溶液的pH为7.3。

实施例6

选择新鲜的带瓣管道，将新鲜的带瓣管道经过生理盐水漂洗3次，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将带瓣管道放入低温等离子体设备中，设定压力为50Pa，放电功率是15W，处理时间为40min。

将经过低温等离子体改性处理后的牛心包浸泡于质量浓度为0.5％的戊二醛溶液中，浸泡温度为45℃，交联时间为3h，其中戊二醛溶液的pH为7.3。

相应的，本实施例还提供一种耐折弯的干燥生物心脏瓣膜，其中生物心脏瓣膜基于一种耐折弯的干燥生物心脏瓣膜的制备方法制备得到的。

对比实施例

选择新鲜的牛心包，将新鲜的牛心包经过生理盐水漂洗，去除表面的脂肪纤维等杂质后，将牛心包浸泡于浓度为0.5％的戊二醛溶液浓度中，浸泡温度为45℃，交联时间为50h，其中戊二醛溶液的pH为8.6。

表1实施例1～6以及对比实施例的工艺参数

改性后生物材料的性能测试：

1、钙含量的测试

采用动物模型来评估经本发明提供的制备方法改性后的生物材料的钙化的情况。选择10周龄，体重为300-400g/只的SD大鼠进行皮下植入，两个皮下袋平行于大鼠背中线，并位于背中线的两侧。将实施例1～6制备得到的改性生物材料裁剪成1cm×1cm的小片植入一侧皮下袋中，另一侧皮下袋植入对比实施例制备得到的牛心包作为对照组。每个实施例设定10个平行实验组，为期共60天。

实验大鼠喂养60天后拉颈处死，取出包埋在皮下的生物材料，去离子水充分漂洗，烘干(80℃，48小时)，采用原子吸收光谱法测定经改性的生物材料中的钙的含量，计算每毫克干重经改性的生物材料中钙的含量。

仪器型号为：Perkin Elmer公司AA800火焰+石墨炉一体化原子吸收光谱仪。

检测条件为：

波长422.7nm空气流量8L/min乙炔流程1700mL/min灯电流2.0mA

狭缝宽度0.6mm燃烧器高度6mm

每实施例取检测数据的平均值，根据检测的吸光度数据按照如下公式计算生物材料的钙含量，钙含量数据如表2所示。

C/C0＝A/A0

其中，C代表生物材料中钙剩余的浓度，C0代表钙的初始浓度。相对应的，A代表植入生物体内后生物材料中钙的吸光度，而A0代表对照组也就是初始样品所测得的吸光度。

实验数据以

表示，采用配对t检验，由统计软件SPSS10.0完成统计分析。

表2植入后生物材料的钙含量(μg Ca/mg生物材料干重)

由表2可知，相对于对照组，经过本发明提供的制备方法处理的生物材料，植入生物体内同样的时间后，钙含量比未经等离子体改性的心包钙含量低约40％。

2、交联反应后溶液中戊二醛的浓度

采用高效液相色谱法测试本发明实施例1～6及对比实施例交联反应之后溶液中戊二醛的浓度，检测和计算方法采用辽宁师范大学学报(自然科学版)2003年，26卷1期《气相色谱法定量分析戊二醛的含量》所述方法检测和计算，结果如表3所示：

表3、交联反应后溶液中戊二醛的浓度(％)

由表3可知，经过本发明提供的方法处理制备生物材料，与戊二醛交联后，溶液中残留的戊二醛含量更低，仅为对比实施例中戊二醛浓度的22％，残留溶液中戊二醛浓度降低，对应的，采用本发明提供的制备方法得到的改性生物材料中戊二醛的浓度也会降低。

残留戊二醛的含量降低，一方面在生物材料被植入生物体后，可以降低戊二醛对生物体的毒性，减少细胞死亡数量，那么生物材料所在环境中游离的失活细胞碎屑就相应减少，其作为晶核吸引钙离子团聚的可能性也进一步降低。

另一方面，在戊二醛残留量降低的情况下，其水解生成的羧基量也会明显降低，改性后的生物材料所在环境的电负性减弱，吸引钙离子的能力也相应减弱，产生钙沉积的可能性就会明显降低，并最终延长了生物材料的使用寿命。

3、改性后生物材料的热皱缩温度

取实施例1～6及对比实施例制备得到的改性生物材料，每组试片切成10cm×50cm大小，用蒸馏水冲洗后，将试片平直插入皮革温度仪的上下挂钩中，另一端系3g重物，以蒸馏水为介质，从室温开始加热，每分钟升高2℃，以试片开始收缩、指针发生偏转作为其热皱缩温度，结果如表4所示。

表4、交联反应后生物材料的热皱缩温度(℃)

热皱缩温度可以表征生物材料的交联的程度，温度越高则交联的程度越大。由表4可知，采用本发明的制备方法得到的改性生物材料，热皱缩温度比采用普通的戊二醛交联得到的改性生物材料高5℃以上，说明采用本发明的方法制备得到的改性生物材料的交联程度更高，能更好的抑制生物材料的钙化。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (10)

1.一种改性生物材料的制备方法，所述方法包括交联处理步骤，所述交联处理步骤为采用戊二醛对所述生物材料进行交联处理，得到改性生物材料；其特征在于：所述方法还包括在所述交联处理步骤之前的表面改性步骤，所述表面改性步骤采用低温等离子体对所述生物材料进行表面改性。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述方法还包括在所述表面改性步骤之前的漂洗步骤，所述漂洗步骤采用生理盐水漂洗所述生物材料。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述表面改性步骤采用低频或中频高压电晕放电和低气压高频辉光放电的低温等离子设备进行表面改性。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述表面改性步骤的条件为：压力为5-200Pa；放电功率为10-500W；处理时间为5-90min。

5.根据权利要求4所述的抗钙化方法，其特征在于，所述表面改性步骤采用的低温等离子体是指氮气、二氧化硫、氨气、氧气、空气和水中的一种或者几种气体的等离子体。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联处理步骤是指在20-45℃条件下，优选地，交联温度为25-35℃；将所述生物材料浸泡于戊二醛溶液中1-100h，优选地，浸泡时间为1-24h；戊二醛溶液的pH值为6.5-8.5。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联处理步骤采用戊二醛溶液对所述生物材料进行交联处理，所述戊二醛溶液的质量分数为0.05％-0.3％，优选的戊二醛溶液的质量分数是0.1％-0.2％。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的生物材料为：心包、瓣膜、脑硬膜、肠粘膜、真皮、韧带、肌腱、巩膜、血管和带瓣管道中的一种或几种。

9.一种改性生物材料，其特征在于：采用权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。

10.根据权利要求9所述的改性生物材料，其特征在于，所述改性生物材料是指具有抗钙化的改性生物材料。