CN113453754B - 抗angptl3/8复合物抗体和使用所述抗体的方法 - Google Patents
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Abstract
公开了血管生成素样蛋白(ANGPTL)3/8复合物和抗体，其中所述抗体与ANGPTL3/8复合物结合并且由此中和所述ANGPTL3/8复合物。还公开了药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体中的本文的一种或多种抗ANGPTL3/8复合抗体。还公开了制备和使用所述药物组合物的方法，尤其是用于增加脂蛋白脂肪酶活性并降低甘油三酯的方法。以此方式，化合物和组合物可以用于治疗脂质代谢相关的和葡萄糖代谢相关的疾病和病症。
Description
本公开总体上涉及生物学和医学，并且更具体地其涉及与人血管生成素样蛋白(ANGPTL)3/8复合物结合并由此中和所述复合物的抗体(Ab)。此Ab可以增加脂蛋白脂肪酶(LPL)活性并且由此可以降低血清甘油三酯(TG)，使得其可以用于治疗脂质代谢相关的和葡萄糖代谢相关的疾病和病症。
ANGPTL是调节许多生理和病理生理过程的蛋白质家族。本文特别关注的是ANGPTL3和ANGPTL8在脂质和葡萄糖代谢中的作用。
证据支持ANGPTL3作为脂蛋白代谢的主要调节剂的作用，并且其可以通过抑制LPL并且抑制内皮脂肪酶(EL)来调节TG清除。参见Chi等人,(2017)《分子代谢(Mol.Metab.)》6:1137-1149。ANGPTL3缺乏、失活或丢失可能导致低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和TG的水平低。ANGPTL3也可以影响胰岛素敏感性，由此在调节脂质代谢和葡萄糖代谢中发挥作用。参见Robciuc等人,(2013)《动脉硬化、血栓和血管生物学(Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.)》33:1706-1713。人ANGPTL3的核酸和氨基酸序列是已知的。例如，一种核酸序列可以在NCBI参考序列号NM_014495(SEQ ID NO:1)中找到，并且一个氨基酸序列可以在NCBI参考序列号NP_055310(SEQ ID NO:2)中找到。
ANGPTL8在肝脏和脂肪组织中高度表达并且据报道其通过与ANGPTL3复合并且由此激活ANGPTL3来抑制LPL。参见以上Chi。人ANGPTL8似乎是通过饲喂诱导的。人ANGPTL8的核酸和氨基酸序列是已知的。例如，一种核酸序列可以在NCBI参考序列号NM_018687(SEQID NO:3)中找到，并且一个氨基酸序列可以在NCBI参考序列号NP_061157(SEQ ID NO:4)中找到。
存在ANGPTL3/8复合物，其具有一个或多个与一个或多个ANGPTL8结合的ANGPTL3。有证据表明，与单独地ANGPTL3或ANGPTL8相比，这些复合物可更有效地介导LPL的抑制。此外，ANGPTL3/8复合物可以通过在哺乳动物表达系统中共表达ANGPTL8和ANGPTL3来制成。参见以上Chi。
已知Ab与ANGPTL3或ANGPTL8结合并且可以单独地或彼此组合使用来治疗脂质代谢相关的和葡萄糖代谢相关的疾病和病症。例如，国际专利申请公开第WO 2012/174178号公开了与ANGPTL3结合并且干扰其活性的完全人单克隆Ab和其抗原结合片段。其它治疗性抗ANGPTL3抗体也是已知的。参见例如国际专利申请公开第WO 2008/073300号和美国专利第7,935,796号。同样，国际专利申请公开第WO 2017/027316号公开了与ANGPTL8结合并干扰其活性的完全人单克隆Ah或其抗原结合片段。此外，国际专利申请公开第WO 2017/177181号公开了组合的抗ANGPTL3 Ab和抗ANGPTL8 Ab疗法。
不幸的是，仅与ANGPTL3或ANGPTL8结合的现有Ab不能完全消除这些ANGPTL和/或ANGPTL3/8复合物对脂质和/或葡萄糖代谢的影响。参见例如Dewey等人,(2017)《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》377:211-221；以及Gusarova等人,(2017)《内分泌学(Endocrinology)》158:1252-1259。鉴于此，需要另外的用于治疗脂质代谢相关的和葡萄糖代谢相关的疾病和病症的Ab，特别是抗ANGPTL3/8复合物Ab，其中此类Ab具有改善的药理学抑制和/或调节性质来调节脂质和/或葡萄糖代谢。
为了满足此需求，提供了经修饰的ANGTPL3/8复合物的核酸和氨基酸序列。因此，本文描述了对编码修饰的ANGPTL3和经修饰的ANGPTL8(例如，融合蛋白)中的一种或多种的核酸序列。在一些情况下，核酸序列包含编码具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的ANGPTL3融合蛋白的多核苷酸序列。在其它情况下，核酸序列包含编码具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的ANGPTL8融合蛋白的多核苷酸序列。在仍其它情况下，核酸序列包含编码SEQ ID NO:17和18的多核苷酸序列。
另外，提供了核酸构建体，所述核酸构建体包含编码如本文所述的ANGPTL3融合蛋白、如本文所述的ANGPTL8融合蛋白或两者的多核苷酸序列，其中此类构建体可以是表达盒或载体。
鉴于以上，提供了宿主细胞，所述宿主细胞在其中包含一个或多个如本文所述的表达盒或载体。在一些情况下，所述宿主细胞是真核细胞。在一些情况下，所述ANGPTL3和所述ANGTPL8融合蛋白的多核苷酸序列位于单独的表达盒或载体上，而在其它情况下，其可以位于同一表达盒或载体上。
而且，提供了ANGPTL3融合蛋白，所述ANGPTL3融合蛋白包含SEQ ID NO:17或19的氨基酸序列以及其活性变体或片段。同样，提供了ANGPTL8融合蛋白，所述ANGPTL8融合蛋白包含SEQ ID NO:18或20的氨基酸序列以及其活性变体或片段。
此外，提供了功能性ANGPTL3/8复合物，尤其是人ANGPTL3/8复合物，其中所述复合物的ANGPTL3部分是如本文所述的天然(全长或截短的)ANGPTL3或ANGPTL3融合蛋白，并且其中所述复合物的ANGPTL8部分是如本文所述的ANGPTL8融合蛋白。在一些情况下，所述ANGPTL3融合蛋白包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。同样，并且在一些情况下，所述ANGPTL8融合蛋白包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。此外，并且在一些情况下，所述复合物具有的所述ANGPTL3部分与所述ANGPTL8部分的比率可以为1:1比率。在其它情况下，所述复合物具有的ANGPTL3部分与ANGPTL8部分的比率除了1:1之外分别可以为如1:2、1:3、2:1或3:1比率。
还提供了用于制备重组ANGTPL3/8复合物的方法。所述方法可以包含至少一个步骤：在宿主细胞，如在哺乳动物表达系统中表达如本文所述的ANGPTL3部分和ANGPTL8部分的一个或多个多核苷酸序列，以从其获得ANGPTL3/8复合物。在一些情况下，所述ANGPTL3部分和所述ANGPTL8部分在单独的表达构建体或载体上提供。在其它情况下，ANGPTL3和ANGPTL8在一个表达构建体或载体上提供。所述方法还可以包含纯化所产生的ANGPTL3/8复合物的步骤，所述步骤可以不仅包含浓缩ANGPTL3/8复合物，还包含从所述ANGPTL3部分和/或所述ANGPTL8部分去除标签、接头和血清白蛋白中的一种或多种。所述方法还可以包含在纯化步骤之前和/或之后浓缩所述ANGPTL3/8复合物的步骤。
第二，提供了ANGPTL3/8复合物的Ab以及其用途，其包含通过与ANGPTL3/8复合物结合并且由此抑制ANGPTL3/8复合物活性来治疗脂质代谢相关的和葡萄糖代谢相关的疾病和病症。
有效量的本文所述的抗ANGPTL3/8复合物Ab或其药学上可接受的盐可以用于增加LPL活性，降低TG以及治疗有需要的个体的脂质代谢和/或葡萄糖代谢相关的疾病或病症。
本文所述的抗ANGPTL3/8复合物Ab结合可溶性ANGPTL3/8复合物，由此增加LPL活性并且降低血清TG水平。TG水平较低的个体患心血管疾病的风险较低。有利地，本文所述的抗ANGPTL3/8复合物Ab仅与ANGPTL3/8复合物结合，并且不与单独地ANGPTL3或与单独地ANGPTL8以相关浓度结合。据信，抗ANGPTL3/8复合物Ab增加富含TG的脂蛋白(TRL)的分解代谢，这会降低TG和/或非HDL-C，由此改善未通过当前疗法解决的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)的血脂异常风险因素。此外，并且因为本文所述的抗ANGPTL3/8复合物Ab不结合单独的ANGPTL3或ANGPTL8，所以未抑制这些ANGPTL的其它动作，这会使得不良体内作用更少，如EL的去抑制降低。
具体地，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab是人抗ANGPTL3/8复合物Ab。在一些情况下，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab可以消除、阻断、抑制、干扰、中和或降低ANGPTL3/8复合物的体内活性，尤其是其LPL抑制性活性。在一些情况下，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab可以是全长的或者可以仅是抗原结合片段(例如，Fab、F(ab')2或scFv片段)。抗ANGPTL3/8复合物Ab的可期望性质包含在低剂量的Ab下TG降低，所述降低可持续至少21天。
在一些情况下，抗ANGPTL3/8复合物Ab结合人ANGPTL3/8复合物并且包含轻链决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1具有氨基酸序列RSSQSLLDSDDGNTYLD(SEQ ID NO:11)，LCDR2具有氨基酸序列YMLSYRAS(SEQ ID NO:12)，并且LCDR3具有氨基酸序列MQRIEFPLT(SEQ ID NO:13)，并且其中HCDR1具有氨基酸序列TFSGFSLSISGVGVG(SEQ ID NO:14)，HCDR2具有氨基酸序列LIYRNDDKRYSPSLKS(SEQ ID NO:15)，并且HCDR3具有氨基酸序列ARTYSSGWYGNWFDP(SEQ ID NO:16)。
进一步提供了：包含轻链可变区(LCVR)的Ab，其中所述LCVR具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列；或包含重链可变区(HCVR)的Ab，其中所述HCVR具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些情况下，所述Ab包含具有SEQ ID NO:9的氨基酸序列的LCVR和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的HCVR。在一些情况下，所述Ab包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC具有SEQID NO:5的氨基酸序列，或者所述HC具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列。可替代地，所述Ab包含轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列，并且所述HC具有SEQ IDNO:6的氨基酸序列。在某些情况下，所述Ab是IgG4同种型。
在一些情况下，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab可以是以上所述的Ab的变体，尤其是相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQID NO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:23)、M56T突变(SEQ ID NO:24)、E99Q突变(SEQ ID NO:25)或其组合(例如，D33T和M56T突变或D33A和M56T突变)的LC变体。
此外，提供了一种通过以下产生的Ab：在具有SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列的多肽得以表达的条件下培养包含cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子编码所述多肽；以及回收所述Ab。可替代地，提供了一种通过以下产生的Ab：在多肽得以表达的条件下培养包含两种cDNA分子的哺乳动物细胞，其中第一cDNA分子编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽，并且第二cDNA分子编码具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽；以及回收所述Ab。在一些情况下，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab可以是以上所述的Ab的变体，尤其是相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ IDNO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:23)、M56T突变(SEQ ID NO:24)、E99Q突变(SEQ ID NO:25)或其组合的LC变体。
此外，提供了一种在标准LPL活性测定中以0.5nM或更少的EC50与人ANGPTL3/8复合物结合并且中和所述人ANGPTL3/8复合物的Ab。而且，提供了一种以小于或等于1×10-6M的解离常数与人ANGPTL3/8复合物结合的Ab。此外，提供了一种以大于1×10-6M的解离常数与人ANGPTL3和人ANGPTL8结合的Ab。此外，提供了一种以如通过单点ELISA测定所测量的比非结合背景信号的3倍大的信号与人ANGPTL3/8复合物结合，但不以如通过单点ELISA测定所测量的比非结合背景信号的3倍大的信号与单独地ANGPTL3或单独地人ANGPTL8单独结合的Ab。同样，提供了一种与IgG对照相比，在给药之后14天的时间点时以10mg/kg的剂量将TG体内降低至少50％的Ab。
第三，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文的Ab或本文的Ab的种群以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。还提供了一种包含DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包含编码具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达本文的Ab。进一步提供了一种包含第一DNA分子和第二DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述第一DNA分子包含编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，并且其中所述第二DNA分子包含编码具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，并且其中所述细胞能够表达本文的Ab。在一些情况下，所述抗ANGPTL3/8复合物Ab可以是以上所述的Ab的变体，尤其是相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:23)、M56T突变(SEQID NO:24)、E99Q突变(SEQ ID NO:25)或其组合的LC变体。
第四，提供了一种用于产生Ab的方法，其中所述方法包含培养具有DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子具有编码具有SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述细胞能够在使得所述Ab得以表达的条件下表达本文所述的Ab，以及回收表达的Ab。在一些情况下，编码具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的所述多肽的所述多核苷酸序列可以编码D31S突变、D33A突变、D33T突变、M56T突变、E99Q突变或其组合。本文还提供了一种治疗ASCVD、慢性肾脏疾病(CKD)、糖尿病、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肥胖症或其组合的方法，其中所述方法包含向有需要的个体施用有效量的本文的Ab。进一步提供了一种降低TG的方法，所述方法包括向需要的个体施用有效量的本文的Ab。
第五，提供一种用于疗法的Ab。具体地，所述Ab用于治疗ASCVD、CKD、糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或其组合。还提供了一种用于治疗ASCVD、CKD、糖尿病、高甘油三酯血症、NASH、肥胖症或其组合的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本文的Ab。
当考虑下文详细描述时，除了上述那些优点、作用、特征和目的的优点、作用、特征和目的将变得更加显而易见。此类详细描述参考以下附图，其中：
图1示出了SDS-page凝胶的图像，其示出了在还原和非还原条件下运行的ANGPTL3/8复合物。
通过不定冠词“a”或“an”提及要素并不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文明确地要求存在一个且仅一个要素。因此，不定冠词“a”或“an”通常意指“至少一个”。
定义
如本文所用，“约”意指在一个或多个值的统计上有意义范围内，例如规定的浓度、长度、分子量、pH、序列相似性、时间帧、温度、体积等。此值或范围可以在给定值或范围的一定数量级内，典型地在20％内、更典型地在10％内以及甚至更典型地在5％内。“约”所涵盖的可允许变量将取决于研究下的特定系统，并且本领域的普通技术人员可以容易地理解。
如本文所用，“亲和力”意指Ab与ANGPTL3/8复合物上的表位结合的强度。
如本文所用，“血管生成素样蛋白3”或“ANGPTL3”意指具有包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，“血管生成素样蛋白8”或“ANGPTL8”意指具有包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的蛋白质。
如本文所用，“ANGPTL3/8复合物”意指与一种或多种ANGPTL8化合物结合的一种或多种ANGPTL3化合物的多蛋白质复合物。
如本文所用，“抗ANGPTL3/8复合物Ab”或“抗ANGPTL3/8复合物Ab”意指同时识别ANGPTL3和ANGPTL8两者并且与ANGPTL3和ANGPTL8两者上的区域(特别是当呈ANGPTL3/8复合物的形式时)结合的Ab。总体上，抗ANGPTL3/8复合物Ab通常将不与其它ANGPTL家族成员(例如，ANGPTL1、ANGPTL2、ANGPTL4、ANGPTL5、ANGPTL6或ANGPTL7)结合。此外，并且如在其它地方所指出的，抗ANGPTL3/8复合物Ab也不会与单独地ANGPTL3或ANGPTL8以指定浓度结合，如下面的单点ELISA测定中所描述的。
如本文所用，“结合(bind)”或“结合(binds)”意指蛋白质与另一蛋白质或分子形成一种类型的化学键或吸引力的能力，如通过本领域已知的常规方法所确定的。结合可以由约1×10-6M或更小的平衡解离常数(KD)(即更小的KD表示更紧的结合)表征。确定两个分子是否结合的方法是本领域众所周知的，并且包含例如平衡透析、表面等离子体共振等。在此，抗ANGPTL3/8复合物Ab仅结合ANGPTL3/8复合物，并且不结合单独地ANGPTL3或单独地ANGPTL8。Ab是否仅与ANGPTL3/8复合物结合并且不与单独地ANGPTL3或单独地ANGPTL8结合可以如下所述的在标准ELISA测定中以单点格式确定，并且结合可以如下所述通过Biacore进行表征。尽管本文的Ab是人的，然而其可以展现出与来自其它物种的其它ANGPTL3/8复合物，例如食蟹猴ANGPTL3/8复合物、小鼠ANGPTL3/8复合物或大鼠ANGPTL3/8复合物的交叉反应性。
如本文所用，“有效量”意指化合物或含有所述化合物的药物组合物的量或剂量，在对个体进行单次或多次剂量施用之后，所述量或剂量将引发研究者、兽医、医师或其它临床医生所寻求的对组织、系统、动物、哺乳动物或人的生物学或医疗应答或期望的治疗作用。在一些情况下，本文的化合物或包含所述化合物的组合物对有需要的个体的有效量将导致LPL活性增加。剂量可以包含较高初始负荷剂量，然后包含较低剂量。剂量可以以任何治疗有效间隔施用，如一天多次、每天一次、隔天一次、一周三次、一周两次、一周一次、每两周一次、一月一次、每两个月一次等。构成有效量的剂量可以介于0.01mg/kg与100mg/kg之间。
如本文所用，“平衡解离常数”或“KD”意指Ab对特定抗原相互作用的亲和力，如Ab对ANGPTL3/8复合物的亲和力的定量测量，尤其是Ab/ANGPTL3/8复合物缀合物可逆地分离成其组分部分的倾向性的度量。同样，并且如本文所用，“平衡缔合常数”或“Ka”意指KD的倒数。
如本文所用，“功能性”意指ANGPTL3融合蛋白、ANGPTL8融合蛋白或ANGPTL3/8复合物具有近似于天然ANGPTL3、天然ANGPTL8或天然ANGPTL3/8复合物的生物学活性，包含例如抑制LPL或充当可以对其制备Ab并且所述Ab所针对的抗原。
如本文所用，“葡萄糖代谢相关的疾病或病症”是指糖尿病等。
如本文所用，“脂质代谢相关的疾病或病症”意指与异常脂质代谢相关联的病状，如血脂异常症、高脂血症和高脂蛋白血症，包含高甘油三酯血症、高胆固醇血症，乳糜微粒血、混合性血脂异常(肥胖症、代谢综合征，糖尿病等)、脂肪营养不良和脂肪萎缩。所述术语还涵盖某些心血管疾病，如动脉粥样硬化和冠状动脉疾病、急性胰腺炎、NASH、肥胖症等。
如本文所用，“半最大有效浓度”或“EC50”意指在预定时间段之后诱导介于基线与最大值中途的应答的Ab的浓度(通常以摩尔单位(M)表示)。本文所述的EC50理想地为3.0nM或更小。
如本文所用，“核酸构建体”或“表达盒”意指至少具有与编码序列可操作地连接的控制序列的核酸分子。以此方式，如启动子等控制序列与编码所关注的至少一种多肽，如本文所述的ANGPTL3融合蛋白和/或本文所述的ANGPTL8融合蛋白的核酸序列可操作地相互作用。此类核酸构建体可以呈表达盒或转移盒的形式。核酸构建体可以包含由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其组合构成的寡核苷酸或多核苷酸，所述寡核苷酸或多核苷酸其中已掺入所关注的一个或多个多肽的核苷酸序列。
如本文所用，“可操作地连接”意指核酸构建体的要素被配置为执行其通常功能。因此，与编码序列可操作地连接的控制序列(即，启动子)能够影响编码序列的表达。对照序列不需要与编码序列连续，只要其功能为引导其表达(即，维持正确的阅读框)即可。因此，例如，在启动子与编码序列之间可以存在中间的未经翻译的但仍转录的序列，并且启动子序列仍可以被视为与编码序列“可操作地连接”。
如本文所用，“控制序列(control sequence)”或“控制序列(controlsequences)”意指共同提供对受体宿主细胞中的编码序列的复制、转录和翻译的启动子、聚腺苷酸化信号、转录和翻译终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)，增强子等。并非这些控制序列中的所有控制序列都需要总是存在，只要所选编码序列能够在适当宿主细胞中进行复制、转录和翻译即可。
如本文所用，“编码序列(coding sequence)”或“编码序列(coding sequences)”意指编码所关注的一个或多个多肽的核酸序列，并且是当放置在适当调节序列的控制下时，在体外或体内被转录(在DNA的情况下)和翻译(在RNA的情况下)成多肽的核酸序列。一个或多个编码序列的边界通过5'(氨基)末端处的起始密码子和3'(羧基)末端处的翻译终止密码子确定。编码序列可以包含但不限于病毒核酸序列、来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列或甚至合成DNA序列。
关于控制和编码序列，其可以对宿主细胞是天然的/类似的，或彼此是天然的/类似的。可替代地，控制和编码序列可以对宿主细胞是异源的或彼此异源。
如本文所用，“启动子”意指由核酸调节序列构成的核苷酸区，其中所述调节序列衍生自基因或合成产生，并且能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录。许多启动子可以用于核酸构建体，包含所关注的一个或多个多肽的天然启动子。可替代地，启动子可以基于期望的结果来选择。此类启动子可以包含但不限于诱导型启动子、阻遏型启动子和组成型启动子。
如本文所用，“变体”意指与参考核酸或氨基酸序列相比，具有一个或多个修饰，如一个或多个特定核酸或氨基酸残基的添加、缺失、插入和/或取代的多核苷酸或多肽。因此，与参考核酸或氨基酸序列相比，变体包含一个或多个改变。在此，抗ANGPTL3/8复合物Ab可以具有LC或HC变化。具体地，Ab可以是相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:23)、M56T突变(SEQ ID NO:24)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体。同样，再次相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，LC变体可以是以上中的任何两个的组合，例如D31S和D33A突变、D31S和D33T突变、D31S和M56T突变、D31S和E99Q突变、D33A和M56T突变、D33A和E99Q突变、D33T和M56T突变、D33T和E99Q突变以及M56T和E99Q突变。此外，再次相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，LC变体可以是以上中的任何三个的组合，例如D31S、D33A和M56T突变、D31S、D33A和E99Q突变、D31S、D33T和M56T突变、D31S、D33T和E99Q突变、D33A、M56T和E99Q突变以及D33T、M56T和E99Q突变。此外，再次相对于具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的LC，LC变体可以是以上中的任何四个的组合，例如D31S、D33A、M56T和E99Q突变以及D31S、D33T、M56T和E99Q突变。
如本文所用，“载体”意指另一个核酸序列，如表达盒可以与其连接，以引起经连接的序列的复制的复制子，如质粒、噬菌体或粘粒。载体能够将核酸分子转移到宿主细胞。载体典型地包含一个或少量限制性核酸内切酶识别位点以及可选择标志物，在所述限制核酸内切酶识别位点处，所关注的核苷酸序列可以在不丧失载体的基本生物学功能的情况下以可确定方式插入，所述可选择标志物可以用于鉴定和选择用载体转化的宿主细胞。因此载体能够将核酸序列转移到靶细胞。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”意指对患有病状的个体的管理和护理，针对所述病症，抗ANGPTL3/8复合物Ab施用被指示为用于对抗或减轻所述病状的症状和并发症的目的。治疗包括向此个体施用本文的化合物或含有所述化合物的组合物，以预防症状或并发症的发作、减轻症状或并发症或消除疾病、病状或病症。治疗包含向有需要的个体施用本文的化合物或含有所述化合物的组合物，以导致LPL活性增加和TG降低。待治疗的个体是动物，尤其是人类。
如本文所用，“患者”、“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且意指动物，尤其是人。在某些情况下，个体是人，并且其特征进一步在于患有将从抗ANGPTL3/8复合物Ab的施用中受益的疾病、病症或病状。
如本文所用，“抗体”或“Ab”等意指包含具有链间和链内二硫键的两条重链和两条轻链的全长Ab。四个多肽链中的每个多肽链的氨基末端部分包含主要负责抗原识别的可变区。每个HC包含N末端HCVR和HC恒定区(HCCR)。每条轻链包含轻链(LC)可变区(LCVR)和LC恒定区(LCCR)。在此，Ab是免疫球蛋白G(IgG)型Ab，并且IgG同种型可以进一步分成亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。HCVR和LCVR区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区间散布有更保守的被称为框架区(FR)的区。每个HCVR和LCVR包含从N末端到C末端按以下次序布置的三个CDR和四个FR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在此，HC的三个CDR被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且LC的三个CDR被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。CDR含有大多数与抗原，如ANGPTL3/8复合物形成特异性相互作用的残基。可以通过例如Chothia、Kabat或North等算法进行将残基分配到各个CDR。North CDR定义基于利用大量结晶结构的亲和力传播聚类(North等人,(2011)《分子生物学杂志(J.Mol.Bio.)》406:228-256)。本文中，CDR最好由序列表中列示的序列定义，所述序列基于包含North的多个定义的组合。
通过将编码HCVR的DNA与编码重链恒定区的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码HCVR区的分离的DNA转化为全长重链基因。人以及其它哺乳动物重链恒定区基因的序列是本领域已知的。涵盖这些区的DNA片段可以通过例如标准PCR扩增获得。
通过将编码LCVR的DNA与编码轻链恒定区的另一DNA分子可操作地连接，可以将编码LCVR区的分离的DNA转化为全长轻链基因。人以及其它哺乳动物轻链恒定区基因的序列是本领域已知的。涵盖这些区的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。
本文的Ab可以含有IgG4-PAA Fc部分。如由SEQ ID NO:6中的绝对位置编号的，IgG4-PAA Fc部分在位置231处具有Ser到Pro突变(S231P)，在位置237处具有Phe到Ala突变(F237A)并且在位置238处具有Leu到Ala突变(L238A)。S231P突变是防止半Ab形成(IgG4 Ab中半分子动态交换的现象)的铰链突变。F237A和L238A突变进一步降低了已经低的人IgG4同种型的效应子功能。然而，设想了本文的Ab可替代地可以包含不同的Fc部分。
为了减少当在人体内给药时潜在地诱导免疫应答，某些氨基酸可能需要回复突变以匹配Ab种系序列。
可以向需要此治疗的个体肠胃外施用包含本文的化合物的药物组合物。此个体可能患有ASCVD或患ASCVD的风险高。这些个体可能患有急性冠状动脉综合征、心肌梗塞(MI)史、稳定或不稳定的心绞痛、冠状动脉或其它动脉血管再生、中风、短暂性缺血发作(TIA)、胸或腹主动脉瘤或推测为动脉粥样硬化起源的外周动脉病变。患ASCVD风险高的个体可能进一步患有2型糖尿病(T2D)、CKD或家族性高胆固醇血症(FH)。
肠胃外施用可以借助于注射器(syringe)、任选地笔形注射器或机械驱动的注射器(注入器)通过皮下、肌肉内或静脉内注射来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵执行。在一些情况下，适合于向个体施用的药物组合物有治疗有效量的本文化合物以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。此类药物组合物可以使用本领域众所周知的药物产物的常规赋形剂通过多种技术中的任何技术来制备。参见例如，Remington,“药学科学与实践(The Science and Practice of Pharmacy)”(D.B.Troy编辑,第21版,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott,Williams&Wilkins),2006)。
本文的化合物可以与用于调节LPL活性、治疗脂质代谢相关的疾病或病症、或治疗葡萄糖代谢相关的疾病或病症，包含以上列示的病症中的任何病症的一种或多种另外的治疗剂同时、分开的或依次组合使用。可以与要求保护的化合物组合的另外的治疗剂的非限制性实例包含但不限于抗糖尿病药剂，如胰岛素或胰岛素类似物、双胍类、磺酰脲类、噻唑烷二酮类、二肽基肽酶-4(“DPP-4”)抑制剂或钠依赖性葡萄糖转运子(SGLT2)抑制剂；肠降血糖素化合物，如胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或GLP-1类似物、胃抑制多肽(GIP)或GIP类似物、胃泌酸调节素(OXM)或OXM类似物；阿司匹林(aspirin)；抗血小板药剂；H2受体阻断剂；质子泵抑制剂；抗高血压药；脂质修饰疗法，如HMG-CoA还原酶抑制剂、PCSK9抑制剂、胆固醇吸收抑制剂、贝特类(fibrates)、烟酸、LXR激动剂、RXR激动剂、ROR激动剂或反向胆固醇转运调节剂；心力衰竭疗法，如ACE、血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂、ARB或B肾上腺素能拮抗剂；抗炎疗法；高血压疗法、心房颤动疗法；神经退行性治疗；肿瘤疗法；用于糖尿病性心肌病、糖尿病性视网膜病、糖尿病性神经病、糖尿病性肾病、体重减轻、伤口愈合的疗法；肾病疗法；PAD疗法；或上述药剂中的任何药剂的组合。抗ANGPTL3/8复合物Ab和一种或多种另外的治疗剂可以：通过相同的递送途径和装置，如单个丸剂、胶囊、片剂或可注射制剂一起施用；或在分开的递送装置或途径中同时分开的施用；或依序施用。
ANGPTL3/8复合物的制备和纯化
本公开的一个方面是可以用于制备仅与复合物结合并且不与单独地ANGPTL3或与单独地ANGPTL8结合的Ab的ANGPTL3/8复合物。尽管抗ANGPTL3抗体和抗ANGPTL8 Ab是已知的，但是在合成足够数量的功能性ANGPTL3/8复合物，尤其是人ANGPTL3/8复合物以制备抗ANGPTL3/8复合物方面存在挑战。另外或可替代地，可以在测定中使用此类ANGPTL3/8复合物来评估针对ANGPTL3、ANGPTL8和/或ANGPTL3/8复合物的Ab的性质。
以此方式，本公开还描述了通过将其制成为N或C末端血清白蛋白(例如，人、小鼠或兔)融合蛋白形式来生成ANGPTL8的方法。然后可以通过在哺乳动物表达系统中共表达ANGPTL8融合蛋白与天然ANGPTL3或ANGPTL3融合蛋白来制成功能性ANGPTL3/8复合物。
如以上所指示的，天然人ANGPTL3和天然人ANGPTL8的核酸和氨基酸序列是已知的(分别参见，例如，SEQ ID NO:1-2和3-4)。然而，如本文所述的ANGPTL3或ANGPTL8是经修饰的(即，经重组的/合成的)，并且因此通过包含另外的氨基酸序列以改善生成、分泌和/或复合ANGTPL3和ANGTPL8而与天然序列不同。
例如，ANGPTL3可以被修饰为包含如本领域已知的一个或多个接头和标签。在此，人ANGPTL3(SEQ ID NO:2)被修饰为包含接头和FLAG标签，使得ANGPTL3融合蛋白具有SEQID NO:17的氨基酸序列。在一些情况下，接头可以为约1个到约10个氨基酸，如3个氨基酸，尤其是3个Ala残基。可以将接头和FLAG标签放置在ANGPTL3序列的N或C末端，尤其是如SEQID NO:17中的C末端，其中残基1-460与ANGPTL3相对应，并且残基461-471与3-Ala接头和FLAG标签相对应。
同样，ANGPTL8可以被修饰为包含除了血清白蛋白，尤其是人血清白蛋白的序列之外的一个或多个接头和标签。在此，人ANGPTL8(SEQ ID NO:4)被修饰为包含接头、IgGκ信号肽、多组氨酸(His)标签、成熟人血清白蛋白、接头和切割位点，使得ANGPTL8融合蛋白具有SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些情况下，接头可以是约1个到约10个氨基酸，如刚性聚脯氨酸重复序列，尤其是Ala-Pro(AP)-10接头。信号肽、His标签、成熟HSA、接头和/>切割位点可以放置在ANGPTL8序列的N或C末端，尤其是SEQ ID NO:18的N末端处，其中残基1-20与IgGκ信号肽相对应，残基21-27与His标签相对应，残基28-612与HSA相对应，残基613-632与AP-10接头相对应，残基633-643与/>切割位点相对应，并且残基644-820与ANGPTL8相对应。
构建用于表达如本文所述的ANGPTL3融合蛋白和/或ANGPTL8融合蛋白的核酸构建体的方法是本领域众所周知的，并且可以在以下中找到：例如Balbás和Lorence,“重组基因表达：评论和方案(Recombinant Gene Expression:Reviews and Protocols)”(第2版,Humana出版社(Humana Press)2004)；Davis等人,“分子生物学基础方法(Basic Methodsin Molecular Biology)”(爱思唯尔出版社(Elsevier Press)1986)；Sambrook和Russell,“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”(第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)2001)；Tijssen,“生物化学与分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交(Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology–Hybridization with Nucleic Acid Probes)”(爱思唯尔,1993)；以及“当代分子生物学实验手册(Current Protocols in Molecular Biology)”(Ausubel等人编辑,Greene出版社(Greene Publishing)和Wiley-Interscience杂志1995)；以及美国专利第6,664,387号、第7,060,491号；第7,345,216号和第7,494,805号。因为ANGPTL8不含有任何二硫键，所以可以使用哺乳动物表达系统。在此，可以使用HEK293表达系统或CHO表达系统来生成ANGPTL3和/或ANGPTL8融合蛋白，尤其是通过共表达。
除了表达ANGPTL3融合蛋白和/或ANGPTL8融合蛋白之外，所述方法还可以包含基于用于每种融合蛋白的特定标签来纯化所产生的融合蛋白，所述特定标签是本领域众所周知的。关于本文所述的ANGPTL3和ANGTPL8融合蛋白，纯化在去除标签之后可能导致许多截短，使得ANGPTL3融合蛋白具有SEQ ID NO:19的氨基酸序列(其中残基1-444与ANGPTL3相对应，并且残基445-455与3-Ala接头和FLAG标签相对应)，并且ANGPTL8融合蛋白具有SEQ IDNO:20的氨基酸序列(其中残基1-4与来自切割位点的切割残基相对应，并且残基5-182与ANGPTL8的片段相对应)，所述氨基酸序列易于彼此缔合以形成功能性ANGPTL3/8复合物。
抗体的制备和纯化
可以使用CHO GSKO细胞系在哺乳动物细胞表达系统中产生抗ANGPTL3/8复合物Ab。谷氨酰胺合成酶(GS)基因敲除使得能够通过消除内源性GS背景活性来加强选择严格性，这可以允许低产生性或非产生性细胞在选择条件下存活。可以将本文编码Ab HC和LC的基因亚克隆到单独含GS的表达质粒中以用于共转染，或者可以将两条链亚克隆到单个含GS的表达质粒中。将编码HC或LC的cDNA序列与信号肽的编码序列在框中融合，以增强期望的产物分泌到细胞培养基中，所述信号肽可以是鼠κ前导序列。表达由病毒巨细胞病毒(CMV)启动子驱动。
使用电穿孔和适当量的重组HC和LC表达质粒稳定转染CHO GSKO细胞，并且以足够的细胞密度将经转染的细胞维持在悬浮培养物中。经转染的细胞的选择是通过在无谷氨酰胺的含25μM甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的无血清培养基中生长并且在32-37℃和5％-7％CO2下培育完成的。使Ab从CHO细胞分泌到培养基中。Ab可以通过进行蛋白质A亲和力色谱，然后进行阴离子交换，或疏水相互作用色谱(或其它合适的方法)来纯化，并且可以利用尺寸排阻色谱以进行进一步纯化。
将来自所收获培养基的Ab捕获到MabSelect SuRe蛋白质A树脂(通用电气医疗集团(GE Healthcare))中。然后，用运行缓冲液，如磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4或含有Tris的运行缓冲液短暂洗涤树脂，以去除非特异性结合的材料。然后用低pH溶液，如20mM乙酸/5mM柠檬酸从树脂中洗脱Ab。将含有ANGPTL3/8Ab的级分合并，并且可以将其保持在低pH下以灭活潜在病毒。pH可以如需要的通过添加碱，如0.1M Tris pH 8.0来提高。可以通过疏水相互作用色谱(HIC)使用如苯基HP(通用电气医疗集团)等树脂进一步纯化ANGPTL3/8Ab。可以在20mM Tris，pH 8.0中使用硫酸钠梯度从HIC柱中洗脱抗ANGPTL3/8Ab。可以通过尺寸排阻色谱使用Superdex 200柱(通用电气医疗集团公司)利用在PBS，pH 7.4中进行等度洗脱来进一步纯化抗ANGPTL3/8Ab。
以此方式或本领域的技术人员将易于确定的类似方式制备本文所述的化合物。
用上述ANGPTL3/8复合物对携带人可变轻链和重链结构域的小鼠进行免疫，并且使用ANGPTL3/8(阳性)和ANGPTL3(阴性)作为标志物通过FACS分离单个抗原特异性B细胞。通过PCR从单个B细胞中回收重链和轻链可变区DNA，并且将其克隆到IgG表达载体中。转染之后测试CHO细胞上清液的结合活性。
实例
出于说明而非限制的目的提供以下非限制性实例。
实例1：制成ANGPTL3/8复合物
ANGPTL3和ANGPTL8表达：将编码人ANGPTL3、接头和FLAG标签的氨基酸序列(SEQID NO:17)的核苷酸序列插入到含有CMV启动子的哺乳动物表达载体中。同样，将编码人ANGTPL8、小鼠IgGκ信号肽、HIS标签、成熟人血清白蛋白切割位点的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)的核苷酸序列插入到含有CMV启动子的哺乳动物表达载体中。蛋白质表达是通过在于无血清培养基中培养的HEK293F细胞中共转染两种上述表达载体。转染之后5天收获培养基，并且将其储存在4℃下以用于随后蛋白质纯化。
蛋白质纯化：在4℃下执行蛋白质纯化，其中用1M Tris-HCl(pH 8.0)和5M NaCl分别将4L培养基补充到终浓度25mM和150mM。然后用150ml Ni-NTA树脂(Qiagen公司)将培养基培育过夜。将树脂填充到柱中，并且用缓冲液A(50mM Tris-HCl，pH 8.0、0.3M NaCl)进行洗涤。在缓冲液A中以0-300mM咪唑梯度对蛋白质进行洗脱。将含有HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag的级分合并，浓缩并装载到 200柱中(通用电气医疗集团生物科学股份公司(GE Healthcare Biosciences))，并用缓冲液A进行洗脱。将含有HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag的级分再次合并、浓缩、并用/>蛋白酶(通用电气医疗集团生物科学股份公司)消化，以从HIS-HSA-ANGPTL8融合蛋白中去除HSA。将经消化的蛋白质样品装载到/> 200柱中，并且用存储缓冲液(20mM HEPES，pH8.0、150mM NaCl)洗脱。将含有ANGPTL3/8复合物的级分合并和浓缩，其中蛋白质浓度使用Bradford方法确定。将ANGTPL3/8复合物等分并且在进一步使用之前储存在-80℃下。
LPL活性测定：根据制造商的说明(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisherScientific))执行LPL测定。简而言之，在生长培养基中连续稀释ANGPTL3和ANGPLT3/8复合物，并且替换LPL细胞培养基，以进行1小时培育。然后将/>脂肪酶底物(ELS)添加到表达LPL的细胞中，并且培育30分钟。在482nm/515nm下测量荧光(分别为激发/发射)。计算ANGPTL3和3/8对LPL的抑制％。
结果：
表1示出了ANGTPL3/8复合蛋白在纯化/浓缩的各个阶段的产率。
表1：ANGPTL3/8复合蛋白产率.
同样，图1示出了由柱得到的经纯化和经浓缩的ANGPTL3/8复合物的4-20％经TGTGX考马斯染色的凝胶，这证实了复合物形成/组装。纯化和浓缩之后，ANGTL3具有SEQ IDNO:19的氨基酸序列，而ANGPTL8具有SEQ ID NO:20的氨基酸序列。
在LPL测定中，ANGPTL3的EC50为21.5nM，而ANGTPL3/8复合物的EC50为0.54nM，这证实了复合物是功能性的。
实例2：测定
单点ELISA(SPE)测定：初始地使用标准ELISA测定以单点格式验证Ab对ANGPTL3/8复合物、游离ANGPTL3或游离ANGPTL8的结合选择性。简而言之，用抗人Fc Ab以2μg/ml的浓度涂覆测定板，并且随后用酪蛋白阻断。将在CHO细胞中表达之后分泌到上清液中的IgG捕获到测定板。以25nM的浓度添加生物素化抗原，以允许Ab/抗原结合。在添加碱性磷酸酶缀合的中性抗生物素蛋白(alkaline phosphatase-conjugated neutravidin)和碱性磷酸酶底物，并且随后在560nm下测量了光密度之后，检测了Ab/抗原复合物。通过大于非结合背景信号3倍的信号确定了正结合。
ELISA测定：使用标准ELISA测定验证Ab对ANGPTL3/8复合物、游离ANGPTL3或游离ANGPTL8的结合选择性。简而言之，用抗人Fc Ab以2μg/ml的浓度涂覆测定板，并且随后用酪蛋白阻断。将在CHO细胞中表达之后来自CHO上清液的Ab捕获到测定板，并且结果是Ab浓度为2μg/ml。通过连续稀释以不同浓度添加生物素化抗原(ANGPTL3、ANGPTL8或ANGPTL3/8复合物)，以允许Ab/抗原结合。在添加碱性磷酸酶缀合的中性抗生物素蛋白和碱性磷酸酶底物，并且随后在560nm下测量了光密度之后，检测了Ab/抗原复合物。
表2：在SPE测定中Ab对ANGPTL3/8复合物、ANGPTL8和ANGPTL3的结合选择性.
| ANGPTL3/8复合物结合 | ANGPTL8结合 | ANGPTL3结合 | |
| Ab | 2.302(正) | 0.087(负) | 0.074(负) |
| D31S | 0.928 | 0.072 | 0.058 |
| D33A | 0.898 | 0.118 | 0.076 |
| D33T | 0.661 | 0.070 | 0.060 |
| M56T | 0.775 | 0.085 | 0.060 |
| E99Q | 1.538 | 0.100 | 0.083 |
| 平均非结合背景信号 | 0.09 | 0.07 | 0.08 |
| 3×背景 | 0.27 | 0.21 | 0.24 |
值为560nm的光密度(OD)，并且跨平均所测试的所有板的非结合背景信号反映在“背景信号”行中。此阴性对照示出了在没有Ab的情况下的背景信号。
在SPE测定中，具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的Ab示出了与人ANGPTL3/8复合物的正结合以及与人ANGPTL8和人ANGPTL3的负结合。有具有D31S突变(SEQID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:24)、M56T突变(SEQ ID NO:24)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体以及SEQ ID NO:6的HC的Ab同样示出了与人ANGPTL3/8复合物的结合以及与人ANGPTL8和人ANGPTL的负结合。
表3：对与各种浓度的ANGPTL3、ANGPTL8和ANGPTL3/8复合物结合的Ab的ELISA测定.
对照是缓冲液并且无Ab。
在此测定中，具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的Ab示出了以浓度依赖性方式与人ANGPTL3/8复合物的正结合，并且在高达100nM的抗原浓度下未示出可检测到的与人ANGPTL8和人ANGPTL3的结合(表3)。
除了以上具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab之外，对有具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体以及SEQ ID NO:6的HC的Ab进行了测定并且在此测定中，其同样示出了以浓度依赖性方式与人ANGPTL3/8复合物的正结合，并且在高达100nM的抗原浓度下未示出可检测到的与人ANGPTL8和人ANGPTL3的结合(表4-6)。
表4：对与各种浓度的ANGPTL3、ANGPTL8和ANGPTL3/8复合物结合的D31S变体Ab的ELISA测定.
表5：对与各种浓度的ANGPTL3、ANGPTL8和ANGPTL3/8复合物结合的D33A变体Ab的ELISA测定.
表6：对与各种浓度的ANGPTL3、ANGPTL8和ANGPTL3/8复合物结合的E99Q变体Ab的ELISA测定.
实例3：体外受体亲和力
可以使用T200仪器(通用电气医疗集团生物科学股份公司；新泽西州皮斯卡塔韦(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.；Piscataway,NJ))确定结合动力学。可以通过共价偶联人Fab结合剂(通用电气医疗集团生物科学股份公司)来制备CM4传感器芯片表面。可以在约25℃下在pH 7.4的HBSEP+、0.01％BSA的运行缓冲液中执行动力学实验。可以捕获Ab，并且可以以约50微升/分钟将一系列浓度的小鼠、食蟹猴或人ANGPTL3/8复合物注入在芯片表面之上，持续约240秒，其中解离时间为约800秒。为了确定动力学参数(例如，ka、kd、KD)，对数据进行了双参考并且使用Biacore T200评价软件将其与1:1结合模型拟合(通用电气医疗集团生物科学股份公司)。以下表7示出了在pH 7.4以及温度25℃°下具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab与来自不同物种的各种ANGPTL3/8复合物的结合。
表7：在pH 7.4以及温度25℃下Ab与跨物种ANGPTL3/8复合物的结合。
除了以上具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab之外，对有具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体以及SEQ ID NO:6的HC的Ab进行了测定，以用于在pH 7.4以及温度25℃°下与来自不同物种的各种ANGPTL3/8复合物结合(表8-10)。
表8：在pH 7.4以及温度25℃下D31S变体Ab与跨物种ANGPTL3/8复合物的结合。
表9：在pH 7.4以及温度25℃下D33A变体Ab与跨物种ANGPTL3/8复合物的结合。
表10：在pH 7.4以及温度25℃下E99Q变体Ab与跨物种ANGPTL3/8复合物的结合。
实例4：体外功能活性LPL测定
使用基于细胞的生物测定来评估具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab对经ANGPTL3/8纯化的蛋白质对LPL活性的抑制去抑制的能力。使用EnzChekTM脂肪酶底物(赛默飞世尔公司)确定Ab的ANGPTL3/8抑制活性。HEK293细胞系表达人、食蟹猴、小鼠或大鼠LPL并且纯化人、食蟹猴、小鼠或大鼠ANGPTL3/8蛋白。HEK293-LPL生成包含稳定地表达人LPL的人胚胎细胞系，其利用标准方法生成(HEK293-huLPL)。简而言之，将人LPL克隆到具有CMV启动子和杀稻瘟素耐药性的慢病毒质粒中。所述质粒用于使用ViraPower包装混合物(英杰公司(Invitrogen))生成人LPL慢病毒。将HEK293细胞与LPL慢病毒一起培育，并且选择对杀稻瘟菌素具有抗性的克隆。在利用EnzChekTM底物通过qPCR和LPL活性确认人LPL mRNA表达之后，选择克隆。对食蟹猴、小鼠和大鼠LPL重复此过程。
根据Basu等人描述的那些修改方法(Basu等人,(2011)《脂质研究杂志(J.LipidRes.)》52:826-832)：(a)以25000个细胞/孔的密度将HEK293-LPL细胞添加到一半面积的96孔经多-D-赖氨酸涂覆的板A(人)、B(食蟹猴)、C(小鼠)或D(大鼠)并且在37℃、5％CO2下培育过夜。从起始原料浓度将Ab连续稀释九次以生成十点CRC，并且然后将其添加到在96孔板E(人)、F(食蟹猴)、G(小鼠)或H(大鼠)中的经纯化的ANGPTL3/8蛋白质中(对于人，ICxo浓度为0.42nM，对于食蟹猴为0.38nM，对于小鼠为0.13nM，或对于大鼠为0.81nM)。
分别用来自板E、F、G和H的ANGPTL3/8和Ab混合物替换板A、B、C和D中的HEK293-LPL细胞上的培养基，并且在37℃、5％CO2下培育1小时。将10μl EnzChekTM脂肪酶底物(在0.05％两性洗涤剂(3-(N,N-二甲基十八烷基酰胺基)丙烷磺酸盐)(西格玛公司(Sigma))中在5μM的浓度下制备)添加到板A、B、C和D中的细胞、ANGPTL3/8和Ab混合物中。使用读板仪来利用495nm截止滤波器测量在482nm激发和515nm发射下的荧光。在时间点之间在37℃、5％CO2中培育板。通过从31分钟时的信号减去1分钟时的信号来计算相对荧光(与LPL活性成正比)。利用Excel Fit计算Ab回收的LPL活性50％时的功效浓度(EC50)。EC50浓度在表11中示出。
去抑制百分比计算如下：
＝(RFU–RFU(MIN))/(RFU(MAX)–RFU(MIN))×100，
其中MAX＝细胞单独(LPL)，并且MIN＝细胞(LPL)+ANGPTL3/8CM(条件培养基)。
Ab的EC50总体上低，并且因此在对LPL去抑制方面是有效的。Ab还具有LPL的有利的最大去抑制％。
表11：Ab EC50以及人、食蟹猴、小鼠和大鼠LPL以及人、食蟹猴、小鼠和大鼠ANGPTL3/8复合物的LPL的最大去抑制％.
除了以上具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab之外，对有具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)、D33T突变(SEQ ID NO:23)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体以及SEQ ID NO:6的HC的Ab进行了测定，测定其对经ANGPTL3/8纯化的蛋白质对LPL活性的抑制去抑制(表12)。
表12：变体Ab EC50以及人和小鼠LPL以及人和小鼠ANGPTL3/8复合物的LPL的最大去抑制％。
实例5：体内甘油三酯应答
评估了在huCETP和hu载脂蛋白A1转基因(a)的小鼠体内具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab对血清TG的作用。从小鼠收集血液，并且在实验开始之前分离血清。使用临床化学分析仪(罗氏公司(Roche))测量血清样品中的TG。将动物分成5组，每组20个，以得到具有相似血清TG平均值的组。然后将每组20个进一步细分为4组，每组5个，其血清甘油三酯平均值相似。通过以1mg/kg(n＝20)、3mg/kg(n＝20)、10mg/kg(n＝20)或30mg/kg(n＝20)对4个单独组的动物进行单次皮下注射来向小鼠施用Ab。通过以30mg/kg(n＝20)对第五组动物进行单次皮下注射来施用对照抗原结合无效同种型匹配的mAb。
在Ab施用之后1小时(n＝5)、8小时(n＝5)、1天(n＝5)、2天(n＝5)、3天(n＝5)、7天(n＝5)、14天(n＝5)和21天(n＝5)从动物中收集血液。在第1小时和第3天时从亚组A动物中收集血液。在第8小时和第7天时从亚组B动物中收集血液。在第1天和第14天时从亚组C动物中收集血液。在第2天和第21天时从亚组D动物中收集血液。从血液中制备血清，并且使用临床化学分析仪(罗氏公司(Roche))测量血清TG水平。针对Ab在每个时间点处的每个剂量，计算TG与时间匹配的同种型对照的改变％。改变％计算为[(Rx血清甘油三酯-时间匹配的同种型对照血清甘油三酯)/(时间匹配的同种型对照血清甘油三酯)]×100。数据在表13中示出。
表13：与不同时间点处不同剂量的Ab的IgG对照相比，通过Ab降低的TG％.
| 给药后时间 | 1小时 | 8小时 | 1天 | 2天 | 3天 | 7天 | 14天 | 21天 |
| 1mg/kg | -22 | -33 | -76* | -66* | -61* | 41 | 6.4 | -20 |
| 3mg/kg | -26 | -71* | -84* | -77* | -86* | -25 | 19.7 | -19 |
| 10mg/kg | -27 | -62* | -87* | -89* | -88* | -88* | -64.4* | -28 |
| 30mg/kg | -23 | -74* | -92* | -87* | -93* | -93* | -89.1* | -75* |
对每个数据集使用Dunnett测试来将每个治疗组与时间匹配的对照进行比较，并且p值<0.05被视为是统计学显著的。表中由(*)表示与其时间匹配的对照统计学显著的组。
具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的Ab在降低TG时的效力从第1天开始是有利的，并且所述有利效果持续到第21天。
除了以上具有SEQ ID NO:5的LC以及SEQ ID NO:6的HC的抗ANGPTL3/8复合物Ab之外，对有具有D31S突变(SEQ ID NO:21)、D33A突变(SEQ ID NO:22)或E99Q突变(SEQ ID NO:25)的LC变体以及SEQ ID NO:6的HC的Ab进行了测定，以评价小鼠中TG相对于IgG对照的改变(表14)。
表14：不同时间点处不同剂量的变体Ab与IgG对照相比，TG降低的％.
| 给药后时间 | 1天 | 7天 | 15天 | 21天 |
| D31S 3mg/kg | -83* | -38* | -25 | -12 |
| D31S 10mg/kg | -90* | -91* | -37* | -21 |
| D33A 3mg/kg | -74* | -77* | -34* | -10 |
| D33A 10mg/kg | -78* | -86* | -76* | -60* |
| E99Q 3mg/kg | -82* | -49* | -5 | 15 |
| E99Q 10mg/kg | -86* | -91* | -61* | 6 |
对每个数据集使用Dunnett测试来将每个治疗组与时间匹配的对照进行比较，并且p值<0.05被视为是统计学显著的。表中由(*)表示与其时间匹配的对照统计学显著的组。
序列表
以下核酸和氨基酸序列在以上公开中提及，并且在下文提供以供参考。
SEQ ID NO:1
atatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgatcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgttaaaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaatcttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatgctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgtttaaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattatagaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaagattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgccagtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctttgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatataaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataaaggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttagggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattcattatttaatatatgagttgcttcctctatt
SEQ ID NO:2
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
SEQ ID NO:3
ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaatggtgacccggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgaggagctgaccctgctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacaggaccacggagggacggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaatagaactcctggggcaggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaagcctgttggagactcagatggaggaggatattctgcagctgcaggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggcccaggcacagaaggtgctacgggacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctggctgggccctgcctaccgagaatttgaggtcttaaaggctcacgctgacaagcagagccacatcctatgggccctcacaggccacgtgcagcggcagaggcgggagatggtggcacagcagcatcggctgcgacagatccaggagagactccacacagcggcgctcccagcctgaatctgcctggatggaactgaggaccaatcatgctgcaaggaacacttccacgccccgtgaggcccctgtgcagggaggagctgcctgttcactgggatcagccagggcgccgggccccacttctgagcacagagcagagacagacgcaggcggggacaaaggcagaggatgtagccccattggggaggggtggaggaaggacatgtaccctttcatgcctacacacccctcattaaagcagagtcgtggcatctcaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO:4
MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:5
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:6
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYYCARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO:7
gatattgtgatgacccagacccccctgtctctgcctgtcactccgggggaaccggcctcgatctcatgccggtcgagccagtccctgctggactccgatgacgggaacacttatttggattggtacctccaaaagcctggacagagcccgcagctcctgatctacatgctgtcctaccgggcctccggagtgccagaccgcttctcgggaagcggctccggtaccgacttcacactgaagatctcccgcgtggaagctgaggacgtgggcatctactactgtatgcaaagaatcgagttccccctcaccttcggcggcgggactaaggtcgagattaagagaaccgtggccgcaccatccgtgttcatttttcccccgtccgatgaacagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaacaacttctacccgagggaagcgaaagtgcagtggaaagtggacaatgcgctgcagtccggaaactcccaagagtccgtgaccgaacaggactccaaggactcaacctactcgctgagctcaacgctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtctacgcctgcgaagtgacccatcagggtttgagctcgcccgtgaccaagtccttcaaccggggagagtgc
SEQ ID NO:8
caagtcacattgaaggagagcggtccgaccctggtcaagccgactcagaccctgaccctgacgtgcactttctcgggcttctcattgtccatttctggagtgggcgtgggatggatcagacagcccccggggaaggccctcgagtggctcgcgctgatctaccgcaacgacgacaaacgctactccccctcactgaaatcccggctgaccatcactaaggatacgtccaagaaccaggtcgtgttgaccctcaccaacatggatcccgtggatactgccacctactattgtgcacggacctatagcagcggttggtacggaaactggttcgacccgtggggccagggaactcttgtgacggtgtcctccgcaagcaccaagggtccttctgtgttccccctggcgccgtgctcgcggagcacctcagagtccaccgccgccctcggctgccttgtgaaggactacttcccggagccagtcaccgtgtcctggaacagcggggccctgacttccggcgtgcacaccttccctgcggtgctgcagagctcaggcctctattcgctgtcatccgtcgtgaccgtgccttcctcgtccctgggcactaagacctacacttgcaacgtggaccataagcccagcaacaccaaagtggacaagagagtggaatccaaatacggaccgccatgtccgccctgccccgccccggaagctgccgggggacccagcgtgttcctgttcccacctaagccgaaggacactctgatgatctcaaggactcccgaagtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccccgaagtccagtttaattggtacgtggatggtgtcgaggtccacaacgccaagaccaagcctcgcgaggaacagttcaattccacctaccgggtcgtgtccgtcctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggaaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaagggactcccttcctccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgaaccacaagtctacaccctgcccccatcgcaagaggaaatgaccaagaaccaagtgtcgctgacatgcctcgtcaagggattctacccgtcggatattgcggtggaatgggagtccaacggacagcccgagaacaactacaagaccaccccgccggtgttggactccgacggctcctttttcctgtactcccggctcactgtggacaagtcgcggtggcaggaggggaacgtgttctcctgttccgtgatgcacgaagctctgcacaaccactacacccagaagtcgctgagcctctcactggga
SEQ ID NO:9
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:10
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYYCARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:11
RSSQSLLDSDDGNTYLD
SEQ ID NO:12
YMLSYRAS
SEQ ID NO:13
MQRIEFPLT
SEQ ID NO:14
TFSGFSLSISGVGVG
SEQ ID NO:15
LIYRNDDKRYSPSLKS
SEQ ID NO:16
ARTYSSGWYGNWFDP
SEQ ID NO:17
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK
SEQ ID NO:18
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHHHHHHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPLEVLFQGPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:19
SRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK
SEQ ID NO:20
GPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:21
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:22
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSADGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:23
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSTDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:24
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:25
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIQFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
Claims (38)
1.一种结合人ANGPTL3/8复合物的抗体，所述抗体包括轻链决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3以及重链决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，其中LCDR1由氨基酸序列RSSQSLLDSDDGNTYLD(SEQ ID NO:11)组成，LCDR2由氨基酸序列YMLSYRAS(SEQ ID NO:12)组成，LCDR3由氨基酸序列MQRIEFPLT(SEQ ID NO:13)组成，HCDR1由氨基酸序列TFSGFSLSISGVGVG(SEQ ID NO:14)组成，HCDR2由氨基酸序列LIYRNDDKRYSPSLKS(SEQ ID NO:15)组成，并且HCDR3由氨基酸序列ARTYSSGWYGNWFDP(SEQ ID NO:16)组成。
2.根据权利要求1所述的抗体，其包括轻链可变区(LCVR)，其中所述LCVR由SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的抗体，其包括重链可变区(HCVR)，其中所述HCVR由SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的抗体，其中所述LCVR由所述SEQ ID NO:9的氨基酸序列组成，并且所述HCVR由所述SEQ ID NO:10的氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG4同种型。
6.一种结合人ANGPTL3/8复合物的抗体，所述抗体包括轻链(LC)和重链(HC)，其中所述LC由选自由SEQ ID NO:5、21、22、23、24和25组成的组的氨基酸序列组成，并且所述HC由SEQID NO:6的氨基酸序列组成。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:5的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:21的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
9.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
10.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:23的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
11.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:24的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
12.根据权利要求6所述的抗体，其中所述LC由所述SEQ ID NO:25的氨基酸序列组成，并且所述HC由所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成。
13.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列的多肽得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述多肽进行编码；以及回收所述抗体。
14.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:21和6的氨基酸序列的抗体得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述抗体进行编码；以及回收所述抗体。
15.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:22和6的氨基酸序列的抗体得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述抗体进行编码；以及回收所述抗体。
16.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:23和6的氨基酸序列的抗体得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述抗体进行编码；以及回收所述抗体。
17.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:24和6的氨基酸序列的抗体得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述抗体进行编码；以及回收所述抗体。
18.一种通过以下产生的抗体：在包括SEQ ID NO:25和6的氨基酸序列的抗体得以表达的此类条件下培养包括cDNA分子的哺乳动物细胞，其中所述cDNA分子对所述抗体进行编码；以及回收所述抗体。
19.一种通过以下产生的抗体：在抗体得以表达的此类条件下培养包括至少两个cDNA分子的哺乳动物细胞，其中第一cDNA分子对所述抗体的由选自由SEQ ID NO:5、21、22、23、24和25组成的组的氨基酸序列组成的轻链进行编码，并且第二cDNA分子对所述抗体的由SEQ ID NO:6的氨基酸序列组成的重链进行编码；以及回收所述抗体。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体，其中所述抗体在标准脂蛋白脂肪酶活性测定中以3.0nM或更少的EC50结合并中和人ANGPTL3/8复合物。
21.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体，其中所述抗体以小于或等于1×10-6M的解离常数与人ANGPTL3/8复合物结合。
22.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体，其中所述抗体以大于1×10-6M的解离常数与人ANGPTL3和人ANGPTL8结合。
23.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体，其中在如通过ELISA测定测量的高达100nM下，所述抗体与人ANGPTL3/8复合物结合并且不与单独地人ANGPTL3或单独地人ANGPTL8结合。
24.根据权利要求1到19中任一项所述的抗体，其中与IgG对照相比，在给药之后14天的时间点，所述抗体以10mg/kg的剂量将体内的甘油三酯降低至少50％。
25.一种药物组合物，其包括根据权利要求1到24中任一项所述的抗体以及可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
26.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:5和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
27.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:21和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
28.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:22和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
29.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:23和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
30.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:24和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
31.一种包括DNA分子的哺乳动物细胞，所述DNA分子包括对包括SEQ ID NO:25和6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，其中所述细胞能够表达所述多肽。
32.一种包括第一DNA分子和第二DNA分子的哺乳动物细胞，其中所述第一DNA分子包括对包括选自由SEQ ID NO:5、21、22、23、24或25组成的组的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，并且其中所述第二DNA分子包括对包括所述SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽进行编码的多核苷酸序列，并且其中所述细胞能够表达所述多肽。
33.一种用于产生抗体的方法，所述方法包括在使得所述抗体得以表达的条件下培养根据权利要求26到32中任一项所述的哺乳动物细胞以及回收所表达的抗体。
34.有效量的根据权利要求1到24中任一项所述的抗体在制备用于治疗有需要的患者中的动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性肾脏疾病(CKD)或高甘油三酯血症或其组合的药物中的用途。
35.有效量的根据权利要求1到24中任一项所述的抗体在制备用于降低有需要的患者中的甘油三酯的药物中的用途。
36.根据权利要求1到24中任一项所述的抗体，其用于疗法。
37.根据权利要求1到24中任一项所述的抗体，其用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性肾脏疾病(CKD)或高甘油三酯血症或其组合。
38.一种用于治疗动脉粥样硬化性心血管疾病(ASCVD)、糖尿病、肥胖症、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、慢性肾脏疾病(CKD)或高甘油三酯血症或其组合的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的根据权利要求1到24中任一项所述的抗体。
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