KR20210093994A - 항-angptl3/8 복합체 항체 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

항체가 ANGPTL3/8 복합체에 결합하여 이를 중화시키는 앤지오포이에틴-유사 단백질(ANGPTL: angiopoietin-like protein)3/8 복합체 및 항체가 개시된다. 본원의 하나 이상의 항-ANGPTL3/8 복합체 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물이 또한 개시된다. 특히 지질단백질 리파제 활성을 증가시키고 트리글리세라이드를 낮추기 위해, 이를 제조하는 방법 및 사용하는 방법이 개시된다. 이러한 방식으로, 상기 화합물 및 조성물은 지질 대사-관련 및 글루코스 대사-관련 질환 및 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.

Description

항-ANGPTL3/8 복합체 항체 및 이의 사용 방법
본 개시내용은 일반적으로 생물학 및 의약에 관한 것이며, 더욱 특히 본 개시내용은 인간 앤지오포이에틴-유사 단백질(ANGPTL: angiopoietin-like protein) 3/8 복합체에 결합하여 이를 중화시키는 항체(Ab)에 관한 것이다. 이러한 Ab는 지질단백질 리파제(LPL) 활성을 증가시켜 혈청 트리글리세라이드(TG)를 낮출 수 있으므로, 이들 Ab는 지질 대사-관련 및 글루코스 대사-관련 질환 및 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
ANGPTL은 많은 생리학적 및 병태생리학적 과정을 조절하는 단백질 패밀리이다. 본원에서 특히 흥미로운 것은 지질 및 글루코스 대사에서 ANGPTL3 및 ANGPTL8의 역할이다.
증거는 지질단백질 대사의 주요 조절인자로서 ANGPTL3의 역할을 뒷받침하고, 이는 LPL을 저해하고 내피 리파제(EL)를 저해함으로써 TG 청소율을 조절할 수 있다. 문헌[Chi 등. (2017) Mol. Metab. 6:1137-1149]를 참조한다. ANGPTL3 결핍, 불활성화, 또는 손실은 낮은 수준의 저밀도 지질단백질-콜레스테롤(LDL-C), 고밀도 지질단백질-콜레스테롤(HDL-C) 및 TG를 초래할 수 있다. ANGPTL3은 또한, 인슐린 민감성에 영향을 주어, 지질 대사뿐만 아니라 글루코스 대사를 조절하는 데 역할을 할 수 있다. 문헌[Robciuc 등. (2013) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33:1706-1713]을 참조한다. 인간 ANGPTL3에 대한 핵산 및 아미노산 서열이 알려져 있다. 예를 들어, 하나의 핵산 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NM_014495(SEQ ID NO:1)에서 찾을 수 있고, 하나의 아미노산 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NP_055310(SEQ ID NO:2)에서 찾을 수 있다.
ANGPTL8은 간 및 지방 조직에서 고도로 발현되고, ANGPTL3과 복합체화하여 이를 활성화시킴으로써 LPL을 저해하는 것으로 보고되었다. 상기 Chi 참조. 인간 ANGPTL8은 급식(feeding)에 의해 유도되는 것으로 보인다. 인간 ANGPTL8에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 알려져 있다. 예를 들어, 하나의 핵산 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NM_018687(SEQ ID NO:3)에서 찾을 수 있고, 하나의 아미노산 서열은 NCBI 기준 서열 번호 NP_061157(SEQ ID NO:4)에서 찾을 수 있다.
하나 이상의 ANGPTL8에 결합된 하나 이상의 ANGPTL3을 갖는 ANGPTL3/8 복합체가 존재한다. 증거는, 이들 복합체가 ANGPTL3 또는 ANGPTL8 단독과 비교할 때 LPL의 저해를 더욱 효과적으로 매개함을 시사한다. 더욱이, ANGPTL3/8 복합체는 포유류 발현 시스템에서 ANGPTL8 및 ANGPTL3을 공동발현시킴으로써 시험관내에서 제조될 수 있다. 상기 Chi 참조.
Ab는 ANGPTL3 또는 ANGPTL8에 결합하고 단독으로 또는 서로 조합되어 사용되어 지질 대사-관련 및 글루코스 대사-관련 질환 및 장애를 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 국제특허출원공개 WO 2012/174178호는 ANGPTL3에 결합하고 이의 활성을 방해하는 완전 인간 단일클론 Ab 및 이의 항원-결합 단편을 개시한다. 다른 치료적 항-ANGPTL3 Ab가 또한 알려져 있다. 예를 들어, 국제특허출원공개 WO 2008/073300호 및 미국 특허 제7,935,796호를 참조한다. 마찬가지로, 국제특허출원공개 WO 2017/027316호는 ANGPTL8에 결합하고 이의 활성을 방해하는 완전 인간 단일클론 Ab 또는 이의 항원-결합 단편을 개시한다. 더욱이, 국제특허출원공개 WO 2017/177181은 조합된 항-ANGPTL3 Ab와 항-ANGPTL8 Ab 치료법을 개시한다.
안타깝게도, ANGPTL3 또는 ANGPTL8에만 결합하는 기존의 Ab는 지질 및/또는 글루코스 대사에 미치는 이들 ANGPTL 및/또는 ANGPTL3/8 복합체의 효과를 완전히 무효화하지 않는다. 예를 들어, 문헌[Dewey 등. (2017) N. Engl. J. Med. 377:211-221]; 및 문헌[Gusarova 등. (2017) Endocrinology 158:1252-1259]를 참조한다. 이러한 관점에서, 지질 대사-관련 및 글루코스 대사-관련 질환 및 장애를 치료하기 위한 추가 Ab, 특히 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab에 대한 필요성이 존재하며, 이러한 Ab는 지질 및/또는 글루코스 대사를 조절하기 위해 개선된 약물학적 저해 및/또는 조절 특성을 갖는다.
이러한 필요성을 해결하기 위해, 변형된 ANGTPL3/8 복합체에 대해 핵산 및 아미노산 서열이 제공된다. 따라서, 변형된 ANGPTL3 및 변형된 ANGPTL8(즉, 융합 단백질) 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열은 본원에 기재되어 있다. 일부 경우, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖는 ANGPTL3 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 경우, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖는 ANGPTL8 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 더욱 다른 경우, 상기 핵산 서열은 SEQ ID NO:17 및 18을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL3 융합 단백질, 본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL8 융합 단백질, 또는 둘 다 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 작제물이 제공되며, 이러한 작제물은 발현 카세트 또는 벡터일 수 있다.
상기의 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 발현 카세트 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 경우, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 경우, ANGPTL3 및 ANGTPL8 융합 단백질에 대한 폴리뉴클레오타이드 서열은 별개의 발현 카세트 또는 벡터 상에 존재하는 한편, 다른 경우 이들은 동일한 발현 카세트 또는 벡터 상에 존재할 수 있다.
또한, SEQ ID NO:17 또는 19의 아미노산 서열, 뿐만 아니라 이의 활성 변이체 또는 단편을 포함하는 ANGPTL3 융합 단백질이 제공된다. 마찬가지로, SEQ ID NO:18 또는 20의 아미노산 서열, 뿐만 아니라 이의 활성 변이체 또는 단편을 포함하는 ANGPTL8 융합 단백질이 제공된다.
더욱이, 기능적 ANGPTL3/8 복합체, 특히 인간 ANGPTL3/8 복합체가 제공되며, 상기 복합체의 ANGPTL3 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 네이티브(native)(전장 또는 절단된) ANGPTL3 또는 ANGPTL3 융합 단백질이고, 상기 복합체의 ANGPTL8 모이어티는 본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL8 융합 단백질이다. 일부 경우, ANGPTL3 융합 단백질은 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 포함한다. 마찬가지로 그리고 일부 경우, ANGPTL8 융합 단백질은 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함한다. 더욱이 그리고 일부 경우, 상기 복합체는 1:1 비의 ANGPTL3 모이어티 : ANGPTL8 모이어티를 가질 수 있다. 다른 경우, 상기 복합체는 1:1 이외의 비, 예컨대 1:2, 1:3, 2:1 또는 3:1 비의 ANGPTL3 모이어티 : ANGPTL8 모이어티를 가질 수 있다.
재조합 ANGTPL3/8 복합체를 제조하기 위한 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 적어도, 본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL3 모이어티 및 ANGPTL8 모이어티에 대한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에서, 예컨대 포유류 발현 시스템에서 발현시켜, 이로부터 ANGPTL3/8 복합체를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우, ANGPTL3 및 ANGPTL8 모이어티는 별개의 발현 작제물 또는 벡터 상에서 제공된다. 다른 경우, ANGPTL3 및 ANGPTL8은 하나의 발현 작제물 또는 벡터 상에서 제공된다. 상기 방법은 또한, 생성된 ANGPTL3/8 복합체를 정제하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 단계는 ANGPTL3/8 복합체를 농축시키는 단계뿐만 아니라 하나 이상의 태그, 링커 및 혈청 알부민을 ANGPTL3 모이어티 및/또는 ANGPTL8 모이어티로부터 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한, 정제 단계 전에 그리고/또는 후에 ANGPTL3/8 복합체를 농축시키는 단계를 포함할 수 있다.
둘째, ANGPTL3/8 복합체에 대한 Ab, 뿐만 아니라 이의 용도가 제공되며, 이는 ANGPTL3/8 복합체 활성에 결합하여 이를 저해함으로써 지질 대사-관련 및 글루코스 대사-관련 질환 및 장애를 치료하는 단계를 포함한다.
유효량의, 본원에 기재된 항-ANGPTL3/8 복합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 이를 필요로 하는 개체에서 LPL 활성을 증가시키며, TG를 낮추고, 지질 대사- 및/또는 글루코스 대사-관련 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 가용성 ANGPTL3/8 복합체에 결합하여, LPL 활성을 증가시키고 혈청 TG 수준을 감소시킨다. 더 낮은 TG 수준을 갖는 개체는 심혈관 질환에 대해 더 낮은 위험성에 있다. 유리하게는, 본원에 기재된 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 관련 농도에서 ANGPTL3 단독 또는 ANGPTL8 단독이 아니라 ANGPTL3/8 복합체에만 결합한다. 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 TG-풍부(rich) 지질단백질(TRL)의 이화작용을 증가시키며, 이는 TG 및/또는 비-HDL-C를 감소시켜서 현재의 치료법에 의해 해결되지 않는 아테롬성 동맥경화증 심혈관 질환(ASCVD)에 대한 이상지질혈증(dyslipidemia) 위험 인자를 개선하는 것으로 여겨진다. 더욱이, 그리고 본원에 기재된 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab가 ANGPTL3 또는 ANGPTL8 단독에 결합하지 않고, 이들 ANGPTL의 다른 작용이 저해되지 않으며, 이는 더 적은 수의 원치 않는(untoward) 생체내 효과, 예컨대 EL의 감소된 탈-억제(de-repression)를 유발할 수 있다.
특히, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 인간 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab이다. 일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 ANGPTL3/8 복합체의 생체내 활성, 특히 이의 LPL 저해 활성을 무효화시키거나, 차단시키거나, 저해하거나, 방해하거나, 중화시키거나 감소시킬 수 있다. 일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 전장일 수 있거나 단지 항원-결합 단편(예를 들어, Fab, F(ab')2 또는 scFv 단편)일 수 있다. 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab의 바람직한 특성은 낮은 용량을 Ab에서 TG 저하를 포함하며 이러한 특성은 적어도 21일 동안 지속될 수 있다.
일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하고, 경쇄 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 및 중쇄 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며, 상기 LCDR1은 아미노산 서열 RSSQSLLDSDDGNTYLD(SEQ ID NO:11)를 가지며 LCDR2는 아미노산 서열 YMLSYRAS(SEQ ID NO:12)를 갖고 LCDR3은 아미노산 서열 MQRIEFPLT(SEQ ID NO:13)를 가지며, 상기 HCDR1은 아미노산 서열 TFSGFSLSISGVGVG(SEQ ID NO:14)를 가지며 HCDR2는 아미노산 서열 LIYRNDDKRYSPSLKS(SEQ ID NO:15)를 갖고 HCDR3은 아미노산 서열 ARTYSSGWYGNWFDP(SEQ ID NO:16)를 갖는다.
추가로, LCVR이 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하는 Ab; 또는 HCVR이 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하는 Ab가 제공된다. 일부 경우, Ab는 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 LCVR 및 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 HCVR을 포함한다. 일부 경우, Ab는 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)를 포함하고, 상기 LC는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖거나 상기 HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는다. 대안적으로, Ab는 경쇄(LC) 및 중쇄(HC)를 포함하고, 상기 LC는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖고 상기 HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는다. 특정 경우, Ab는 IgG4 이소타입(isotype)이다.
일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 상기 기재된 Ab의 변이체, 특히 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:23); M56T 돌연변이(SEQ ID NO:24), E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25) 또는 이들의 조합(예를 들어, D33T와 M56T 돌연변이 또는 D33A와 M56T 돌연변이)을 갖는 LC 변이체일 수 있다.
더욱이, cDNA 분자가 SEQ ID NO:5 및 6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 상기 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에 배양하고, Ab를 회수함으로써 생성되는 Ab가 제공된다. 대안적으로, 제1 cDNA 분자가 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하고 제2 cDNA 분자가 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 2개의 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를, 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에 배양하고, Ab를 회수함으로써 생성되는 Ab가 제공된다. 일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 상기 기재된 Ab의 변이체, 특히 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:23); M56T 돌연변이(SEQ ID NO:24), E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25) 또는 이들의 조합을 갖는 LC 변이체일 수 있다.
더욱이, 표준 LPL 활성 검정법에서 0.5 nM 이하의 EC50으로 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하고 이를 중화시키는 Ab가 제공된다. 또한, 1 x 10-6 M 이하의 해리 상수로 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하는 Ab가 제공된다. 더욱이, 1 x 10-6 M 초과의 해리 상수로 인간 ANGPTL3 및 인간 ANGPTL8에 결합하는 Ab가 제공된다. 더욱이, 단일점 ELISA 검정법에 의해 측정된 바와 같이 비-결합 배경 신호보다 3배 초과의 신호로 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하지만, 단일점 ELISA 검정법에 의해 측정된 바와 같이 비-결합 배경 신호보다 3배 초과의 신호로 인간 ANGPTL3 단독 또는 인간 ANGPTL8 단독에는 결합하지 않는 Ab가 제공된다. 마찬가지로, 투약 후 14일 시점에서 10 mg/kg의 용량에서 IgG 대조군과 비교할 때 생체내에서 TG를 적어도 50%만큼 낮추는 Ab가 제공된다.
셋째, 본원의 Ab 또는 본원의 Ab의 집단 및 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또한, SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유류 세포가 제공되며, 상기 세포는 본원의 Ab를 발현할 수 있다. 추가로, 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자를 포함하는 포유류 세포가 제공되며, 상기 제1 DNA 분자는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 제2 DNA 분자는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 세포는 본원의 Ab를 발현할 수 있다. 일부 경우, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 상기 기재된 Ab의 변이체, 특히 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:23); M56T 돌연변이(SEQ ID NO:24), E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25) 또는 이들의 조합을 갖는 LC 변이체일 수 있다.
넷째, Ab를 생성하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 배양하는 단계로서, 상기 세포는 본원의 Ab가 발현되는 조건 하에 이러한 Ab를 발현할 수 있는, 단계, 및 발현된 Ab를 회수하는 단계를 포함한다. 일부 경우, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 D31S 돌연변이, D33A 돌연변이, D33T 돌연변이, M56T 돌연변이, E99Q 돌연변이 또는 이들의 조합을 인코딩할 수 있다. 또한, ASCVD, 만성 신장 질환(CKD), 당뇨병, 과트리글리세라이드혈증(hypertriglyceridemia), 비알코올성 지방간염(NASH: nonalcoholic steatohepatitis), 비만, 또는 이들의 조합을 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본원의 Ab를 투여하는 단계를 포함한다. 또한, TG를 낮추는 방법이 제공되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 유효량의 본원의 Ab를 투여하는 단계를 포함한다.
다섯째, 치료법에 사용하기 위한 Ab가 제공된다. 특히, Ab는 ASCVD, CKD, 당뇨병, 과트리글리세라이드혈증, NASH, 비만, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한 것이다. 또한, ASCVD, CKD, 당뇨병, 과트리글리세라이드혈증, NASH, 비만, 또는 이들의 조합을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물이 제공되며, 상기 약학적 조성물은 유효량의 본원에 기재된 Ab를 포함한다.
상술된 것들 이외의 이점, 효과, 특질 및 목적은, 하기 상세한 설명을 고려할 때 더욱 쉽게 분명해질 것이다. 이러한 상세한 설명은 하기 도면(들)을 참조로 하며:
도 1은 환원 조건 및 비-환원 조건 하에 진행된 ANGPTL3/8 복합체를 보여주는 SDS-page 겔의 이미지를 도시한다.
부정 관사("a" 또는 "an")에 의한 요소의 참조는, 1개의 요소 그리고 단지 1개의 요소가 존재하는 것을 문맥상 명확하게 요구하지 않는 한, 1개 초과의 요소가 존재하는 가능성을 배제하지 않는다. 그러므로, 부정 관사("a" 또는 "an")는 통상 "적어도 하나"를 의미한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, "약"은 예를 들어, 언급된 농도, 길이, 분자량, pH, 서열 유사성, 시간 기간, 온도, 부피 등과 같은 값 또는 값들의 통계적으로 유의미한 범위 내에 있는 것을 의미한다. 이러한 값 또는 범위는 주어진 값 또는 범위의 전형적으로 20% 이내, 더욱 전형적으로 10% 이내, 더욱 더 전형적으로 5% 이내의 규모의 순서 이내에 있을 수 있다. "약"에 의해 포괄되는 허용 가능한 변동은 연구 하의 특정 시스템에 따라 다를 것이며, 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "친화도"는 ANGPTL3/8 복합체 상의 에피토프에 대한 Ab의 결합 강도를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "앤지오포이에틴-유사 단백질 3" 또는 "ANGPTL3"은 SEQ ID NO:2를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "앤지오포이에틴-유사 단백질 8" 또는 "ANGPTL8"은 SEQ ID NO:4를 포함하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "ANGPTL3/8 복합체"는 하나 이상의 ANGPTL8 화합물에 결합된 하나 이상의 ANGPTL3 화합물의 다중-단백질 복합체를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "항-ANGPTL3/8 복합체 Ab" 또는 "항-ANGPTL3/8 복합체 Ab"는 특히 ANGPTL3/8 복합체 형태로 있을 때 ANGPTL3 및 ANGPTL8 둘 다의 영역을 동시에 인식하고 이에 결합하는 Ab를 의미한다. 일반적으로, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 통상 다른 ANGPTL 패밀리 구성원(예를 들어, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 또는 ANGPTL7)에 결합하지 않을 것이다. 더욱이 그리고 어디에서나 언급된 바와 같이, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 또한, 하기 단일점 ELISA 검정법에 기재된 바와 같이 명시된 농도에서 ANGPTL3 또는 ANGPTL8 단독에 결합하지 않을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "결합하다" 또는 "결합한다"는, 당업계에 알려진 보편적인 방법에 의해 결정된 바와 같이 또 다른 단백질 또는 분자와 일종의 화학 결합 또는 인력을 형성하는 단백질의 능력을 의미한다. 결합은 약 1 x10-6 M 이하(즉, 더 작은 KD는 더 단단한 결합을 의미함)의 평형 해리 상수(KD)에 의해 특징지어질 수 있다. 2개의 분자가 결합하는 지의 여부를 결정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라즈몬 공명 등을 포함한다. 본원에서, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 ANGPTL3/8 복합체에만 결합하고 ANGPTL3 단독 또는 ANGPTL8 단독에는 결합하지 않는다. Ab가 ANGPTL3/8 복합체에만 결합하고 ANGPTL3 단독 또는 ANGPTL8 단독에는 결합하지 않는 지의 여부는 하기 기재된 바와 같이 단일점 포맷에서 표준 ELISA 검정법에서 결정될 수 있고, 결합은 하기 기재된 바와 같이 Biacore에 의해 특징지어질 수 있다. 본원의 Ab가 인간인 한편, 그러나, 이들 Ab는 다른 종으로부터의 다른 ANGPTL3/8 복합체, 예를 들어, 시노몰구스 원숭이 ANGPTL3/8 복합체, 마우스 ANGPTL3/8 복합체, 또는 래트 ANGPTL3/8 복합체와 교차-반응성을 나타낼 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 개체에게 단일 또는 다중 용량 투여 시, 연구자, 수의학자, 의사 또는 다른 임상의에 의해 모색되는 조직, 시스템, 동물, 포유류 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응 또는 요망되는 치료 효과를 발휘할, 화합물 또는 이를 함유하는 약학적 조성물의 양 또는 용량을 의미한다. 일부 경우, 본원의 화합물 또는 이를 포함하는 조성물의 유효량은 이를 필요로 하는 개체에게 LPL 활성을 증가시킬 것이다. 용량은 더 높은 초기 로딩 용량, 뒤이어 더 낮은 용량을 포함할 수 있다. 용량은 임의의 치료적 유효 간격, 예컨대 1일 다수 회, 1일 1회, 격일 1회, 1주 3회, 1주 2회, 1주 1회, 2주마다 1회, 1개월 1회, 2개월마다 1회 등으로 투여될 수 있다. 유효량을 구성하는 용량은 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg일 수 있을 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "평형 해리 상수" 또는 "KD"는 특정 항원 상호작용에 대한 Ab 친화도, 예컨대 ANGPTL3/8 복합체에 대한 Ab의 친화도의 정량적 측정, 특히 Ab/ANGPTL3/8 복합체가 이의 성분 파트로 가역적으로 분리되기 위한 접합체의 경향의 척도를 의미한다. 마찬가지로 그리고 본원에 사용된 바와 같이, "평형 회합 상수" 또는 "Ka"는 KD의 역수를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "기능적"은, ANGPTL3 융합 단백질, ANGPTL8 융합 단백질 또는 ANGPTL3/8 복합체가, 예를 들어 Ab가 만들어지고 지시될 수 있는 항원으로서 작용하거나 LPL을 저해하는 것을 포함하여, 네이티브 ANGPTL3, 네이티브 ANGPTL8 또는 네이티브 ANGPTL3/8 복합체와 유사한 생물학적 활성을 가짐을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "글루코스 대사-관련 질환 또는 장애"는 당뇨병 등을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, "지질 대사-관련 질환 또는 장애"는 비정상적인 지질 대사와 관련된 병태, 예컨대 이상지질혈증(dyslipidemia), 과지질혈증(hyperlipidemia) 및 과지질단백질혈증(hyperlipoproteinemia), 예컨대 과트리글리세라이드혈증, 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 킬로미크론혈증(chylomicronemia), 혼합 이상지질혈증(mixed dyslipidemia)(비만, 대사 증후군, 당뇨병 등), 지방이영양증(lipodystrophy) 및 지방위축증(lipoatrophy)을 의미한다. 상기 용어는 또한, 아테롬성 동맥경화증(atherosclerosis) 및 관상 동맥 질환, 급성 췌장염, NASH, 비만 등과 같은 특정 심혈관 질환을 포괄한다.
본원에 사용된 바와 같이, "반수-최대 유효 농도(half-maximal effective concentration)" 또는 "EC50"은, 예정된 기간 후 기준선과 최대 사이의 절반의 반응을 유도하는 Ab의 농도(전형적으로 몰 단위(M)로 표현됨)를 의미한다. 본원에 기재된 EC50은 이상적으로 3.0 nM 이하이다.
본원에 사용된 바와 같이, "핵산 작제물" 또는 "발현 카세트"는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 제어 서열을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 이러한 방식으로, 제어 서열, 예컨대 프로모터는 본원에 기재된 ANGPTL3 융합 단백질 및/또는 본원에 기재된 ANGPTL8 융합 단백질과 같은 적어도 하나의 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열과 작동적인 상호작용에 있다. 이러한 핵산 작제물은 발현 또는 전달 카세트의 형태로 존재할 수 있다. 핵산 작제물은, 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열을 혼입한 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 조합으로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "작동적으로 연결된"은, 핵산 작제물의 요소가 이의 통상적인 기능을 수행하도록 배치됨을 의미한다. 따라서, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 제어 서열(즉, 프로모터)는 코딩 서열의 발현을 수행할 수 있다. 제어 서열은, 이것이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한(즉, 적절한 리딩 프레임을 유지하는 한) 상기 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 전사되었지만 미번역된 개입(intervening) 서열은 프로모터와 코딩 서열 사이에 존재할 수 있고, 상기 프로모터 서열은 여전히 상기 코딩 서열과 "작동적으로 연결되어" 있는 것으로 간주될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제어 서열" 또는 "제어 서열들"은, 수혜체(recipient) 숙주 세포에서 종합적으로 코딩 서열의 복제, 전사 및 번역을 제공하는 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 전사 및 번역 종결 서열, 업스트림 조절 도메인, 복제 기원, 내부 리보솜 진입 부위("IRES": internal ribosome entry site), 인핸서 등을 의미한다. 선택된 코딩 서열이 적절한 숙주 세포 내에서 복제, 전사 및 번역될 수 있는 한, 이들 모든 제어 서열이 항상 존재할 필요는 없다.
본원에 사용된 바와 같이, "코딩 서열" 또는 "코딩 서열들"은, 하나 이상의 관심 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 의미하고, 적절한 조절 서열의 제어 하에 놓일 때 시험관내에서 또는 생체내에서 폴리펩타이드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(RNA의 경우) 핵산 서열이다. 코딩 서열(들)의 경계는 5'(아미노) 말단에서 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 코딩 서열은 바이러스 핵산 서열, 원핵생물 또는 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 원핵생물 또는 진핵생물 DNA로부터의 게놈 DNA 서열, 또는 심지어 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.
제어 서열 및 코딩 서열에 관하여, 이들은 숙주 세포 또는 서로에 대해 네이티브/유사(analogous)할 수 있다. 대안적으로, 제어 서열 및 코딩 서열은 숙주 세포 또는 서로에 대해 이종성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프로모터"는 핵산 조절 서열로 이루어진 뉴클레오타이드 영역을 의미하며, 상기 조절 서열은 유전자로부터 유래되거나 합성적으로 생성되고, RNA 폴리머라제에 결합하고 다운스트림(3'-방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있다. 하나 이상의 관심 폴리펩타이드에 대한 네이티브 프로모터를 포함하여 많은 프로모터가 핵산 작제물에 사용될 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 요망되는 결과물에 따라 선택될 수 있다. 이러한 프로모터는 유도성(inducible) 프로모터, 억제성(repressible) 프로모터 및 구성적(constitutive) 프로모터를 포함할 수 있지만 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, "변이체"는, 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상의 특정 핵산 또는 아미노산의 첨가, 결실, 삽입 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 변형을 갖는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 변이체는 기준 핵산 또는 아미노산 서열과 비교할 때 하나 이상의 변경을 포함한다. 본원에서, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 LC 또는 HC 변이(variation)를 가질 수 있다. 특히, Ab는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:23); M56T 돌연변이(SEQ ID NO:24) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체일 수 있다. 마찬가지로, LC 변이체는 마찬가지로, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 D31S와 D33A 돌연변이, D31S와 D33T 돌연변이, D31S와 M56T 돌연변이, D31S와 E99Q 돌연변이, D33A와 M56T 돌연변이, D33A와 E99Q 돌연변이, D33T와 M56T 돌연변이, D33T와 E99Q 돌연변이, 및 M56T와 E99Q 돌연변이와 같이 상기 중 임의의 2개의 조합일 수 있다. 더욱이, LC 변이체는 마찬가지로, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 예를 들어, D31S, D33A 및 M56T 돌연변이, D31S, D33A 및 E99Q 돌연변이, D31S, D33T 및 M56T 돌연변이, D31S, D33T 및 E99Q 돌연변이, D33A, M56T 및 E99Q 돌연변이, 및 D33T, M56T 및 E99Q 돌연변이와 같이 상기 중 임의의 3개의 조합일 수 있다. 더욱이, LC 변이체는 마찬가지로, SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖는 LC에 관해 예를 들어, D31S, D33A, M56T 및 E99Q 돌연변이; 및 D31S, D33T, M56T 및 E99Q 돌연변이와 같이 상기 중 임의의 4개의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "벡터"는, 또 다른 핵산 서열, 예컨대 발현 카세트가 부착되어 부착된 서열의 복제를 야기할 수 있는 레플리콘(replicon), 예컨대 플라스미드, 파지 또는 코스미드(cosmid)를 의미한다. 벡터는 핵산 분자를 숙주 세포로 전달할 수 있다. 벡터는 전형적으로, 관심 뉴클레오타이드 서열이 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 결정 가능한 방식으로 삽입될 수 있는 부위인 하나 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위, 뿐만 아니라 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 인식하고 선별하는 데 사용될 수 있는 선별 마커를 포함한다. 따라서, 벡터는 핵산 서열을 표적 세포로 전달할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료" 또는 "치료하는"은, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 투여가 병태의 증상 및 합병증과 대항하거나 이를 완화시키는 목적으로 지시되는 병태를 갖는 개체의 관리 및 치유를 의미한다. 치료하는 것은, 본원의 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 조성물을 이러한 개체에게 투여하여, 질환, 병태, 또는 장애의 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 완화시키거나, 또는 없애는 것을 포함한다. 치료하는 것은, 본원의 화합물 또는 상기 화합물을 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여, LPL 활성을 증가시키고 TG를 낮추는 것을 포함한다. 치료될 개체는 동물, 특히 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, "환자," "대상체" 및 "개체"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되며, 동물, 특히 인간을 의미한다. 특정 경우, 개체는 인간이고, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab의 투여로부터 이익을 얻을 질환, 장애 또는 병태로 추가로 특징지어진다.
본원에 사용된 바와 같이, "항체" 또는 "Ab" 등은 사슬간 및 사슬내 이황화 결합을 갖는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 전장 Ab를 의미한다. 4개의 폴리펩타이드 사슬 각각의 아미노-말단 부분은 항원 인식을 주로 담당하는 가변 영역을 포함한다. 각각의 HC는 N-말단 HCVR 및 HC 불변 영역(HCCR)을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄(LC) 가변 영역(LCVR) 및 LC 불변 영역(LCCR)을 포함한다. 본원에서, Ab는 면역글로불린 G(IgG) 유형 Ab이고, IgG 이소타입은 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)로 추가로 나눠질 수 있다. HCVR 및 LCVR 영역은, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 더욱 보존된 영역이 산재된(interspersed) 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 HCVR 및 LVCR은 N-말단으로부터 C-말단까지 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본원에서, HC의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지칭되고, LC의 3개의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지칭된다. CDR은 ANGPTL3/8 복합체와 같이 항원과 특이적인 상호작용을 형성하는 대부분의 잔기를 함유한다. 잔기를 다양한 CDR에 지정하는 것은 예를 들어, 초티아(Chothia), 카바트(Kabat) 또는 노쓰(North)와 같은 알고리즘에 의해 수행될 수 있다. 노쓰 CDR 정의는 다수의 결정 구조와 함께 친화도 전파 클러스터링에 기초한다(문헌[North 등. (2011) J. Mol. Bio. 406:228-256]). 본원에서, CDR은 노쓰 정의를 포함하는 다수의 정의들의 조합에 기초하는 서열 목록에 나열된 서열에 의해 가장 잘 정의된다.
HCVR 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는, HCVR-인코딩 DNA를 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 중쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간, 뿐만 아니라 다른 포유류의 서열, 중쇄 불변 영역 유전자는 당업계에 알려져 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 예를 들어, 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다.
LCVR 영역을 인코딩하는 단리된 DNA는, LCVR-인코딩 DNA를 경쇄 불변 영역을 인코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동적으로 연결함으로써 전장 경쇄 유전자로 전환될 수 있다. 인간, 뿐만 아니라 다른 포유류의 서열, 경쇄 불변 영역 유전자는 당업계에 알려져 있다. 이들 영역을 포괄하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다.
본원에서 Ab는 IgG4-PAA Fc 부분을 함유할 수 있다. IgG4-PAA Fc 부분은 SEQ ID NO:6에서 절대 위치에 의해 넘버링된 바와 같이 위치 231에서 Ser으로부터 Pro으로의 돌연변이(S231P), 위치 237에서 Phe로부터 Ala으로의 돌연변이(F237A), 및 위치 238에서 Leu으로부터 Ala으로의 돌연변이(L238A)를 갖는다. S231P 돌연변이는 하프(half)-Ab 형성(IgG4 Ab에서 하프-분자의 역학적 교환(dynamic exchange) 현상)을 방지하는 힌지(hinge) 돌연변이이다. F237A 및 L238A 돌연변이는 이미 낮은 인간 IgG4 이소타입의 이펙터(effector) 기능을 추가로 감소시킨다. 그러나, 본원의 Ab는 대안적으로, 상이한 Fc 부분을 포함할 수 있는 것으로 고려된다.
인간에게 투약 시 면역 반응의 잠재적인 유도를 감소시키기 위해, 특정 아미노산은 Ab 생식계열(germline) 서열을 매칭하도록 역돌연변이를 필요로 할 수 있다.
본원의 화합물을 포함하는 약학적 조성물은 이러한 치료를 필요로 하는 개체에게 비경구 투여될 수 있다. 이러한 개체는 ASCVD를 갖고 있거나 ASCVD에 대한 고위험에 있을 수 있다. 이들 개체는 급성 관상 증후군(acute coronary syndrome), 심근 경색(MI: myocardial infarction) 이력, 안정 또는 불안정 협심증(stable or unstable angina), 관상 또는 다른 동맥 혈관재형성(revascularization), 뇌졸중, 일과성 허혈 발작(TIA: transient ischemic attack), 흉부 또는 복부 대동맥류, 또는 아테롬성 동맥경화증 기원인 것으로 추정되는 말초 동맥 질환을 갖고 있을 수 있다. ASCVD에 대해 고위험에 있는 개체는 2형 당뇨병(T2D), CKD 또는 가족성 과콜레스테롤혈증(FH: familial hypercholesterolemia)을 추가로 갖고 있을 수 있다.
비경구 투여는 주사기, 선택적으로 펜-유사 주사기, 또는 기계적 구동 인젝터(injector)에 의한 피하, 근육내 또는 정맥내 주사에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여는 주입 펌프에 의해 수행될 수 있다. 일부 경우, 개체에게 투여하기에 적합한 약학적 조성물은 치료적 유효량의 본원의 화합물 또는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 갖는다. 이러한 약학적 조성물은 당업계에 잘 알려진 약학적 제품에 대한 통상의 부형제를 사용하여 여러 가지 기법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington, "The Science and Practice of Pharmacy" (D.B. Troy ed., 21st Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)]을 참조한다.
본원의 화합물은 LPL 활성을 조절하거나, 상기 나열된 임의의 장애를 포함하여 지질 대사-관련 질환 또는 장애를 치료하거나, 글루코스 대사-관련 질환 또는 장애를 치료하는 데 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 조합되어 사용될 수 있다. 청구된 화합물과 조합될 수 있는 추가 치료제의 비제한적인 예는 항-당뇨병 제제, 예컨대 인슐린 또는 인슐린 유사체, 비구아나이드(biguanide), 설포닐우레아, 티아졸리딘디온(thiazolidinedione), 디펩티딜 펩티다제-4("DPP-4") 저해제, 또는 나트륨-의존적 글루코스 수송체(SGLT2) 저해제; 인크레틴(incretin) 화합물, 예컨대 글루카곤-유사-펩타이드-1(GLP-1) 또는 GLP-1 유사체, 위 저해성 폴리펩타이드(GIP) 또는 GIP 유사체, 옥신토모듈린(OXM: oxyntomodulin) 또는 OXM 유사체; 아스피린; 항혈소판제; H2 수용체 차단제; 양성자 펌프 저해제; 항고혈압제; 지질 변형 치료법, 예컨대 HMG-CoA 리덕타제 저해제, PCSK9 저해제, 콜레스테롤 흡수 저해제, 피브레이트(fibrate), 니아신(niacin), LXR 작용제(agonist), RXR 작용제, ROR 작용제, 또는 역(reverse) 콜레스테롤 수송 조절제; 심부전 치료법, 예컨대 ACE, 앤지오텐신 수용체 네프릴리신(neprilysin) 저해제, ARB, 또는 B 아드레날린성 길항제(adrenergic antagonist); 항염증성 치료법; 고혈압 치료법, 심방 세동(atrial fibrillation) 치료법; 신경퇴행 치료법; 종양학 치료법; 당뇨병성 심근병증(diabetic cardiomyopathy), 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 당뇨병성 신경병증(diabetic neuropathy), 당뇨병성 신장병증(diabetic nephropathy), 체중 감소의 치료법, 상처 치유; 신장병증(nephropathy) 치료법; PAD 치료법, 또는 이들 제제 중 임의의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 및 하나 이상의 추가 치료제(들)는 동일한 전달 경로 및 장치, 예컨대 단일 알약, 캡슐, 정제, 또는 주사형 제형을 통해 함께 투여될 수 있거나; 별개의 전달 장치 또는 경로에서 동시에 별개로 투여될 수 있거나; 순차적으로 투여될 수 있다.
ANGPTL3/8 복합체의 제조 및 정제
본 개시내용의 일 양태는, 복합체에만 결합하고 ANGPTL3 단독 또는 ANGPTL8 단독에는 결합하지 않는 Ab를 제조하는 데 사용될 수 있는 ANGPTL3/8 복합체이다. 항-ANGPTL3 Ab 및 항-ANGPTL8 Ab가 알려져 있긴 하지만, 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab를 제조하기 위해 충분한 양의 기능적 ANGPTL3/8 복합체, 특히 인간 ANGPTL3/8 복합체를 합성하는 데에는 난관이 존재한다. 추가로 또는 대안적으로, 이러한 ANGPTL3/8 복합체는 ANGPTL3, ANGPTL8 및/또는 ANGPTL3/8 복합체에 관한 Ab의 특성을 평가하기 위해 검정법에 사용될 수 있다.
이러한 방식으로, 본 개시내용은 또한, N-말단 또는 C-말단 혈청 알부민(예를 들어, 인간, 마우스 또는 토끼) 융합 단백질로서 제조함으로써 ANGPTL8을 생성시키는 방법을 기재한다. 그 후에, 기능적 ANGPTL3/8 복합체는 포유류 발현 시스템에서 ANGPTL8 융합 단백질을 네이티브 ANGPTL3 또는 ANGPTL3 융합 단백질과 함께 공동-발현시킴으로써 제조될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 네이티브, 인간 ANGPTL3 및 네이티브, 인간 ANGPTL8에 대한 핵산 및 아미노산 서열은 알려져 있다(예를 들어, 각각 SEQ ID NO:1-2 및 3-4 참조). 그러나, 본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL3 또는 ANGPTL 8은 변형되며(즉, 재조합/합성), 따라서 ANGTPL3 및 ANGTPL8의 생성, 분비 및/또는 복합체화를 개선하기 위해 추가 아미노산 서열을 포함함으로써 네이티브 서열과 상이해진다.
예를 들어, ANGPTL3은 당업계에 알려진 바와 같이 하나 이상의 링커 및 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서, 인간 ANGPTL3(SEQ ID NO:2)은, ANGPTL3 융합 단백질이 SEQ ID NO:17의 아미노산 서열을 갖도록 링커 및 FLAG-태그를 포함하도록 변형된다. 일부 경우, 링커는 약 1 내지 약 10개 아미노산, 예컨대 3개 아미노산, 특히 3개의 Ala 잔기일 수 있다. 링커 및 FLAG-태그는 ANGPTL3 서열의 N-말단 또는 C-말단, 특히 SEQ ID NO:17에서와 같이 C-말단에 놓일 수 있으며, 여기서 잔기 1-460은 ANGPTL3에 상응하며, 잔기 461-471은 3-Ala 링커 및 FLAG-태그에 상응한다.
마찬가지로, ANGPTL8은 혈청 알부민, 특히 인간 혈청 알부민에 대한 서열 외에도 하나 이상의 링커 및 태그를 포함하도록 변형될 수 있다. 본원에서, 인간 ANGPTL8(SEQ ID NO:4)은, ANGPTL8 융합 단백질이 SEQ ID NO:18의 아미노산 서열을 갖도록, 링커, IgG 카파 신호 펩타이드, 폴리히스티딘(His)-태그, 성숙 인간 혈청 알부민, 링커 및 PreScission® 절단 부위를 포함하도록 변형된다. 일부 경우, 상기 링커는 약 1 내지 약 10개 아미노산, 예컨대 강성(rigid) 폴리프롤린 반복부(repeat), 특히 Ala-Pro(AP)-10 링커일 수 있다. 신호 펩타이드, His-태그, 성숙 HSA, 링커 및 PreScission® 절단 부위는 ANGPTL8 서열의 N-말단 또는 C-말단, 특히 SEQ ID NO:18에서와 같이 N-말단에 놓일 수 있으며, 여기서 잔기 1-20은 IgG 카파 신호 펩타이드에 상응하며, 잔기 21-27은 His-태그에 상응하고, 잔기 28-612는 HSA에 상응하며, 잔기 613-632는 AP-10 링커에 상응하고, 잔기 633-643은 PreScission® 절단 부위에 상응하며, 잔기 644-820은 ANGPTL8에 상응한다.
본원에 기재된 바와 같은 ANGPTL3 융합 단백질 및/또는 ANGPTL8 융합 단백질을 발현시키기 위해 핵산 작제물을 작제하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들어, 문헌[Balbαs & Lorence, "Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols" (2nd Ed. Humana Press 2004)]; 문헌[Davis 등., "Basic Methods in Molecular Biology" (Elsevier Press 1986)]; 문헌[Sambrook & Russell, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)]; 문헌[Tijssen, "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology - Hybridization with Nucleic Acid Probes" (Elsevier 1993)]; 및 문헌["Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel 등. eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience 1995)]; 뿐만 아니라 미국 특허 제6,664,387호; 제7,060,491호; 제7,345,216호 및 제7,494,805호에서 찾을 수 있다. ANGPTL8이 임의의 이황화 결합을 함유하지 않기 때문에, 포유류 발현 시스템이 사용될 수 있다. 본원에서, HEK293 발현 시스템 또는 CHO 발현 시스템은 ANGPTL3 및/또는 ANGPTL8 융합 단백질을 특히 공동-발현에 의해 생성시키는 데 사용될 수 있다.
ANGPTL3 융합 단백질 및/또는 ANGPTL8 융합 단백질을 발현시키는 것 외에도, 상기 방법은 또한, 생성된 융합 단백질을 각각의 융합 단백질에 사용되는 특정 태그에 따라 정제할 수 있으며, 상기 태그는 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 ANGPTL3 및 ANGTPL8 융합 단백질에 관하여, 서로 쉽게 회합되어 기능적 ANGPTL3/8 복합체를 형성하는, ANGPTL3 융합 단백질이 SEQ ID NO:19(여기서 잔기 1-444는 ANGPTL3에 상응하고, 잔기 445-455는 3-Ala 링커 및 FLAG-태그에 상응함)의 아미노산 서열을 갖고 ANGPTL8 융합 단백질이 SEQ ID NO:20(여기서 잔기 1-4는 PreScission® 절단 부위로부터의 절단 잔기에 상응하고, 잔기 5-182는 ANGPTL8의 단편에 상응함)의 아미노산 서열을 갖도록, 정제는 태그를 제거한 후 다수의 절단을 초래할 수 있다.
항체의 제조 및 정제
항-ANGPTL3/8 복합체 Ab는 CHO GSKO 세포주를 사용하여 포유류 세포 발현 시스템에서 생성될 수 있다. 글루타민 신타제(GS: glutamine synthetase) 유전자 넉아웃(knockout)은, 선별 조건 하에 저생산성 또는 비생산성(non-productive) 세포의 생존을 가능하게 할 수 있는 내인성 GS 배경 활성을 없앰으로써 강화된(tightened) 선별 엄격성(selection stringency)을 가능하게 한다. 본원에서 Ab HC 및 LC를 코딩하는 유전자는 공동-형질주입을 위해 개별 GS-함유 발현 플라스미드 내로 서브클로닝될 수 있거나, 두 사슬 모두 단일 GS-함유 발현 플라스미드 내로 서브클로닝될 수 있다. HC 또는 LC를 인코딩하는 cDNA 서열은, 세포 배양 배지 내로의 요망되는 생성물의 분비를 증대시키기 위해 신호 펩타이드의 코딩 서열과 프레임 내에서 융합되며, 상기 신호 펩타이드는 뮤린 카파 리더 서열일 수 있다. 발현은 바이러스성(viral) 사이토메갈로바이러스(CMV: cytomegalovirus) 프로모터에 의해 구동된다.
CHO GSKO 세포는 전기천공 및 적절한 양의 재조합 HC 및 LC 발현 플라스미드 를 사용하여 안정하게 형질주입되고, 형질주입된 세포는 적절한 세포 밀도에서 현탁액 배양물에서 유지된다. 형질주입된 세포의 선택은 무글루타민(glutamine-free), 25 μM 메티오닌 설폭심(MSX: methionine sulfoximine)-함유 무혈청(serum-free) 배지에서 성장에 의해 달성되고, 32-37℃ 및 5%-7% CO2에서 인큐베이션된다. Ab는 CHO 세포로부터 배지 내로 분비된다. Ab는 단백질 A 친화도 크로마토그래피, 뒤이어 음이온 교환, 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(또는 다른 적합한 방법)에 의해 정제될 수 있고, 추가의 정제를 위해 크기 배제 크로마토그래피를 이용할 수 있다.
수합된 배지로부터의 Ab는 MabSelect SuRe 단백질 A 수지(GE Healthcare) 상에 캡처된다. 그 후에, 수지는 진행 완충액, 예컨대 포스페이트 완충 식염수(PBS) pH 7.4 또는 Tris를 함유하는 진행 완충액으로 가볍게 세척되어, 비-특이적으로 결합된 물질을 제거한다. 그 후에, Ab는 낮은 pH 용액, 예컨대 20 mM 아세트산/5 mM 시트르산으로 수지로부터 용리된다. ANGPTL3/8 Ab를 함유하는 분획은 풀링(pool)되고, 낮은 pH에서 유지되어 잠재적인 바이러스를 불활성화시킬 수 있다. pH는 염기, 예컨대 0.1 M Tris pH 8.0을 첨가함으로써 필요에 따라 증가될 수 있다. ANGPTL3/8 Ab는 수지, 예컨대 페닐 HP(GE Healthcare)를 사용한 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 추가로 정제될 수 있다. 항-ANGPTL3/8 Ab는 20 mM Tris, pH 8.0에서 소듐 설페이트 구배를 사용하여 HIC 컬럼으로부터 용리될 수 있다. 항-ANGPTL3/8 Ab는 PBS, pH 7.4에서의 등용매 용리(isocratic elution)와 함께 Superdex 200 컬럼(GE Healthcare)을 사용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해 추가로 정제될 수 있다.
본원에 기재된 화합물은, 이러한 방식으로, 또는 당업자에 의해 쉽게 결정될 유사한 방식으로 제조된다.
인간 가변 경쇄 및 중쇄 도메인을 보유하는 마우스는 상기 기재된 ANGPTL3/8 복합체로 면역화되고, 단일 항원-특이적 B 세포는 ANGPTL3/8(양성(positive)) 및 ANGPTL3(음성(negative))을 마커로서 사용하여 FACS에 의해 단리된다. 중쇄 가변 영역 DNA 및 경쇄 가변 영역 DNA는 PCR에 의해 단일 B 세포로부터 회수되고 IgG 발현 벡터 내로 클로닝된다. CHO 세포 상층액은 형질주입 후 결합 활성에 대해 시험된다.
실시예
하기 비제한적인 실시예는 제한이 아니라 예시를 위해 제공된다.
실시예 1: ANGPTL3/8 복합체의 제조
ANGPTL3 및 ANGPTL8 발현: 인간 ANGPTL3에 대한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 링커 및 FLAG 태그(SEQ ID NO:17)를, CMV 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터 내로 삽입한다. 마찬가지로, 인간 ANGTPL8에 대한 아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 마우스 IgG 카파 신호 펩타이드, HIS-태그, 성숙 인간 혈청 알부민(HSA)-PreScission® 절단 부위(SEQ ID NO:18)를, CMV 프로모터를 함유하는 포유류 발현 벡터 내로 삽입한다. 단백질 발현은 무혈청 배지에서 배양된 HEK293F 세포에서 상기 기재된 발현 벡터 둘 다의 일시적인 공동-형질주입을 통해 이루어진다. 배양 배지를 형질주입 후 5일째에 수합하고, 후속 단백질 정제를 위해 4℃에 보관한다.
단백질 정제: 단백질 정제를 4℃에서 수행하며, 여기서 4 L 배양 배지에 1 M Tris-HCl(pH 8.0) 및 5 M NaCl을 각각 25 mM 및 150 mM의 최종 농도로 보충한다. 그 후에, 배지를 150 ml의 Ni-NTA 수지(Qiagen)와 함께 밤새 인큐베이션한다. 상기 수지를 컬럼 내로 패킹(pack)하고, 완충액 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.3 M NaCl)로 세척한다. 단백질을 완충액 A에서 0-300 mM 이미다졸 구배로 용리시킨다. HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag를 함유하는 분획을 풀링(pool)하며, 농축시키고, HiLoad® Superdex® 200 컬럼(GE Healthcare Biosciences) 상으로 로딩한 다음, 완충액 A로 용리시킨다. HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag를 함유하는 분획을 다시 풀링하며, 농축시키고, PreScission® 프로테아제(GE Healthcare Biosciences)로 분해하여, HSA를 HIS-HSA-ANGPTL8 융합 단백질로부터 제거한다. PreScission®-분해된 단백질 시료를 HiLoad® Superdex® 200 컬럼 상에 로딩하고, 보관 완충액(20 mM HEPES, pH8.0, 150 mM NaCl)으로 용리시킨다. ANGPTL3/8 복합체를 함유하는 분획을 풀링하고 농축시키며, 이때 단백질 농도를 브랜포드(Bradford) 방법을 사용하여 결정한다. ANGTPL3/8 복합체를 분취하고, 추가 사용 시까지 -80℃에 보관한다.
LPL 활성 검정법: EnzCheck® LPL 검정법을 제조업체의 설명(ThermoFisher Scientific)에 따라 수행한다. 간략하게는, ANGPTL3 및 ANGPLT3/8 복합체를 성장 배지에서 단계 희석시키고, 1시간 인큐베이션을 위해 LPL 세포 배지로 대체하였다. 그런 다음, EnzCheck® 리파제 기질(ELS)을 LPL-발현 세포에 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션한다. 형광을 482 nm/515 nm(각각 여기/방출)에서 측정한다. LPL 상에서 ANGPTL3 및 3/8의 저해 %를 계산한다.
결과:
표 1은 정제/농축의 다양한 스테이지(stage)에서 ANGTPL3/8 복합체 단백질의 수율을 나타낸다.
Figure pct00001
마찬가지로, 도 1은 컬럼으로부터 발생된 정제되고 농축된 ANGPTL3/8 복합체의 4-20% TG TGX 쿠마시-염색 겔을 도시하며, 이는 복합체가 형성/조립됨을 확인시켜 준다. 정제 및 농축 후, ANGTL3은 SEQ ID NO:19의 아미노산 서열을 갖고 ANGPTL8은 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 갖는다.
LPL 검정법에서, ANGPTL3의 EC50은 21.5 nM인 한편, ANGTPL3/8 복합체의 EC50은 0.54 nM이며, 이는 복합체가 기능적임을 확인시켜 준다.
실시예 2: 검정법
단일점 ELISA(SPE) 검정법: ANGPTL3/8 복합체, 자유(free) ANGPTL3 또는 자유 ANGPTL8에 대한 Ab 결합 선택성을 단일점 포맷에서 표준 ELISA 검정법을 사용하여 초기에 확인한다. 간략하게는, 검정법 플레이트를 2 μg/ml의 농도에서 항-인간 Fc Ab로 코팅시키고, 후속해서 카제인으로 차단한다. 그런 다음, CHO 세포에서 발현 후 상층액 내로 분비된 IgG를 검정법 플레이트에 포착한다. 비오틴화된 항원을 25 nM의 농도로 첨가하여, Ab/항원 결합을 가능하게 한다. 알칼리 포스파타제-접합 뉴트라비딘(neutravidin) 및 알칼리 포스파타제 기질을 첨가하고, 후속해서 560 nm의 광학 밀도에서 측정함으로써 Ab/항원 복합체를 검출한다. 양성 결합은 비-결합 배경 신호보다 3배 더 큰 신호에 의해 결정된다.
ELISA 검정법: ANGPTL3/8 복합체, 자유 ANGPTL3 또는 자유 ANGPTL8에 대한 Ab 결합 선택성을 표준 ELISA 검정법을 사용하여 확인한다. 간략하게는, 검정법 플레이트를 2 μg/ml의 농도에서 항-인간 Fc Ab로 코팅시키고, 후속해서 카제인으로 차단한다. 그런 다음, CHO 세포에서 발현 후 CHO 상층액으로부터의 Ab를 검정법 플레이트에 포착하고, 그 결과는 2 μg/ml의 Ab 농도이다. 비오틴화된 항원(ANGPTL3, ANGPTL8 또는 ANGPTL3/8 복합체)을 일련의 희석에 의해 다양한 농도로 첨가하여, Ab/항원 결합을 가능하게 한다. 알칼리 포스파타제-접합 뉴트라비딘 및 알칼리 포스파타제 기질을 첨가하고, 후속해서 560 nm의 광학 밀도에서 측정함으로써 Ab/항원 복합체를 검출한다.
Figure pct00002
SPE 검정법에서, SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab는 인간 ANGPTL3/8 복합체에 대해 양성 결합 및 인간 ANGPTL8 및 인간 ANGPTL3에 대해 음성 결합을 나타낸다. D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:24), M56T 돌연변이(SEQ ID NO:24) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab는 마찬가지로, 인간 ANGPTL3/8 복합체에 대한 결합 및 인간 ANGPTL8 및 인간 ANGPTL에 대한 음성 결합을 나타낸다.
Figure pct00003
SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab는 인간 ANGPTL3/8 복합체에 대한 양성 결합을 농도-의존적 방식으로 나타내고, 이 검정법에서 100 nM 이하의 항원 농도에서 인간 ANGPTL8 및 인간 ANGPTL3에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다(표 3).
SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 상기 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 외에도, D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab가 검정되며, 마찬가지로 인간 ANGPTL3/8 복합체에 대한 양성 결합을 농도-의존적 방식으로 나타내고, 이 검정법에서 100 nM 이하의 항원 농도에서 인간 ANGPTL8 및 인간 ANGPTL3에 대한 검출 가능한 결합을 나타내지 않는다(표 4 내지 6).
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
실시예 3: 시험관내 수용체 친화도
결합 동역학을 Biacore® T200 기기(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ)를 사용하여 결정할 수 있다. 인간 Fab 결합제(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)의 공유 결합에 의해 CM4 센서 칩 표면을 제조할 수 있다. 동역학 실험을 약 25℃에서 HBSEP+, 0.01% BSA, pH 7.4의 진행 완충액에서 수행할 수 있다. Ab는 캡처될 수 있고, 마우스, 시노몰구스 또는 인간 ANGPTL3/8 복합체의 농도 시리즈를 칩 표면에 걸쳐 약 800초의 해리 시간과 함께 약 50 uL/분으로 약 240초 동안 주입할 수 있다. 동역학 매개변수(예를 들어, ka, kd, KD)를 결정하기 위해, 데이터를 이중-참조하고 Biacore T200 평가 소프트웨어(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.)를 사용하여 1:1 결합 모델로 맞춘다(fit). 하기 표 7은 pH 7.4 및 온도 25℃에서 상이한 종으로부터의 다양한 ANGPTL3/8 복합체에 대한 SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab의 결합을 나타낸다.
Figure pct00007
SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 상기 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 외에도, D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab를, 다양한 종으로부터의 다양한 ANGPTL3/8 복합체에 대한 결합에 대해 pH 7.4 및 온도 25℃에서 검정한다(표 8 내지 10).
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 4: 시험관내 기능적 활성 LPL 검정법
세포-기초 생물검정법을 사용하여, LPL 활성의 ANGPTL3/8 정제된 단백질 저해를 탈억제(de-repress)시키는 SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab의 능력을 평가한다. Ab의 ANGPTL3/8 저해 활성을, EnzChek™ 리파제 기질(ThermoFisher)을 사용하여 결정한다. HEK293 세포주는 인간, 시노몰구스, 마우스 또는 래트 LPL을 발현하고, 인간, 시노몰구스, 마우스 또는 래트 ANGPTL3/8 단백질을 정제하였다. HEK293-LPL 생성은 인간 LPL을 안정하게 발현하는 인간 배아 세포주를 포함하고, 이는 표준 방법을 이용하여 생성된다(HEK293-huLPL). 간략하게는, 인간 LPL을 CMV 프로모터 및 블라스티시딘(blasticidin) 내성을 갖는 렌티바이러스 플라스미드 내로 클로닝한다. 상기 플라스미드는 ViraPower 패키징 믹스(Invitrogen)를 사용하여 인간 LPL을 생성시키는 데 사용된다. HEK293 세포를 LPL 렌티바이러스와 함께 인큐베이션하고, 블라스티시딘에 내성인 클론을 선별한다. 인간 LPL mRNA 발현을 qPCR에 의해 확인하고 LPL 활성을 EnzChek™ 기질을 이용하여 확인한 후, 클론을 선택한다. 이 과정을 시노몰구스, 마우스 및 래트 LPL에 대해 반복한다.
방법은 Basu 등(문헌[Basu 등. (2011) J. Lipid Res. 52:826-832])에 기재된 것들로부터 변형된다: (a) HEK293-LPL 세포를 하프 영역 96-웰 폴리-D-라이신 코팅된 플레이트 A(인간), B(시노몰구스), C(마우스) 또는 D(래트)에 25000 세포/웰의 밀도로 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 밤새 인큐베이션한다. Ab를 출발 스톡 농도로부터 9회 단계적으로 희석시켜 10-점 CRC를 생성시킨 다음, 96웰 플레이트 E(인간), F(시노몰구스), G(마우스) 또는 H(래트)에서 정제된 ANGPTL3/8 단백질(인간의 경우 0.42 nM, 시노몰구스의 경우 0.38 nM, 마우스의 경우 0.13 nM, 또는 래트의 경우 0.81 nM의 IC80 농도에서)에 첨가한다.
플레이트 A, B, C, 및 D에서 HEK293-LPL 세포 상의 배지를 ANGPTL3/8 및 플레이트 E, F, G 및 H로부터의 Ab 혼합물로 각각 대체하고, 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 10 μl의 EnzChek™ 리파제 기질(0.05% Zwittergent(3-(N,N-디메틸옥타데실암모니오)프로판설포네이트)(Sigma)에서 5 μM의 농도로 제조됨)을 플레이트 A, B, C 및 D에서 세포, ANGPTL3/8 및 Ab 혼합물에 첨가한다. 플레이트 판독기를 사용하여, 495 nm 컷오프 필터와 함께 482 nm 여기 및 515 nm 방출에서 형광을 측정한다. 상기 플레이트를 시점들 사이에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션한다. 31분에서의 신호로부터 1분에서의 신호를 차감함으로써 상대 형광(LPL 활성에 정비례함)을 계산한다. Ab가 LPL 활성을 50% 복구시킨 효능 농도(EC50)를 엑셀 피트를 이용하여 계산한다. EC50 농도를 표 11에 나타낸다.
탈억제 백분율을 하기와 같이 계산하며:
= (RFU - RFU(MIN))/(RFU(MAX) - RFU(MIN)) x 100,
여기서 MAX = 세포 단독 (LPL) 및 MIN = 세포 (LPL) + ANGPTL3/8 CM (조건화된 배지).
Ab는 일반적으로 낮은 EC50을 가지므로, LPL을 탈억제시키는 데 강력하다. Ab는 또한, LPL의 선호할 만한 최대 탈억제 %를 갖는다.
Figure pct00011
SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 상기 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 외에도, D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22), D33T 돌연변이(SEQ ID NO:23) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab를 검정하여, LPL 활성의 ANGPTL3/8 정제된 단백질 저해를 탈억제시킨다(표 12).
Figure pct00012
실시예 5: 생체내 트리글리세라이드 반응
혈청 TG에 미치는 SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab의 효과를 huCETP 및 hu아포지질단백질 A1 (a)에 대해 유전자이식 마우스에서 평가한다. 혈액을 마우스로부터 수집하고, 실험 시작 전에 혈청을 단리한다. TG는 Cobas® 임상 화학 분석기(Roche)를 사용하여 혈청 시료에서 측정된다. 동물을 20의 5개 군으로 지정하여, 유사한 혈청 TG 평균을 갖는 군을 산출한다. 그런 다음, 20의 각각의 군을 유사한 혈청 트리글리세라이드 평균을 갖는 5의 4개 군으로 추가로 세분한다. Ab를 1 mg/kg(n=20), 3 mg/kg(n=20), 10 mg/kg(n=20), 또는 30 mg/kg(n=20)을 4개의 별개의 동물군에게 단일 피하 주사하여 마우스에게 투여한다. 대조군 항원 결합 널(null) 이소타입 매칭된 Ab를 5번째 동물군에게 30 mg/kg(n=20)에서 단일 피하 주사에 의해 투여한다.
Ab 투여 후 1시간(n=5), 8시간(n=5), 1일(n=5), 2일(n=5), 3일(n=5), 7일(n=5), 14일(n=5) 및 21일(n=5)에서 동물로부터 혈액을 수집한다. 1시간 및 3일 시점에서 서브군 A 동물로부터 혈액을 수집한다. 8시간 및 7일 시점에서 서브군 B 동물로부터 혈액을 수집한다. 1일 및 14일 시점에서 서브군 C 동물로부터 혈액을 수집한다. 2일 및 21일 시점에서 서브군 D 동물로부터 혈액을 수집한다. 혈청을 혈액으로부터 준비하고, Cobas® 임상 화학 분석기(Roche)를 사용하여 혈청 TG 수준을 측정하였다. 시간 매칭된 이소타입 대조군으로부터 TG의 변화 백분율을 각각의 시점에서 각각의 용량의 Ab에 대해 계산한다. 변화 백분율에 대한 계산은 [(Rx 혈청 트리글리세라이드 - 시간 매칭된 이소타입 대조군 혈청 트리글리세라이드)/(시간 매칭된 이소타입 대조군 혈청 트리글리세라이드)] x 100이다. 데이터를 표 13에 나타낸다.
Figure pct00013
TG를 낮추는 데 있어서 SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab의 약효는 1일째에 시작하여 선호할 만하고, 선호할 만한 효과는 21일째까지 지속된다.
SEQ ID NO:5의 LC 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 상기 항-ANGPTL3/8 복합체 Ab 외에도, D31S 돌연변이(SEQ ID NO:21), D33A 돌연변이(SEQ ID NO:22) 또는 E99Q 돌연변이(SEQ ID NO:25)를 갖는 LC 변이체 및 SEQ ID NO:6의 HC를 갖는 Ab를 검정하여, 마우스에서 IgG 대조군과 비교하여 TG의 변화를 평가한다(표 14).
Figure pct00014
서열 목록
하기 핵산 및 아미노산 서열은 상기 개시내용에서 언급되고, 참조를 위해 하기에 제공된다.
SEQ ID NO:1
atatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgatcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgttaaaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaatcttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatgctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgtttaaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattatagaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaagattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgccagtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctttgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatataaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataaaggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttagggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattcattatttaatatatgagttgcttcctctatt
SEQ ID NO:2
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE
SEQ ID NO:3
ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaatggtgacccggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgaggagctgaccctgctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacaggaccacggagggacggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaatagaactcctggggcaggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaagcctgttggagactcagatggaggaggatattctgcagctgcaggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggcccaggcacagaaggtgctacgggacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctggctgggccctgcctaccgagaatttgaggtcttaaaggctcacgctgacaagcagagccacatcctatgggccctcacaggccacgtgcagcggcagaggcgggagatggtggcacagcagcatcggctgcgacagatccaggagagactccacacagcggcgctcccagcctgaatctgcctggatggaactgaggaccaatcatgctgcaaggaacacttccacgccccgtgaggcccctgtgcagggaggagctgcctgttcactgggatcagccagggcgccgggccccacttctgagcacagagcagagacagacgcaggcggggacaaaggcagaggatgtagccccattggggaggggtggaggaaggacatgtaccctttcatgcctacacacccctcattaaagcagagtcgtggcatctcaaaaaaaaaaaaaaaaa
SEQ ID NO:4
MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:5
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:6
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYYCARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG
SEQ ID NO:7
gatattgtgatgacccagacccccctgtctctgcctgtcactccgggggaaccggcctcgatctcatgccggtcgagccagtccctgctggactccgatgacgggaacacttatttggattggtacctccaaaagcctggacagagcccgcagctcctgatctacatgctgtcctaccgggcctccggagtgccagaccgcttctcgggaagcggctccggtaccgacttcacactgaagatctcccgcgtggaagctgaggacgtgggcatctactactgtatgcaaagaatcgagttccccctcaccttcggcggcgggactaaggtcgagattaagagaaccgtggccgcaccatccgtgttcatttttcccccgtccgatgaacagctgaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaacaacttctacccgagggaagcgaaagtgcagtggaaagtggacaatgcgctgcagtccggaaactcccaagagtccgtgaccgaacaggactccaaggactcaacctactcgctgagctcaacgctgaccctgagcaaggccgactacgagaagcacaaggtctacgcctgcgaagtgacccatcagggtttgagctcgcccgtgaccaagtccttcaaccggggagagtgc
SEQ ID NO:8
caagtcacattgaaggagagcggtccgaccctggtcaagccgactcagaccctgaccctgacgtgcactttctcgggcttctcattgtccatttctggagtgggcgtgggatggatcagacagcccccggggaaggccctcgagtggctcgcgctgatctaccgcaacgacgacaaacgctactccccctcactgaaatcccggctgaccatcactaaggatacgtccaagaaccaggtcgtgttgaccctcaccaacatggatcccgtggatactgccacctactattgtgcacggacctatagcagcggttggtacggaaactggttcgacccgtggggccagggaactcttgtgacggtgtcctccgcaagcaccaagggtccttctgtgttccccctggcgccgtgctcgcggagcacctcagagtccaccgccgccctcggctgccttgtgaaggactacttcccggagccagtcaccgtgtcctggaacagcggggccctgacttccggcgtgcacaccttccctgcggtgctgcagagctcaggcctctattcgctgtcatccgtcgtgaccgtgccttcctcgtccctgggcactaagacctacacttgcaacgtggaccataagcccagcaacaccaaagtggacaagagagtggaatccaaatacggaccgccatgtccgccctgccccgccccggaagctgccgggggacccagcgtgttcctgttcccacctaagccgaaggacactctgatgatctcaaggactcccgaagtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccccgaagtccagtttaattggtacgtggatggtgtcgaggtccacaacgccaagaccaagcctcgcgaggaacagttcaattccacctaccgggtcgtgtccgtcctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggaaaggagtacaagtgcaaagtgtccaacaagggactcccttcctccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggccagcctcgcgaaccacaagtctacaccctgcccccatcgcaagaggaaatgaccaagaaccaagtgtcgctgacatgcctcgtcaagggattctacccgtcggatattgcggtggaatgggagtccaacggacagcccgagaacaactacaagaccaccccgccggtgttggactccgacggctcctttttcctgtactcccggctcactgtggacaagtcgcggtggcaggaggggaacgtgttctcctgttccgtgatgcacgaagctctgcacaaccactacacccagaagtcgctgagcctctcactggga
SEQ ID NO:9
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:10
QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALEWLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYYCARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:11
RSSQSLLDSDDGNTYLD
SEQ ID NO:12
YMLSYRAS
SEQ ID NO:13
MQRIEFPLT
SEQ ID NO:14
TFSGFSLSISGVGVG
SEQ ID NO:15
LIYRNDDKRYSPSLKS
SEQ ID NO:16
ARTYSSGWYGNWFDP
SEQ ID NO:17
MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK
SEQ ID NO:18
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHHHHHHDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPLEVLFQGPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:19
SRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK
SEQ ID NO:20
GPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA
SEQ ID NO:21
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:22
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSADGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:23
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSTDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:24
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO:25
DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPGQSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCMQRIQFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> ANTI-ANGPTL3/8 COMPLEX ANTIBODIES AND METHODS OF USING THE SAME <130> X21977 <150> US 62/783,260 <151> 2018-12-21 <150> US 62/783,265 <151> 2018-12-21 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2951 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atatatagag ttaagaagtc taggtctgct tccagaagaa aacagttcca cgttgcttga 60 aattgaaaat caagataaaa atgttcacaa ttaagctcct tctttttatt gttcctctag 120 ttatttcctc cagaattgat caagacaatt catcatttga ttctctatct ccagagccaa 180 aatcaagatt tgctatgtta gacgatgtaa aaattttagc caatggcctc cttcagttgg 240 gacatggtct taaagacttt gtccataaga cgaagggcca aattaatgac atatttcaaa 300 aactcaacat atttgatcag tctttttatg atctatcgct gcaaaccagt gaaatcaaag 360 aagaagaaaa ggaactgaga agaactacat ataaactaca agtcaaaaat gaagaggtaa 420 agaatatgtc acttgaactc aactcaaaac ttgaaagcct cctagaagaa aaaattctac 480 ttcaacaaaa agtgaaatat ttagaagagc aactaactaa cttaattcaa aatcaacctg 540 aaactccaga acacccagaa gtaacttcac ttaaaacttt tgtagaaaaa caagataata 600 gcatcaaaga ccttctccag accgtggaag accaatataa acaattaaac caacagcata 660 gtcaaataaa agaaatagaa aatcagctca gaaggactag tattcaagaa cccacagaaa 720 tttctctatc ttccaagcca agagcaccaa gaactactcc ctttcttcag ttgaatgaaa 780 taagaaatgt aaaacatgat ggcattcctg ctgaatgtac caccatttat aacagaggtg 840 aacatacaag tggcatgtat gccatcagac ccagcaactc tcaagttttt catgtctact 900 gtgatgttat atcaggtagt ccatggacat taattcaaca tcgaatagat ggatcacaaa 960 acttcaatga aacgtgggag aactacaaat atggttttgg gaggcttgat ggagaatttt 1020 ggttgggcct agagaagata tactccatag tgaagcaatc taattatgtt ttacgaattg 1080 agttggaaga ctggaaagac aacaaacatt atattgaata ttctttttac ttgggaaatc 1140 acgaaaccaa ctatacgcta catctagttg cgattactgg caatgtcccc aatgcaatcc 1200 cggaaaacaa agatttggtg ttttctactt gggatcacaa agcaaaagga cacttcaact 1260 gtccagaggg ttattcagga ggctggtggt ggcatgatga gtgtggagaa aacaacctaa 1320 atggtaaata taacaaacca agagcaaaat ctaagccaga gaggagaaga ggattatctt 1380 ggaagtctca aaatggaagg ttatactcta taaaatcaac caaaatgttg atccatccaa 1440 cagattcaga aagctttgaa tgaactgagg caaatttaaa aggcaataat ttaaacatta 1500 acctcattcc aagttaatgt ggtctaataa tctggtatta aatccttaag agaaagcttg 1560 agaaatagat tttttttatc ttaaagtcac tgtctattta agattaaaca tacaatcaca 1620 taaccttaaa gaataccgtt tacatttctc aatcaaaatt cttataatac tatttgtttt 1680 aaattttgtg atgtgggaat caattttaga tggtcacaat ctagattata atcaataggt 1740 gaacttatta aataactttt ctaaataaaa aatttagaga cttttatttt aaaaggcatc 1800 atatgagcta atatcacaac tttcccagtt taaaaaacta gtactcttgt taaaactcta 1860 aacttgacta aatacagagg actggtaatt gtacagttct taaatgttgt agtattaatt 1920 tcaaaactaa aaatcgtcag cacagagtat gtgtaaaaat ctgtaataca aatttttaaa 1980 ctgatgcttc attttgctac aaaataattt ggagtaaatg tttgatatga tttatttatg 2040 aaacctaatg aagcagaatt aaatactgta ttaaaataag ttcgctgtct ttaaacaaat 2100 ggagatgact actaagtcac attgacttta acatgaggta tcactatacc ttatttgtta 2160 aaatatatac tgtatacatt ttatatattt taacacttaa tactatgaaa acaaataatt 2220 gtaaaggaat cttgtcagat tacagtaaga atgaacatat ttgtggcatc gagttaaagt 2280 ttatatttcc 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135 140 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 145 150 155 160 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 165 170 175 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 180 185 190 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 195 200 205 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 210 215 220 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 225 230 235 240 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 245 250 255 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 260 265 270 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 275 280 285 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 290 295 300 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 305 310 315 320 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 325 330 335 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 340 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Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys 65 70 75 80 Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu 85 90 95 Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly 100 105 110 Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys 115 120 125 Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg 130 135 140 Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr 145 150 155 160 Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe 165 170 175 Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe 180 185 190 Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys 195 200 205 Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg 210 215 220 Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala 225 230 235 240 Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala 245 250 255 Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys 260 265 270 Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala 275 280 285 Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu 290 295 300 Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val 305 310 315 320 Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe 325 330 335 Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val 340 345 350 Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr 355 360 365 Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu 370 375 380 Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val 385 390 395 400 Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys 405 410 415 Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn 420 425 430 Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro 435 440 445 Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys 450 455 460 Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu 465 470 475 480 Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val 485 490 495 Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg 500 505 510 Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu 515 520 525 Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser 530 535 540 Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val 545 550 555 560 Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp 565 570 575 Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu 580 585 590 Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala 595 600 605 Ala Leu Gly Leu Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro 610 615 620 Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro 625 630 635 640 Gly Arg Ala Ala Pro Met Gly Gly Pro Glu Leu Ala Gln His Glu Glu 645 650 655 Leu Thr Leu Leu Phe His Gly Thr Leu Gln Leu Gly Gln Ala Leu Asn 660 665 670 Gly Val Tyr Arg Thr Thr Glu Gly Arg Leu Thr Lys Ala Arg Asn Ser 675 680 685 Leu Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Ile Glu Leu Leu Gly Gln Glu Val Ser 690 695 700 Arg Gly Arg Asp Ala Ala Gln Glu Leu Arg Ala Ser Leu Leu Glu Thr 705 710 715 720 Gln Met Glu Glu Asp Ile Leu Gln Leu Gln Ala Glu Ala Thr Ala Glu 725 730 735 Val Leu Gly Glu Val Ala Gln Ala Gln Lys Val Leu Arg Asp Ser Val 740 745 750 Gln Arg Leu Glu Val Gln Leu Arg Ser Ala Trp Leu Gly Pro Ala Tyr 755 760 765 Arg Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala His Ala Asp Lys Gln Ser His Ile 770 775 780 Leu Trp Ala Leu Thr Gly His Val Gln Arg Gln Arg Arg Glu Met Val 785 790 795 800 Ala Gln Gln His Arg Leu Arg Gln Ile Gln Glu Arg Leu His Thr Ala 805 810 815 Ala Leu Pro Ala 820 <210> 19 <211> 455 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 19 Ser Arg Ile Asp Gln Asp Asn Ser Ser Phe Asp Ser Leu Ser Pro Glu 1 5 10 15 Pro Lys Ser Arg Phe Ala Met Leu Asp Asp Val Lys Ile Leu Ala Asn 20 25 30 Gly Leu Leu Gln Leu Gly His Gly Leu Lys Asp Phe Val His Lys Thr 35 40 45 Lys Gly Gln Ile Asn Asp Ile Phe Gln Lys Leu Asn Ile Phe Asp Gln 50 55 60 Ser Phe Tyr Asp Leu Ser Leu Gln Thr Ser Glu Ile Lys Glu Glu Glu 65 70 75 80 Lys Glu Leu Arg Arg Thr Thr Tyr Lys Leu Gln Val Lys Asn Glu Glu 85 90 95 Val Lys Asn Met Ser Leu Glu Leu Asn Ser Lys Leu Glu Ser Leu Leu 100 105 110 Glu Glu Lys Ile Leu Leu Gln Gln Lys Val Lys Tyr Leu Glu Glu Gln 115 120 125 Leu Thr Asn Leu Ile Gln Asn Gln Pro Glu Thr Pro Glu His Pro Glu 130 135 140 Val Thr Ser Leu Lys Thr Phe Val Glu Lys Gln Asp Asn Ser Ile Lys 145 150 155 160 Asp Leu Leu Gln Thr Val Glu Asp Gln Tyr Lys Gln Leu Asn Gln Gln 165 170 175 His Ser Gln Ile Lys Glu Ile Glu Asn Gln Leu Arg Arg Thr Ser Ile 180 185 190 Gln Glu Pro Thr Glu Ile Ser Leu Ser Ser Lys Pro Arg Ala Pro Arg 195 200 205 Thr Thr Pro Phe Leu Gln Leu Asn Glu Ile Arg Asn Val Lys His Asp 210 215 220 Gly Ile Pro Ala Glu Cys Thr Thr Ile Tyr Asn Arg Gly Glu His Thr 225 230 235 240 Ser Gly Met Tyr Ala Ile Arg Pro Ser Asn Ser Gln Val Phe His Val 245 250 255 Tyr Cys Asp Val Ile Ser Gly Ser Pro Trp Thr Leu Ile Gln His Arg 260 265 270 Ile Asp Gly Ser Gln Asn Phe Asn Glu Thr Trp Glu Asn Tyr Lys Tyr 275 280 285 Gly Phe Gly Arg Leu Asp Gly Glu Phe Trp Leu Gly Leu Glu Lys Ile 290 295 300 Tyr Ser Ile Val Lys Gln Ser Asn Tyr Val Leu Arg Ile Glu Leu Glu 305 310 315 320 Asp Trp Lys Asp Asn Lys His Tyr Ile Glu Tyr Ser Phe Tyr Leu Gly 325 330 335 Asn His Glu Thr Asn Tyr Thr Leu His Leu Val Ala Ile Thr Gly Asn 340 345 350 Val Pro Asn Ala Ile Pro Glu Asn Lys Asp Leu Val Phe Ser Thr Trp 355 360 365 Asp His Lys Ala Lys Gly His Phe Asn Cys Pro Glu Gly Tyr Ser Gly 370 375 380 Gly Trp Trp Trp His Asp Glu Cys Gly Glu Asn Asn Leu Asn Gly Lys 385 390 395 400 Tyr Asn Lys Pro Arg Ala Lys Ser Lys Pro Glu Arg Arg Arg Gly Leu 405 410 415 Ser Trp Lys Ser Gln Asn Gly Arg Leu Tyr Ser Ile Lys Ser Thr Lys 420 425 430 Met Leu Ile His Pro Thr Asp Ser Glu Ser Phe Glu Ala Ala Ala Asp 435 440 445 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 450 455 <210> 20 <211> 182 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 20 Gly Pro Gly Arg Ala Ala Pro Met Gly Gly Pro Glu Leu Ala Gln His 1 5 10 15 Glu Glu Leu Thr Leu Leu Phe His Gly Thr Leu Gln Leu Gly Gln Ala 20 25 30 Leu Asn Gly Val Tyr Arg Thr Thr Glu Gly Arg Leu Thr Lys Ala Arg 35 40 45 Asn Ser Leu Gly Leu Tyr Gly Arg Thr Ile Glu Leu Leu Gly Gln Glu 50 55 60 Val Ser Arg Gly Arg Asp Ala Ala Gln Glu Leu Arg Ala Ser Leu Leu 65 70 75 80 Glu Thr Gln Met Glu Glu Asp Ile Leu Gln Leu Gln Ala Glu Ala Thr 85 90 95 Ala Glu Val Leu Gly Glu Val Ala Gln Ala Gln Lys Val Leu Arg Asp 100 105 110 Ser Val Gln Arg Leu Glu Val Gln Leu Arg Ser Ala Trp Leu Gly Pro 115 120 125 Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Val Leu Lys Ala His Ala Asp Lys Gln Ser 130 135 140 His Ile Leu Trp Ala Leu Thr Gly His Val Gln Arg Gln Arg Arg Glu 145 150 155 160 Met Val Ala Gln Gln His Arg Leu Arg Gln Ile Gln Glu Arg Leu His 165 170 175 Thr Ala Ala Leu Pro Ala 180 <210> 21 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 21 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Ser Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 22 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 22 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Ala Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 23 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 23 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Thr Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 24 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 25 <211> 220 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 25 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Met Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Arg Ile Gln Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp 115 120 125 Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn 130 135 140 Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu 145 150 155 160 Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp 165 170 175 Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 180 185 190 Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser 195 200 205 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220

Claims (38)

  1. 경쇄 결정 영역 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3, 및
    중쇄 결정 영역 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3
    을 포함하는, 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하는 항체이며,
    LCDR1은 아미노산 서열 RSSQSLLDSDDGNTYLD(SEQ ID NO:11)를 갖고,
    LCDR2는 아미노산 서열 YMLSYRAS(SEQ ID NO:12)를 갖고,
    LCDR3은 아미노산 서열 MQRIEFPLT(SEQ ID NO:13)를 갖고,
    HCDR1은 아미노산 서열 TFSGFSLSISGVGVG(SEQ ID NO:14)를 갖고,
    HCDR2는 아미노산 서열 LIYRNDDKRYSPSLKS(SEQ ID NO:15)를 갖고,
    HCDR3은 아미노산 서열 ARTYSSGWYGNWFDP(SEQ ID NO:16)를 갖는 것인
    항체.
  2. 제1항에 있어서,
    경쇄 가변 영역(LCVR)을 포함하며,
    LCVR은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  3. 제1항에 있어서,
    중쇄 가변 영역(HCVR)을 포함하며,
    HCVR은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    LCVR은 SEQ ID NO:9의 아미노산 서열을 갖고,
    HCVR은 SEQ ID NO:10의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IgG4 이소타입(isotype)인 항체.
  6. 경쇄(LC) 및
    중쇄(HC)
    를 포함하는, 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하는 항체이며,
    LC는 SEQ ID NO:5, 21, 22, 23, 24 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 것인
    항체.
  7. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:5의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  8. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  9. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  10. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  11. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  12. 제6항에 있어서,
    LC는 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 갖고,
    HC는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 갖는 것인 항체.
  13. SEQ ID NO:5 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 폴리펩타이드가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  14. SEQ ID NO:21 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  15. SEQ ID NO:22 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  16. SEQ ID NO:23 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  17. SEQ ID NO:24 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  18. SEQ ID NO:25 및 6의 아미노산 서열을 포함하는 항체를 인코딩하는 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    상기 항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  19. SEQ ID NO:5, 21, 22, 23, 24 및 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 인코딩하는 제1 cDNA 분자, 및
    SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄를 인코딩하는 제2 cDNA 분자
    의 적어도 2개의 cDNA 분자를 포함하는 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하고,
    항체를 회수함
    으로써 생성되는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 표준 지질단백질 리파제 활성 검정법에서 인간 ANGPTL3/8 복합체에 3.0 nM 이하의 EC50으로 결합하고 이를 중화시키는 항체.
  21. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 ANGPTL3/8 복합체에 1 x 10-6 M 이하의 해리 상수로 결합하는 항체.
  22. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 ANGPTL3 및 인간 ANGPTL8에 1 x 10-6 M 초과의 해리 상수로 결합하는 항체.
  23. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, ELISA 검정법으로 측정시 100 nM 이하에서 인간 ANGPTL3/8 복합체에 결합하고 인간 ANGPTL3 단독 또는 인간 ANGPTL8 단독에는 결합하지 않는 항체.
  24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 투약 후 14일 시점에 10 mg/kg의 용량에서 IgG 대조군과 비교하여 생체내에서 트리글리세라이드를 적어도 50%만큼 낮추는 항체.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체 또는 항체 집단 및
    허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제
    를 포함하는 약학적 조성물.
  26. SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  27. SEQ ID NO:21 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  28. SEQ ID NO:22 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  29. SEQ ID NO:23 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  30. SEQ ID NO:24 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  31. SEQ ID NO:25 및 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자를 포함하며,
    폴리펩타이드를 발현할 수 있는
    포유류 세포.
  32. 제1 DNA 분자 및
    제2 DNA 분자
    를 포함하며,
    상기 제1 DNA 분자는 SEQ ID NO:5, 21, 22, 23, 24 또는 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
    상기 제2 DNA 분자는 SEQ ID NO:6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하며,
    상기 세포는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 포유류 세포.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항의 포유류 세포를 상기 항체가 발현되는 조건 하에 배양하는 단계, 및
    상기 발현된 항체를 회수하는 단계
    를 포함하는, 항체를 생성하는 방법.
  34. ASCVD, 당뇨병, 비만, NASH, CKD, 또는 과트리글리세라이드혈증(hypertriglyceridemia), 또는 이들의 조합을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  35. 트리글리세라이드를 낮추는 방법으로서, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료법에 사용하기 위한, 항체.
  37. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, ASCVD, 당뇨병, 비만, NASH, CKD, 또는 과트리글리세라이드혈증, 또는 이들의 조합의 치료에 사용하기 위한, 항체.
  38. 유효량의 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항의 항체
    를 포함하며, ASCVD, 당뇨병, 비만, NASH, CKD, 또는 과트리글리세라이드혈증, 또는 이들의 조합을 치료하는 데 사용하기 위한 약학적 조성물.
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