CN113461803B - 一种特异性识别巨细胞病毒的t细胞受体及其应用 - Google Patents

一种特异性识别巨细胞病毒的t细胞受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种特异性识别巨细胞病毒的T细胞受体及其应用。所述T细胞受体包含可变区Va和可变区Vβ，所述可变区Va的CDR3的氨基酸序列包括：ILSNNNDMR；所述可变区Vβ的CDR3的氨基酸序列包括：AWSVSDLLNTEAF。本发明提供的T细胞受体可以特异性结合HLA‑A0201递呈巨细胞病毒的pp65495‑503表位，在实际应用时可以特异性地杀伤靶抗原阳性的肿瘤细胞。本发明提供的T细胞受体可以在T细胞中稳定表达，表达水平高，杀伤效率高，在针对CMV病毒的治疗中具有重要意义。

Description

一种特异性识别巨细胞病毒的T细胞受体及其应用
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种特异性识别巨细胞病毒的T细胞受体及其应用。
背景技术
T细胞受体(T cell receptor,TCR)为免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，其与参与调节信号转导的CD3复合物的无变异蛋白相关联。
TCR存在α和β链的形式，其结构上相似但是具有完全不同的解剖学定位和可能的功能。天然异质二聚体α和β链TCR的胞外部分由两条多肽组成，每条多肽具有膜近侧恒定区和膜远侧可变区。每个恒定区和可变区均包括链内二硫键。本文所用的术语“可变区”应理解为包括某给定TCR的所有不包含在TCRα链的TRAC基因或TCR β链的TRBC1或TRBC2基因所编码的恒定区内的氨基酸。可变区含有类似于抗体的互补决定区(complementaritydetermining region, CDR)的高度多态环。本文所使用的术语”特异性”或“抗原特异性”或对指定抗原”特异”指抗原识别构建体能特异性地结合并且免疫地识别所述抗原。过继性细胞免疫治疗(ACT)通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤、抗感染或者治疗自身免疫疾病的目的。在体外利用病毒或者非病毒载体将特定抗原的特异TCR转导进入患者自体T细胞后，进一步在体外将特异性T细胞扩增至 108-109级别后回输至患者体内，以达到治疗目的。
巨细胞病毒(Cytomegalovirus,CMV)是一种疱疹病毒组DNA病毒，由于被感染的细胞会发生肿大，因此被命名为巨细胞病毒。由于 CMV感染的细胞还会形成巨大的核内包涵体，亦被称细胞包涵体病毒。CMV是人类最常见病原体之一，在人群中广泛流行，其在成人群体中的感染率可以高达50％-100％。在免疫系统正常的个体中， CMV的感染后通常不会出现任何临床症状，但是在无症状原发感染后，CMV病毒常常不能被完全清除，而在患者体内形成持续性地潜伏感染。如果携带CMV的个体免疫系统的功能被抑制，如艾滋病发病、器官移植后接受免疫抑制治疗，潜伏的CMV感染再度活化可导致严重甚至致死性疾病。
目前，针对CMV病毒，现有技术通常利用CMV特异性TCR制备 TCR-T细胞，将其回输患者后，则可让CMV再活化的患者获得有效的即时抗病毒能力，清除本次再活的病毒。而接受CMV特异性TCR-T 回输的患者还能获得持久的抗病毒能力，能显著降低随后再活化的机率。此外CMV的感染还可能与部分肿瘤的发病和进展有关。例如，一半的胶质细胞瘤组织中，可以检测到CMV-pp65抗原；初步的临床研究也显示CMV-pp65疫苗可延长脑胶质瘤患者的无进展生存期及总体生存率。因此，靶向CMV-pp65的TCR也有可能应用于治疗CMV相关的恶性肿瘤。
发明内容
为了至少解决一种现有技术存在的技术问题，本发明提供一种特异性识别巨细胞病毒的T细胞受体及其应用。
第一方面，本发明提供一种T细胞受体，所述T细胞受体包含可变区Va和可变区Vβ，所述可变区Va的CDR3的氨基酸序列包括： ILSNNNDMR；所述可变区Vβ的CDR3的氨基酸序列包括： AWSVSDLLNTEAF。
进一步地，所述可变区Va包括如下互补决定区：
CDR1：TISGTDY(SEQ ID NO:1)；CDR2：GLTSN(SEQ ID NO:2)； CDR3：ILSNNNDMR(SEQID NO:3)；所述可变区Vβ包括如下互补决定区：
CDR1：GTSNPN(SEQ ID NO:4)；CDR2：SVGIG(SEQ ID NO:5)； CDR3：AWSVSDLLNTEAF(SEQ ID NO:6)。
进一步地，所述可变区Va包括如SEQ ID NO:7所述的氨基酸序列；和/或，所述可变区Vβ包括如SEQ ID NO:11所述的氨基酸序列。
进一步地，所述可变区Va位于所述T细胞受体的TCR alpha序列，所述TCR alpha序列包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；和/或，所述可变区Vβ位于所述T细胞受体的TCRbeta序列，所述TCR beta序列包括如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
进一步地，所述T细胞受体和巨细胞病毒pp65表位特异性结合。
第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码所述T细胞受体。
进一步地，所述核酸包括：用于编码可变区Va的核苷酸序列SEQ ID NO:9以及用于编码可变区Vβ的核苷酸序列SEQ ID NO:13。
本发明进一步地提供一种生物材料，所述生物材料包含所述核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
进一步地，所述转基因细胞为可以表达特异性结合巨细胞病毒 pp65表位的T细胞受体的T细胞。
本发明进一步提供一种药物组合物，所述药物组合物含有所述T 细胞受体。
本发明进一步提供所述T细胞受体，所述核酸，所述生物材料在制备用于抑制巨细胞病毒的药物或用于检测巨细胞病毒的试剂中的应用
本发明具备如下有益效果：
本发明提供的T细胞受体可以特异性结合巨细胞病毒的pp53位点，在实际应用时杀伤效率达到40％以上。本发明提供的T细胞受体可以在T细胞中稳定表达，表达水平高，杀伤效率高，可以应用于抑制CMV 相关的恶性肿瘤的药物中，在针对CMV病毒的治疗或和CMV病毒相关的治疗中具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的流式细胞术检测和分选HLA-A0201 递呈CMV-pp65495-503特异性T细胞的结果图；
图2为本发明实施例1构建的慢病毒TCR表达载体示意图；
图3为本发明实施例1提供的使用T2细胞系作为递呈抗原肽的靶细胞，比较负载了不同摩尔浓度CMV-pp65495-503多肽后，T2细胞刺激 A9B2 TCR-T细胞表达CD107a的水平和细胞内IFNγ的水平的结果；
图4为本发明实施例2提供的A9B2 TCR-T细胞的杀伤活性和特异性检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施通过如下流程得到针对巨细胞病毒pp65位点的T细胞受体，具体如下：
1、分离pp65特异性T细胞并扩增TCR的可变区序列
(1)利用5M浓度的pp65多肽NLVPMVATV刺激HLA-A0201阳健康志愿者资源捐献的外周血单个核细胞(MC)，促进pp65特异性T细胞克隆活化扩增；
(2)使用抗人CD3、CD8抗体和HLA-A0201呈递CMV-pp65495-503表位四聚体(Tetramer)，染色pp65特异性T细胞(图1)，并利用流式分选细胞仪，分选出CD3+，CD8+和Tetramer阳性的T细胞；
(3)使用cDNA 5’端的快速扩增方法，扩增出该T细胞群中的 TCR beta序列和TCRalpha的可变区序列，并利用测序鉴定序列。
最终得到T细胞受体A9B2 TCR的TCR alpha序列(氨基酸序列为 SEQ ID NO:8，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:10)，TCR be ta序列(氨基酸序列为SEQ ID NO:12，编码基因的核苷酸序列为SE Q ID NO:14)；其中TCR alpha序列包括可变区Va(氨基酸序列为SEQ ID NO:7，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:9)，TCR beta序列包括可变区Vβ(氨基酸序列为SEQ ID NO:11，编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:13)；可变区Va包括如下互补决定区：CDR1a：T ISGTDY；CDR2a：GLTSN；CDR3a：ILSNNNDMR(SEQ ID NO: 1-3)，可变区Vβ包括如下互补决定区：CDR1β：GTSNPN；CDR2β： SVGIG；CDR3β：AWSVSDLLNTEAF(SEQ ID NO:4-6)。
2、构建表达TCR的慢病毒载体及包装制备慢病毒
将TCR beta序列和TCR alpha序列通过能够自剪切的2A序列连接，比如T2A序列。为了能够将上述TCR递送至T细胞中表达，可以使用缺陷型的第三代慢病毒载体进行载体构建，利用能够人源细胞中长期保持转录活性的EF1a等启动子控制(图2)。
3、抗原肽刺激的T细胞活化
(1)构建表达A9B2 TCR的TCR-T细胞：解冻PBMC后，用适量的含100IU/mL rhIL-2的X-VIVO 15培养基，使其密度为1×106/mL。每 2×106细胞加入10L MACS CD3/CD28 T cellTransAct beads(吸取前充分混匀)，培养基为X-VIVO15含有100IU/mL rhIL-2，轻轻混匀，细胞培养箱培养。24小时后离心并倒出上清液以去除磁珠，以1mL含有 100IU/mL rhIL-2的X-VIVO 15培养基重新悬浮，根据细胞总数和测定病毒滴度加入目标慢病毒(以MOI20进行感染)，补培养液至终体积2mL含100IU/mL IL-2的X-VIVO 15中，加入终浓度为10ug/mlpolybrene(添加感染助剂对照实验),平板吊篮于32℃离心2000g离心99mins，离心结束后不要吹打细胞，将感染的细胞放入二氧化碳培养箱中培养24h。定期更换新鲜培养基并调整细胞密度，培养至第12 天。以不含rhIL-2的X-VIVO15培养基重悬,调整细胞密度为 5-10×106/mL，静置于6孔板内24小时后进行后续实验。
(2)利用T2细胞系(HLA-A*0201阳性，TAP1/TAP2缺陷的细胞) 作为抗原递呈细胞，该细胞不能呈递细胞内表达的内源肽，因此可以有效结合并递呈外源性抗原肽。利用不同浓度的CMV-pp65495-503肽负载T2细胞，可以获得细胞表面具有不同肽浓度的T2细胞。将其与TCR-T细胞共同培养时，呈递不同浓度抗原肽的细胞对TCR的刺激强度不同。而具有不同亲和力级别的TCR对于不同肽浓度的反应也有显著差异。利用浓度为-5M至-10M的CMV-pp65495-503肽负载T2细胞刺激表达A9B2 TCR的TCR-T细胞8小时。
(3)利用人源CD107a和IFNγ特异性抗体染色肽负载T2细胞刺激后的A9B2 TCR的TCR-T细胞，分析不同浓度抗原体活化A9B2 TCR-T的能力。结果如图3所示：A9B2 TCR可以被从-5M至-8M的多肽有效激活，提示A9B2 TCR对CMV-pp65495-503肽具有非常高的亲和力，-8M的多肽负载细胞即可显著地激活表达本发明TCR的T细胞。
实施例2
本实施例对实施例1得到A9B2 TCR的抗原特异性杀伤活性进行检测，具体流程如下：
(1)利用表达Firefly Luciferase(荧光素酶)的慢病毒转导利用 A0201+的HCT116、Caski和A375细胞和A0201-的Hela、A549和Huh7 细胞，并筛选获得稳定表达的细胞系。
(2)构建能够表达CMV-pp65蛋白的慢病毒载体，利用上述载体包装制备慢病毒后，在稳定表达Firefly Luciferase的A0201+的HCT116、 Caski和A375细胞和A0201-的Hela、A549和Huh7细胞中，构建能够稳定表达CMV-pp65蛋白的细胞系或者转导空载体的对照细胞系。
(3)为了评估A9B2 TCR的抗原特异性杀伤活性，将表达A9B2 TCR的TCR-T细胞与上述的细胞系按照效靶比5:1的比例共同培养8个小时后，添加Luciferase底物并使用多功能酶标仪，直接读取残余活细胞中荧光素酶的活力水平，并换算为靶细胞被杀伤的比例。
结果如图4所示：A9B2 TCR能够特异性杀伤表达CMV-pp65抗原的A0201+细胞系，而不杀伤不表达CMV-pp65抗原的A0201+细胞系；也不杀伤A0201-的细胞系，无论其是否表达CMV-pp65抗原。证明 A9B2 TCR对靶细胞的杀伤具有高度的HLA和抗原特异性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 北京可瑞生物科技有限公司
<120> 一种特异性识别巨细胞病毒的T细胞受体及其应用
<130> KHP201116747.9
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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accacacagc caaattcaat ggagagtaac gaagaagagc ctgttcactt gccttgtaac 120
cactccacaa tcagtggaac tgattacata cattggtatc gacagcttcc ctcccagggt 180
ccagagtacg tgattcatgg tcttacaagc aatgtgaaca acagaatggc ctctctggca 240
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gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac 600
gccttcaaca acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccaga aagttcctgt 660
gatgtcaagc tggtcgagaa aagctttgaa acagatacga acctaaactt tcaaaacctg 720
tcagtgattg ggttccgaat cctcctcctg aaagtggccg ggtttaatct gctcatgacg 780
ctgcggctgt ggtccagc 798
<210> 11
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly
1 5 10 15
Val Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro
20 25 30
Val Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn
35 40 45
Pro Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln
65 70 75 80
Asn Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser
85 90 95
Lys Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser
100 105 110
Val Ser Asp Leu Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Val
130
<210> 12
<211> 309
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Met Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu Leu Leu Gly Thr Phe Phe Gly
1 5 10 15
Val Arg Ser Gln Thr Ile His Gln Trp Pro Ala Thr Leu Val Gln Pro
20 25 30
Val Gly Ser Pro Leu Ser Leu Glu Cys Thr Val Glu Gly Thr Ser Asn
35 40 45
Pro Asn Leu Tyr Trp Tyr Arg Gln Ala Ala Gly Arg Gly Leu Gln Leu
50 55 60
Leu Phe Tyr Ser Val Gly Ile Gly Gln Ile Ser Ser Glu Val Pro Gln
65 70 75 80
Asn Leu Ser Ala Ser Arg Pro Gln Asp Arg Gln Phe Ile Leu Ser Ser
85 90 95
Lys Lys Leu Leu Leu Ser Asp Ser Gly Phe Tyr Leu Cys Ala Trp Ser
100 105 110
Val Ser Asp Leu Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Phe
305
<210> 13
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atgatgctct gctctctcct tgcccttctc ctgggcactt tctttggggt cagatctcag 60
actattcatc aatggccagc gaccctggtg cagcctgtgg gcagcccgct ctctctggag 120
tgcactgtgg agggaacatc aaaccccaac ctatactggt accgacaggc tgcaggcagg 180
ggcctccagc tgctcttcta ctccgttggt attggccaga tcagctctga ggtgccccag 240
aatctctcag cctccagacc ccaggaccgg cagttcatcc tgagttctaa gaagctcctt 300
ctcagtgact ctggcttcta tctctgtgcc tggagtgtaa gtgatttact gaacactgaa 360
gctttctttg gacaaggcac cagactcaca gttgta 396
<210> 14
<211> 927
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
atgatgctct gctctctcct tgcccttctc ctgggcactt tctttggggt cagatctcag 60
actattcatc aatggccagc gaccctggtg cagcctgtgg gcagcccgct ctctctggag 120
tgcactgtgg agggaacatc aaaccccaac ctatactggt accgacaggc tgcaggcagg 180
ggcctccagc tgctcttcta ctccgttggt attggccaga tcagctctga ggtgccccag 240
aatctctcag cctccagacc ccaggaccgg cagttcatcc tgagttctaa gaagctcctt 300
ctcagtgact ctggcttcta tctctgtgcc tggagtgtaa gtgatttact gaacactgaa 360
gctttctttg gacaaggcac cagactcaca gttgtagagg acctgaacaa ggtgttccca 420
cccgaggtcg ctgtgtttga gccatcagaa gcagagatct cccacaccca aaaggccaca 480
ctggtgtgcc tggccacagg cttcttcccc gaccacgtgg agctgagctg gtgggtgaat 540
gggaaggagg tgcacagtgg ggtcagcacg gacccgcagc ccctcaagga gcagcccgcc 600
ctcaatgact ccagatactg cctgagcagc cgcctgaggg tctcggccac cttctggcag 660
aacccccgca accacttccg ctgtcaagtc cagttctacg ggctctcgga gaatgacgag 720
tggacccagg atagggccaa acccgtcacc cagatcgtca gcgccgaggc ctggggtaga 780
gcagactgtg gctttacctc ggtgtcctac cagcaagggg tcctgtctgc caccatcctc 840
tatgagatcc tgctagggaa ggccaccctg tatgctgtgc tggtcagcgc ccttgtgttg 900
atggccatgg tcaagagaaa ggatttc 927

Claims (9)

1.一种T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体包含可变区Va和可变区Vβ，所述可变区Va包括如下互补决定区：
CDR1：TISGTDY；CDR2：GLTSN；CDR3：ILSNNNDMR；
所述可变区Vβ包括如下互补决定区：
CDR1：GTSNPN；CDR2：SVGIG；CDR3：AWSVSDLLNTEAF。
2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，所述可变区Va为如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；和/或，
所述可变区Vβ为如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的T细胞受体，其特征在于，所述可变区Va位于所述T细胞受体的TCR alpha序列，所述TCR alpha序列为如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；和/或，所述可变区Vβ位于所述T细胞受体的TCR beta序列，所述TCR beta序列为如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的T细胞受体，其特征在于，所述T细胞受体和巨细胞病毒pp65表位特异性结合。
5.一种核酸，其特征在于，所述核酸用于编码权利要求1-4任一项所述T细胞受体。
6.根据权利要求5所述的核酸，其特征在于，包括：
用于编码可变区Va的核苷酸序列SEQ ID NO:9，和/或，用于编码可变区Vβ的核苷酸序列SEQ ID NO:13。
7.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求5或6所述的核酸，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述转基因细胞为能够表达特异性结合巨细胞病毒pp65表位的T细胞受体的T细胞。
9.权利要求1-4任一项所述T细胞受体，或权利要求5或6所述核酸，或权利要求7或8所述生物材料在制备用于抑制巨细胞病毒的药物或用于检测巨细胞病毒的试剂中的应用。
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Denomination of invention: A T-cell receptor with specific recognition for cytomegalovirus and its application

Effective date of registration: 20230811

Granted publication date: 20220506

Pledgee: Haidian Beijing science and technology enterprise financing Company limited by guarantee

Pledgor: Beijing Kerui Biotechnology Co.,Ltd.

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