CN113481267A - 一种抗菌肽发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：1)摇瓶培养：将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1‑10％，在28‑35℃，摇床转速150‑300r/min的条件下，培养24‑72h，得到摇瓶种子；2)发酵罐培养：将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为1‑10％，在28‑35℃，搅拌速度150‑300r/min，罐压0.03‑0.10MPa，且持续通入空气流量20‑50m3/h的条件下，培养24‑96h，再将发酵液在100℃下加热15min，得到抗菌肽成品。本发明工艺过程简单，发酵周期短，制得的抗菌肽效价较高，且生产成本低，适应于大规模生产应用，经济效益好，能够在商业上获得成功。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种抗菌肽发酵工艺。
背景技术
为提高消费者对畜牧产品的信赖，我国2020年12月31日全面禁止在动物饲料中添加抗生素。
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽,这类活性多肽多数具有碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。与抗生素相比，对人和动物正常细胞无伤害，无副作用、无残留，在医药抗菌领域、食品防腐保鲜领域以及饲料添加剂领域中有着广阔的应用前景。
但是，目前抗菌肽发酵培养基在工业化生产过程中存在很多问题，如生产成本高，抗菌肽与培养基组分不易分离，发酵过程中产生的气泡使发酵过程不易控制，培养基中存在不溶性成分导致消毒困难，以及发酵周期较长等问题，因此培养基的问题成为长期以来制约抗菌肽大规模应用的一个障碍。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种抗菌肽发酵工艺，有效解决抗菌肽发酵培养基在工业化生产过程中存在的生产成本高，生产过程容易产生气泡，生产批次质量不稳定，以及发酵周期较长、效率低等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1-10％，在28-35℃，摇床转速150-300r/min的条件下，培养24-72h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为1-10％，在28-35℃，搅拌速度150-300r/min，罐压0.03-0.10MPa，且持续通入空气流量20-50m3/h的条件下，培养24-96h，再将发酵液在100℃下加热15min，得到抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L和食盐7.5-10.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨8-12g/L、玉米粉2.4-3.4g/L、豆粕2-3.6g/L、酵母提取物4.5-6g/L、食盐7.5-10.5g/L、硫酸铵0.36-0.5g/L和硫酸镁0.03-0.07g/L，且初始pH为6.5-8.5。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，步骤1)中，锥形瓶中的培养液接种前，在121℃的条件下，维持30min灭菌。
进一步，步骤2)中，发酵罐中的培养液接种前，在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌。
进一步，步骤2)中，发酵罐中的培养液通过添加氢氧化钠调节初始pH。
进一步，步骤1)中，抗菌肽为鱼类抗菌肽或虾类抗菌肽。
进一步，步骤1)中，抗菌肽菌种为枯草芽孢杆菌，且其保藏编号为CCTCC NO.M2020057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
进一步，所述抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为5-10％，在32-35℃，摇床转速190-270r/min的条件下，培养24-48h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为5-10％，在31-35℃，搅拌速度150-230r/min，罐压0.03-0.06MPa，且持续通入空气流量30-40m3/h的条件下，培养42-78h，再将发酵液在100℃下加热15min，得到抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨10-12g/L、酵母提取物5-6g/L和食盐9-10.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨9-11g/L、玉米粉3.0-3.4g/L、豆粕2.8-3.6g/L、酵母提取物5.2-6g/L、食盐8.5-9.5g/L、硫酸铵0.43-0.5g/L和硫酸镁0.05-0.07g/L，且初始pH为7-8。
进一步，培养液中的蛋白胨由鸡骨蛋白胨和牛骨蛋白胨以质量比1:1混合打粉制成。
本发明的有益效果是：
1)培养液采用的组分水溶性好，便于灭菌，且不易产生气泡；
2)发酵过程易于控制，生产批次质量稳定性高，有利于抗菌肽收集处理；
3)工艺过程简单，便于操作，发酵周期短，且生产成本低，适应于大规模生产应用；
4)本发明制得的抗菌肽效价较高，可用于工业化生产，且生产成本显著降低，经济效益好，能够在商业上获得成功。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
需要说明的是，本发明适用于鱼类抗菌肽及虾类抗菌肽，例如罗非鱼抗菌肽、鲈鱼抗菌肽等。本发明实施例1-5及对比例1和2中的抗菌他菌种均为枯草芽孢杆菌，且其保藏编号为CCTCC NO.M 2020057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。此外，发酵罐中的培养液通过添加氢氧化钠调节初始pH。
实施例1
本实施例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置3L培养液，平均分装在10个1L的锥形瓶中(每瓶装量300ml)，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至32℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为10％，然后在32℃，摇床转速270r/min的条件下，培养24h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置27L培养液于50L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至33℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为10％)，然后在33℃，搅拌速度230r/min，罐压0.03MPa，且持续通入空气流量40m3/h的条件下，培养42h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨12g/L、酵母提取物5g/L和食盐9g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨9g/L、玉米粉3.2g/L、豆粕3.6g/L、酵母提取物5.2g/L、食盐9.5g/L、硫酸铵0.46g/L和硫酸镁0.06g/L，且初始pH为7.5。
本实施例所述培养液中的蛋白胨由鸡骨蛋白胨和牛骨蛋白胨以质量比1:1混合打粉制成。
本实施例发酵罐中的培养液采用以鸡骨及牛骨为原料所制备的蛋白胨为主，鸡骨及牛骨所制蛋白胨每吨厂家直销价7500元，再以玉米粉、豆粕等常规较为便宜的配料为辅，最后添加少量的其他营养成分，从而大大降低了生产成本，并且可溶性好，在生产过程中也不易产生泡沫，便于后续工艺上的操作。
实施例2
本实施例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置1.5L培养液，平均分装在5个1L的锥形瓶中(每瓶装量300ml)，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至33℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为5％，然后在33℃，摇床转速190r/min的条件下，培养48h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置28.5L培养液于50L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至31℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为5％)，然后在31℃，搅拌速度150r/min，罐压0.06MPa，且持续通入空气流量30m3/h的条件下，培养78h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨10g/L、酵母提取物6g/L和食盐10.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨10g/L、玉米粉3.4g/L、豆粕2.8g/L、酵母提取物5.6g/L、食盐8.5g/L、硫酸铵0.5g/L和硫酸镁0.05g/L，且初始pH为7。
本实施例所述培养液中的蛋白胨由鸡骨蛋白胨和牛骨蛋白胨以质量比1:1混合打粉制成。
实施例3
本实施例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置0.3L培养液于1L的锥形瓶中，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至28℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1％，然后在28℃，摇床转速150r/min的条件下，培养72h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置29.7L培养液于50L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至30℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为1％)，然后在30℃，搅拌速度270r/min，罐压0.10MPa，且持续通入空气流量20m3/h的条件下，培养96h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨8g/L、酵母提取物5g/L和食盐8.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨8g/L、玉米粉2.7g/L、豆粕2g/L、酵母提取物4.8g/L、食盐7.5g/L、硫酸铵0.36g/L和硫酸镁0.04g/L，且初始pH为8.5。
本实施例所述培养液中的蛋白胨为鸡骨蛋白胨。
实施例4
本实施例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置3L培养液，平均分装在10个1L的锥形瓶中(每瓶装量300ml)，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至35℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为10％，然后在35℃，摇床转速230r/min的条件下，培养36h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置57L培养液于100L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至35℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为5％)，然后在35℃，搅拌速度190r/min，罐压0.05MPa，且持续通入空气流量30m3/h的条件下，培养60h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨11g/L、酵母提取物6g/L和食盐9.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨11g/L、玉米粉3g/L、豆粕3.2g/L、酵母提取物6g/L、食盐9g/L、硫酸铵0.43g/L和硫酸镁0.07g/L，且初始pH为8。
本实施例所述培养液中的蛋白胨由鸡骨蛋白胨和牛骨蛋白胨以质量比1:1混合打粉制成。
实施例5
本实施例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置3L培养液，平均分装在10个1L的锥形瓶中(每瓶装量300ml)，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至30℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1％，然后在30℃，摇床转速300r/min的条件下，培养60h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置57L培养液于100L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至28℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为5％)，然后在28℃，搅拌速度300r/min，罐压0.08MPa，且持续通入空气流量50m3/h的条件下，培养24h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨9g/L、酵母提取物4g/L和食盐7.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨12g/L、玉米粉2.4g/L、豆粕2.4g/L、酵母提取物4.5g/L、食盐10.5g/L、硫酸铵0.4g/L和硫酸镁0.03g/L，且初始pH为6.5。
本实施例所述培养液中的蛋白胨为牛骨蛋白胨。
对比例1
本对比例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置3L培养液，平均分装在10个1L的锥形瓶中(每瓶装量300ml)，装好后在110℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至38℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为10％，然后在38℃，摇床转速120r/min的条件下，培养20h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置27L培养液于50L发酵罐中，装好后在110℃，罐压0.08MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至38℃时将摇瓶种子接入发酵罐中(接种量为10％)，然后在38℃，搅拌速度120r/min，罐压0.13MPa，且持续通入空气流量10m3/h的条件下，培养42h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨7g/L、酵母提取物3g/L和食盐7g/L；发酵罐中的培养液含葡萄糖10g/L、蛋白胨2g/L、玉米粉3.6g/L、豆粕4g/L、酵母提取物4g/L、食盐11g/L、硫酸铵0.3g/L和硫酸镁0.02g/L，且初始pH为6。
对比例2
本对比例所设计的一种抗菌肽发酵工艺，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：首先配置0.3L培养液于1L的锥形瓶中，装好后在121℃的条件下，维持30min灭菌，冷却至26℃时将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1％，然后在26℃，摇床转速320r/min的条件下，培养75h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：首先配置29.7L培养液于50L发酵罐中，装好后在121℃，罐压0.03MPa的条件下，维持30min灭菌，冷却至26℃时将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为1％，然后在26℃，搅拌速度320r/min，罐压0.02MPa，且持续通入空气流量60m3/h的条件下，培养20h，即可产生抗菌肽，发酵液在100℃的条件下，维持15min灭活后，即为抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨13g/L、酵母提取物7g/L和食盐11g/L；发酵罐中的培养液含葡萄糖20g/L、玉米粉4g/L、豆粕2g/L、酵母提取物6.5g/L、食盐11g/L、硫酸铵0.3g/L和硫酸镁0.08g/L，且初始pH为9。
对本发明实施例1-5及对比例1和2进行产品效价的检测以及生产成本的计算，所得数据见下表1。
表1
| 序号 | 产品效价(U/ml) | 生产成本(元/L) |
| 实施例1 | 10000 | 0.3 |
| 实施例2 | 9000 | 0.35 |
| 实施例3 | 7200 | 0.45 |
| 实施例4 | 8300 | 0.7 |
| 实施例5 | 7400 | 0.5 |
| 对比例1 | 5900 | 1.7 |
| 对比例2 | 6800 | 2.8 |
通过对表1的分析可知，实施例3的产品效价在5组实施例中是最差的。然而通过对实施例3及对比例1和2的数据对比可知，实施例3的产品效价明显高于对比例1和对比例2。此外，与对比例1和2相比，采用本发明实施例1-5的抗菌肽产品生产成本显著降低。因此，可以确定本发明技术方案具有明显优于对比例1和2的技术效果，本发明的优选方案的技术效果更佳。
采用本发明技术方案的抗菌肽不仅产品效价显著提高(不低于7200U/ml)，而且生产成本显著降低(不高于0.7元/L)，经济效益好，能够在商业上获得成功，此外培养液采用的组分水溶性好，便于灭菌的同时，不易产生气泡，发酵过程易于控制，生产批次质量稳定性高，发酵周期短，适应于大规模生产应用，能够有效解决现有技术中存在的技术问题。
本发明中未对具体技术做出描述的均为现有技术。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种抗菌肽发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为1-10％，在28-35℃，摇床转速150-300r/min的条件下，培养24-72h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为1-10％，在28-35℃，搅拌速度150-300r/min，罐压0.03-0.10MPa，且持续通入空气流量20-50m3/h的条件下，培养24-96h，再将发酵液在100℃下加热15min，得到抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨8-12g/L、酵母提取物4-6g/L和食盐7.5-10.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨8-12g/L、玉米粉2.4-3.4g/L、豆粕2-3.6g/L、酵母提取物4.5-6g/L、食盐7.5-10.5g/L、硫酸铵0.36-0.5g/L和硫酸镁0.03-0.07g/L，且初始pH为6.5-8.5。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，步骤1)中，锥形瓶中的培养液接种前，在121℃的条件下，维持30min灭菌。
3.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，步骤2)中，发酵罐中的培养液接种前，在121℃，罐压0.05MPa的条件下，维持30min灭菌。
4.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，步骤2)中，发酵罐中的培养液通过添加氢氧化钠调节初始pH。
5.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，步骤1)中，抗菌肽为鱼类抗菌肽或虾类抗菌肽。
6.根据权利要求1或5所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，步骤1)中，抗菌肽菌种为枯草芽孢杆菌，且其保藏编号为CCTCC NO.M 2020057，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。
7.根据权利要求6所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，包括以下步骤：
1)摇瓶培养：将抗菌肽菌种接入锥形瓶中，接种量为5-10％，在32-35℃，摇床转速190-270r/min的条件下，培养24-48h，得到摇瓶种子；
2)发酵罐培养：将摇瓶种子接入发酵罐中，接种量为5-10％，在31-35℃，搅拌速度150-230r/min，罐压0.03-0.06MPa，且持续通入空气流量30-40m3/h的条件下，培养42-78h，再将发酵液在100℃下加热15min，得到抗菌肽成品；
其中，锥形瓶中的培养液含蛋白胨10-12g/L、酵母提取物5-6g/L和食盐9-10.5g/L；发酵罐中的培养液含蛋白胨9-11g/L、玉米粉3.0-3.4g/L、豆粕2.8-3.6g/L、酵母提取物5.2-6g/L、食盐8.5-9.5g/L、硫酸铵0.43-0.5g/L和硫酸镁0.05-0.07g/L，且初始pH为7-8。
8.根据权利要求1所述的抗菌肽发酵工艺，其特征在于，培养液中的蛋白胨由鸡骨蛋白胨和牛骨蛋白胨以质量比1:1混合打粉制成。
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| CN106282275A (zh) * | 2016-08-15 | 2017-01-04 | 河南仰韶生化工程有限公司 | 一种抗菌肽的制备方法 |
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| CN111733117A (zh) * | 2020-08-17 | 2020-10-02 | 中国科学院烟台海岸带研究所 | 一株产抗菌肽的海洋芽孢杆菌及其发酵方法和应用 |
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2021
- 2021-07-05 CN CN202110754478.3A patent/CN113481267A/zh active Pending
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