BR112021011941A2

BR112021011941A2 - Anticorpos dos complexos anti-angptl3/8 e métodos de uso do mesmo

Info

Publication number: BR112021011941A2
Application number: BR112021011941-8A
Authority: BR
Inventors: Qing Chai; Jonathan Wesley Day; Robert John Konrad; Yuewei Qian; Oliver Schroeder; Robert William Siegel
Original assignee: Eli Lilly And Company
Priority date: 2018-12-21
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-09-14
Also published as: BR112021011910A2; AU2019405442B2; CN113453754B; AU2019406505A1; WO2020131606A3; US20220110537A1; CA3124413A1; JP2022514765A; CA3124315A1; CN113453754A; JP2023071918A; MX2021007356A; CN113454228A; JP7394855B2; TWI749421B; US20200199212A1; MA54527A; WO2020131624A1; EP3898670A2; AU2019405442A1

Abstract

anticorpos dos complexos antiangptl3/8 e métodos de uso do mesmo. a presente invenção refere-se a complexos (angptl)3/8 e anticorpos de proteína semelhante à angiopoietina, em que os anticorpos se ligam e, desse modo, neutralizam os complexos angptl3/8. também são divulgadas composições farmacêuticas que incluem um ou mais anticorpos do complexo anti-angptl3/8 no presente documento em um veículo farmaceuticamente aceitável. métodos de fabricação e de uso do mesmo também são divulgados, especialmente para aumentar a atividade de lipase da lipoproteína e diminuir os triglicerídeos. desse modo, os compostos e composições podem usados no tratamento de doenças e distúrbios relacionados com o metabolismo de lipídios e relacionados com o metabolismo de glicose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS DOS COMPLEXOS ANTI-ANGPTL3/8 E MÉTODOS DE USO DO MESMO".

[0001] A divulgação refere-se geralmente a biologia e medicina e, mais particularmente, se refere a anticorpos (Abs) que se ligam e, desse modo, neutralizam os complexos de proteína semelhante à angiopoietina humana (ANGPTL) 3/8. Esses Abs podem aumentar a atividade da lipase de lipopro- teína (LPL) e, assim, diminuir os triglicerídeos séricos (TGs) de modo que possam ser usados no tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e de glicose.

[0002] ANGPTLs são uma família de proteínas que regulam vários processos fisiológicos e fisiopatológicos. De particular interesse no presente documento, é o papel de ANGPTL3 e ANGPTL8 no metabo- lismo de lipídios e glicose.

[0003] As evidências apoiam o papel de ANGPTL3 como um regu- lador principal do metabolismo das lipoproteínas e pode regular a de- puração de TG ao inibir a LPL e inibir a lipase endotelial (EL). Consul- tar Chi et al. (2017) Mol. Metab. 6: 1137-1149. A deficiência, inativação ou perda de ANGPTL3 pode resultar em níveis baixos de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e TGs. ANGPTL3 também pode afetar a sen- sibilidade à insulina, desempenhando assim um papel na modulação não apenas do metabolismo lipídico, mas também do metabolismo da glicose. Consultar Robciuc et al. (2013) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33: 1706-1713. As sequências de ácido nucleico e de aminoáci- dos para ANGPTL3 humano são conhecidas. Por exemplo, uma se- quência de ácido nucleico pode ser encontrada na Sequência de Refe- rência NCBI Número NM_014495 (SEQ ID NO: 1), e uma sequência de aminoácidos pode ser encontrada na Sequência de Referência NCBI Número NP_055310 (SEQ ID NO: 2).

[0004] ANGPTL8 é altamente expresso no fígado e tecido adiposo e foi relatado que inibe a LPL por complexação com e, portanto, ativa- ção de ANGPTL3. Consultar Chi, supra. ANGPTL8 humano parece ser induzido pela alimentação. As sequências de ácido nucleico e de ami- noácidos para ANGPTL8 humano são conhecidas. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser encontrada na Sequência de Referência NCBI Número NM_018687 (SEQ ID NO: 3), e uma se- quência de aminoácidos pode ser encontrada na Sequência de Refe- rência NCBI Número NP_061157 (SEQ ID NO: 4).

[0005] Existem complexos ANGPTL3/8, que têm um ou mais AN- GPTL3s ligados a um ou mais ANGPTL8s. As evidências sugerem que esses complexos medeiam a inibição de LPL de forma mais eficaz quando comparados a ANGPTL3 ou ANGPTL8 isoladamente. Além disso, os complexos ANGPTL3/8 podem ser feitos in vitro pela coex- pressão de ANGPTL8 e ANGPTL3 em um sistema de expressão de mamífero. Consultar Chi, supra.

[0006] São conhecidos os Abs que se ligam a ANGPTL3 ou ANG- PTL8 e que podem ser usados sozinhos ou em combinação uns com os outros para tratar doenças e distúrbios relacionados ao metabolis- mo de lipídeos e de glicose. Por exemplo, Intl. A Publicação do Pedido de Patente Número WO 2012/174178 divulga um Ab monoclonal to- talmente humano e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ANGPTL3 e interferem com sua atividade. Outros Abs terapêu- ticos anti-ANGPTL3 também são conhecidos. Consultar, por exemplo, Intl. Publicação do pedido de patente número WO 2008/073300 e pa- tente Número US 7.935.796. Da mesma forma, Intl. A publicação do pedido de patente nº WO 2017/027316 divulga um Ab monoclonal to- talmente humano ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ANGPTL8 e interferem com a sua atividade. Além disso, Intl. A Publicação do Pedido de Patente Número WO 2017/177181 divulga uma terapia combinada de Ab anti-ANGPTL3 e Ab anti-ANGPTL8.

[0007] Infelizmente, os Abs existentes que se ligam apenas a AN- GPTL3 ou ANGPTL8 não anulam totalmente o efeito desses comple- xos ANGPTLs e/ou ANGPTL3/8 no metabolismo de lipídeos e/ou gli- cose. Consultar, por exemplo, Dewey et al. (2017) N. Engl. J. Med. 377: 211-221; e Gusarova et al. (2017) Endocrinology 158: 1252-1259. Em vista disso, há uma necessidade de Abs adicionais, especialmente Abs do complexo anti-ANGPTL3/8, para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e da glicose, em que tais Abs tenham propriedades farmacológicas inibitórias e/ou regu- latórias melhoradas para modular metabolismo de lipídios e/ou glicose.

[0008] Para atender a essa necessidade, as sequências nucleicas e de aminoácidos são fornecidas para um complexo ANGTPL3/8 modi- ficado. Consequentemente, as sequências de ácido nucleico que codi- ficam um ou mais de um ANGPTL3 modificado e um ANGPTL8 modi- ficado (isto é, proteínas de fusão) são descritas no presente documen- to. Em alguns casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANG- PTL3 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em ou- tros casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANGPTL8 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em ainda outros casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência poli- nucleotídica que codifica SEQ ID NO: 17 e 18.

[0009] Além disso, são fornecidos construtos de ácido nucleico que incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANGPTL3 conforme descrito no presente documento, uma proteína de fusão ANGPTL8 conforme descrito no presente documen- to, ou ambos, em que tais construtos podem ser um cassete de ex- pressão ou um vetor.

[0010] Tendo em vista o acima, são fornecidas células hospedei-

ras que incluem um ou mais cassetes de expressão ou vetores con- forme descrito no presente documento. Em alguns casos, as células hospedeiras são células eucarióticas. Em alguns casos, as sequências polinucleotídicas para as proteínas de fusão ANGPTL3 e ANGTPL8 estão em cassetes de expressão ou vetores separados, enquanto em outros casos podem estar no mesmo cassete de expressão ou vetor.

[0011] Além disso, são fornecidas proteínas de fusão ANGPTL3 que incluem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, bem como variantes ativas ou fragmentos das mesmas. Da mesma forma, são fornecidas proteínas de fusão ANGPTL8 que incluem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou 20, bem como vari- antes ativas ou fragmentos das mesmas.

[0012] Além disso, complexos ANGPTL3/8 funcionais são forneci- dos, especialmente complexos ANGPTL3/8 humanos, em que uma fração ANGPTL3 do complexo é um ANGPTL3 nativo (comprimento total ou truncado) ou uma proteína de fusão ANGPTL3 conforme des- crito no presente documento e em que uma fração ANGPTL8 do com- plexo é uma proteína de fusão ANGPTL8 conforme descrito no pre- sente documento. Em alguns casos, a proteína de fusão ANGPTL3 inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Da mesma forma, e em alguns casos, a proteína de fusão ANGPTL8 inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Além disso, e em al- guns casos, os complexos podem ter uma razão de 1:1 da fração AN- GPTL3 para a fração ANGPTL8. Em outros casos, os complexos po- dem ter razões diferentes de 1:1, como razão de 1:2, 1:3, 2:1 ou 3:1 de fração ANGPTL3 para fração ANGPTL8, respectivamente.

[0013] Métodos também são fornecidos para fazer complexos ANGTPL3/8 recombinantes. Os métodos podem incluir pelo menos uma etapa de expressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas para uma fração ANGPTL3 e uma fração ANGPTL8 conforme descrito no presente documento em uma célula hospedeira, como em um sis- tema de expressão de mamífero para obter complexos ANGPTL3/8 a partir da mesma. Em alguns casos, as porções ANGPTL3 e ANGPTL8 são fornecidas em construtos de expressão ou vetores separados. Em outros casos, ANGPTL3 e ANGPTL8 são fornecidos em um construto de expressão ou vetor. Os métodos também podem incluir uma etapa de purificação dos complexos ANGPTL3/8 resultantes, que podem in- cluir não apenas a concentração dos complexos ANGPTL3/8, mas também a remoção de um ou mais dos marcadores, ligantes e albumi- na sérica da fração ANGPTL3 e/ou ANGPTL8 metade. Os métodos também podem incluir uma etapa de concentração dos complexos ANGPTL3/8 antes e/ou após a etapa de purificação.

[0014] Em segundo lugar, um Ab para um complexo ANGPTL3/8 é fornecido, bem como seus usos, que incluem o tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídios e de glicose por ligação e, desse modo, inibindo a atividade do complexo ANGPTL3/8.

[0015] Uma quantidade eficaz do Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento, ou um sal farmaceuticamente aceitá- vel do mesmo, pode ser usada para aumentar a atividade de LPL, di- minuir TGs e tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolis- mo de lipídeos e/ou glicose em um indivíduo em necessidade.

[0016] O Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento liga o complexo ANGPTL3/8 solúvel, aumentando assim a atividade de LPL e diminuindo os níveis séricos de TG. Indivíduos com níveis mais baixos de TG apresentam menor risco de doenças cardio- vasculares. Vantajosamente, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 des- crito no presente documento se liga apenas ao complexo ANGPTL3/8 e não a ANGPTL3 sozinho ou a ANGPTL8 sozinho em concentrações relevantes. Acredita-se que o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 au- menta o catabolismo de lipoproteínas ricas em TG (TRLs), o que reduz

TGs e/ou não-HDL-C, melhorando assim os fatores de risco de dislipi- demia para doença cardiovascular aterosclerótica (ASCVD) não trata- da por terapias atuais. Além disso, e devido ao Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 descrito no presente documento não se ligar a ANGPTL3 ou ANGPTL8 sozinho, outras ações desses ANGPTLs não são inibi- das, o que pode levar a menos efeitos indesejáveis in vivo, como re- dução da repressão de EL.

[0017] Em particular, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 é um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 humano. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode anular, bloquear, inibir, interferir, neu- tralizar ou reduzir a atividade in vivo do complexo ANGPTL3/8, especi- almente sua atividade inibidora de LPL. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser de comprimento total ou pode ser apenas um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um frag- mento Fab, F(ab')2 ou scFv). Propriedades desejáveis de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 incluem redução de TG em baixas doses do Ab, que é durável por pelo menos 21 dias.

[0018] Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 liga o complexo ANGPTL3/8 humano e inclui regiões determinantes de ca- deia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e regiões determinantes de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1 tem a sequência de aminoácidos RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 11), LCDR2 tem a sequência de aminoácidos YMLSYRAS (SEQ ID NO: 12) e LCDR3 tem a sequência de aminoácidos MQRIEFPLT (SEQ ID NO: 13), e em que HCDR1 tem a sequência de aminoácidos TFSGFSL- SISGVGVG (SEQ ID NO: 14), HCDR2 tem a sequência de aminoáci- dos LIYRNDDKRYSPSLKS (SEQ ID NO: 15) e HCDR3 tem a sequên- cia de aminoácidos ARTYSSGWYGNWFDP (SEQ ID NO: 16).

[0019] É ainda fornecido um Ab que inclui uma região variável da cadeia leve (LCVR), em que o LCVR tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou um Ab que inclui uma região variável da cadeia pesada (HCVR), em que o HCVR tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em alguns casos, o Ab inclui um LCVR com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um HCVR com a sequên- cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em alguns casos, o Ab inclui uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a LC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou a HC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Alternativamente, o Ab inclui uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a LC tem a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e a HC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certos casos, o Ab é um isotipo IgG4.

[0020] Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab descrito acima, especialmente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), um Mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas (por exemplo, mutações D33T e M56T ou mutações D33A e M56T), em relação a uma LC com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0021] Além disso, é fornecido um Ab que é produzido através do cultivo de uma célula de mamífero que inclui uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica polipeptídeos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e 6, sob tais condições em que os polipeptídeos são expressos, e se que recupera o Ab. Alternativamen- te, é fornecido um Ab que é produzido cultivando-se uma célula de mamífero incluindo duas moléculas de cDNA, em que uma primeira molécula de cDNA codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma segunda molécula de cDNA co- difica um polipeptídeo que tem o amino sequência de ácido de SEQ ID

NO: 6, sob tais condições em que os polipeptídeos são expressos e que recupera o Ab. Em alguns casos, o Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab descrito acima, especial- mente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas, em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0022] Além disso, é fornecido um Ab que se liga a e neutraliza ANGPTL3/8 humano complexa em um ensaio de atividade da LPL pa- drão com um EC50 de 0,5 nM ou menos. Além disso, é fornecido um Ab que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano com uma constante de dissociação menor ou igual a 1 x 10-6 M. Além disso, é fornecido um Ab que se liga a ANGPTL3 humano e ANGPTL8 humano com uma constante de dissociação de maior do que 1 x 10-6 M. Além disso, é fornecido um Ab que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano com um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação, conforme medido por ensaio ELISA de ponto único, mas não se liga para ANGPTL3 humano sozinho ou ANGPTL8 humano sozinho com um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação, conforme medido por ensaio ELISA de ponto único. Da mesma forma, é fornecido um Ab que reduz os TGs in vivo em pelo menos 50% quando comparado ao controle de IgG a uma dose de 10 mg/kg em um ponto de tempo 14 dias após a dosagem.

[0023] Em terceiro lugar, é fornecida uma composição farmacêuti- ca que inclui o Ab no presente documento ou uma população de Abs no presente documento e um veículo, diluente ou excipiente aceitável. Também é fornecida uma célula de mamífero incluindo uma molécula de DNA incluindo uma sequência polinucleotídica que codifica polipep- tídeos que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e SEQ

ID NO: 6, em que a célula é capaz de expressar um Ab no presente documento. É fornecida ainda uma célula de mamífero incluindo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA inclui uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e em que a segunda molécula de DNA inclui uma se- quência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e em que a célula é ca- paz de expressar um Ab no presente documento. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab des- crito acima, especialmente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas, em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0024] Em quarto lugar, é fornecido um processo para a produção de um Ab, em que o processo inclui o cultivo de uma célula de mamí- fero com uma molécula de DNA que tem uma sequência polinucleotí- dica que codifica polipeptídeos que tem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, em que a célula é capaz de ex- pressar o Ab no presente documento sob condições tais que o Ab é expresso e recuperar o Ab expresso. Em alguns casos, a sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo com a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 5 pode codificar uma mutação D31S, uma mutação D33A, uma mutação D33T, uma mutação M56T, uma muta- ção E99Q ou uma combinação dos mesmos. Também é fornecido no presente documento um método de tratamento de ASCVD, doença renal crônica (CKD), diabetes, hipertrigliceridemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), obesidade ou uma combinação dos mesmos,

em que o método inclui a administração a um indivíduo em necessida- de de um Ab no presente documento. É fornecido ainda um método de redução de TGs que inclui a administração a um indivíduo em neces- sidade de uma quantidade eficaz de um Ab no presente documento.

[0025] Em quinto lugar, um Ab é fornecido para uso em terapia. Em particular, o Ab é para uso no tratamento de ASCVD, CKD, diabe- tes, hipertrigliceridemia, NASH, obesidade ou uma combinação dos mesmos. Também é fornecida uma composição farmacêutica para uso no tratamento de ASCVD, CKD, diabetes, hipertrigliceridemia, NASH, obesidade ou uma combinação dos mesmos, que inclui uma quantida- de eficaz de um Ab no presente documento.

[0026] As vantagens, efeitos, recursos e objetos diferentes daque- les estabelecidos acima se tornarão mais facilmente evidentes quando for dada consideração à descrição detalhada abaixo. Essa descrição detalhada faz referência aos seguintes desenhos, em que:

[0027] A Figura 1 mostra uma imagem de um gel de página SDS que mostra o complexo ANGPTL3/8 executado sob condições reduzi- das e não reduzidas.

[0028] A referência a um elemento pelo artigo indefinido "um" ou "uma" não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um elemento. O artigo indefinido "um" ou "uma", portanto, ge- ralmente significa "pelo menos um."

DEFINIÇÕES

[0029] Conforme usado no presente documento, "cerca de" signifi- ca dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor ou valores como, por exemplo, uma concentração declarada, comprimen- to, peso molecular, pH, similaridade de sequência, período de tempo, temperatura, volume, etc. Tal valor ou o intervalo pode estar dentro de uma ordem de magnitude normalmente dentro de 20%, mais tipica-

mente dentro de 10% e ainda mais tipicamente dentro de 5% de um determinado valor ou intervalo. A variação permitida abrangida por "cerca de" dependerá do sistema particular em estudo e pode ser prontamente apreciada por um versado na técnica.

[0030] Conforme usado no presente documento, "afinidade" signi- fica uma força de ligação de um Ab a um epítopo em um complexo ANGPTL3/8.

[0031] Conforme usado no presente documento, "proteína seme- lhante a angiopoietina 3" ou "ANGPTL3" significa uma proteína com uma sequência de aminoácidos incluindo SEQ ID NO: 2.

[0032] Conforme usado no presente documento, "proteína seme- lhante a angiopoietina 8" ou "ANGPTL8" significa uma proteína com uma sequência de aminoácidos incluindo SEQ ID NO: 4.

[0033] Conforme usado no presente documento, "complexo ANG- PTL3/8" significa um complexo multiproteico de um ou mais compostos ANGPTL3 que estão ligados a um ou mais compostos ANGPTL8.

[0034] Conforme usado no presente documento, "Ab complexo anti-ANGPTL3/8" ou "Ab complexo anti-ANGPTL3/8" significa um Ab que simultaneamente reconhece e se liga a uma área em ANGPTL3 e ANGPTL8, especialmente quando na forma de ANGPTL3/8 complexo. Geralmente, um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 geralmente não se liga a outros membros da família ANGPTL (por exemplo, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 ou ANGPTL7). Além dis- so, e conforme observado em outro lugar, um Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 também não se ligará a ANGPTL3 ou ANGPTL8 sozinho em concentrações especificadas, conforme descrito no ensaio ELISA de ponto único abaixo.

[0035] Conforme usado no presente documento, "ligar" ou "liga- rem" significa uma capacidade de uma proteína de formar um tipo de ligação química ou força atrativa com outra proteína ou molécula, con-

forme determinado por métodos comuns conhecidos na técnica. A li- gação pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 1 x 10-6 M ou menos (isto é, um KD menor denota uma ligação mais forte). Métodos para determinar se duas mo- léculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exem- plo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície e se- melhantes. Aqui, um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 liga apenas o complexo ANGPTL3/8 e não liga ANGPTL3 sozinho ou ANGPTL8 so- zinho. Se um Ab se liga apenas ao complexo ANGPTL3/8 e não a ANGPTL3 sozinho ou ANGPTL8 sozinho pode ser determinado em ensaios ELISA padrão em um formato de ponto único, conforme des- crito abaixo e a ligação pode ser caracterizada por Biacore, conforme descrito abaixo. Embora os Abs no presente documento sejam huma- nos, podem, no entanto, exibir reatividade cruzada com outros com- plexos ANGPTL3/8 de outras espécies, por exemplo, complexo ANG- PTL3/8 de macaco cinomolgo, complexo ANGPTL3/8 de camundongo ou complexo ANGPTL3/8 de rato.

[0036] Conforme usado no presente documento, "quantidade efi- caz" significa uma quantidade ou dose de um composto ou uma com- posição farmacêutica que contém o mesmo, que após administração de dose única ou múltipla a um indivíduo, irá provocar uma resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sis- tema, animal, mamífero ou humano que é procurado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. Em alguns casos, uma quantidade eficaz de um composto no presente documento ou composições que incluem o mesmo para um indivíduo em necessidade resultaria no aumento da atividade de LPL. Uma dose pode incluir uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma dose mais baixa. Uma dose pode ser administrada em qualquer intervalo terapeuticamente eficaz, como várias vezes ao dia, uma vez ao dia, a cada dois dias, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, etc. Uma dose que constitui uma quantidade eficaz pode estar entre 0,01 mg/kg e 100 mg/kg.

[0037] Conforme usado no presente documento, "constante de dissociação de equilíbrio" ou "KD" significa uma medição quantitativa da afinidade de Ab para uma interação de antígeno particular, como afinidade de um Ab para o complexo ANGPTL3/8, especialmente uma medida de uma propensão de um conjugado complexo Ab/ANGPTL3/8 para separar reversivelmente em suas partes componentes. Da mes- ma forma, e conforme usado no presente documento, "constante de associação de equilíbrio" ou "Ka" significa um inverso de KD.

[0038] Conforme usado no presente documento, "funcional" signi- fica que uma proteína de fusão ANGPTL3, proteína de fusão ANG- PTL8 ou complexo ANGPTL3/8 tem atividade biológica semelhante à de um ANGPTL3 nativo, um ANGPTL8 nativo ou um complexo ANG- PTL3/8 nativo incluindo, por exemplo, a inibição de LPL ou agindo co- mo um antígeno para o qual um Ab pode ser feito e direcionado.

[0039] Conforme usado no presente documento, "doença ou dis- túrbio relacionado ao metabolismo da glicose" significa diabetes e se- melhantes.

[0040] Conforme usado no presente documento, "doença ou dis- túrbio relacionado ao metabolismo lipídico" significa uma afecção as- sociada ao metabolismo lipídico anormal, como dislipidemia, hiperlipi- demia e hiperlipoproteinemia, incluindo hipertrigliceridemia, hipercoles- terolemia, quilomicronemia, dislipidemia mista (obesidade, síndrome metabólica, diabetes, etc.), lipodistrofia e lipoatrofia. O termo também abrange certas doenças cardiovasculares, como aterosclerose e do- ença arterial coronariana, pancreatite aguda, NASH, obesidade e se- melhantes.

[0041] Conforme usado no presente documento, "metade da con- centração efetiva máxima" ou "EC50" significa uma concentração de um Ab (tipicamente expresso em unidades molares (M)) que induz uma resposta a meio caminho entre uma linha de base e um máximo após um período de tempo predeterminado. O EC50 no presente do- cumento descrito é idealmente de 3,0 nM ou menos.

[0042] Conforme usado no presente documento, "construção de ácido nucleico" ou "cassete de expressão" significa uma molécula de ácido nucleico com pelo menos uma sequência de controle operacio- nalmente ligada a uma sequência de codificação. Desse modo, uma sequência de controle, como um promotor, está em interação operável com as sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um polipeptídeo de interesse, como as proteínas de fusão ANGPTL3 des- critas no presente documento e/ou as proteínas de fusão ANGPTL8 descritas no presente documento. Tais construções de ácido nucleico podem estar na forma de uma expressão ou cassete de transferência. Um construto de ácido nucleico pode incluir um composto oligonucleo- tídeo ou polinucleotídeo de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos que tem incorporados nos mesmos as sequências de nucleotídeos para um ou mais polipeptídeos de interes- se.

[0043] Conforme usado no presente documento, "operacionalmen- te ligado" significa que os elementos de um construto de ácido nuclei- co são configurados de modo a desempenhar sua função usual. As- sim, as sequências de controle (isto é, promotores) operativamente ligadas a uma sequência de codificação são capazes de efetuar a ex- pressão da sequência de codificação. As sequências de controle não precisam ser contíguas à sequência de codificação, desde que funcio- nem para direcionar sua expressão (isto é, manter a estrutura de leitu- ra adequada). Assim, por exemplo, sequências intermediárias não tra-

duzidas, embora transcritas, podem estar presentes entre um promotor e uma sequência de codificação, e a sequência do promotor ainda po- de ser considerada "operacionalmente ligada" à sequência de codifi- cação.

[0044] Conforme usado no presente documento, "sequência de controle" ou "sequências de controle" significa promotores, sinais de poliadenilação, sequências de terminação de transcrição e tradução, domínios reguladores a montante, origens de replicação, locais de en- trada de ribossomo interno ("IRES"), potencializadores e semelhantes, que fornecem coletivamente para replicação, transcrição e tradução de uma sequência de codificação em uma célula hospedeira receptora. Nem todas essas sequências de controle precisam estar sempre pre- sentes, desde que a sequência de codificação selecionada seja capaz de ser replicada, transcrita e traduzida em uma célula hospedeira apropriada.

[0045] Conforme usado no presente documento, "sequência de codificação" ou "sequências de codificação" significa uma sequência de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos de inte- resse e é uma sequência de ácido nucleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de RNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocado sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Os limites da sequência (ou sequências) de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5 '(amino) e um códon de parada da tradução no terminal 3' (carbóxi). Uma sequência de codificação pode incluir, mas sem limitação, sequências de ácido nucleico viral, cDNA de mRNA procariótico ou eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA procariótico ou eucariótico ou mesmo se- quências de DNA sintético.

[0046] No que diz respeito às sequências de controle e de codifi- cação, podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou entre si.

Alternativamente, as sequências de controle e de codificação podem ser heterólogas para a célula hospedeira ou entre si.

[0047] Conforme usado no presente documento, "promotor" signi- fica uma região de nucleotídeo composta por uma sequência regulado- ra de ácido nucleico, em que a sequência reguladora é derivada de um gene ou criada sinteticamente e é capaz de se ligar à RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência a jusante (direção 3') sequên- cia de codificação. Vários promotores podem ser usados em constru- ções de ácido nucleico, incluindo um promotor nativo para um ou mais polipeptídeos de interesse. Alternativamente, os promotores podem ser selecionados com base em um resultado desejado. Esses promo- tores podem incluir, mas sem limitação, promotores indutíveis, promo- tores reprimíveis e promotores constitutivos.

[0048] Conforme usado no presente documento, "variante" signifi- ca um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que tem uma ou mais modi- ficações, como uma adição, deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais ácidos nucleicos específicos ou resíduos de aminoácidos quando comparados a um ácido nucleico ou aminoácido de referência sequência de ácido. Uma variante, portanto, inclui uma ou mais altera- ções quando comparada ao ácido nucleico de referência ou sequência de aminoácidos. Aqui, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ter uma variação LC ou HC. Em particular, o Ab pode ser uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Da mesma forma, a variante LC pode ser uma combinação de qual- quer um dos dois acima, como, por exemplo, mutações D31S e D33A, mutações D31S e D33T, mutações D31S e M56T, mutações D31S e E99Q, mutações D33A e M56T, mutações D33A e E99Q, Mutações

D33T e M56T, mutações D33T e E99Q e M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Além disso, a variante LC pode ser uma combinação de qualquer um dos três acima, como, por exemplo, mutações D31S, D33A e M56T, mutações D31S, D33A e E99Q, mutações D31S, D33T e M56T, mutações D31S, D33T e E99Q, D33A, mutações M56T e E99Q, e mutações D33T, M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Além disso, a variante LC pode ser uma combinação de quaisquer quatro dos acima, como, por exemplo, mutações D31S, D33A, M56T e E99Q; e mutações D31S, D33T, M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0049] Conforme usado no presente documento, "vetor" significa um replicon, como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outra se- quência de ácido nucleico, como um cassete de expressão, pode ser anexada de modo a provocar a replicação da sequência anexada. Um vetor é capaz de transferir moléculas de ácido nucleico para células hospedeiras. Os vetores normalmente incluem um ou um pequeno número de locais de reconhecimento de endonuclease de restrição em que uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser inserida de uma forma determinável sem perda da função biológica essencial do vetor, bem como um marcador selecionável que pode ser usado para identificar e selecionar células hospedeiras transformadas com o vetor. Um vetor para esse fim pode ser capaz de transferir sequências de ácido nucleico para células alvo.

[0050] Conforme usado no presente documento, "tratamento" ou "tratar" significa gerenciamento e cuidado de um indivíduo com uma afecção para a qual a administração de Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 é indicada com o propósito de combater ou aliviar os sin- tomas e complicações dessas afecções. O tratamento inclui a adminis-

tração de um composto ou composições que contêm um composto no presente documento a tal indivíduo para prevenir o aparecimento de sintomas ou complicações, aliviar os sintomas ou complicações ou eliminar a doença, afecção ou distúrbio. O tratamento inclui a adminis- tração de um composto ou composições que contêm um composto no presente documento a um indivíduo em necessidade do mesmo para resultar no aumento da atividade de LPL e redução de TGs. O indiví- duo a ser tratado é um animal, especialmente um ser humano.

[0051] Conforme usado no presente documento, "paciente", "sujei- to" e "indivíduo" são usados de forma intercambiável no presente do- cumento e significam um animal, especialmente um humano. Em cer- tos casos, o indivíduo é um ser humano e é ainda caracterizado com uma doença, distúrbio ou afecção que se beneficiaria da administração de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8.

[0052] Conforme usado no presente documento, "anticorpo" ou "Ab" e semelhantes significa um Ab de comprimento total incluindo du- as cadeias pesadas e duas cadeias leves com ligações dissulfeto inter e intracadeias. A porção amino-terminal de cada uma das quatro ca- deias polipeptídicas inclui uma região variável principalmente respon- sável pelo reconhecimento do antígeno. Cada HC inclui um HCVR de terminal N e uma região constante de HC (HCCR). Cada cadeia leve inclui uma região variável de cadeia leve (LC) (LCVR) e uma região constante LC (LCCR). Aqui, o Ab é uma imunoglobulina G (IgG) do tipo Ab e o isotipo IgG pode ser dividido em subclasses (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). As regiões HCVR e LCVR podem ser subdi- vididas em regiões de hiper-variabilidade, denominadas regiões de- terminantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada HCVR e LCVR inclui três CDRs e quatro FRs, organizados do terminal N ao terminal C na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2,

FR3, CDR3, FR4. Aqui, os três CDRs do HC são chamados de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e os três CDRs do LC são chamados de LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Os CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com um antígeno, como um com- plexo ANGPTL3/8. A atribuição dos resíduos às várias CDRs pode ser feita por algoritmos como, por exemplo, Chothia, Kabat ou North. A defi- nição de CDR do Norte é baseada no agrupamento de propagação de afinidade com um grande número de estruturas cristalinas (North et al. (2011) J. Mol. Bio. 406: 228-256). Aqui, os CDRs são mais bem definidos pelas sequências listadas na Listagem de Sequências, que são base- adas em uma combinação de múltiplas definições, incluindo Norte.

[0053] Um DNA isolado que codifica uma região HCVR pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligan- do operacionalmente o DNA que codifica HCVR a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada. As sequên- cias de genes da região constante da cadeia pesada de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os frag- mentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação de PCR padrão.

[0054] Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. As sequências de genes da região constante da cadeia leve de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

[0055] Os Abs no presente documento podem conter uma porção Fc de IgG4-PAA. A porção Fc de IgG4-PAA tem uma mutação Ser para

Pro na posição 231 (S231P), uma mutação Phe para Ala na posição 237 (F237A) e uma mutação Leu para Ala na posição 238 (L238A) numerada pela posição absoluta na SEQ ID NO: 6. A mutação S231P é uma muta- ção em dobradiça que impede a formação de meio-Ab (fenômeno de troca dinâmica de meias-moléculas em Abs de IgG4). As mutações F237A e L238A reduzem ainda mais a função efetora do já baixo isoti- po IgG4 humano. É contemplado, no entanto, que o Abs no presente documento pode incluir alternativamente uma porção Fc diferente.

[0056] Para reduzir o potencial de indução de uma resposta imune quando administrado em humanos, certos aminoácidos podem exigir mutações reversas para corresponder às sequências da linha germina- tiva de Ab.

[0057] As composições farmacêuticas, incluindo os compostos no presente documento descritos, podem ser administradas por via pa- rentérica a indivíduos que necessitem de tal tratamento. Esse indiví- duo pode ter ASCVD ou estar em alto risco para ASCVD. Esses indi- víduos podem ter síndromes coronárias agudas, história de infarto do miocárdio (MI), angina estável ou instável, revascularização coronária ou outra arterial, acidente vascular cerebral, ataque isquêmico transitó- rio (AIT), aneurisma da aorta torácica ou abdominal ou doença arterial periférica presumivelmente de origem aterosclerótica. Indivíduos com alto risco para ASCVD podem ainda ter diabetes tipo 2 (T2D), CKD ou hipercolesterolemia familiar (FH).

[0058] A administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta ou injetor acionado mecanica- mente. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realiza- da por meio de uma bomba de infusão. Em alguns casos, as composi- ções farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Essas composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer uma de uma varie- dade de técnicas usando excipientes convencionais para produtos farmacêuticos que são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (DB Troy ed., 21ª Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0059] Os compostos no presente documento podem ser usados em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis para modular a atividade da LPL, tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos ou tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolismo da glico- se, incluindo qualquer um dos distúrbios listado acima. Exemplos não limitativos dos agentes terapêuticos adicionais que podem ser combi- nados com os compostos reivindicados incluem, mas sem limitação, agentes antidiabéticos, como insulina ou análogos de insulina, bigua- nidas, sulfonilureias, tiazolidinedionas, dipeptidil peptidase-4 ("DPP-4") inibidores ou inibidores do veículo de glicose dependente de sódio (SGLT2); compostos de incretina, como peptídeo semelhante a gluca- gon-1 (GLP-1) ou análogos de GLP-1, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP) ou análogos de GIP, oxintomodulina (OXM) ou análogos de OXM; aspirina; agentes antiplaquetários; Bloqueadores do receptor H2; inibidores da bomba de protões; anti-hipertensivos; terapias modi- ficadoras de lipídios, como inibidores da HMG-CoA redutase, inibido- res da PCSK9, inibidores da absorção do colesterol, fibratos, niacina, agonistas LXR, agonistas RXR, agonistas ROR ou moduladores rever- sos do transporte do colesterol; terapias para insuficiência cardíaca, como ACE, inibidores da neprilisina do receptor da angiotensina, ARB ou antagonistas adrenérgicos B; terapias antiinflamatórias; terapias de hipertensão, terapias de fibrilação atrial; terapias de neurodegenera- ção; terapias oncológicas; terapias para cardiomiopatia diabética, reti-

nopatia diabética, neuropatia diabética, nefropatia diabética, redução de peso, cicatrização de feridas; terapias de nefropatia; Terapias PAD ou combinações de qualquer um dos agentes anteriores. O Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 e o um ou mais agentes terapêuticos adici- onais podem ser administrados juntos através da mesma via de distri- buição e dispositivo, como um único comprimido, cápsula, comprimido ou formulação injetável; ou administrados separadamente ao mesmo tempo em dispositivos ou rotas de entrega separados; ou administrado sequencialmente. PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE COMPLEXOS ANGPTL3/8

[0060] Um aspecto da divulgação são os complexos ANGPTL3/8 que podem ser usados para fazer um Ab que se liga ao complexo apenas e não se liga a ANGPTL3 sozinho ou a ANGPTL8 sozinho. Embora Abs anti-ANGPTL3 e Abs anti-ANGPTL8 sejam conhecidos, existe um desafio em sintetizar quantidades suficientes de complexos ANGPTL3/8 funcionais, especialmente complexos ANGPTL3/8 huma- nos, para fazer o complexo Abs anti-ANGPTL3/8. Adicional ou alterna- tivamente, tais complexos ANGPTL3/8 podem ser usados em ensaios para avaliar as propriedades de Abs direcionados aos complexos AN- GPTL3, ANGPTL8 e/ou ANGPTL3/8.

[0061] Desta maneira, a divulgação também descreve métodos de geração de ANGPTL8 tornando-a uma proteína de fusão de albumina sérica N ou C-terminal (por exemplo, humano, camundongo ou coe- lho). Os complexos funcionais ANGPTL3/8 podem então ser feitos co- expressando a proteína de fusão ANGPTL8 com ANGPTL3 nativa ou uma proteína de fusão ANGPTL3 em um sistema de expressão de mamífero.

[0062] Como observado acima, as sequências de aminoácidos e nucleicos para ANGPTL3 nativo, humano e ANGPTL8 nativo, humano são conhecidas (consultar, por exemplo, SEQ ID NOS: 1-2 e 3-4, res-

pectivamente). ANGPTL3 ou ANGPTL 8 conforme descrito no presen- te documento, no entanto, são modificados (isto é, recombinan- tes/sintéticos) e, portanto, diferem das sequências nativas incluindo sequências de aminoácidos adicionais para melhorar a geração, se- gregação e/ou complexação de ANGTPL3 e ANGTPL8.

[0063] Por exemplo, ANGPTL3 pode ser modificado para incluir um ou mais ligantes e etiquetas como são conhecidos na técnica. Aqui, ANGPTL3 humano (SEQ ID NO: 2) é modificado para incluir um ligante e etiqueta FLAG de modo que a proteína de fusão ANGPTL3 tenha uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em alguns casos, o ligante pode ser de cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos, como 3 aminoácidos, especialmente 3 resíduos de Ala. O ligante e a etiqueta FLAG podem ser colocados no terminal N ou C da sequência ANGPTL3, especialmente no terminal C como em SEQ ID NO: 17, em que os resíduos 1-460 correspondem a ANGPTL3, e os resíduos 461- 471 correspondem para o ligante 3-Ala e a etiqueta FLAG.

[0064] Da mesma forma, ANGPTL8 pode ser modificado para in- cluir um ou mais ligantes e marcadores além de uma sequência para albumina de soro, especialmente albumina de soro humano. Aqui, ANGPTL8 humano (SEQ ID NO: 4) é modificado para incluir um ligan- te, um peptídeo sinal IgG capa, uma poli-histidina (His)-etiqueta, albu- mina sérica humana madura, um ligante e um local de clivagem PreS- cission® de modo que a proteína de fusão ANGPTL8 tem uma se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em alguns casos, o ligan- te pode ser de cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos, como uma repe- tição de poliprolina rígida, especialmente um ligante Ala-Pro (AP)-10. O peptídeo de sinal, His-tag, HSA maduro, ligante e local de clivagem PreScission® podem ser colocados no terminal N ou C da sequência ANGPTL8, especialmente no terminal N como em SEQ ID NO: 18, em que os resíduos 1-20 correspondem ao peptídeo de sinal IgG capa, os resíduos 21-27 correspondem ao His-tag, os resíduos 28-612 corres- pondem a HSA, os resíduos 613-632 correspondem ao ligante AP-10, os resíduos 633-643 correspondem ao local de clivagem PreScissi- on®, e os resíduos 644-820 correspondem a ANGPTL8.

[0065] Métodos de construção de construtos de ácido nucleico pa- ra expressar a proteína de fusão ANGPTL3 e/ou a proteína de fusão ANGPTL8, conforme descrito no presente documento, são bem co- nhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Bal- bás & Lorence, "Recombinant Gene Expression: Reviews and Proto- cols" (2ª Ed. Humana Press 2004); Davis et al., "Basic Methods in Mo- lecular Biology" (Elsevier Press 1986); Sambrook & Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Tijssen, "Laboratory Techniques in Biochemistry and Mo- lecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes" (Elsevier 1993); e "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al. eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience 1995); bem como as patentes números US 6.664.387; 7.060.491; 7.345.216 e 7.494.805. Como AN- GPTL8 não contém nenhuma ligação dissulfeto, os sistemas de ex- pressão de mamíferos podem ser usados. Aqui, os sistemas de ex- pressão HEK293 ou sistemas de expressão CHO podem ser usados para gerar as proteínas de fusão ANGPTL3 e/ou ANGPTL8, especial- mente por co-expressão.

[0066] Além de expressar a proteína de fusão ANGPTL3 e/ou a proteína de fusão ANGPTL8, os métodos também podem incluir a puri- ficação das proteínas de fusão resultantes com base na marca particu- lar usada para cada proteína de fusão, que são bem conhecidas na técnica. No que diz respeito às proteínas de fusão ANGPTL3 e ANG- TPL8 descritas no presente documento, a purificação pode resultar em uma série de truncamentos após a remoção dos marcadores de modo que a proteína de fusão ANGPTL3 tenha uma sequência de aminoáci-

dos de SEQ ID NO: 19 (em que os resíduos 1-444 correspondem a ANGPTL3, e os resíduos 445-455 correspondem ao ligante 3-Ala e etiqueta FLAG) e a proteína de fusão ANGPTL8 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (em que os resíduos 1-4 corres- pondem a resíduos de clivagem do local de clivagem PreScission®, e os resíduos 5-182 correspondem a um fragmento de ANGPTL8), que prontamente se associam um ao outro para formar complexos ANG- PTL3/8 funcionais.

PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

[0067] Abs de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser produzido em um sistema de expressão de células de mamífero usando uma linha de células CHO GSKO. Um nocaute do gene da glutamina sintetase (GS) permite restringir a seleção por meio da eliminação da atividade de fundo da GS endógena, o que pode permitir a sobrevivência de cé- lulas de baixa ou não produtiva sob condições de seleção. Os genes que codificam para o Ab HC e LC no presente documento podem ser subclonados em plasmídeos de expressão que contém GS individuais para co-transfecção ou ambas as cadeias podem ser subclonadas em um único plasmídeo de expressão que contém GS. A sequência de cDNA que codifica a HC ou LC é fundida em quadro com a sequência de codificação de um peptídeo sinal, que pode ser a sequência líder capa murina, para aumentar a secreção do produto desejado no meio de cultura celular. A expressão é dirigida pelo promotor do citomegalo- vírus viral (CMV).

[0068] As células CHO GSKO são transfectadas de forma estável usando electroporação e a quantidade apropriada de plasmídeos de expressão de HC e LC recombinantes, e as células transfectadas são mantidas em cultura em suspensão, na densidade celular adequada. A selecção das células transfectadas é conseguido pelo crescimento em 25 µM de metionina sulfoximina (MSX) livre de glutamina que contém meio livre de soro e incubou-se a 32-37 ºC e 5%-7% de CO2. Os abs são secretados no meio a partir das células CHO. Os Abs podem ser purificados por cromatografia de afinidade de Proteína A seguida por troca aniônica ou cromatografia de interação hidrofóbica (ou outros métodos adequados) e podem utilizar cromatografia de exclusão por tamanho para purificação adicional.

[0069] Abs do meio colhido são capturados na resina A de proteí- na MabSelect SuRe (GE Healthcare). A resina é então lavada breve- mente com um tampão de corrida, como uma solução salina tampona- da com fosfato (PBS) pH 7,4 ou um tampão de corrida que contém Tris, para remover o material não especificamente ligado. Os Abs são então eluídos da resina com uma solução de baixo pH, como ácido acético 20 mM/ácido cítrico 5 mM. As frações que contêm Abs ANG- PTL3/8 são agrupadas e podem ser mantidas em um pH baixo para inativar vírus potenciais. O pH pode ser aumentado conforme necessá- rio adicionando uma base como Tris 0,1 M pH 8,0. Abs ANGPTL3/8 pode ser posteriormente purificado por cromatografia de interação hi- drofóbica (HIC) usando resinas como Phenyl HP (GE Healthcare). Abs anti-ANGPTL3/8 pode ser eluído da coluna HIC usando um gradiente de sulfato de sódio em Tris 20 mM, pH 8,0. O Abs anti-ANGPTL3/8 pode ser posteriormente purificado por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) com elui- ção isocrática em PBS, pH 7,4.

[0070] Os compostos no presente documento descritos são prepa- rados deste modo ou de um modo semelhante que seria facilmente determinado por um especialista na técnica.

[0071] Camundongos que abrigam domínios de cadeias leve e pe- sada variáveis humanas são imunizados com o complexo ANGPTL3/8 descrito acima, e células B específicas de antígeno único são isoladas por FACS usando ANGPTL3/8 (positivo) e ANGPTL3 (negativo) como marcadores. O DNA da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve é recuperado de células B individuais por PCR e clonado em veto- res de expressão de IgG. Os sobrenadantes das células CHO são tes- tados após transfecção quanto à atividade de ligação.

EXEMPLOS

[0072] Os seguintes exemplos não limitativos são oferecidos para fins de ilustração, não de limitação. EXEMPLO 1: FABRICAÇÃO DE COMPLEXOS ANGPTL3/8

[0073] Expressão de ANGPTL3 e ANGPTL8: sequências de nu- cleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos para ANG- PTL3 humano, um ligante e uma etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 17) são inseridos em um vetor de expressão de mamífero que contém um promotor CMV. Da mesma forma, as sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos para ANGTPL8 humano, peptídeo sinal IgG capa de camundongo, HIS-etiqueta, albumina de soro humano maduro (HSA) -PreScission® local de clivagem (SEQ ID NO: 18) são inseridas em um vetor de expressão de mamífero que contém um promotor CMV. A expressão da proteína é através da co- transfecção transitória de ambos os vetores de expressão descritos acima em células HEK293F cultivadas em meio sem soro. O meio de cultura é colhido 5 dias após a transfecção e armazenado a 4 ºC para subsequente purificação da proteína.

[0074] Purificação de proteína: a purificação de proteína é condu- zida a 4 ºC, em que 4 l de meio de cultura são suplementados com Tris-HCl 1 M (pH 8,0) e NaCl 5 M para uma concentração final de 25 mM e 150 mM, respectivamente. Os meios são então incubados com 150 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) durante a noite. A resina é colocada em uma coluna e é lavada com Tampão A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,3 M). A proteína é eluída com gradiente de imidazol 0-300 mM em Tampão A. As frações contendo HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-

Flag são reunidas, concentradas e carregadas em uma coluna HiLo- ad® Superdex® 200 (GE Healthcare Biosciences) e eluídas com Tam- pão A. As frações que contêm HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag são novamente reunidas, concentradas e digeridas com PreScission® Protease (GE Healthcare Biosciences) para remover HSA da proteína de fusão HIS-HSA-ANGPTL8. A amostra de proteína digerida por PreScission® é carregada em uma coluna HiLoad® Superdex® 200 e é eluída com tampão de armazenamento (HEPES 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM). As frações que contêm o complexo ANGPTL3/8 são reunidas e concentradas, com a concentração de proteína determina- da usando o método de Bradford. O complexo ANGTPL3/8 é dividido em alíquotas e armazenado a -80 ºC até uso posterior.

[0075] Ensaio de atividade LPL: Um ensaio EnzCheck® LPL é rea- lizado de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher Scienti- fic). Resumidamente, ANGPTL3 e os complexos ANGPLT3/8 são diluí- dos em série em meio de crescimento e substituídos por meio de células LPL por 1 hora de incubação. EnzCheck® Lipase Substrate (ELS) é en- tão adicionado em células que expressam LPL e é incubado por 30 minu- tos. A fluorescência é medida a 482 nm/515 nm (excitação/emissão, res- pectivamente). A% de inibição de ANGPTL3 e 3/8 em LPL é calculada. RESULTADOS:

[0076] A Tabela 1 mostra o rendimento da proteína do complexo ANGTPL3/8 nos vários estágios de purificação/concentração. TABELA 1: RENDIMENTO DA PROTEÍNA DO COMPLEXO ANG- PTL3/8. Iniciar Rendimento de re- 1º Rendimento da colu- 2º Rendimento da colu- (L) sina Ni-NTA (mg) na Superdex® 200 (mg) na Superdex® 200 (mg) 4 105 47 12

[0077] Da mesma forma, a Figura 1 mostra 4-20% de gel corado de TG TGX Coomassie do complexo ANGPTL3/8 purificado e concen- trado resultante das colunas, o que confirma que os complexos se formam/montam. Após purificação e concentração, ANGTL3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e ANGPTL8 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0078] No ensaio LPL, o EC50 de ANGPTL3 é 21,5 nM, enquanto que o EC50 do complexo ANGTPL3/8 é 0,54 nM, o que confirma que os complexos são funcionais. EXEMPLO 2: ENSAIOS

[0079] Ensaio ELISA de Ponto Único (SPE): A seletividade de li- gação de Ab para o complexo ANGPTL3/8, ANGPTL3 livre ou ANG- PTL8 livre é inicialmente verificada usando ensaios ELISA padrão em um formato de ponto único. Resumidamente, as placas de ensaio são revestidas com um Fc Ab anti-humano a uma concentração de 2 µg/ml e subsequentemente bloqueadas com caseína. IgG secretado em so- brenadantes após expressão em células CHO são então capturados para a placa de ensaio. O antígeno biotinilado é adicionado a uma concentração de 25 nM para permitir a ligação Ab/antígeno. Os com- plexos Ab/antígeno são detectados após a adição de neutravidina con- jugada com fosfatase alcalina e substrato de fosfatase alcalina, e sub- sequente medição da densidade óptica a 560 nm. A ligação positiva é determinada por um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação.

[0080] Ensaio ELISA: A seletividade de ligação de Ab para o com- plexo ANGPTL3/8, ANGPTL3 livre ou ANGPTL8 livre é verificada usando ensaios ELISA padrão. Resumidamente, as placas de ensaio são revestidas com um Fc Ab anti-humano a uma concentração de 2 µg/ml e subsequentemente bloqueadas com caseína. O Ab dos sobre- nadantes de CHO após a expressão em células CHO é então captura- do para a placa de ensaio e o resultado é uma concentração de Ab de 2 µg/ml. Antígeno biotinilado (ANGPTL3, ANGPTL8 ou complexo AN- GPTL3/8) é adicionado em concentrações variáveis por diluição em série para permitir a ligação Ab/antígeno. Os complexos Ab/antígeno são detectados após a adição de neutravidina conjugada com fosfa- tase alcalina e substrato de fosfatase alcalina, e subsequente medição da densidade óptica a 560 nm. TABELA 2: SELETIVIDADE DE LIGAÇÃO DE Ab AO COMPLEXO ANGPTL3/8, ANGPTL8 E ANGPTL3 EM UM ENSAIO SPE. Ligação do complexo Ligação ANG- Ligação ANG- ANGPTL3/8 PTL8 PTL3 Ab 2,302 (positivo) 0,087 (negativo) 0,074 (negativo) D31S 0,928 0,072 0,058 D33A 0,898 0,118 0,076 D33T 0,661 0,070 0,060 M56T 0,775 0,085 0,060 E99Q 1,538 0,100 0,083 Sinal de fundo não 0,09 0,07 0,08 vinculativo médio 3 x fundo 0,27 0,21 0,24

[0081] Os valores são densidade óptica (OD) a 560 nm, e o sinal de fundo não vinculativo em todas as placas testadas em média é re- fletido na linha "Sinal de fundo". Esse controle negativo mostra o sinal de fundo na ausência de Ab.

[0082] No ensaio SPE, o Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6 mostra ligação positiva ao complexo ANG- PTL3/8 humano e ligação negativa a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano. Abs com variantes LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 24), uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24) ou uma muta- ção E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 também mos- tram ligação ao complexo ANGPTL3/8 humano e ligação negativa a ANGPTL8 humano e ANGPTL humano.

TABELA 3: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB A VÁRIAS CON- CENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 Complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,072 0,076 0,081 0,091 2,705 0,063 33,3 0,050 0,060 0,052 0,063 2,411 0,056 11,1 0,045 0,051 0,046 0,052 1,708 0,047 3,70 0,051 0,048 0,046 0,052 1,042 0,046 1,23 0,043 0,048 0,043 0,052 0,510 0,046 0,412 0,046 0,050 0,043 0,067 0,231 0,046 0,137 0,047 0,053 0,048 0,055 0,110 0,044 0,046 0,051 0,054 0,060 0,069 0,078 0,053

[0083] O controle é tampão e sem Ab.

[0084] O Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6 mostra ligação positiva ao complexo ANGPTL3/8 humano de uma maneira dependente da concentração e nenhuma ligação detec- tável a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano até um antígeno con- centração de 100 nM nesse ensaio (Tabela 3).

[0085] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são ensaiados e da mesma forma mostram ligação positiva ao complexo ANGPTL3/8 humano de uma maneira dependente da concentração e não detectável ligação a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano até uma concentração de antígeno de 100 nM nesse ensaio (Tabelas 4-6).

TABELA 4: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB VARIANTE D31S A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,098 0,076 0,084 0,081 2,471 0,092 33,3 0,063 0,065 0,069 0,064 2,226 0,068 11,1 0,062 0,059 0,062 0,062 1,735 0,053 3,70 0,056 0,055 0,060 0,057 1,134 0,049 1,23 0,058 0,049 0,059 0,058 0,575 0,048 0,412 0,062 0,049 0,058 0,057 0,234 0,047 0,137 0,080 0,077 0,057 0,076 0,137 0,068 0,046 0,096 0,085 0,060 0,064 0,149 0,075

TABELA 5: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE D33A VARIANTE Ab A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,078 0,076 0,082 0,081 2,388 0,092 33,3 0,049 0,065 0,067 0,064 2,179 0,068 11,1 0,048 0,059 0,060 0,062 1,635 0,053 3,70 0,048 0,055 0,056 0,057 1,040 0,049 1,23 0,049 0,049 0,057 0,058 0,491 0,048 0,412 0,047 0,049 0,056 0,057 0,196 0,047 0,137 0,053 0,077 0,062 0,076 0,101 0,068 0,046 0,074 0,085 0,062 0,064 0,111 0,075

TABELA 6: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB VARIANTE E99Q A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,098 0,076 0,084 0,081 2,471 0,092 33,3 0,063 0,065 0,069 0,064 2,226 0,068 11,1 0,062 0,059 0,062 0,062 1,735 0,053 3,70 0,056 0,055 0,060 0,057 1,134 0,049 1,23 0,058 0,049 0,059 0,058 0,575 0,048 0,412 0,062 0,049 0,058 0,057 0,234 0,047 0,137 0,080 0,077 0,057 0,076 0,137 0,068 0,046 0,096 0,085 0,060 0,064 0,149 0,075 EXEMPLO 3: AFINIDADE DO RECEPTOR IN VITRO

[0086] A cinética de ligação pode ser determinada usando um ins- trumento Biacore® T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscata- way, NJ). A superfície de um chip sensor CM4 pode ser preparada por acoplamento covalente de Human Fab Binder (GE Healthcare Bio- Sciences Corp.). As experiências cinéticas podem ser realizadas a cerca de 25 ºC em um tampão de corrida de HBSEP+, BSA a 0,01% a pH 7,4. Abs pode ser capturado e uma série de concentração de com- plexo de camundongo, cino ou humano ANGPTL3/8 pode ser injetada sobre a superfície do chip em cerca de 50 ul/min por cerca de 240 se- gundos com um tempo de dissociação de cerca de 800 segundos. Pa- ra determinar os parâmetros cinéticos (por exemplo, ka, kd, KD), os da- dos são duplamente referenciados e ajustados a um modelo de liga- ção 1: 1 usando o software de avaliação Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A Tabela 7, abaixo, mostra a ligação de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6 a vários complexos ANGPTL3/8 de diferentes espécies em pH 7,4 e temperatura 25ºC.

TABELA 7: LIGAÇÃO DE AB A COMPLEXOS DE ESPÉCIES CRU- ZADAS ANGPTL3/8 EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie ao Ab Camundongo 4,75 x 105 1,72 x 10-4 3,66 x 10-10 6,19 x 10-11 3 Cino 4,91 x 105 9,91 x 10-5 2,13 x 10-10 6,30 x 10-11 3 5 -5 -10 -11 Humano 4,77 x 10 6,31 x 10 1,35 x 10 2,69 x 10 2

[0087] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são testados quanto à ligação a vários complexos ANGPTL3/8 de diferentes espécies em pH 7,4 e temperatura 25ºC (Tabelas 8-10). TABELA 8: LIGAÇÃO DE D31S VARIANTE AB PARA CRUZAR ES- PÉCIES DE COMPLEXOS ANGPTL3/8 EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie a D31S Ab Camundongo 4,96 x 105 1,08 x 10-4 2,18 x 10-10 1,88 x 10-11 3 5 -4 -10 -11 Cino 4,62 x 10 1,68 x 10 3,65 x 10 1,50 x 10 3 Humano 4,97 x 105 5,75 x 10-5 1,16 x 10-10 1,91 x 10-11 3 TABELA 9: LIGAÇÃO DE D33A VARIANTE Ab A COMPLEXOS ANG- PTL3/8 DE ESPÉCIES EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 da espécie ao D33A Ab Camundongo 5,15 x 105 3,47 x 10-4 6,80 x 10-10 7,07 x 10-11 3 Cino 4,35 x 105 2,65 x 10-4 6,09 x 10-10 1,21 x 10-11 3 5 -5 -10 -11 Humano 4,57 x 10 9,19 x 10 2,01 x 10 1,75 x 10 3

TABELA 10: LIGAÇÃO DE E99Q VARIANTE Ab A COMPLEXOS AN- GPTL3/8 DE ESPÉCIES CRUZADAS EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie a E99Q Ab Camundongo 5,96 x 105 1,51 x 10-4 2,54 x 10-10 1,79 x 10-11 3 5 -5 -10 -12 Cino 6,20 x 10 7,23 x 10 1,16 x 10 8,58 x 10 3 Humano 6,74 x 105 3,26 x 10-5 4,84 x 10-11 6,50 x 10-12 3 EXEMPLO 4: ENSAIO LPL DE ATIVIDADE FUNCIONAL IN VITRO

[0088] Um bioensaio com base em células é usado para avaliar a capacidade do Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6 para reprimir a inibição da proteína purificada ANGPTL3/8 da atividade de LPL. A atividade inibi- tória de ANGPTL3/8 do Ab é determinada usando EnzChek™ Lipase Substrate (ThermoFisher). Linhagens celulares HEK293 que expres- sam LPL humana, cinomolgos, camundongo ou rato e proteína ANG- PTL3/8 humana purificada, cinomolgos, camundongo ou rato. A gera- ção de HEK293-LPL inclui uma linha de células embrionárias humanas que expressa estavelmente LPL humana, que é gerada (HEK293- huLPL) utilizando métodos padrão. Resumidamente, a LPL humana é clonada em um plasmídeo de lentivírus com um promotor CMV e resis- tência à blasticidina. O plasmídeo é usado para gerar um lentivírus LPL humano usando ViraPower Packaging Mix (Invitrogen). As células HEK293 são incubadas com o lentivírus LPL e clones resistentes à blasticidina são selecionados. Um clone é escolhido após a confirma- ção da expressão de mRNA de LPL humana por qPCR e atividade de LPL utilizando o substrato EnzChek™. Esse processo é repetido para LPL de cinomolgos, camundongos e ratos.

[0089] Os métodos são modificados daqueles descritos em Basu et al. (Basu et al. (2011) J. Lipid Res. 52: 826-832): (a) Células HEK293- LPL são adicionadas a uma placa A revestida com poli-D-lisina de 96 poços de meia área (humano), B (cinomolgos), C (camundongo) ou D (rato) a uma densidade de 25.000 células/poço e são incubados du- rante a noite a 37ºC, 5% de CO2. Ab é diluído em série nove vezes a partir de uma concentração de estoque inicial para gerar um CRC de dez pontos, e então adicionado a proteínas ANGPTL3/8 purificadas (na concentração IC80 de 0,42 nM para humanos, 0,38 nM para cino- molgos, 0,13 nM para camundongos, ou 0,81 nM para ratos) em pla- cas de 96 poços E (humano), F (cinomolgos), G (camundongo) ou H (rato).

[0090] Os meios nas células HEK293-LPL nas placas A, B, C e D são substituídos pelas misturas ANGPTL3/8 e Ab da placa E, F, G e H, respectivamente, e são incubados 1 hora a 37ºC, 5% de CO2. 10 µl de EnzChek™ Lipase Substrate (preparado a uma concentração de 5 µM em 0,05% Zwittergent (3-(N, N-Dimetiloctadecilamônio) propanesulfo- nate) (Sigma) são adicionados às células, ANGPTL3/8 e mistura de Ab nas placas A, B, C e D. Um leitor de placas é usado para medir a fluo- rescência a 482 nm de Excitação e 515 nm de Emissão com um filtro de corte de 495 nm. As placas são incubadas a 37 ºC, 5% de CO2 em entre pontos de tempo. A fluorescência relativa (diretamente proporci- onal à atividade LPL) é calculada subtraindo o sinal em 1 min do sinal em 31 min. A concentração de eficácia na qual o Ab restaurou a ativi- dade LPL 50% (EC50) é calculada utilizando o Excel Fit. As concentra- ções de EC50 são mostradas na Tabela 11.

[0091] A porcentagem de desrepressão é calculada da seguinte forma: = (RFU – RFU(MIN))/(RFU(MAX) – RFU(MIN)) x 100, em que MAX = células sozinhas (LPL) e MIN = células (LPL) + ANG- PTL3/8 CM (meio condicionado).

[0092] O Ab geralmente tem um EC50 baixo e, portanto, é potente na desrepressão da LPL. O Ab também apresenta % máx de desre-

pressão favorável de LPL. TABELA 11: AB EC50 E % DE DESREPRESSÃO MÁXIMA DE LPL PARA LPL HUMANO, CINO, DE CAMUNDONGO E DE RATO E COMPLEXO ANGPTL3/8 HUMANO, CINO, DE CAMUNDONGO E DE RATO. Espécies LPL e ANGPTL3/8 Ab EC50 % de desrepressão (nM) máxima de LPL LPL humana e ANGPTL3/8 humana 0,28 102% cino LPL e cino ANGPTL3/8 1,31 96% LPL de camundongo e ANGPTL3/8 camundongo 1,38 103% LPL de rato e ANGPTL3/8 de rato 2,77 105%

[0093] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são tes- tados para desreprimir a inibição da proteína purificada ANGPTL3/8 da atividade da LPL (Tabela 12). TABELA 12: EC50 DE AB VARIANTE E % DE DESREPRESSÃO MÁ- XIMA DE LPL PARA LPL HUMANA E DE CAMUNDONGO E COM- PLEXO ANGPTL3/8 DE HUMANO E CAMUNDONGO. Espécies LPL e D31S D33A D33T E99Q ANGPTL3/8 Ab EC50 Ab EC50 Ab EC50 Ab EC50 (nM), (nM), (nM), (nM), % LPL de % LPL de % LPL de % LPL de desrepressão desrepressão desrepressão desrepressão máxima máxima máxima máxima LPL humana e AN- 0,86, 106% 1,14, 103% 1,56, 105% 0,49, 106% GPTL3/8 humana LPL de camundon- 1,79, 110% 4,07, 106% 4,55, 114% 1,65, 110% go e ANGPTL3/8 camundongo EXEMPLO 5: RESPOSTA DE TRIGLICERÍDEO IN VIVO

[0094] O efeito de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e HC de SEQ ID NO: 6 no soro TG é avalia- do em camundongos transgênicos para huCETP e huApolipoproteína A1 (a). O sangue é coletado dos camundongos e o soro é isolado an- tes do início do experimento. O TG é medido em amostras de soro usando um analisador de química clínica Cobas® (Roche). Os animais são divididos em 5 grupos de 20 para produzir grupos com médias de TG no soro semelhantes. Cada grupo de 20 é então subdividido em 4 grupos de 5 com médias de triglicerídeos séricos semelhantes. O Ab é administrado a camundongos por uma única injeção subcutânea a 1 mg/kg (n = 20), 3 mg/kg (n = 20), 10 mg/kg (n = 20) ou 30 mg/kg (n = 20) para 4 grupos separados de animais. Um antígeno de controle de ligação com isotipo nulo de mAb compatível é administrado por uma única injeção subcutânea a 30 mg/kg (n = 20) a um quinto grupo de animais.

[0095] O sangue é coletado dos animais 1 hora (n = 5), 8 horas (n = 5), 1 dia (n = 5), 2 dias (n = 5), 3 dias (n = 5), 7 dias (n = 5), 14 dias (n = 5) e 21 dias (n = 5) após a administração de Ab. O sangue é cole- tado de animais do subgrupo A em tempos de 1 hora e 3 dias. O san- gue é coletado de animais do subgrupo B em tempos de 8 horas e 7 dias. O sangue é coletado de animais do subgrupo C em tempos de 1 dia e 14 dias. O sangue é coletado de animais do subgrupo D em tem- pos de 2 dias e 21 dias. O soro é preparado a partir do sangue e os níveis séricos de TG foram medidos usando um analisador de química clínica Cobas® (Roche). A mudança percentual de TG a partir do con- trole de isotipo com correspondência de tempo é calculada para cada dose de Ab em cada ponto de tempo. O cálculo da alteração percen- tual é [(Triglicerídeo sérico Rx - triglicerídeo sérico de controle de isoti- po com correspondência de tempo)/(triglicerídeo sérico de controle de isotipo compatível com tempo)] x 100. Os dados são mostrados na Tabela 13.

TABELA 13: REDUÇÃO PERCENTUAL DE TG POR AB EM COM-

PARAÇÃO COM O CONTROLE DE IGG DE DIFERENTES DOSES DE AB EM DIFERENTES PONTOS DE TEMPO. Momento de 1 hora 8 ho- 1 dia 2 dias 3 dias 7 dias 14 dias 21 dias Pós Dose ras 1 mg/kg -22 -33 -76 * -66 * -61 * 41 6,4 -20 3 mg/kg -26 -71 * -84 * -77 * -86 * -25 19,7 -19 10 mg/kg -27 -62 * -87 * -89 * -88 * -88 * -64,4 * -28 30 mg/kg -23 -74 * -92 * -87 * -93 * -93 * -89,1 * -75 *

[0096] O teste de Dunnett é usado para cada conjunto de dados para comparar cada grupo de tratamento a um controle de correspondência de tempo e um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os grupos estatisticamente significativos de seus controles com correspon- dência de tempo são designados por um (*) na tabela.

[0097] A potência do Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e HC de SEQ ID NO: 6 na redução de TGs é favorável começando no Dia 1 e o efeito favorável é sustentado até o Dia 21.

[0098] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são testados para avaliar a mudança nos TGs em relação a um controle de IgG em camundongos (Tabela 14). TABELA 14: REDUÇÃO PERCENTUAL DE TG EM COMPARAÇÃO COM O CONTROLE DE IGG DE DIFERENTES DOSES DE ABS VA- RIANTE EM DIFERENTES PONTOS DE TEMPO. Momento de Pós Dose 1 dia 7 dias 15 dias 21 dias D31S 3 mg/kg -83 * -38 * -25 -12 D31S 10 mg/kg -90 * -91 * -37 * -21 D33A 3 mg/kg -74 * -77 * -34 * -10 D33A 10 mg/kg -78 * -86 * -76 * -60 * E99Q 3 mg/kg -82 * -49 * -5 15 E99Q 10 mg/kg -86 * -91 * -61 * 6

[0099] O teste de Dunnett é usado para cada conjunto de dados para comparar cada grupo de tratamento a um controle de correspon- dência de tempo e um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamen- te significativo. Os grupos estatisticamente significativos de seus con- troles com correspondência de tempo são designados por um (*) na tabela.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[00100] As seguintes sequências nucleicas e de aminoácidos são referidas na divulgação acima e são fornecidas abaixo para referência. SEQ ID NO: 1 atatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaa aatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgat caagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgta aaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagg gccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaac cagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaa aatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaa aaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaac ctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagc atcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaa ataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatc ttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaac atgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgc catcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacatt aattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggtt ttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaa ttatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgg gaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcc cggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccag agggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatat aacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaa tggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaa tgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaat aatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctattta agattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataata ctatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtg aacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaat atcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagagg actggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagta tgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatg tttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtcttt aaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgtta aaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaat cttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatg ctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgttt aaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattat agaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaa gattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgcc agtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctt tgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatat aaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataa aggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttag ggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattc attatttaatatatgagttgcttcctctatt SEQ ID NO: 2

MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGL LQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKEL RRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTN LIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHS QIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPA ECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGS QNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWK DNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHK AKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRG

LSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE SEQ ID NO: 3 ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaatggtgacc cggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgaggagctgaccct gctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacaggaccacggaggg acggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaatagaactcctggggca ggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaagcctgttggagactcaga tggaggaggatattctgcagctgcaggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggccc aggcacagaaggtgctacgggacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctg gctgggccctgcctaccgagaatttgaggtcttaaaggctcacgctgacaagcagagccacatc ctatgggccctcacaggccacgtgcagcggcagaggcgggagatggtggcacagcagcatcg gctgcgacagatccaggagagactccacacagcggcgctcccagcctgaatctgcctggatgg aactgaggaccaatcatgctgcaaggaacacttccacgccccgtgaggcccctgtgcagggag gagctgcctgttcactgggatcagccagggcgccgggccccacttctgagcacagagcagaga cagacgcaggcggggacaaaggcagaggatgtagccccattggggaggggtggaggaagg acatgtaccctttcatgcctacacacccctcattaaagcagagtcgtggcatctcaaaaaaaaaa aaaaaaa SEQ ID NO: 4

MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLG QALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRA SLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSA WLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLR

QIQERLHTAALPA SEQ ID NO: 5

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 6

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYY CARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR

WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG SEQ ID NO: 7 gatattgtgatgacccagacccccctgtctctgcctgtcactccgggggaaccggcctcgatctcat gccggtcgagccagtccctgctggactccgatgacgggaacacttatttggattggtacctccaaa agcctggacagagcccgcagctcctgatctacatgctgtcctaccgggcctccggagtgccaga ccgcttctcgggaagcggctccggtaccgacttcacactgaagatctcccgcgtggaagctgag gacgtgggcatctactactgtatgcaaagaatcgagttccccctcaccttcggcggcgggactaa ggtcgagattaagagaaccgtggccgcaccatccgtgttcatttttcccccgtccgatgaacagct gaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaacaacttctacccgagggaagcgaaagtg cagtggaaagtggacaatgcgctgcagtccggaaactcccaagagtccgtgaccgaacagga ctccaaggactcaacctactcgctgagctcaacgctgaccctgagcaaggccgactacgagaa gcacaaggtctacgcctgcgaagtgacccatcagggtttgagctcgcccgtgaccaagtccttca accggggagagtgc SEQ ID NO: 8 caagtcacattgaaggagagcggtccgaccctggtcaagccgactcagaccctgaccctgacg tgcactttctcgggcttctcattgtccatttctggagtgggcgtgggatggatcagacagcccccggg gaaggccctcgagtggctcgcgctgatctaccgcaacgacgacaaacgctactccccctcactg aaatcccggctgaccatcactaaggatacgtccaagaaccaggtcgtgttgaccctcaccaaca tggatcccgtggatactgccacctactattgtgcacggacctatagcagcggttggtacggaaact ggttcgacccgtggggccagggaactcttgtgacggtgtcctccgcaagcaccaagggtccttct gtgttccccctggcgccgtgctcgcggagcacctcagagtccaccgccgccctcggctgccttgtg aaggactacttcccggagccagtcaccgtgtcctggaacagcggggccctgacttccggcgtgc acaccttccctgcggtgctgcagagctcaggcctctattcgctgtcatccgtcgtgaccgtgccttcc tcgtccctgggcactaagacctacacttgcaacgtggaccataagcccagcaacaccaaagtg gacaagagagtggaatccaaatacggaccgccatgtccgccctgccccgccccggaagctgc cgggggacccagcgtgttcctgttcccacctaagccgaaggacactctgatgatctcaaggactc ccgaagtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccccgaagtccagtttaattggtacg tggatggtgtcgaggtccacaacgccaagaccaagcctcgcgaggaacagttcaattccaccta ccgggtcgtgtccgtcctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggaaaggagtacaagtgc aaagtgtccaacaagggactcccttcctccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggcca gcctcgcgaaccacaagtctacaccctgcccccatcgcaagaggaaatgaccaagaaccaag tgtcgctgacatgcctcgtcaagggattctacccgtcggatattgcggtggaatgggagtccaacg gacagcccgagaacaactacaagaccaccccgccggtgttggactccgacggctcctttttcctg tactcccggctcactgtggacaagtcgcggtggcaggaggggaacgtgttctcctgttccgtgatg cacgaagctctgcacaaccactacacccagaagtcgctgagcctctcactggga SEQ ID NO: 9

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC

MQRIEFPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 10

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYY

CARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 11

RSSQSLLDSDDGNTYLD SEQ ID NO: 12

YMLSYRAS

SEQ ID NO: 13

MQRIEFPLT SEQ ID NO: 14

TFSGFSLSISGVGVG SEQ ID NO: 15

LIYRNDDKRYSPSLKS SEQ ID NO: 16

ARTYSSGWYGNWFDP SEQ ID NO: 17

LSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK SEQ ID NO: 18

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHHHHHHDAHKSEVAHRFKDLGEENF KALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECA DDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADL PSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRL AKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPLEVLFQGPGRAAPMGGPELAQHE ELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEV SRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRD SVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQR

REMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA SEQ ID NO: 19

SRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHK TKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEE VKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPE VTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSI QEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTS GMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKY GFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLG NHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYS GGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLY

SIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK SEQ ID NO: 20

GPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTK ARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQA EATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAH

ADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA SEQ ID NO: 21

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 22

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSADGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 23

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSTDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS

KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 24

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCM QRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK

ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 25

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIQFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano caracterizado pelo fato de que compreende as regiões determinantes de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e as regiões determinantes da cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1 tem uma sequência de aminoácidos RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 11), LCDR2 tem uma sequência de aminoácidos YMLSYRAS (SEQ ID NO: 12), LCDR3 tem uma sequência de aminoácidos MQRIEFPLT (SEQ ID NO: 13), HCDR1 tem uma sequência de amino- ácidos TFSGFSLSISGVGVG (SEQ ID NO: 14), HCDR2 tem uma se- quência de aminoácidos LIYRNDDKRYSPSLKS (SEQ ID NO: 15), e HCDR3 tem uma sequência de aminoácidos ARTYSSGWYGNWFDP (SEQ ID NO: 16).

2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve (LCVR), em que o LCVR tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada (HCVR), em que o HCVR tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado pelo fato de que LCVR tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e o HCVR tem a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 10.

5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que é um isotipo IgG4.

6. Anticorpo que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano caracterizado pelo fato de que compreende uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a LC compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 5, 21, 22, 23, 24 e 25, e a HC compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteriza- do pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteriza- do pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteriza- do pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 6, caracteri- zado pelo fato de que a LC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25 e a HC tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.

13. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica polipeptídeos que com- preendem sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e 6 sob tais condições em que os polipeptídeos são expressos e que recuperam o anticorpo.

14. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica um anticorpo que com-

preende sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e 6 sob tais condições em que o anticorpo é expresso e que recuperam o anticor- po.

15. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica um anticorpo que com- preende sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e 6 sob tais condições em que o anticorpo é expresso e que recuperam o anticor- po.

16. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica um anticorpo que com- preende sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e 6 sob tais condições em que o anticorpo é expresso e que recuperam o anticor- po.

17. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica um anticorpo que com- preende sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e 6 sob tais condições em que o anticorpo é expresso e que recuperam o anticor- po.

18. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica um anticorpo que com- preende sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e 6 sob tais condições em que o anticorpo é expresso e que recuperam o anticor- po.

19. Anticorpo produzido pelo cultivo de uma célula de ma- mífero caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos duas moléculas de cDNA, em que uma primeira molécula de cDNA codifica uma cadeia leve para o anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 5, 21, 22, 23, 24 e 25 e uma segunda molécula de cDNA codifica uma cadeia pesada para o anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, sob tais condições em que o anti- corpo é expresso, e que recuperam o anticorpo.

20. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que se liga e neutraliza o com- plexo ANGPTL3 humano/8 em um ensaio de atividade da lipoproteína lipase padrão com um EC50 de 3,0 nM ou menos.

21. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que se liga ao complexo ANG- PTL3/8 humano com uma constante de dissociação menor ou igual a 1 x 10-6 M.

22. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que se liga ao ANGPTL3 hu- mano e ao ANGPTL8 humano com uma constante de dissociação su- perior a 1 x 10-6 M.

23. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que se liga ao complexo ANG- PTL3/8 humano e não se liga ao ANGPTL3 humano sozinho ou ANG- PTL8 humano sozinho, até 100 nM conforme medido por um ensaio ELISA.

24. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que reduz os triglicerídeos in vivo em pelo menos 50% em comparação com o controle de IgG a uma dose de 10 mg/kg em um ponto de tempo 14 dias após a dosa- gem.

25. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo ou população de anticorpos, como defini-

do em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, e um veículo, diluente ou excipiente aceitável.

26. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

27. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

28. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

29. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

30. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên- cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

31. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de DNA que compreende uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que compreendem sequên-

cias de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e 6, em que a célula é capaz de expressar um polipeptídeo.

32. Célula de mamífero caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA compreende uma se- quência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 5, 21, 22, 23, 24 ou 25, e em que a segun- da molécula de DNA compreende uma sequência polinucleotídica que codifica um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 6, em que a célula é capaz de expressar os poli- peptídeos.

33. Processo para a produção de um anticorpo caracteriza- do pelo fato de que compreende o cultivo da célula de mamífero, como definido nas reivindicações 26 a 32, em condições tais que o anticorpo seja expresso, e a recuperação do anticorpo expresso.

34. Método de tratamento de ASCVD, diabetes, obesidade, NASH, CKD ou hipertrigliceridemia, ou uma combinação dos mesmos, caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um pa- ciente em necessidade de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24.

35. Método de redução de triglicerídeos caracterizado pelo fato de que compreende a administração a um paciente em necessi- dade de uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 24.

36. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizada pelo fato de que é para uso em terapia.

37. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 24, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento de ASCVD, diabetes, obesidade, NASH, CKD ou hipertrigliceridemia,

ou uma combinação dos mesmos.

38. Composição farmacêutica para uso no tratamento de ASCVD, diabetes, obesidade, NASH, CKD ou hipertrigliceridemia, ou uma combinação dos mesmos, caracterizada pelo fato de que com- preende uma quantidade eficaz do anticorpo, como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 24.