CN113462594A - 一株产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属qnx-s26菌株及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属QNX‑S26菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年6月7日，保藏编号为：CCTCC NO:M2021692；该菌株的16S rDNA序列如SEQ IDNO.1所示。上述克吕沃尔氏菌属QNX‑S26菌株能够用于发酵制备石杉碱乙，本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决石杉碱乙成本较高、市场需求缺口大的现状。

Description

一株产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株及用途

技术领域

本发明涉及一种克吕沃尔氏菌属菌株，该菌株可产石杉碱乙，属于微生物技术领域。

背景技术

目前植物内生菌的研究逐渐受到重视，不同植物的各种内生菌相继被发现。内生菌 种类的多样性也赋予了其代谢产物的多样性，这也预示着利用内生菌代谢发掘生物、化学、医药等新资源具有巨大的潜力。大量研究表明，植物内生菌可产生与宿主植物相同 或相似的活性物质及前体，这一发现直接推动了植物内生菌尤其是药用植物内生菌研究 的广泛展开。随着人们对药用植物内生菌的逐步研究，利用能够代谢产生相应活性成分 的内生菌来生产新型、高效、低成本的活性药物，解决珍稀中药植物资源紧缺的现状， 必将成为将来药用植物内生菌研究的重点。

蛇足石杉中的药用活性成分石杉碱甲(Huperzine A，HupA)和石杉碱乙(Huperzine B，HupB)是一种低毒、高效抑制乙酰胆碱酯酶(AChE)的药物，其中石杉碱甲/乙对 治疗“阿尔茨海默症(老年痴呆症)”(Alzaheimer disease，AD)有很好的疗效。然而， 由于蛇足石杉植物资源匮乏且生长缓慢、石杉碱甲/乙含量很低等原因，仅依靠从蛇足石 杉提取石杉碱甲、石杉碱乙无法满足市场需求。而且，人工化学合成的石杉碱甲/乙的活 性远低于天然石杉碱甲/乙，且得到强生物活性的石杉碱甲/乙成本较高。利用内生菌发 酵生产石杉碱甲/乙是解决其药源紧缺问题的重要途径之一。目前本领域中有一些产石杉 碱甲/乙的蛇足石杉内生菌的相关报道，但是这些菌株的种类以及产量还是无法满足市场 对于石杉碱甲/乙的需求。

发明内容

本发明解决了背景技术中的问题，提供了一株产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株，该菌株可产石杉碱乙。

本发明人筛选到一株新型菌株，该菌株被命名为QNX-S26，属一种克吕沃尔氏菌(Kluyvera sp.)，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大 学；邮编430072，保藏日期为2021年6月7日，保藏编号为：CCTCC NO:M2021692； 该菌株的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

上述克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株能够用于发酵制备石杉碱乙。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明所提供的克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株能够代谢产生石杉碱乙。本发明提供的菌株可以在短期内进行大规模发酵培养，且 发酵成本较低，又不受时域、季节等条件限制，因此能够通过微生物发酵的途径解决石 杉碱乙成本较高、市场需求缺口大的现状。

附图说明

图1为石杉碱甲/石杉碱乙标准品的第一次HPLC检测图；

图2为克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株的发酵液提取物的第一次HPLC检测图；

图3为石杉碱甲/石杉碱乙标准品的第二次HPLC检测图；

图4为克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株的发酵液提取物的第二次HPLC检测图；

图5为石杉碱乙标准品MS检测图；

图6为克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株的发酵液提取物的MS检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做详细具体的说明，但是本发明的保护范围并不局限 于以下实施例。

菌株的分离、培养

本实施例中将蛇足石杉材料用清水冲洗干净后，再用清水超声10min，分离其根、叶、茎并切割成约4cm小段，依次在0.1％升汞浸泡4min、70％乙醇中浸泡2分钟，5％ 次氯酸钠浸泡5分钟，之后用无菌水多次冲洗，无菌条件下加入适量生理盐水并将植物 材料研磨成匀浆，均匀涂布在不含抗生素的LA平板上，30℃静置培养1-2d。培养过 程中，根据细菌生长情况挑取各新长出的菌落至新的LA培养基，并经过多次平板划线 法分离传代获得各单克隆，编号并保种。

将平板上纯化完成的细菌挑取至装有600μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，封口膜封口，然后于37℃恒温摇床中190r/min摇床培养1d后，加入等体积的50％的甘 油，混匀后于-80℃超低温冰箱中保存，每个菌株至少保存3份。

将保存的菌种取10μL接种到5mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇床150r/min 活化培养24h，按照1％转接量至100mL LB液体培养基(装液量100mL/250mL)， 37℃、150r/min摇床培养7d。经过以上发酵培养后，收集发酵液。

菌株的筛选

本实施例中将上述收集得到的菌株，通过高效液相色谱法(HPLC)初筛和复筛检测各个内生细菌的发酵提取物后，利用质谱法(Mass Spectrometry，MS)进一步确认。 分离得到了一株能够产石杉碱乙的菌株，将其命名为：QNX-S26菌株。

HPLC初筛条件：色谱仪为Agilent1200色谱系统，ODS-C18反相柱(4.6mm×150 mm，5μm，Agilent)，流动相为甲醇：水＝40:60；标准品浓度为5μg/mL，流速为0.5 mL/min，紫外波长设定为310nm，柱温为20℃。石杉碱甲/石杉碱乙标准品的第一次 HPLC检测图如图1所示，QNX-S26菌株的发酵液提取物的HPLC第一次检测结果如图 2所示。从图1和图2中可以看出，QNX-S26菌株的发酵液提取物有与石杉碱乙标准品 (Hup B)出峰时间相同的峰，初步判断其发酵液含有石杉碱乙。

HPLC复筛条件：色谱仪为Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨液质联用仪，流动相为甲醇：水＝30:70，其它条件同HPLC初筛条件。石杉碱甲/石杉碱乙标准品的第二 次HPLC检测图如图3所示，QNX-S26菌株的发酵液提取物的HPLC第二次检测结果 如图4所示。从图3和图4中可以看出，QNX-S26菌株的发酵液提取物有与石杉碱乙 标准品(Hup B)出峰时间相同的峰，进一步确认其发酵液含有石杉碱乙。

质谱分析由中南民族大学药学院测试分析中心采用Q-Exactive四级杆-静电场轨道 阱高分辨液质联用仪完成。石杉碱乙标准品的MS检测图如图5所示，QNX-S26菌株发 酵液提取物中的石杉碱乙的MS检测结果如图6所示。由图5和图6对比可知，两者的 出峰时间和峰值相同，可确认QNX-S26菌株能够通过发酵产生石杉碱乙。

测序及序列比对、分析

将该菌株送某生物技术有限公司测序，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。测序结果在GenBank核酸数据库中进行Blast相似性分析，经Blast序列比对及 进化树分析，确定其为克吕沃尔氏菌属(Kluyvera sp.)。

菌株的保藏：

将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；邮编430072，保藏日期为2021年6月7日，保藏编号为：CCTCC NO:M2021692。

序列表

<110> 中南民族大学

<120> 一株产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株及用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1115

<212> DNA

<213> 克吕沃尔氏菌属(Kluyvera sp.)

<400> 1

ggcgcggcta cacatgcagt cgacggtagc acagagagct tgctctcggg tgacgagtgg 60

cggacgggtg agtaatgtct gggaaactgc ccgatggagg gggataacta ctggaaacgg 120

tagctaatac cgcataacgt cgcaagacca aagtggggga ccttcgggcc tcacaccatc 180

ggatgtgccc agatgggatt agctagtagg tggggtaatg gctcacctag gcgacgatcc 240

ctagctggtc tgagaggatg accagccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac 300

gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc catgccgcgt 360

gtatgaagaa ggccttcggg ttgtaaagta ctttcagcgg ggaggaaggc ggtgaagtta 420

atagcttcac cgattgacgt tacccgcaga agaagcaccg gctaactccg tgccagcagc 480

cgcggtaata cggagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgcacgcagg 540

cggtctgtca agtcggatgt gaaatccccg ggcttaacct gggaactgca ttcgaaactg 600

gcaggctaga gtcttgtaga ggggggtaga attccaggtg tagcggtgaa atgcgtagag 660

atctggagga ataccggtgg cgaaggcggc cccctggaca aagactgacg ctcaggtgcg 720

aaagcgtggg gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccgtaa acgatgtcga 780

cttggaggtt gttcccttga ggagtggctt ccggagctaa cgcgttaagt cgaccgcctg 840

gggagtacgg ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tactcttgac atccacagaa 960

tttagcagag atgctttggt gccttcggga actctgagac aggtgctgca tggctgtcgt 1020

cagctcgtgt tgggaaatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaccctt atcctttgtt 1080

gccagcggtt atgccgggaa ttcaaaggaa atgcc 1115

Claims (2)

1.一株产石杉碱乙的克吕沃尔氏菌属(Kluyvera sp.)QNX-S26菌株，该菌株保藏编号为：CCTCC No:M2021692，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述克吕沃尔氏菌属QNX-S26菌株的用途，其特征在于：用于发酵制备石杉碱乙。

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