BR112021011910A2 - Anticorpos dos complexos anti-angptl3/8 e métodos de uso dos mesmos - Google Patents

Abstract

anticorpos dos complexos antiangptl3/8 e métodos de uso dos mesmo. a presente invenção refere-se a complexos (angptl)3/8 e anticorpos de proteína semelhante à angiopoietina, em que os anticorpos se ligam e, desse modo, neutralizam os complexos angptl3/8. também são divulgadas composições farmacêuticas que incluem um ou mais anticorpos do complexo anti-angptl3/8 no presente documento em um veículo farmaceuticamente aceitável. métodos de fabricação e de uso do mesmo também são divulgados, especialmente para aumentar a atividade de lipase da lipoproteína e diminuir os triglicerídeos. desse modo, os compostos e composições podem ser usados no tratamento de doenças e distúrbios relacionados com o metabolismo de lipídios e relacionados com o metabolismo de glucose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “ANTICORPOS DOS COMPLEXOS ANTI-ANGPTL3/8 E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS”.

[0001] A presente invenção refere-se geralmente a biologia e medicina e, mais particularmente, refere-se a anticorpos (Abs) que se ligam e, desse modo, neutralizam os complexos de proteína semelhante à angiopoietina humana (ANGPTL) 3/8. Esses Abs podem aumentar a atividade da lipase de lipoproteína (LPL) e, assim, diminuir os triglicerídeos séricos (TGs) de modo que possam ser usados no tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e de glicose.

[0002] ANGPTLs são uma família de proteínas que regulam vários processos fisiológicos e fisiopatológicos. De particular interesse no presente documento, é o papel de ANGPTL3 e ANGPTL8 no metabolismo de lipídios e glicose.

[0003] As evidências apoiam o papel de ANGPTL3 como um regulador principal do metabolismo das lipoproteínas e pode regular a depuração de TG ao inibir a LPL e inibir a lipase endotelial (EL). Consultar Chi et al. (2017) Mol. Metab. 6: 1137-1149. A deficiência, inativação ou perda de ANGPTL3 pode resultar em níveis baixos de colesterol de lipoproteína de baixa densidade (LDL-C), colesterol de lipoproteína de alta densidade (HDL-C) e TGs. ANGPTL3 também pode afetar a sensibilidade à insulina, desempenhando assim um papel na modulação não apenas do metabolismo lipídico, mas também do metabolismo da glicose. Consultar Robciuc et al. (2013) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33: 1706-1713. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para ANGPTL3 humano são conhecidas. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser encontrada na Sequência de Referência NCBI Número NM_014495 (SEQ ID NO: 1), e uma sequência de aminoácidos pode ser encontrada na Sequência de

Referência NCBI Número NP_055310 (SEQ ID NO: 2).

[0004] ANGPTL8 é altamente expresso no fígado e tecido adiposo e foi relatado que inibe a LPL por complexação com e, portanto, ativação de ANGPTL3. Consultar Chi, supra. ANGPTL8 humano parece ser induzido pela alimentação. As sequências de ácido nucleico e de aminoácidos para ANGPTL8 humano são conhecidas. Por exemplo, uma sequência de ácido nucleico pode ser encontrada na Sequência de Referência NCBI Número NM_018687 (SEQ ID NO: 3), e uma sequência de aminoácidos pode ser encontrada na Sequência de Referência NCBI Número NP_061157 (SEQ ID NO: 4).

[0005] Existem complexos ANGPTL3/8, que têm um ou mais ANGPTL3s ligados a um ou mais ANGPTL8s. As evidências sugerem que esses complexos medeiam a inibição de LPL de forma mais eficaz quando comparados a ANGPTL3 ou ANGPTL8 isoladamente. Além disso, os complexos ANGPTL3/8 podem ser feitos in vitro pela coexpressão de ANGPTL8 e ANGPTL3 em um sistema de expressão de mamífero. Consultar Chi, supra.

[0006] São conhecidos os Abs que se ligam a ANGPTL3 ou ANGPTL8 e que podem ser usados sozinhos ou em combinação uns com os outros para tratar doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e de glicose. Por exemplo, Intl. A Publicação do Pedido de Patente Número WO 2012/174178 divulga um Ab monoclonal totalmente humano e seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ANGPTL3 e interferem com sua atividade. Outros Abs terapêuticos anti-ANGPTL3 também são conhecidos. Consultar, por exemplo, Intl. Publicação do pedido de patente número WO 2008/073300 e patente Número US 7.935.796. Da mesma forma, Intl. A publicação do pedido de patente nº WO 2017/027316 divulga um Ab monoclonal totalmente humano ou seus fragmentos de ligação ao antígeno que se ligam a ANGPTL8 e interferem com a sua atividade.

Além disso, Intl. A Publicação do Pedido de Patente Número WO 2017/177181 divulga uma terapia combinada de Ab anti-ANGPTL3 e Ab anti-ANGPTL8.

[0007] Infelizmente, os Abs existentes que se ligam apenas a ANGPTL3 ou ANGPTL8 não anulam totalmente o efeito desses complexos ANGPTLs e/ou ANGPTL3/8 no metabolismo de lipídeos e/ou glicose. Consultar, por exemplo, Dewey et al. (2017) N. Engl. J. Med. 377: 211-221; e Gusarova et al. (2017) Endocrinology 158: 1252-1259. Em vista disso, há uma necessidade de Abs adicionais, especialmente Abs do complexo anti-ANGPTL3/8, para o tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e da glicose, em que tais Abs tenham propriedades farmacológicas inibitórias e/ou regulatórias melhoradas para modular metabolismo de lipídios e/ou glicose.

[0008] Para atender a essa necessidade, as sequências nucleicas e de aminoácidos são fornecidas para um complexo ANGTPL3/8 modificado. Consequentemente, as sequências de ácido nucleico que codificam um ou mais de um ANGPTL3 modificado e um ANGPTL8 modificado (isto é, proteínas de fusão) são descritas no presente documento. Em alguns casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANGPTL3 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em outros casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANGPTL8 com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em ainda outros casos, as sequências de ácido nucleico incluem uma sequência polinucleotídica que codifica SEQ ID NO: 17 e 18.

[0009] Além disso, são fornecidos construtos de ácido nucleico que incluem uma sequência polinucleotídica que codifica uma proteína de fusão ANGPTL3 conforme descrito no presente documento, uma proteína de fusão ANGPTL8 conforme descrito no presente documento, ou ambos, em que tais construtos podem ser um cassete de expressão ou um vetor.

[0010] Tendo em vista o acima, são fornecidas células hospedeiras que incluem um ou mais cassetes de expressão ou vetores conforme descrito no presente documento. Em alguns casos, as células hospedeiras são células eucarióticas. Em alguns casos, as sequências polinucleotídicas para as proteínas de fusão ANGPTL3 e ANGTPL8 estão em cassetes de expressão ou vetores separados, enquanto em outros casos podem estar no mesmo cassete de expressão ou vetor.

[0011] Além disso, são fornecidas proteínas de fusão ANGPTL3 que incluem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou 19, bem como variantes ativas ou fragmentos das mesmas. Da mesma forma, são fornecidas proteínas de fusão ANGPTL8 que incluem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 ou 20, bem como variantes ativas ou fragmentos das mesmas.

[0012] Além disso, complexos ANGPTL3/8 funcionais são fornecidos, especialmente complexos ANGPTL3/8 humanos, em que uma fração ANGPTL3 do complexo é um ANGPTL3 nativo (comprimento total ou truncado) ou uma proteína de fusão ANGPTL3 conforme descrito no presente documento e em que uma fração ANGPTL8 do complexo é uma proteína de fusão ANGPTL8 conforme descrito no presente documento. Em alguns casos, a proteína de fusão ANGPTL3 inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Da mesma forma, e em alguns casos, a proteína de fusão ANGPTL8 inclui uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. Além disso, e em alguns casos, os complexos podem ter uma razão de 1:1 da fração ANGPTL3 para a fração ANGPTL8. Em outros casos, os complexos podem ter razões diferentes de 1:1, como razão de 1:2, 1:3, 2:1 ou 3:1 de fração ANGPTL3 para fração ANGPTL8, respectivamente.

[0013] Métodos também são fornecidos para fazer complexos ANGTPL3/8 recombinantes. Os métodos podem incluir pelo menos uma etapa de expressão de uma ou mais sequências polinucleotídicas para uma fração ANGPTL3 e uma fração ANGPTL8 conforme descrito no presente documento em uma célula hospedeira, como em um sistema de expressão de mamífero para obter complexos ANGPTL3/8 a partir da mesma. Em alguns casos, as porções ANGPTL3 e ANGPTL8 são fornecidas em construtos de expressão ou vetores separados. Em outros casos, ANGPTL3 e ANGPTL8 são fornecidos em um construto de expressão ou vetor. Os métodos também podem incluir uma etapa de purificação dos complexos ANGPTL3/8 resultantes, que podem incluir não apenas a concentração dos complexos ANGPTL3/8, mas também a remoção de um ou mais dos marcadores, ligantes e albumina sérica da fração ANGPTL3 e/ou ANGPTL8 metade. Os métodos também podem incluir uma etapa de concentração dos complexos ANGPTL3/8 antes e/ou após a etapa de purificação.

[0014] Em segundo lugar, um Ab para um complexo ANGPTL3/8 é fornecido, bem como seus usos, que incluem o tratamento de doenças e distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídios e de glicose por ligação e, desse modo, inibindo a atividade do complexo ANGPTL3/8.

[0015] Uma quantidade eficaz do Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, pode ser usada para aumentar a atividade de LPL, diminuir TGs e tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos e/ou glicose em um indivíduo em necessidade.

[0016] O Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento liga o complexo ANGPTL3/8 solúvel, aumentando assim a atividade de LPL e diminuindo os níveis séricos de TG. Indivíduos com níveis mais baixos de TG apresentam menor risco de doenças cardiovasculares. Vantajosamente, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento se liga apenas ao complexo ANGPTL3/8 e não a ANGPTL3 sozinho ou a ANGPTL8 sozinho em concentrações relevantes. Acredita-se que o Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 aumenta o catabolismo de lipoproteínas ricas em TG (TRLs), o que reduz TGs e/ou não-HDL-C, melhorando assim os fatores de risco de dislipidemia para doença cardiovascular aterosclerótica (ASCVD) não tratada por terapias atuais. Além disso, e devido ao Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 descrito no presente documento não se ligar a ANGPTL3 ou ANGPTL8 sozinho, outras ações desses ANGPTLs não são inibidas, o que pode levar a menos efeitos indesejáveis in vivo, como redução da repressão de EL.

[0017] Em particular, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 é um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 humano. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode anular, bloquear, inibir, interferir, neutralizar ou reduzir a atividade in vivo do complexo ANGPTL3/8, especialmente sua atividade inibidora de LPL. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser de comprimento total ou pode ser apenas um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab')2 ou scFv). Propriedades desejáveis de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 incluem redução de TG em baixas doses do Ab, que é durável por pelo menos 21 dias.

[0018] Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 liga o complexo ANGPTL3/8 humano e inclui regiões determinantes de cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 e regiões determinantes de cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3, em que LCDR1 tem a sequência de aminoácidos RSSQSLLDSDDGNTYLD (SEQ ID NO: 11), LCDR2 tem a sequência de aminoácidos YMLSYRAS (SEQ ID NO: 12) e LCDR3 tem a sequência de aminoácidos MQRIEFPLT (SEQ ID NO: 13), e em que HCDR1 tem a sequência de aminoácidos TFSGFSLSISGVGVG (SEQ ID NO: 14), HCDR2 tem a sequência de aminoácidos

LIYRNDDKRYSPSLKS (SEQ ID NO: 15) e HCDR3 tem a sequência de aminoácidos ARTYSSGWYGNWFDP (SEQ ID NO: 16).

[0019] É ainda fornecido um Ab que inclui uma região variável da cadeia leve (LCVR), em que o LCVR tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; ou um Ab que inclui uma região variável da cadeia pesada (HCVR), em que o HCVR tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em alguns casos, o Ab inclui um LCVR com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 e um HCVR com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 10. Em alguns casos, o Ab inclui uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a LC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou a HC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Alternativamente, o Ab inclui uma cadeia leve (LC) e uma cadeia pesada (HC), em que a LC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e a HC tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. Em certos casos, o Ab é um isotipo IgG4.

[0020] Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab descrito acima, especialmente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), um Mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas (por exemplo, mutações D33T e M56T ou mutações D33A e M56T), em relação a uma LC com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0021] Além disso, é fornecido um Ab que é produzido através do cultivo de uma célula de mamífero que inclui uma molécula de cDNA, em que a molécula de cDNA codifica polipeptídeos com as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e 6, sob tais condições em que os polipeptídeos são expressos, e se que recupera o Ab. Alternativamente, é fornecido um Ab que é produzido cultivando-se uma célula de mamífero incluindo duas moléculas de cDNA, em que uma primeira molécula de cDNA codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e uma segunda molécula de cDNA codifica um polipeptídeo que tem o amino sequência de ácido de SEQ ID NO: 6, sob tais condições em que os polipeptídeos são expressos e que recupera o Ab. Em alguns casos, o Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab descrito acima, especialmente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas, em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0022] Além disso, é fornecido um Ab que se liga a e neutraliza ANGPTL3/8 humano complexa em um ensaio de atividade da LPL padrão com um EC50 de 0,5 nM ou menos. Além disso, é fornecido um Ab que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano com uma constante de dissociação menor ou igual a 1 x 10-6 M. Além disso, é fornecido um Ab que se liga a ANGPTL3 humano e ANGPTL8 humano com uma constante de dissociação de maior do que 1 x 10-6 M. Além disso, é fornecido um Ab que se liga ao complexo ANGPTL3/8 humano com um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação, conforme medido por ensaio ELISA de ponto único, mas não se liga para ANGPTL3 humano sozinho ou ANGPTL8 humano sozinho com um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação, conforme medido por ensaio ELISA de ponto único. Da mesma forma, é fornecido um Ab que reduz os TGs in vivo em pelo menos 50% quando comparado ao controle de IgG a uma dose de 10 mg/kg em um ponto de tempo 14 dias após a dosagem.

[0023] Em terceiro lugar, é fornecida uma composição farmacêutica que inclui o Ab no presente documento ou uma população de Abs no presente documento e um transportador, diluente ou excipiente aceitável. Também é fornecida uma célula de mamífero incluindo uma molécula de DNA incluindo uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que tem sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, em que a célula é capaz de expressar um Ab no presente documento. É fornecida ainda uma célula de mamífero incluindo uma primeira molécula de DNA e uma segunda molécula de DNA, em que a primeira molécula de DNA inclui uma sequência de polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, e em que a segunda molécula de DNA inclui uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, e em que a célula é capaz de expressar um Ab no presente documento. Em alguns casos, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser uma variante do Ab descrito acima, especialmente uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24), uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) ou uma combinação das mesmas, em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0024] Em quarto lugar, é fornecido um processo para a produção de um Ab, em que o processo inclui o cultivo de uma célula de mamífero com uma molécula de DNA que tem uma sequência polinucleotídica que codifica polipeptídeos que tem as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, em que a célula é capaz de expressar o Ab no presente documento sob condições tais que o Ab é expresso e recuperar o Ab expresso. Em alguns casos, a sequência polinucleotídica que codifica o polipeptídeo com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 pode codificar uma mutação D31S, uma mutação D33A, uma mutação D33T, uma mutação M56T, uma mutação E99Q ou uma combinação dos mesmos. Também é fornecido no presente documento um método de tratamento de ASCVD, doença renal crônica (CKD), diabetes, hipertrigliceridemia, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), obesidade ou uma combinação dos mesmos, em que o método inclui a administração a um indivíduo em necessidade de um Ab no presente documento. É fornecido ainda um método de redução de TGs que inclui a administração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade eficaz de um Ab no presente documento.

[0025] Em quinto lugar, um Ab é fornecido para uso em terapia. Em particular, o Ab é para uso no tratamento de ASCVD, CKD, diabetes, hipertrigliceridemia, NASH, obesidade ou uma combinação dos mesmos. Também é fornecida uma composição farmacêutica para uso no tratamento de ASCVD, CKD, diabetes, hipertrigliceridemia, NASH, obesidade ou uma combinação dos mesmos, que inclui uma quantidade eficaz de um Ab no presente documento.

[0026] As vantagens, efeitos, recursos e objetos diferentes daqueles estabelecidos acima se tornarão mais facilmente evidentes quando for dada consideração à descrição detalhada abaixo. Essa descrição detalhada faz referência aos seguintes desenhos, em que:

[0027] A Figura 1 mostra uma imagem de um gel de página SDS que mostra o complexo ANGPTL3/8 executado sob condições reduzidas e não reduzidas.

[0028] A referência a um elemento pelo artigo indefinido “um” ou “uma” não exclui a possibilidade de que mais de um elemento esteja presente, a menos que o contexto exija claramente que haja um e apenas um elemento. O artigo indefinido "um" ou "uma", portanto, geralmente significa "pelo menos um."

DEFINIÇÕES

[0029] Conforme usado no presente documento, "cerca de" significa dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor ou valores como, por exemplo, uma concentração declarada, comprimento, peso molecular, pH, similaridade de sequência, período de tempo, temperatura, volume, etc. Tal valor ou o intervalo pode estar dentro de uma ordem de magnitude normalmente dentro de 20%, mais tipicamente dentro de 10% e ainda mais tipicamente dentro de 5% de um determinado valor ou intervalo. A variação permitida abrangida por "cerca de" dependerá do sistema particular em estudo e pode ser prontamente apreciada por um versado na técnica.

[0030] Conforme usado no presente documento, "afinidade" significa uma força de ligação de um Ab a um epítopo em um complexo ANGPTL3/8.

[0031] Conforme usado no presente documento, "proteína semelhante a angiopoietina 3" ou "ANGPTL3" significa uma proteína com uma sequência de aminoácidos incluindo SEQ ID NO: 2.

[0032] Conforme usado no presente documento, "proteína semelhante a angiopoietina 8" ou "ANGPTL8" significa uma proteína com uma sequência de aminoácidos incluindo SEQ ID NO: 4.

[0033] Conforme usado no presente documento, "complexo ANGPTL3/8" significa um complexo multiproteico de um ou mais compostos ANGPTL3 que estão ligados a um ou mais compostos ANGPTL8.

[0034] Conforme usado no presente documento, "Ab complexo anti- ANGPTL3/8" ou "Ab complexo anti-ANGPTL3/8" significa um Ab que simultaneamente reconhece e se liga a uma área em ANGPTL3 e ANGPTL8, especialmente quando na forma de ANGPTL3/8 complexo. Geralmente, um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 geralmente não se liga a outros membros da família ANGPTL (por exemplo, ANGPTL1, ANGPTL2, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6 ou ANGPTL7). Além disso, e conforme observado em outro lugar, um Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 também não se ligará a ANGPTL3 ou ANGPTL8 sozinho em concentrações especificadas, conforme descrito no ensaio ELISA de ponto único abaixo.

[0035] Conforme usado no presente documento, "ligar" ou “ligarem" significa uma capacidade de uma proteína de formar um tipo de ligação química ou força atrativa com outra proteína ou molécula, conforme determinado por métodos comuns conhecidos na técnica. A ligação pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de cerca de 1 x 10-6 M ou menos (isto é, um KD menor denota uma ligação mais forte). Métodos para determinar se duas moléculas se ligam são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância plasmônica de superfície e semelhantes. Aqui, um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 liga apenas o complexo ANGPTL3/8 e não liga ANGPTL3 sozinho ou ANGPTL8 sozinho. Se um Ab se liga apenas ao complexo ANGPTL3/8 e não a ANGPTL3 sozinho ou ANGPTL8 sozinho pode ser determinado em ensaios ELISA padrão em um formato de ponto único, conforme descrito abaixo e a ligação pode ser caracterizada por Biacore, conforme descrito abaixo. Embora os Abs no presente documento sejam humanos, podem, no entanto, exibir reatividade cruzada com outros complexos ANGPTL3/8 de outras espécies, por exemplo, complexo ANGPTL3/8 de macaco cinomolgo, complexo ANGPTL3/8 de camundongo ou complexo ANGPTL3/8 de rato.

[0036] Conforme usado no presente documento, "quantidade eficaz" significa uma quantidade ou dose de um composto ou uma composição farmacêutica que contém o mesmo, que após administração de dose única ou múltipla a um indivíduo, irá provocar uma resposta biológica ou médica ou efeito terapêutico desejado em um tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que é procurado pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico. Em alguns casos, uma quantidade eficaz de um composto no presente documento ou composições que incluem o mesmo para um indivíduo em necessidade resultaria no aumento da atividade de LPL. Uma dose pode incluir uma dose de ataque inicial mais alta, seguida por uma dose mais baixa. Uma dose pode ser administrada em qualquer intervalo terapeuticamente eficaz, como várias vezes ao dia, uma vez ao dia, a cada dois dias, três vezes por semana, duas vezes por semana, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, etc. Uma dose que constitui uma quantidade eficaz pode estar entre 0,01 mg/kg e 100 mg/kg.

[0037] Conforme usado no presente documento, "constante de dissociação de equilíbrio" ou "KD" significa uma medição quantitativa da afinidade de Ab para uma interação de antígeno particular, como afinidade de um Ab para o complexo ANGPTL3/8, especialmente uma medida de uma propensão de um conjugado complexo Ab/ANGPTL3/8 para separar reversivelmente em suas partes componentes. Da mesma forma, e conforme usado no presente documento, "constante de associação de equilíbrio" ou "Ka" significa um inverso de KD.

[0038] Conforme usado no presente documento, "funcional" significa que uma proteína de fusão ANGPTL3, proteína de fusão ANGPTL8 ou complexo ANGPTL3/8 tem atividade biológica semelhante à de um ANGPTL3 nativo, um ANGPTL8 nativo ou um complexo ANGPTL3/8 nativo incluindo, por exemplo, a inibição de LPL ou agindo como um antígeno para o qual um Ab pode ser feito e direcionado.

[0039] Conforme usado no presente documento, "doença ou distúrbio relacionado ao metabolismo da glicose" significa diabetes e semelhantes.

[0040] Conforme usado no presente documento, "doença ou distúrbio relacionado ao metabolismo lipídico" significa uma afecção associada ao metabolismo lipídico anormal, como dislipidemia, hiperlipidemia e hiperlipoproteinemia, incluindo hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia, quilomicronemia, dislipidemia mista (obesidade,

síndrome metabólica, diabetes, etc.), lipodistrofia e lipoatrofia. O termo também abrange certas doenças cardiovasculares, como aterosclerose e doença arterial coronariana, pancreatite aguda, NASH, obesidade e semelhantes.

[0041] Conforme usado no presente documento, "metade da concentração efetiva máxima" ou "EC50" significa uma concentração de um Ab (tipicamente expresso em unidades molares (M)) que induz uma resposta a meio caminho entre uma linha de base e um máximo após um período de tempo predeterminado. O EC50 no presente documento descrito é idealmente de 3,0 nM ou menos.

[0042] Conforme usado no presente documento, "construção de ácido nucleico" ou "cassete de expressão" significa uma molécula de ácido nucleico com pelo menos uma sequência de controle operacionalmente ligada a uma sequência de codificação. Desse modo, uma sequência de controle, como um promotor, está em interação operável com as sequências de ácido nucleico que codificam pelo menos um polipeptídeo de interesse, como as proteínas de fusão ANGPTL3 descritas no presente documento e/ou as proteínas de fusão ANGPTL8 descritas no presente documento. Tais construções de ácido nucleico podem estar na forma de uma expressão ou cassete de transferência. Um construto de ácido nucleico pode incluir um composto oligonucleotídeo ou polinucleotídeo de desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos ou combinações dos mesmos que tem incorporados nos mesmos as sequências de nucleotídeos para um ou mais polipeptídeos de interesse.

[0043] Conforme usado no presente documento, "operacionalmente ligado" significa que os elementos de um construto de ácido nucleico são configurados de modo a desempenhar sua função usual. Assim, as sequências de controle (isto é, promotores) operativamente ligadas a uma sequência de codificação são capazes de efetuar a expressão da sequência de codificação. As sequências de controle não precisam ser contíguas à sequência de codificação, desde que funcionem para direcionar sua expressão (isto é, manter a estrutura de leitura adequada). Assim, por exemplo, sequências intermediárias não traduzidas, embora transcritas, podem estar presentes entre um promotor e uma sequência de codificação, e a sequência do promotor ainda pode ser considerada "operacionalmente ligada" à sequência de codificação.

[0044] Conforme usado no presente documento, "sequência de controle" ou "sequências de controle" significa promotores, sinais de poliadenilação, sequências de terminação de transcrição e tradução, domínios reguladores a montante, origens de replicação, locais de entrada de ribossomo interno ("IRES"), potencializadores e semelhantes, que fornecem coletivamente para replicação, transcrição e tradução de uma sequência de codificação em uma célula hospedeira receptora. Nem todas essas sequências de controle precisam estar sempre presentes, desde que a sequência de codificação selecionada seja capaz de ser replicada, transcrita e traduzida em uma célula hospedeira apropriada.

[0045] Conforme usado no presente documento, "sequência de codificação" ou "sequências de codificação" significa uma sequência de ácido nucleico que codifica para um ou mais polipeptídeos de interesse e é uma sequência de ácido nucleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de RNA) em um polipeptídeo in vitro ou in vivo quando colocado sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Os limites da sequência (ou sequências) de codificação são determinados por um códon de início no terminal 5 '(amino) e um códon de parada da tradução no terminal 3' (carbóxi). Uma sequência de codificação pode incluir, mas sem limitação, sequências de ácido nucleico viral, cDNA de mRNA procariótico ou eucariótico, sequências de DNA genômico de DNA procariótico ou eucariótico ou mesmo sequências de DNA sintético.

[0046] No que diz respeito às sequências de controle e de codificação, podem ser nativas/análogas à célula hospedeira ou entre si. Alternativamente, as sequências de controle e de codificação podem ser heterólogas para a célula hospedeira ou entre si.

[0047] Conforme usado no presente documento, "promotor" significa uma região de nucleotídeo composta por uma sequência reguladora de ácido nucleico, em que a sequência reguladora é derivada de um gene ou criada sinteticamente e é capaz de se ligar à RNA polimerase e iniciar a transcrição de uma sequência a jusante (direção 3') sequência de codificação. Vários promotores podem ser usados em construções de ácido nucleico, incluindo um promotor nativo para um ou mais polipeptídeos de interesse. Alternativamente, os promotores podem ser selecionados com base em um resultado desejado. Esses promotores podem incluir, mas sem limitação, promotores indutíveis, promotores reprimíveis e promotores constitutivos.

[0048] Conforme usado no presente documento, "variante" significa um polinucleotídeo ou um polipeptídeo que tem uma ou mais modificações, como uma adição, deleção, inserção e/ou substituição de um ou mais ácidos nucleicos específicos ou resíduos de aminoácidos quando comparados a um ácido nucleico ou aminoácido de referência sequência de ácido. Uma variante, portanto, inclui uma ou mais alterações quando comparada ao ácido nucleico de referência ou sequência de aminoácidos. Aqui, o Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ter uma variação LC ou HC. Em particular, o Ab pode ser uma variante LC com uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23); uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO:

25) em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Da mesma forma, a variante LC pode ser uma combinação de qualquer um dos dois acima, como, por exemplo, mutações D31S e D33A, mutações D31S e D33T, mutações D31S e M56T, mutações D31S e E99Q, mutações D33A e M56T, mutações D33A e E99Q, Mutações D33T e M56T, mutações D33T e E99Q e M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Além disso, a variante LC pode ser uma combinação de qualquer um dos três acima, como, por exemplo, mutações D31S, D33A e M56T, mutações D31S, D33A e E99Q, mutações D31S, D33T e M56T, mutações D31S, D33T e E99Q, D33A, mutações M56T e E99Q, e mutações D33T, M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. Além disso, a variante LC pode ser uma combinação de quaisquer quatro dos acima, como, por exemplo, mutações D31S, D33A, M56T e E99Q; e mutações D31S, D33T, M56T e E99Q, novamente em relação a uma LC que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

[0049] Conforme usado no presente documento, "vetor" significa um replicon, como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual outra sequência de ácido nucleico, como um cassete de expressão, pode ser anexada de modo a provocar a replicação da sequência anexada. Um vetor é capaz de transferir moléculas de ácido nucleico para células hospedeiras. Os vetores normalmente incluem um ou um pequeno número de locais de reconhecimento de endonuclease de restrição em que uma sequência de nucleotídeos de interesse pode ser inserida de uma forma determinável sem perda da função biológica essencial do vetor, bem como um marcador selecionável que pode ser usado para identificar e selecionar células hospedeiras transformadas com o vetor. Um vetor para esse fim pode ser capaz de transferir sequências de ácido nucleico para células alvo.

[0050] Conforme usado no presente documento, "tratamento" ou "tratar" significa gerenciamento e cuidado de um indivíduo com uma afecção para a qual a administração de Ab de complexo anti- ANGPTL3/8 é indicada com o propósito de combater ou aliviar os sintomas e complicações dessas afecções. O tratamento inclui a administração de um composto ou composições que contêm um composto no presente documento a tal indivíduo para prevenir o aparecimento de sintomas ou complicações, aliviar os sintomas ou complicações ou eliminar a doença, afecção ou distúrbio. O tratamento inclui a administração de um composto ou composições que contêm um composto no presente documento a um indivíduo em necessidade do mesmo para resultar no aumento da atividade de LPL e redução de TGs. O indivíduo a ser tratado é um animal, especialmente um ser humano.

[0051] Conforme usado no presente documento, "paciente", "sujeito" e "indivíduo" são usados de forma intercambiável no presente documento e significam um animal, especialmente um humano. Em certos casos, o indivíduo é um ser humano e é ainda caracterizado com uma doença, distúrbio ou afecção que se beneficiaria da administração de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8.

[0052] Conforme usado no presente documento, "anticorpo" ou "Ab" e semelhantes significa um Ab de comprimento total incluindo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves com ligações dissulfeto inter e intracadeias. A porção amino-terminal de cada uma das quatro cadeias polipeptídicas inclui uma região variável principalmente responsável pelo reconhecimento do antígeno. Cada HC inclui um HCVR de terminal N e uma região constante de HC (HCCR). Cada cadeia leve inclui uma região variável de cadeia leve (LC) (LCVR) e uma região constante LC (LCCR). Aqui, o Ab é uma imunoglobulina G (IgG) do tipo Ab e o isotipo IgG pode ser dividido em subclasses (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e

IgG4). As regiões HCVR e LCVR podem ser subdivididas em regiões de hiper-variabilidade, denominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada HCVR e LCVR inclui três CDRs e quatro FRs, organizados do terminal N ao terminal C na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Aqui, os três CDRs do HC são chamados de HCDR1, HCDR2 e HCDR3, e os três CDRs do LC são chamados de LCDR1, LCDR2 e LCDR3. Os CDRs contêm a maioria dos resíduos que formam interações específicas com um antígeno, como um complexo ANGPTL3/8. A atribuição dos resíduos às várias CDRs pode ser feita por algoritmos como, por exemplo, Chothia, Kabat ou North. A definição de CDR do Norte é baseada no agrupamento de propagação de afinidade com um grande número de estruturas cristalinas (North et al. (2011) J. Mol. Bio. 406: 228-256). Aqui, os CDRs são mais bem definidos pelas sequências listadas na Listagem de Sequências, que são baseadas em uma combinação de múltiplas definições, incluindo Norte.

[0053] Um DNA isolado que codifica uma região HCVR pode ser convertido em um gene de cadeia pesada de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica HCVR a outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada. As sequências de genes da região constante da cadeia pesada de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Os fragmentos de DNA que abrangem estas regiões podem ser obtidos, por exemplo, por amplificação de PCR padrão.

[0054] Um DNA isolado que codifica uma região LCVR pode ser convertido em um gene de cadeia leve de comprimento total ligando operacionalmente o DNA que codifica LCVR a outra molécula de DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. As sequências de genes da região constante da cadeia leve de humanos, bem como de outros mamíferos, são conhecidas na técnica. Fragmentos de DNA que abrangem essas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

[0055] Os Abs no presente documento podem conter uma porção Fc de IgG4-PAA. A porção Fc de IgG4-PAA tem uma mutação Ser para Pro na posição 231 (S231P), uma mutação Phe para Ala na posição 237 (F237A) e uma mutação Leu para Ala na posição 238 (L238A) numerada pela posição absoluta na SEQ ID NO: 6. A mutação S231P é uma mutação em dobradiça que impede a formação de meio-Ab (fenômeno de troca dinâmica de meias-moléculas em Abs de IgG4). As mutações F237A e L238A reduzem ainda mais a função efetora do já baixo isotipo IgG4 humano. É contemplado, no entanto, que o Abs no presente documento pode incluir alternativamente uma porção Fc diferente.

[0056] Para reduzir o potencial de indução de uma resposta imune quando administrado em humanos, certos aminoácidos podem exigir mutações reversas para corresponder às sequências da linha germinativa de Ab.

[0057] As composições farmacêuticas, incluindo os compostos no presente documento descritos, podem ser administradas por via parentérica a indivíduos que necessitem de tal tratamento. Esse indivíduo pode ter ASCVD ou estar em alto risco para ASCVD. Esses indivíduos podem ter síndromes coronárias agudas, história de infarto do miocárdio (MI), angina estável ou instável, revascularização coronária ou outra arterial, acidente vascular cerebral, ataque isquêmico transitório (AIT), aneurisma da aorta torácica ou abdominal ou doença arterial periférica presumivelmente de origem aterosclerótica. Indivíduos com alto risco para ASCVD podem ainda ter diabetes tipo 2 (T2D), CKD ou hipercolesterolemia familiar (FH).

[0058] A administração parenteral pode ser realizada por injeção subcutânea, intramuscular ou intravenosa por meio de uma seringa, opcionalmente uma seringa tipo caneta ou injetor acionado mecanicamente. Alternativamente, a administração parenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Em alguns casos, as composições farmacêuticas adequadas para administração a um indivíduo com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Essas composições farmacêuticas podem ser preparadas por qualquer uma de uma variedade de técnicas usando excipientes convencionais para produtos farmacêuticos que são bem conhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Remington, “The Science and Practice of Pharmacy” (DB Troy ed., 21ª Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 2006).

[0059] Os compostos no presente documento podem ser usados em combinação simultânea, separada ou sequencial com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis para modular a atividade da LPL, tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolismo de lipídeos ou tratar doenças ou distúrbios relacionados ao metabolismo da glicose, incluindo qualquer um dos distúrbios listado acima. Exemplos não limitativos dos agentes terapêuticos adicionais que podem ser combinados com os compostos reivindicados incluem, mas sem limitação, agentes antidiabéticos, como insulina ou análogos de insulina, biguanidas, sulfonilureias, tiazolidinedionas, dipeptidil peptidase-4 (“DPP-4”) inibidores ou inibidores do transportador de glicose dependente de sódio (SGLT2); compostos de incretina, como peptídeo semelhante a glucagon-1 (GLP-1) ou análogos de GLP-1, polipeptídeo inibidor gástrico (GIP) ou análogos de GIP, oxintomodulina (OXM) ou análogos de OXM; aspirina; agentes antiplaquetários; Bloqueadores do receptor H2; inibidores da bomba de protões; anti-

hipertensivos; terapias modificadoras de lipídios, como inibidores da HMG-CoA redutase, inibidores da PCSK9, inibidores da absorção do colesterol, fibratos, niacina, agonistas LXR, agonistas RXR, agonistas ROR ou moduladores reversos do transporte do colesterol; terapias para insuficiência cardíaca, como ACE, inibidores da neprilisina do receptor da angiotensina, ARB ou antagonistas adrenérgicos B; terapias antiinflamatórias; terapias de hipertensão, terapias de fibrilação atrial; terapias de neurodegeneração; terapias oncológicas; terapias para cardiomiopatia diabética, retinopatia diabética, neuropatia diabética, nefropatia diabética, redução de peso, cicatrização de feridas; terapias de nefropatia; Terapias PAD ou combinações de qualquer um dos agentes anteriores. O Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 e o um ou mais agentes terapêuticos adicionais podem ser administrados juntos através da mesma via de distribuição e dispositivo, como um único comprimido, cápsula, comprimido ou formulação injetável; ou administrados separadamente ao mesmo tempo em dispositivos ou rotas de entrega separados; ou administrado sequencialmente. PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE COMPLEXOS ANGPTL3/8

[0060] Um aspecto da divulgação são os complexos ANGPTL3/8 que podem ser usados para fazer um Ab que se liga ao complexo apenas e não se liga a ANGPTL3 sozinho ou a ANGPTL8 sozinho. Embora Abs anti-ANGPTL3 e Abs anti-ANGPTL8 sejam conhecidos, existe um desafio em sintetizar quantidades suficientes de complexos ANGPTL3/8 funcionais, especialmente complexos ANGPTL3/8 humanos, para fazer o complexo Abs anti-ANGPTL3/8. Adicional ou alternativamente, tais complexos ANGPTL3/8 podem ser usados em ensaios para avaliar as propriedades de Abs direcionados aos complexos ANGPTL3, ANGPTL8 e/ou ANGPTL3/8.

[0061] Desta maneira, a divulgação também descreve métodos de geração de ANGPTL8 tornando-a uma proteína de fusão de albumina sérica N ou C-terminal (por exemplo, humano, camundongo ou coelho). Os complexos funcionais ANGPTL3/8 podem então ser feitos co- expressando a proteína de fusão ANGPTL8 com ANGPTL3 nativa ou uma proteína de fusão ANGPTL3 em um sistema de expressão de mamífero.

[0062] Como observado acima, as sequências de aminoácidos e nucleicos para ANGPTL3 nativo, humano e ANGPTL8 nativo, humano são conhecidas (consultar, por exemplo, SEQ ID NOS: 1-2 e 3-4, respectivamente). ANGPTL3 ou ANGPTL 8 conforme descrito no presente documento, no entanto, são modificados (isto é, recombinantes/sintéticos) e, portanto, diferem das sequências nativas incluindo sequências de aminoácidos adicionais para melhorar a geração, segregação e/ou complexação de ANGTPL3 e ANGTPL8.

[0063] Por exemplo, ANGPTL3 pode ser modificado para incluir um ou mais ligantes e etiquetas como são conhecidos na técnica. Aqui, ANGPTL3 humano (SEQ ID NO: 2) é modificado para incluir um ligante e etiqueta FLAG de modo que a proteína de fusão ANGPTL3 tenha uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17. Em alguns casos, o ligante pode ser de cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos, como 3 aminoácidos, especialmente 3 resíduos de Ala. O ligante e a etiqueta FLAG podem ser colocados no terminal N ou C da sequência ANGPTL3, especialmente no terminal C como em SEQ ID NO: 17, em que os resíduos 1-460 correspondem a ANGPTL3, e os resíduos 461-471 correspondem para o ligante 3-Ala e a etiqueta FLAG.

[0064] Da mesma forma, ANGPTL8 pode ser modificado para incluir um ou mais ligantes e marcadores além de uma sequência para albumina de soro, especialmente albumina de soro humano. Aqui, ANGPTL8 humano (SEQ ID NO: 4) é modificado para incluir um ligante, um peptídeo sinal IgG capa, uma poli-histidina (His)-etiqueta, albumina sérica humana madura, um ligante e um local de clivagem PreScission® de modo que a proteína de fusão ANGPTL8 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Em alguns casos, o ligante pode ser de cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos, como uma repetição de poliprolina rígida, especialmente um ligante Ala-Pro (AP)-10. O peptídeo de sinal, His-tag, HSA maduro, ligante e local de clivagem PreScission® podem ser colocados no terminal N ou C da sequência ANGPTL8, especialmente no terminal N como em SEQ ID NO: 18, em que os resíduos 1-20 correspondem ao peptídeo de sinal IgG capa, os resíduos 21-27 correspondem ao His-tag, os resíduos 28-612 correspondem a HSA, os resíduos 613-632 correspondem ao ligante AP-10, os resíduos 633-643 correspondem ao local de clivagem PreScission®, e os resíduos 644-820 correspondem a ANGPTL8.

[0065] Métodos de construção de construtos de ácido nucleico para expressar a proteína de fusão ANGPTL3 e/ou a proteína de fusão ANGPTL8, conforme descrito no presente documento, são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados, por exemplo, em Balbás & Lorence, “Recombinant Gene Expression: Reviews and Protocols” (2ª Ed. Humana Press 2004); Davis et al., “Basic Methods in Molecular Biology” (Elsevier Press 1986); Sambrook & Russell, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (3ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Tijssen, “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology – Hybridization with Nucleic Acid Probes” (Elsevier 1993); e “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel et al. eds., Greene Publishing e Wiley-Interscience 1995); bem como as patentes números US 6.664.387; 7.060.491; 7.345.216 e

7.494.805. Como ANGPTL8 não contém nenhuma ligação dissulfeto, os sistemas de expressão de mamíferos podem ser usados. Aqui, os sistemas de expressão HEK293 ou sistemas de expressão CHO podem ser usados para gerar as proteínas de fusão ANGPTL3 e/ou ANGPTL8, especialmente por co-expressão.

[0066] Além de expressar a proteína de fusão ANGPTL3 e/ou a proteína de fusão ANGPTL8, os métodos também podem incluir a purificação das proteínas de fusão resultantes com base na marca particular usada para cada proteína de fusão, que são bem conhecidas na técnica. No que diz respeito às proteínas de fusão ANGPTL3 e ANGTPL8 descritas no presente documento, a purificação pode resultar em uma série de truncamentos após a remoção dos marcadores de modo que a proteína de fusão ANGPTL3 tenha uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 (em que os resíduos 1-444 correspondem a ANGPTL3, e os resíduos 445-455 correspondem ao ligante 3-Ala e etiqueta FLAG) e a proteína de fusão ANGPTL8 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20 (em que os resíduos 1-4 correspondem a resíduos de clivagem do local de clivagem PreScission®, e os resíduos 5-182 correspondem a um fragmento de ANGPTL8), que prontamente se associam um ao outro para formar complexos ANGPTL3/8 funcionais.

PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

[0067] Abs de complexo anti-ANGPTL3/8 pode ser produzido em um sistema de expressão de células de mamífero usando uma linha de células CHO GSKO. Um nocaute do gene da glutamina sintetase (GS) permite restringir a seleção por meio da eliminação da atividade de fundo da GS endógena, o que pode permitir a sobrevivência de células de baixa ou não produtiva sob condições de seleção. Os genes que codificam para o Ab HC e LC no presente documento podem ser subclonados em plasmídeos de expressão que contém GS individuais para co-transfecção ou ambas as cadeias podem ser subclonadas em um único plasmídeo de expressão que contém GS. A sequência de cDNA que codifica a HC ou LC é fundida em quadro com a sequência de codificação de um peptídeo sinal, que pode ser a sequência líder capa murina, para aumentar a secreção do produto desejado no meio de cultura celular. A expressão é dirigida pelo promotor do citomegalovírus viral (CMV).

[0068] As células CHO GSKO são transfectadas de forma estável usando electroporação e a quantidade apropriada de plasmídeos de expressão de HC e LC recombinantes, e as células transfectadas são mantidas em cultura em suspensão, na densidade celular adequada. A selecção das células transfectadas é conseguido pelo crescimento em 25 µM de metionina sulfoximina (MSX) livre de glutamina que contém meio livre de soro e incubou-se a 32-37 ºC e 5%-7% de CO2. Os abs são secretados no meio a partir das células CHO. Os Abs podem ser purificados por cromatografia de afinidade de Proteína A seguida por troca aniônica ou cromatografia de interação hidrofóbica (ou outros métodos adequados) e podem utilizar cromatografia de exclusão por tamanho para purificação adicional.

[0069] Abs do meio colhido são capturados na resina A de proteína MabSelect SuRe (GE Healthcare). A resina é então lavada brevemente com um tampão de corrida, como uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 ou um tampão de corrida que contém Tris, para remover o material não especificamente ligado. Os Abs são então eluídos da resina com uma solução de baixo pH, como ácido acético 20 mM/ácido cítrico 5 mM. As frações que contêm Abs ANGPTL3/8 são agrupadas e podem ser mantidas em um pH baixo para inativar vírus potenciais. O pH pode ser aumentado conforme necessário adicionando uma base como Tris 0,1 M pH 8,0. Abs ANGPTL3/8 pode ser posteriormente purificado por cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando resinas como Phenyl HP (GE Healthcare). Abs anti- ANGPTL3/8 pode ser eluído da coluna HIC usando um gradiente de sulfato de sódio em Tris 20 mM, pH 8,0. O Abs anti-ANGPTL3/8 pode ser posteriormente purificado por cromatografia de exclusão de tamanho usando uma coluna Superdex 200 (GE Healthcare) com eluição isocrática em PBS, pH 7,4.

[0070] Os compostos no presente documento descritos são preparados deste modo ou de um modo semelhante que seria facilmente determinado por um versado na técnica.

[0071] Camundongos que abrigam domínios de cadeias leve e pesada variáveis humanas são imunizados com o complexo ANGPTL3/8 descrito acima, e células B específicas de antígeno único são isoladas por FACS usando ANGPTL3/8 (positivo) e ANGPTL3 (negativo) como marcadores. O DNA da região variável da cadeia pesada e da cadeia leve é recuperado de células B individuais por PCR e clonado em vetores de expressão de IgG. Os sobrenadantes das células CHO são testados após transfecção quanto à atividade de ligação.

EXEMPLOS

[0072] Os seguintes exemplos não limitativos são oferecidos para fins de ilustração, não de limitação. EXEMPLO 1: FABRICAÇÃO DE COMPLEXOS ANGPTL3/8

[0073] Expressão de ANGPTL3 e ANGPTL8: sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos para ANGPTL3 humano, um ligante e uma etiqueta FLAG (SEQ ID NO: 17) são inseridos em um vetor de expressão de mamífero que contém um promotor CMV. Da mesma forma, as sequências de nucleotídeos que codificam uma sequência de aminoácidos para ANGTPL8 humano, peptídeo sinal IgG capa de camundongo, HIS-etiqueta, albumina de soro humano maduro (HSA) -PreScission® local de clivagem (SEQ ID NO: 18) são inseridas em um vetor de expressão de mamífero que contém um promotor CMV. A expressão da proteína é através da co- transfecção transitória de ambos os vetores de expressão descritos acima em células HEK293F cultivadas em meio sem soro. O meio de cultura é colhido 5 dias após a transfecção e armazenado a 4 ºC para subsequente purificação da proteína.

[0074] Purificação de proteína: a purificação de proteína é conduzida a 4 ºC, em que 4 l de meio de cultura são suplementados com Tris-HCl 1 M (pH 8,0) e NaCl 5 M para uma concentração final de 25 mM e 150 mM, respectivamente. Os meios são então incubados com 150 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) durante a noite. A resina é colocada em uma coluna e é lavada com Tampão A (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 0,3 M). A proteína é eluída com gradiente de imidazol 0-300 mM em Tampão A. As frações contendo HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3- Flag são reunidas, concentradas e carregadas em uma coluna HiLoad® Superdex® 200 (GE Healthcare Biosciences) e eluídas com Tampão A. As frações que contêm HIS-HSA-ANGPTL8/ANGPTL3-Flag são novamente reunidas, concentradas e digeridas com PreScission® Protease (GE Healthcare Biosciences) para remover HSA da proteína de fusão HIS-HSA-ANGPTL8. A amostra de proteína digerida por PreScission® é carregada em uma coluna HiLoad® Superdex® 200 e é eluída com tampão de armazenamento (HEPES 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM). As frações que contêm o complexo ANGPTL3/8 são reunidas e concentradas, com a concentração de proteína determinada usando o método de Bradford. O complexo ANGTPL3/8 é dividido em alíquotas e armazenado a -80 ºC até uso posterior.

[0075] Ensaio de atividade LPL: Um ensaio EnzCheck® LPL é realizado de acordo com as instruções do fabricante (ThermoFisher Scientific). Sumariamente, ANGPTL3 e os complexos ANGPLT3/8 são diluídos em série em meio de crescimento e substituídos por meio de células LPL por 1 hora de incubação. EnzCheck® Lipase Substrate (ELS) é então adicionado em células que expressam LPL e é incubado por 30 minutos. A fluorescência é medida a 482 nm/515 nm (excitação/emissão, respectivamente). A % de inibição de ANGPTL3 e 3/8 em LPL é calculada.

RESULTADOS:

[0076] A Tabela 1 mostra o rendimento da proteína do complexo ANGTPL3/8 nos vários estágios de purificação/concentração. TABELA 1: RENDIMENTO DA PROTEÍNA DO COMPLEXO ANGPTL3/8. Iniciar (L) Rendimento de resina 1º Rendimento da coluna 2º Rendimento da coluna Ni-NTA (mg) Superdex® 200 (mg) Superdex® 200 (mg) 4 105 47 12

[0077] Da mesma forma, a Figura 1 mostra 4-20% de gel corado de TG TGX Coomassie do complexo ANGPTL3/8 purificado e concentrado resultante das colunas, o que confirma que os complexos se formam/montam. Após purificação e concentração, ANGTL3 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e ANGPTL8 tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.

[0078] No ensaio LPL, o EC50 de ANGPTL3 é 21,5 nM, enquanto que o EC50 do complexo ANGTPL3/8 é 0,54 nM, o que confirma que os complexos são funcionais. EXEMPLO 2: ENSAIOS

[0079] Ensaio ELISA de Ponto Único (SPE): A seletividade de ligação de Ab para o complexo ANGPTL3/8, ANGPTL3 livre ou ANGPTL8 livre é inicialmente verificada usando ensaios ELISA padrão em um formato de ponto único. Sumariamente, as placas de ensaio são revestidas com um Fc Ab anti-humano a uma concentração de 2 µg/ml e subsequentemente bloqueadas com caseína. IgG secretado em sobrenadantes após expressão em células CHO são então capturados para a placa de ensaio. O antígeno biotinilado é adicionado a uma concentração de 25 nM para permitir a ligação Ab/antígeno. Os complexos Ab/antígeno são detectados após a adição de neutravidina conjugada com fosfatase alcalina e substrato de fosfatase alcalina, e subsequente medição da densidade óptica a 560 nm. A ligação positiva é determinada por um sinal maior do que 3 vezes sobre o sinal de fundo de não ligação.

[0080] Ensaio ELISA: A seletividade de ligação de Ab para o complexo ANGPTL3/8, ANGPTL3 livre ou ANGPTL8 livre é verificada usando ensaios ELISA padrão. Sumariamente, as placas de ensaio são revestidas com um Fc Ab anti-humano a uma concentração de 2 µg/ml e subsequentemente bloqueadas com caseína. O Ab dos sobrenadantes de CHO após a expressão em células CHO é então capturado para a placa de ensaio e o resultado é uma concentração de Ab de 2 µg/ml. Antígeno biotinilado (ANGPTL3, ANGPTL8 ou complexo ANGPTL3/8) é adicionado em concentrações variáveis por diluição em série para permitir a ligação Ab/antígeno. Os complexos Ab/antígeno são detectados após a adição de neutravidina conjugada com fosfatase alcalina e substrato de fosfatase alcalina, e subsequente medição da densidade óptica a 560 nm. TABELA 2: SELETIVIDADE DE LIGAÇÃO DE Ab AO COMPLEXO ANGPTL3/8, ANGPTL8 E ANGPTL3 EM UM ENSAIO SPE. Ligação do complexo Ligação ANGPTL8 Ligação ANGPTL3 ANGPTL3/8 Ab 2,302 (positivo) 0,087 (negativo) 0,074 (negativo) D31S 0,928 0,072 0,058 D33A 0,898 0,118 0,076 D33T 0,661 0,070 0,060 M56T 0,775 0,085 0,060 E99Q 1,538 0,100 0,083 Sinal de fundo não 0,09 0,07 0,08 vinculativo médio 3 x fundo 0,27 0,21 0,24 Os valores são densidade óptica (OD) a 560 nm, e o sinal de fundo não vinculativo em todas as placas testadas em média é refletido na linha

"Sinal de fundo". Esse controle negativo mostra o sinal de fundo na ausência de Ab.

[0081] No ensaio SPE, o Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6 mostra ligação positiva ao complexo ANGPTL3/8 humano e ligação negativa a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano. Abs com variantes LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 24), uma mutação M56T (SEQ ID NO: 24) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 também mostram ligação ao complexo ANGPTL3/8 humano e ligação negativa a ANGPTL8 humano e ANGPTL humano. TABELA 3: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 Complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,072 0,076 0,081 0,091 2,705 0,063 33,3 0,050 0,060 0,052 0,063 2,411 0,056 11,1 0,045 0,051 0,046 0,052 1,708 0,047 3,70 0,051 0,048 0,046 0,052 1,042 0,046 1,23 0,043 0,048 0,043 0,052 0,510 0,046 0,412 0,046 0,050 0,043 0,067 0,231 0,046 0,137 0,047 0,053 0,048 0,055 0,110 0,044 0,046 0,051 0,054 0,060 0,069 0,078 0,053 O controle é tampão e sem Ab.

[0082] O Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6 mostra ligação positiva ao complexo ANGPTL3/8 humano de uma maneira dependente da concentração e nenhuma ligação detectável a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano até um antígeno concentração de 100 nM nesse ensaio (Tabela 3).

[0083] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são ensaiados e da mesma forma mostram ligação positiva ao complexo ANGPTL3/8 humano de uma maneira dependente da concentração e não detectável ligação a ANGPTL8 humano e ANGPTL3 humano até uma concentração de antígeno de 100 nM nesse ensaio (Tabelas 4-6). TABELA 4: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB VARIANTE D31S A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,098 0,076 0,084 0,081 2,471 0,092 33,3 0,063 0,065 0,069 0,064 2,226 0,068 11,1 0,062 0,059 0,062 0,062 1,735 0,053 3,70 0,056 0,055 0,060 0,057 1,134 0,049 1,23 0,058 0,049 0,059 0,058 0,575 0,048 0,412 0,062 0,049 0,058 0,057 0,234 0,047 0,137 0,080 0,077 0,057 0,076 0,137 0,068 0,046 0,096 0,085 0,060 0,064 0,149 0,075 TABELA 5: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE D33A VARIANTE Ab A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8.

hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,078 0,076 0,082 0,081 2,388 0,092 33,3 0,049 0,065 0,067 0,064 2,179 0,068 11,1 0,048 0,059 0,060 0,062 1,635 0,053 3,70 0,048 0,055 0,056 0,057 1,040 0,049 1,23 0,049 0,049 0,057 0,058 0,491 0,048 0,412 0,047 0,049 0,056 0,057 0,196 0,047 0,137 0,053 0,077 0,062 0,076 0,101 0,068 0,046 0,074 0,085 0,062 0,064 0,111 0,075 TABELA 6: ENSAIO ELISA DE LIGAÇÃO DE AB VARIANTE E99Q A VÁRIAS CONCENTRAÇÕES DE COMPLEXO ANGPTL3, ANGPTL8 E ANGPTL3/8. hANGPTL8 hANGPTL3 complexo hANGPTL3/8 Concentração de Ab Controle Ab Controle Ab Controle Antígeno [nM] 100 0,098 0,076 0,084 0,081 2,471 0,092 33,3 0,063 0,065 0,069 0,064 2,226 0,068 11,1 0,062 0,059 0,062 0,062 1,735 0,053 3,70 0,056 0,055 0,060 0,057 1,134 0,049 1,23 0,058 0,049 0,059 0,058 0,575 0,048 0,412 0,062 0,049 0,058 0,057 0,234 0,047 0,137 0,080 0,077 0,057 0,076 0,137 0,068 0,046 0,096 0,085 0,060 0,064 0,149 0,075 EXEMPLO 3: AFINIDADE DO RECEPTOR IN VITRO

[0084] A cinética de ligação pode ser determinada usando um instrumento Biacore® T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.;

Piscataway, NJ). A superfície de um chip sensor CM4 pode ser preparada por acoplamento covalente de Human Fab Binder (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). As experiências cinéticas podem ser realizadas a cerca de 25 ºC em um tampão de corrida de HBSEP+, BSA a 0,01% a pH 7,4. Abs pode ser capturado e uma série de concentração de complexo de camundongo, cino ou humano ANGPTL3/8 pode ser injetada sobre a superfície do chip em cerca de 50 ul/min por cerca de 240 segundos com um tempo de dissociação de cerca de 800 segundos. Para determinar os parâmetros cinéticos (por exemplo, ka, kd, KD), os dados são duplamente referenciados e ajustados a um modelo de ligação 1: 1 usando o software de avaliação Biacore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). A Tabela 7, abaixo, mostra a ligação de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6 a vários complexos ANGPTL3/8 de diferentes espécies em pH 7,4 e temperatura 25ºC. TABELA 7: LIGAÇÃO DE AB A COMPLEXOS DE ESPÉCIES CRUZADAS ANGPTL3/8 EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie ao Ab Camundongo 4,75 x 105 1,72 x 10-4 3,66 x 10-10 6,19 x 10-11 3 Cino 4,91 x 105 9,91 x 10-5 2,13 x 10-10 6,30 x 10-11 3 Humano 4,77 x 105 6,31 x 10-5 1,35 x 10-10 2,69 x 10-11 2

[0085] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e um HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são testados quanto à ligação a vários complexos ANGPTL3/8 de diferentes espécies em pH 7,4 e temperatura 25ºC (Tabelas 8-10). TABELA 8: LIGAÇÃO DE D31S VARIANTE AB PARA CRUZAR

ESPÉCIES DE COMPLEXOS ANGPTL3/8 EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie a D31S Ab Camundongo 4,96 x 105 1,08 x 10-4 2,18 x 10-10 1,88 x 10-11 3 Cino 4,62 x 105 1,68 x 10-4 3,65 x 10-10 1,50 x 10-11 3 Humano 4,97 x 105 5,75 x 10-5 1,16 x 10-10 1,91 x 10-11 3 TABELA 9: LIGAÇÃO DE D33A VARIANTE Ab A COMPLEXOS ANGPTL3/8 DE ESPÉCIES EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 da espécie ao D33A Ab Camundongo 5,15 x 105 3,47 x 10-4 6,80 x 10-10 7,07 x 10-11 3 Cino 4,35 x 105 2,65 x 10-4 6,09 x 10-10 1,21 x 10-11 3 Humano 4,57 x 105 9,19 x 10-5 2,01 x 10-10 1,75 x 10-11 3 TABELA 10: LIGAÇÃO DE E99Q VARIANTE Ab A COMPLEXOS ANGPTL3/8 DE ESPÉCIES CRUZADAS EM PH 7,4 E TEMPERATURA 25ºC. Ligação do complexo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) s.d. N ANGPTL3/8 de espécie a E99Q Ab Camundongo 5,96 x 105 1,51 x 10-4 2,54 x 10-10 1,79 x 10-11 3 Cino 6,20 x 105 7,23 x 10-5 1,16 x 10-10 8,58 x 10-12 3 Humano 6,74 x 105 3,26 x 10-5 4,84 x 10-11 6,50 x 10-12 3 EXEMPLO 4: ENSAIO LPL DE ATIVIDADE FUNCIONAL IN VITRO

[0086] Um bioensaio com base em células é usado para avaliar a capacidade do Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6 para reprimir a inibição da proteína purificada ANGPTL3/8 da atividade de LPL. A atividade inibitória de ANGPTL3/8 do Ab é determinada usando EnzChek™

Lipase Substrate (ThermoFisher). Linhagens celulares HEK293 que expressam LPL humana, cinomolgos, camundongo ou rato e proteína ANGPTL3/8 humana purificada, cinomolgos, camundongo ou rato. A geração de HEK293-LPL inclui uma linha de células embrionárias humanas que expressa estavelmente LPL humana, que é gerada (HEK293-huLPL) utilizando métodos padrão. Sumariamente, a LPL humana é clonada em um plasmídeo de lentivírus com um promotor CMV e resistência à blasticidina. O plasmídeo é usado para gerar um lentivírus LPL humano usando ViraPower Packaging Mix (Invitrogen). As células HEK293 são incubadas com o lentivírus LPL e clones resistentes à blasticidina são selecionados. Um clone é escolhido após a confirmação da expressão de mRNA de LPL humana por qPCR e atividade de LPL utilizando o substrato EnzChek™. Esse processo é repetido para LPL de cinomolgos, camundongos e ratos.

[0087] Os métodos são modificados daqueles descritos em Basu et al. (Basu et al. (2011) J. Lipid Res. 52: 826-832): (a) Células HEK293- LPL são adicionadas a uma placa A revestida com poli-D-lisina de 96 poços de meia área (humano), B (cinomolgos), C (camundongo) ou D (rato) a uma densidade de 25.000 células/poço e são incubados durante a noite a 37ºC, 5% de CO2. Ab é diluído em série nove vezes a partir de uma concentração de estoque inicial para gerar um CRC de dez pontos, e então adicionado a proteínas ANGPTL3/8 purificadas (na concentração IC80 de 0,42 nM para humanos, 0,38 nM para cinomolgos, 0,13 nM para camundongos, ou 0,81 nM para ratos) em placas de 96 poços E (humano), F (cinomolgos), G (camundongo) ou H (rato).

[0088] Os meios nas células HEK293-LPL nas placas A, B, C e D são substituídos pelas misturas ANGPTL3/8 e Ab da placa E, F, G e H, respectivamente, e são incubados 1 hora a 37ºC, 5% de CO2. 10 µl de EnzChek™ Lipase Substrate (preparado a uma concentração de 5 µM em 0,05% Zwittergent (3-(N, N-

Dimetiloctadecilamônio)propanesulfonate) (Sigma) são adicionados às células, ANGPTL3/8 e mistura de Ab nas placas A, B, C e D. Um leitor de placas é usado para medir a fluorescência a 482 nm de Excitação e 515 nm de Emissão com um filtro de corte de 495 nm. As placas são incubadas a 37 ºC, 5% de CO2 em entre pontos de tempo. A fluorescência relativa (diretamente proporcional à atividade LPL) é calculada subtraindo o sinal em 1 min do sinal em 31 min. A concentração de eficácia na qual o Ab restaurou a atividade LPL 50% (EC50) é calculada utilizando o Excel Fit. As concentrações de EC50 são mostradas na Tabela 11.

[0089] A porcentagem de desrepressão é calculada da seguinte forma: = (RFU – RFU(MIN))/(RFU(MAX) – RFU(MIN)) x 100,

[0090] em que MAX = células sozinhas (LPL) e MIN = células (LPL) + ANGPTL3/8 CM (meio condicionado).

[0091] O Ab geralmente tem um EC50 baixo e, portanto, é potente na desrepressão da LPL. O Ab também apresenta % máx de desrepressão favorável de LPL. TABELA 11: AB EC50 E % DE DESREPRESSÃO MÁXIMA DE LPL PARA LPL HUMANO, CINO, DE CAMUNDONGO E DE RATO E COMPLEXO ANGPTL3/8 HUMANO, CINO, DE CAMUNDONGO E DE RATO. Espécies LPL e ANGPTL3/8 Ab EC50 % de desrepressão (nM) máxima de LPL LPL humana e ANGPTL3/8 humana 0,28 102% cino LPL e cino ANGPTL3/8 1,31 96% LPL de camundongo e ANGPTL3/8 camundongo 1,38 103% LPL de rato e ANGPTL3/8 de rato 2,77 105%

[0092] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22), uma mutação D33T (SEQ ID NO: 23) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são testados para desreprimir a inibição da proteína purificada ANGPTL3/8 da atividade da LPL (Tabela 12). TABELA 12: EC50 DE AB VARIANTE E % DE DESREPRESSÃO

MÁXIMA DE LPL PARA LPL HUMANA E DE CAMUNDONGO E COMPLEXO ANGPTL3/8 DE HUMANO E CAMUNDONGO. Espécies LPL e ANGPTL3/8 D31S D33A D33T E99Q Ab EC50 Ab EC50 Ab EC50 Ab EC50 (nM), (nM), (nM), (nM), % LPL de % LPL de % LPL de % LPL de desrepressão desrepressão desrepressão desrepressão máxima máxima máxima máxima LPL humana e ANGPTL3/8 0,86, 106% 1,14, 103% 1,56, 105% 0,49, 106% humana LPL de camundongo e 1,79, 110% 4,07, 106% 4,55, 114% 1,65, 110% ANGPTL3/8 camundongo EXEMPLO 5: RESPOSTA DE TRIGLICERÍDEO IN VIVO

[0093] O efeito de um Ab de complexo anti-ANGPTL3/8 que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e HC de SEQ ID NO: 6 no soro TG é avaliado em camundongos transgênicos para huCETP e huApolipoproteína A1 (a). O sangue é coletado dos camundongos e o soro é isolado antes do início do experimento. O TG é medido em amostras de soro usando um analisador de química clínica Cobas® (Roche). Os animais são divididos em 5 grupos de 20 para produzir grupos com médias de TG no soro semelhantes. Cada grupo de 20 é então subdividido em 4 grupos de 5 com médias de triglicerídeos séricos semelhantes. O Ab é administrado a camundongos por uma única injeção subcutânea a 1 mg/kg (n = 20), 3 mg/kg (n = 20), 10 mg/kg (n = 20) ou 30 mg/kg (n = 20) para 4 grupos separados de animais. Um antígeno de controle de ligação com isotipo nulo de mAb compatível é administrado por uma única injeção subcutânea a 30 mg/kg (n = 20) a um quinto grupo de animais.

[0094] O sangue é coletado dos animais 1 hora (n = 5), 8 horas (n = 5), 1 dia (n = 5), 2 dias (n = 5), 3 dias (n = 5), 7 dias (n = 5), 14 dias (n = 5) e 21 dias (n = 5) após a administração de Ab. O sangue é coletado de animais do subgrupo A em tempos de 1 hora e 3 dias. O sangue é coletado de animais do subgrupo B em tempos de 8 horas e 7 dias. O sangue é coletado de animais do subgrupo C em tempos de 1 dia e 14 dias. O sangue é coletado de animais do subgrupo D em tempos de 2 dias e 21 dias. O soro é preparado a partir do sangue e os níveis séricos de TG foram medidos usando um analisador de química clínica Cobas® (Roche). A mudança percentual de TG a partir do controle de isotipo com correspondência de tempo é calculada para cada dose de Ab em cada ponto de tempo. O cálculo da alteração percentual é [(Triglicerídeo sérico Rx - triglicerídeo sérico de controle de isotipo com correspondência de tempo)/(triglicerídeo sérico de controle de isotipo compatível com tempo)] x 100. Os dados são mostrados na Tabela 13. TABELA 13: REDUÇÃO PERCENTUAL DE TG POR AB EM

COMPARAÇÃO COM O CONTROLE DE IGG DE DIFERENTES DOSES DE AB EM DIFERENTES PONTOS DE TEMPO. Momento de Pós Dose 1 hora 8 horas 1 dia 2 dias 3 dias 7 dias 14 dias 21 dias 1 mg/kg -22 -33 -76 * -66 * -61 * 41 6,4 -20 3 mg/kg -26 -71 * -84 * -77 * -86 * -25 19,7 -19 10 mg/kg -27 -62 * -87 * -89 * -88 * -88 * -64,4 * -28 30 mg/kg -23 -74 * -92 * -87 * -93 * -93 * -89,1 * -75 * O teste de Dunnett é usado para cada conjunto de dados para comparar cada grupo de tratamento a um controle de correspondência de tempo e um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os grupos estatisticamente significativos de seus controles com correspondência de tempo são designados por um (*) na tabela.

[0095] A potência do Ab que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e HC de SEQ ID NO: 6 na redução de TGs é favorável começando no Dia 1 e o efeito favorável é sustentado até o Dia 21.

[0096] Além do Ab complexo anti-ANGPTL3/8 acima que tem uma LC de SEQ ID NO: 5 e uma HC de SEQ ID NO: 6, Abs com variantes de LC que tem uma mutação D31S (SEQ ID NO: 21), uma mutação D33A (SEQ ID NO: 22) ou uma mutação E99Q (SEQ ID NO: 25) e uma HC de SEQ ID NO: 6 são testados para avaliar a mudança nos TGs em relação a um controle de IgG em camundongos (Tabela 14). TABELA 14: REDUÇÃO PERCENTUAL DE TG EM COMPARAÇÃO

COM O CONTROLE DE IGG DE DIFERENTES DOSES DE ABS VARIANTE EM DIFERENTES PONTOS DE TEMPO. Momento de Pós Dose 1 dia 7 dias 15 dias 21 dias D31S 3 mg/kg -83 * -38 * -25 -12 D31S 10 mg/kg -90 * -91 * -37 * -21 D33A 3 mg/kg -74 * -77 * -34 * -10 D33A 10 mg/kg -78 * -86 * -76 * -60 * E99Q 3 mg/kg -82 * -49 * -5 15 E99Q 10 mg/kg -86 * -91 * -61 * 6 O teste de Dunnett é usado para cada conjunto de dados para comparar cada grupo de tratamento a um controle de correspondência de tempo e um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os grupos estatisticamente significativos de seus controles com correspondência de tempo são designados por um (*) na tabela.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0097] As seguintes sequências nucleicas e de aminoácidos são referidas na divulgação acima e são fornecidas abaixo para referência.

[0098] SEQ ID NO: 1 atatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaa aatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgat caagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgta aaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagg gccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaac cagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaa aatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaa aaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaac ctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagc atcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaa ataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatc ttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaac atgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgc catcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacatt aattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggtt ttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaa ttatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgg gaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcc cggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccag agggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatat aacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaa tggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaa tgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaat aatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctattta agattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataata ctatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtg aacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaat atcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagagg actggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagta tgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatg tttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtcttt aaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttatttgtta aaatatatactgtatacattttatatattttaacacttaatactatgaaaacaaataattgtaaaggaat cttgtcagattacagtaagaatgaacatatttgtggcatcgagttaaagtttatatttcccctaaatatg ctgtgattctaatacattcgtgtaggttttcaagtagaaataaacctcgtaacaagttactgaacgttt aaacagcctgacaagcatgtatatatgtttaaaattcaataaacaaagacccagtccctaaattat agaaatttaaattattcttgcatgtttatcgacatcacaacagatccctaaatccctaaatccctaaa gattagatacaaattttttaccacagtatcacttgtcagaatttatttttaaatatgattttttaaaactgcc agtaagaaattttaaattaaacccatttgttaaaggatatagtgcccaagttatatggtgacctacctt tgtcaatacttagcattatgtatttcaaattatccaatatacatgtcatatatatttttatatgtcacatatat aaaagatatgtatgatctatgtgaatcctaagtaaatattttgttccagaaaagtacaaaataataa aggtaaaaataatctataattttcaggaccacagactaagctgtcgaaattaacgctgatttttttag ggccagaataccaaaatggctcctctcttcccccaaaattggacaatttcaaatgcaaaataattc attatttaatatatgagttgcttcctctatt

[0099] SEQ ID NO: 2

MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGL LQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKEL RRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTN LIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHS QIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPA ECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGS QNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWK DNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHK AKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRG LSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFE

[0100] SEQ ID NO: 3 ataccttagaccctcagtcatgccagtgcctgctctgtgcctgctctgggccctggcaatggtgacc cggcctgcctcagcggcccccatgggcggcccagaactggcacagcatgaggagctgaccct gctcttccatgggaccctgcagctgggccaggccctcaacggtgtgtacaggaccacggaggg acggctgacaaaggccaggaacagcctgggtctctatggccgcacaatagaactcctggggca ggaggtcagccggggccgggatgcagcccaggaacttcgggcaagcctgttggagactcaga tggaggaggatattctgcagctgcaggcagaggccacagctgaggtgctgggggaggtggccc aggcacagaaggtgctacgggacagcgtgcagcggctagaagtccagctgaggagcgcctg gctgggccctgcctaccgagaatttgaggtcttaaaggctcacgctgacaagcagagccacatc ctatgggccctcacaggccacgtgcagcggcagaggcgggagatggtggcacagcagcatcg gctgcgacagatccaggagagactccacacagcggcgctcccagcctgaatctgcctggatgg aactgaggaccaatcatgctgcaaggaacacttccacgccccgtgaggcccctgtgcagggag gagctgcctgttcactgggatcagccagggcgccgggccccacttctgagcacagagcagaga cagacgcaggcggggacaaaggcagaggatgtagccccattggggaggggtggaggaagg acatgtaccctttcatgcctacacacccctcattaaagcagagtcgtggcatctcaaaaaaaaaa aaaaaaa

[0101] SEQ ID NO: 4

MPVPALCLLWALAMVTRPASAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLG QALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRA SLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSA WLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLR QIQERLHTAALPA

[0102] SEQ ID NO: 5

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0103] SEQ ID NO: 6

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYY CARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRST SESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSL SSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPA PEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG

[0104] SEQ ID NO: 7 gatattgtgatgacccagacccccctgtctctgcctgtcactccgggggaaccggcctcgatctcat gccggtcgagccagtccctgctggactccgatgacgggaacacttatttggattggtacctccaaa agcctggacagagcccgcagctcctgatctacatgctgtcctaccgggcctccggagtgccaga ccgcttctcgggaagcggctccggtaccgacttcacactgaagatctcccgcgtggaagctgag gacgtgggcatctactactgtatgcaaagaatcgagttccccctcaccttcggcggcgggactaa ggtcgagattaagagaaccgtggccgcaccatccgtgttcatttttcccccgtccgatgaacagct gaagtccggaaccgcctccgtcgtgtgcctgctcaacaacttctacccgagggaagcgaaagtg cagtggaaagtggacaatgcgctgcagtccggaaactcccaagagtccgtgaccgaacagga ctccaaggactcaacctactcgctgagctcaacgctgaccctgagcaaggccgactacgagaa gcacaaggtctacgcctgcgaagtgacccatcagggtttgagctcgcccgtgaccaagtccttca accggggagagtgc

[0105] SEQ ID NO: 8 caagtcacattgaaggagagcggtccgaccctggtcaagccgactcagaccctgaccctgacg tgcactttctcgggcttctcattgtccatttctggagtgggcgtgggatggatcagacagcccccggg gaaggccctcgagtggctcgcgctgatctaccgcaacgacgacaaacgctactccccctcactg aaatcccggctgaccatcactaaggatacgtccaagaaccaggtcgtgttgaccctcaccaaca tggatcccgtggatactgccacctactattgtgcacggacctatagcagcggttggtacggaaact ggttcgacccgtggggccagggaactcttgtgacggtgtcctccgcaagcaccaagggtccttct gtgttccccctggcgccgtgctcgcggagcacctcagagtccaccgccgccctcggctgccttgtg aaggactacttcccggagccagtcaccgtgtcctggaacagcggggccctgacttccggcgtgc acaccttccctgcggtgctgcagagctcaggcctctattcgctgtcatccgtcgtgaccgtgccttcc tcgtccctgggcactaagacctacacttgcaacgtggaccataagcccagcaacaccaaagtg gacaagagagtggaatccaaatacggaccgccatgtccgccctgccccgccccggaagctgc cgggggacccagcgtgttcctgttcccacctaagccgaaggacactctgatgatctcaaggactc ccgaagtcacttgcgtggtcgtggacgtgtcccaggaggaccccgaagtccagtttaattggtacg tggatggtgtcgaggtccacaacgccaagaccaagcctcgcgaggaacagttcaattccaccta ccgggtcgtgtccgtcctgaccgtgctgcatcaggactggctgaacggaaaggagtacaagtgc aaagtgtccaacaagggactcccttcctccatcgaaaagaccatcagcaaggccaagggcca gcctcgcgaaccacaagtctacaccctgcccccatcgcaagaggaaatgaccaagaaccaag tgtcgctgacatgcctcgtcaagggattctacccgtcggatattgcggtggaatgggagtccaacg gacagcccgagaacaactacaagaccaccccgccggtgttggactccgacggctcctttttcctg tactcccggctcactgtggacaagtcgcggtggcaggaggggaacgtgttctcctgttccgtgatg cacgaagctctgcacaaccactacacccagaagtcgctgagcctctcactggga

[0106] SEQ ID NO: 9

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIK

[0107] SEQ ID NO: 10

QVTLKESGPTLVKPTQTLTLTCTFSGFSLSISGVGVGWIRQPPGKALE WLALIYRNDDKRYSPSLKSRLTITKDTSKNQVVLTLTNMDPVDTATYY CARTYSSGWYGNWFDPWGQGTLVTVSS

[0108] SEQ ID NO: 11

RSSQSLLDSDDGNTYLD

[0109] SEQ ID NO: 12

YMLSYRAS

[0110] SEQ ID NO: 13

MQRIEFPLT

[0111] SEQ ID NO: 14

TFSGFSLSISGVGVG

[0112] SEQ ID NO: 15

LIYRNDDKRYSPSLKS

[0113] SEQ ID NO: 16

ARTYSSGWYGNWFDP

[0114] SEQ ID NO: 17

MFTIKLLLFIVPLVISSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGL LQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKEL RRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTN LIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHS QIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPA ECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGS QNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWK DNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHK AKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRG LSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK

[0115] SEQ ID NO: 18

METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHHHHHHDAHKSEVAHRFKDLGEENF KALVLIAFAQYLQQSPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSL HTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNL PRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKR YKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECA DDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADL PSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRL AKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFE QLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPE AKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHK PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAA LGLAPAPAPAPAPAPAPAPAPAPLEVLFQGPGRAAPMGGPELAQHE ELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTKARNSLGLYGRTIELLGQEV SRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQAEATAEVLGEVAQAQKVLRD SVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAHADKQSHILWALTGHVQRQR REMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA

[0116] SEQ ID NO: 19

SRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHK TKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEE VKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPE VTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSI QEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTS GMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKY GFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLG NHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYS GGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLY SIKSTKMLIHPTDSESFEAAADYKDDDDK

[0117] SEQ ID NO: 20

GPGRAAPMGGPELAQHEELTLLFHGTLQLGQALNGVYRTTEGRLTK ARNSLGLYGRTIELLGQEVSRGRDAAQELRASLLETQMEEDILQLQA EATAEVLGEVAQAQKVLRDSVQRLEVQLRSAWLGPAYREFEVLKAH ADKQSHILWALTGHVQRQRREMVAQQHRLRQIQERLHTAALPA

[0118] SEQ ID NO: 21

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLSSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0119] SEQ ID NO: 22

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSADGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0120] SEQ ID NO: 23

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSTDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0121] SEQ ID NO: 24

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYTLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYCM QRIEFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN NFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

[0122] SEQ ID NO: 25

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSDDGNTYLDWYLQKPG QSPQLLIYMLSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGIYYC MQRIQFPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL NNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

Claims (9)

REIVINDICAÇÕES

1. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da SEQ ID NO: 17 ou um polipeptídeo da SEQ ID NO: 18.

2. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da SEQ ID NO: 17 ou um polipeptídeo da SEQ ID NO: 18.

3. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleótido, como definido na reivindicação 1 ou 2.

5. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o construto de expressão, como definido na reivindicação 3, ou o vetor, como definido na reivindicação 4.

6. Célula hospedeira, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que é uma célula de mamífero.

7. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO:17 ou 19.

8. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO 18 ou 20.

9. Complexo de peptídeo semelhante a angiopoietina (ANGPTL)3/8, caracterizado pelo fato de que compreende um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 19 e um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 20.