CN113444669A - 一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌Lactobacillusplantarum F3‑2及其在改善肥胖方面的应用。保藏编号为CCTCC NO:M 2020827。本发明植物乳杆菌Lactobacillusplantarum F3‑2能够显著改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖，能够良好的耐受模拟胃肠液生存环境，具有良好的肠道定殖能力。

Description

一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2及其应用
技术领域
本发明涉及食品微生物技术领域，更具体的说是涉及一株改善肥胖植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2及其应用。
背景技术
目前，肥胖已经成为一种全球性流行性疾病，已对全世界各年龄层的人群的身体健康造成严重威胁。肥胖会引起2型糖尿病等代谢疾病及高血压、心肌梗死等心血管疾病的病发，此外它还与癌症、呼吸系统并发症、骨关节炎、哮喘等多种疾病密切相关。此外肥胖群体会加重国家医疗财政的支出，肥胖个体的医疗费用比正常体重的同龄人约高出30％，丧失劳动力的肥胖个体，还会导致失业率增加，给社会造成了巨大的经济负担。各国研究人员也在致力于寻求健康有效的减肥措施，以代替现有的药物或手术治疗。在这个过程中，安全无毒副作用的益生菌或其制剂成为一个比较热的研究对象。
但是，现有技术中，益生菌调节脂代谢改善肥胖的详细机制尚不明晰，具有良好改善肥胖效果的菌株数量有限，且菌株间具有特异性，这些仍是制约菌株功能开发的关键因素。
因此，提供有效改善肥胖的菌株数量是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2及其在改善肥胖方面的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2，于2020年12月2 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2020827，保藏地址湖北省武汉市。该菌具有良好的肠道定殖能力，能够良好的耐受模拟胃肠液生存环境，能够显著改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖。
本发明的另一目的是提供上述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2在制备改善肥胖产品中的应用。
优选的，所述产品为功能性食品、药品或保健品。
优选的，所述功能性食品为乳制品。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2，该菌株能够显著改善高脂饮食诱导的小鼠肥胖，能够良好的耐受模拟胃肠液生存环境，具有良好的肠道定殖能力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为本发明各试验组对高脂饮食诱导肥胖小鼠体重的影响示意图；
图2为本发明各试验组对小鼠摄食量的影响示意图；
图3为本发明各试验组对小鼠附睾脂肪重量的影响示意图；
图4为本发明各试验组对小鼠肾周脂肪重量的影响示意图；
图5为本发明各试验组对小鼠皮下脂肪重量的影响示意图；
图6为本发明各试验组小鼠附睾脂肪细胞大小(×1000μm2)示意图；
图7为本发明各试验组对小鼠附睾脂肪细胞大小的影响示意图；
图8为本发明各试验组对小鼠肝脏重量的影响示意图；
图9本发明各试验组对小鼠血清甘油三酯(TG)的影响示意图；
图10本发明各试验组对小鼠血清胆固醇(TC)的影响示意图；
图11本发明各试验组对小鼠附睾脂肪组织中PPARγ基因表达量的影响示意图；
图12本发明各试验组对小鼠附睾脂肪组织中GPR43基因表达量的影响示意图；
图13本发明各试验组对高脂饮食诱导肥胖小鼠粪便中主要 SCFAs含量的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例所涉及的试剂均为市售渠道采购，未提及的方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
实施例1
植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2胃肠道生存能力鉴定
1、菌株的形态特征鉴定
该菌株来源于婴儿粪便，依据菌落、菌体形态初步筛选获得乳酸杆菌，后经16SrRNA确定具体为植物乳杆菌。
2、耐酸耐胆盐性能鉴定
将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2在MRS培养基中于 37℃下培养24h，然后离心(1100×g，15min，4℃)，收集菌体，将菌体用PBS缓冲液(pH7.2)洗涤两遍。然后用Ph3.0或含有0.3％胆盐的MRS培养基将菌体重新悬浮，将其置于37℃恒温培养箱中厌氧培养。在培养第0，3，4h时，用平板计数法测定菌落数，对菌株耐受性进行检测，计算存活率(三次重复)，见表1。
存活率(％)＝log cfu Nt/log cfuN0×100％
其中，N0为实验前的总活菌数，Nt为试验结束后的总活菌数
表1耐酸耐胆盐性能
Figure BDA0003182312360000041
结果表明，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2在pH3.0的酸性环境中培养3h后，平均存活率为97.23％，在0.3％胆盐环境中培养 4h后，平均存活率为87.61％，远高于先前研究公开的Lactobacillus plantarum ZS07的63.75％(BELICOVA A,MIKULASOVAM, DUSINSKY R.Probiotic Potential and Safety Properties of Lactobacillusplantarum from Slovak Bryndza Cheese[J].Biomed Research International,2013)和Lactobacillus plantarum ZLP001的61.40％ (WANG J,JI H F,ZHANG D Y,etal.Assessment of probiotic properties of Lactobacilluss plantarum ZLP001isolated from gastrointestinal tract of weaning pigs[J].African Journal ofBiotechnology,2011,10(54):11303-8.)。
3、胃肠液耐受性能鉴定
用PBS缓冲液(pH3.0)将胃蛋白酶悬浮至终浓度3g/L，作为模拟胃液。用PBS缓冲液(pH8.0)将胰蛋白酶以终浓度1g/L进行悬浮，作为模拟肠液。二者用0.22um的滤器过滤除菌。将在37℃培养24h 的植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2，在1100×g，4℃条件下离心15min，收集菌体，用PBS缓冲液(Ph7.2)洗涤两遍，然后用模拟胃液重悬，置于37℃恒温培养箱中进行厌氧培养。3h后，从中吸取 1ml液体加入到9ml模拟肠液中，然后继续在37℃培养箱中培养8h，通过平板计数法计算活菌数，以此评估菌株在胃肠道的耐受性，结果见表2(三次重复)。
存活率(％)＝log cfu Nt/log cfu N0×100％
其中，N0为实验前的总活菌数，Nt为试验结束后的总活菌数
表2胃肠液耐受性能鉴定
Figure BDA0003182312360000051
结果表明，植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2在模拟胃液中培养3h后，平均存活率高达98.05％，继续在模拟肠液中培养8h 后，平均存活率仍达到了86.16％，具有良好的胃肠液耐受能力。
4、表面疏水性和自聚能力鉴定
表面疏水性鉴定：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2培养液离心(1100×g，15min，4℃)，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，重悬于pH7.2的PBS缓冲液中。把菌体浓度在OD600nm处调至吸光度A0为0.4，然后将3ml的菌悬液与1ml的三氯甲烷混合，涡旋30s，在室温下孵育30min，并在OD600nm处测其吸光度A1，细菌对溶剂的黏附率百分比表示为：(1-A1/A0)×100。
三次重复试验的结果：
(1-0.137/0.400)×100＝65.75％
(1-0.143/0.400)×100＝64.25％
(1-0.148/0.400)×100＝63.00％
自聚能力鉴定：将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2培养液离心(1100×g，15min，4℃)，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次，重悬于PBS缓冲液(pH7.2)中。在OD600nm处，调整菌悬液吸光度至A0＝0.4。将4ml菌悬液涡旋10s，室温下培养3h，然后测其自聚性。将0.1ml的菌悬液加到3.9mlPBS缓冲液中，在600nm 处测其吸光度(At)。自聚性百分比表示为：(1-At/A0)×100。
三次重复试验的结果：
(1-0.044/0.400)×100＝89.00％
(1-0.043/0.400)×100＝89.25％
(1-0.043/0.400)×100＝89.25％
结果表面，将植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2的表面疏水能力高于文献标准的50％(SANTOS Y,BANDIN I,NIETO T P,et al. COMPARISON OF THE CELLSURFACE HYDROPHOBICITY OF BACTERIAL FISH PATHOGENS BY DIFFERENT PROCEDURES[M].Pathology in Marine Science,1990.)，自聚能力高于文献标准的 40％(RE B D,BUSETTO A,VIGNOLA G,et al.Autoaggregation and adhesion ability in aBifidobacterium suis strain[J].2010,27(5): 307-10.)，具有优良的粘附性，利于在肠道定殖。
实施例2
植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2改善小鼠肥胖状况及机理研究
试验动物：
小鼠：40只6周龄雄性C57BL/6小鼠购买自济南朋悦实验动物繁育有限公司，在光照12h、温度20±2℃、相对湿度50％±10％条件下，采用低脂饲料(D12450B)和高脂饲料(D12492)(维通利华，中国)饲养小鼠。
试验方法：
用低脂饲料对小鼠进行适应性喂养一周，并使其能够自由饮水。一周后，将小鼠随机分为四组，分别为低脂饲料对照组(NC)、高脂饲料对照组(HFD)、奥利司他阳性对照组(OR)和植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum F3-2干预组(F3-2)，每组10只小鼠，每5只一个笼子。NC组以低脂饲料饲喂，其余三组以高脂饲料饲喂。从第五周起开始干预，NC组小鼠每天灌胃0.2mL PBS；HFD组每天灌胃 0.2mL PBS；OR组以10mg/kg的剂量每天灌胃0.2mL溶于生理盐水的奥利司他；F3-2组每天灌胃0.2mL对应菌浓度5×108cfu/mL的PBS，试验共干预8周。
试验结果：
1.试验结束后，分析小鼠的体重(参见附图1)、摄食量(参加附图2)、脂肪组织重(参见附图3-5)、脂肪细胞大小(参见附图 6-7)、肝重(参见附图8)、血清脂质学指标(参见附图9-10)。
对小鼠体重进行分析(参见附图1)，Lactobacillus plantarum F3-2 干预8周后，与HFD组相比，小鼠体重增势变缓，益生菌干预后的小鼠体重显著低于HFD组(p<0.05)，且效果与阳性药物奥利司他干预组(OR组)无显著差异(p>0.05)。说明，在饲喂高脂饮食的过程中，Lactobacillus plantarum F3-2的干预可在一定程度上缓解小鼠体重的增加，并且作用效果与阳性药物奥利司他的作用效果相近。
对小鼠摄食量进行分析(参见附图2)，直至实验结束，小鼠摄食量变化趋势同体重的变化趋势相近，总体呈现增长趋势，但各组之间的摄食量并无显著差异((p>0.05)，Lactobacillus plantarum F3-2 干预不会对小鼠的摄食量产生影响。
对小鼠脂肪组织重进行分析(参见附图3-5)，与NC组相比， HFD组小鼠各部分脂肪组织重量明显增加(p<0.05)。Lactobacillus plantarum F3-2干预后的小鼠附睾脂肪重显著低于HFD组(p<0.05)，且与阳性药物奥利司他干预后的小鼠附睾脂肪重量没有显著差异(p>0.05)。阳性药物和Lactobacillus plantarum F3-2干预后对其他脂肪组织重无显著影响。
对小鼠脂肪细胞大小进行分析(参见附图6-7)，对照NC组，高脂饮食显著增加了附睾脂肪细胞的平均大小，Lactobacillus plantarumF3-2干预后，小鼠附睾脂肪细胞形态改善，细胞明显变小，小的细胞数量增多。通过软件分析附睾脂肪细胞平均面积，Lactobacillus plantarumF3-2干预的小鼠附睾脂肪细胞平均面积相比 HFD组显著减小(p<0.05)，且与阳性药物奥利司他组无显著差 (p>0.05)。Lactobacillus plantarumF3-2干预能有效缓解小鼠附睾脂肪细胞肥大。
对小鼠肝脏重进行分析(参见附图8)，与HFD组相比， LactobacillusplantarumF3-2干预可以显著减少小鼠肝脏增重 (p<0.05)，且干预效果与阳性药物奥利司他组没有显著差异 (p>0.05)。
对血清脂质学指标进行分析(参见附图9-10)，与NC组相比，高脂饮食饲喂后，HFD组小鼠血清内TG含量明显升高(p<0.05)。 Lactobacillus plantarumF3-2和阳性药物奥利司他干预，可以降低小鼠血清内TG的含量，与高脂组相比分别下调了42.14％和41.41％ (p<0.05)。表明Lactobacillus plantarumF3-2可以通过改善血清TG 含量减少脂质堆积。
2.通过RT-PCR分析脂肪组织中关键脂代谢因子(参见附图 11-12)，采用气相色谱分析小鼠粪便主要短链脂肪酸水平(参见附图13)。
逆转录聚合酶链反应分析脂代谢关键基因：
称取适量附睾脂肪组织，加入Trizol裂解液(TOYOBO,JPN)提取总RNA。利用NanoDrop2000超微量紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific,USA)测定总RNA浓度，根据逆转录试剂盒 (TOYOBO,JPN)的说明，利用逆转录仪合成cDNA。采用Power SYBRGreen PCR Master Mix(TOYOBO,JPN)，进行qPCR反应，对RNA水平进行定量分析。
表2用于定量实时PCR的引物
Figure BDA0003182312360000081
Figure BDA0003182312360000091
肥胖直观表现为脂肪组织的病理性增生或肥大，特别是白色脂肪组织，从细胞水平上来看，为脂肪细胞数量的增多或脂肪细胞体积的增大。抑制脂质生成减少脂质积累或许能够从根本上缓解肥胖。脂肪组织中的脂代谢主要包括脂肪的生成和脂肪的分解两个过程。这个过程依赖于一个协调而复杂的遗传因素网络。这些信号来自前脂肪细胞本身，也有可能来自其他脂肪细胞及内分泌系统，能够刺激或抑制前脂肪细胞的分化。通过分析前脂肪细胞向脂肪细胞分化过程中某些基因的表达，发现了一些与脂肪生成相关的标记物。其中，PPARγ等在脂肪生成过程中其关键作用。
与NC组相比，高脂饮食喂养能明显增加小鼠附睾脂肪组织中 PPARγ基因的表达(p<0.05)。当用Lactobacillus plantarumF3-2干预小鼠时，可以发现相比HFD组，能显著减缓PPARγ基因表达量的增加(p<0.05)，益生菌干预组PPARγ基因表达量与OR组无统计学差异(p>0.05)。SCFAs能够激活G蛋白偶联受体 GPR43(FFAR2)(40)，GPR43在结肠及脂肪组织中都有表达(41；42)高脂喂养的小鼠附睾脂肪组织中GPR43基因表达量要低于NC组 (p<0.05)。而对比HFD组，Lactobacillus plantarumF3-2能显著增加GPR43基因的表达(p<0.05)。可以发现，Lactobacillus plantarumF3-2可以增加高脂饮食诱导肥胖小鼠附睾脂肪组织中 GPR43基因的表达，减少PPARγ基因的表达量，调节脂肪细胞中脂质代谢。
小鼠粪便中短链脂肪酸测定：
将0.1g的样品加入到1200ul的蒸馏水中，充分混匀。然后与50 μl 50％浓硫酸混合进行酸化。室温下，将样品每分钟涡旋一次，持续5min。然后5000×g离心10min。离心后取上清500ul，用0.22um 尼龙滤器过滤，加入50μl过膜的二乙基丁酸作为内标，同时加入500μl无水乙醚，漩涡振荡30s，5000×g离心10min。取上层乙醚150ul， 12000×g离心10min后将上清液转移至液相小瓶中。小鼠粪便短链脂肪酸含量用气相色谱仪(安捷伦GC6890)测定，气相色谱柱为 DB-FFAP弹性石英毛细管柱(30m×0.25nm×0.25μm)，检测器为火焰离子化检测器。实验条件初始温度100℃，保持0.5min；以8℃ /min升至180℃，保持1min；以20℃/min升至220℃，保持5min；进样口温度：250℃；检测器(氢火焰离子化检测器，FID)温度：250℃。每次上样1ul，采用内标法计算相关短链脂肪酸的浓度。
有研究发现，SCFAs可以通过抑制白色脂肪组织中PPARγ的表达和活性来抵抗高脂饮食诱导的肥胖。难消化的碳水化合物经肠道菌群代谢后会被生成多种SCFAs，其中最主要的有三种，分别是乙酸、丙酸、丁酸，占比超过总含量的95％，益生菌干预会对高脂饮食喂养小鼠粪便SCFAs水平产生影响(38；39)。对三种主要SCFAs浓度进行了分析，可以发现，经高脂饲料喂养的小鼠粪便，与对照组相比，乙酸含量下调(p<0.05)。与HFD组相比，药物和Lactobacillus plantarumF3-2能有效提高小鼠粪便中乙酸含量(p<0.05)。HFD组中丙酸、丁酸含量与NC组相比，也显著减少(p<0.05)，但各干预组，对小鼠粪便中丙酸及丁酸含量的作用效果均不明显(p>0.05)。我们发现，益生菌干预能有效提高高脂饮食诱导肥胖小鼠粪便中主要 SCFAs特别是乙酸的含量。
Lactobacillus plantarumF3-2干预提高代谢物SCFAS特别是乙酸的浓度，激活白色脂肪组织中GPR43基因的表达，并抑制脂代谢关键基因PPARγ等基因的表达对脂肪细胞内脂质代谢产生影响，最终改善小鼠因高脂饮食诱导的肥胖。
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 中国海洋大学
<120> 一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 1
ggctgtattc ccctccatcg 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 2
ccagttggta acaatgccat gt 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 3
ttgatttctc cagcatttct 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 4
tgttgtagag ctgggtcttt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 5
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 6
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<210> 7
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<212> DNA
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<400> 7
ggcttctaca gcagcatcta 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<400> 8
aagcacacca ggaaattaag 20

Claims (4)

1.一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO:M 2020827。
2.如权利要求1所述一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum F3-2在制备改善肥胖产品中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为功能性食品、药品或保健品。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述功能性食品为乳制品。
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