CN113444159A

CN113444159A - 能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种

Info

Publication number: CN113444159A
Application number: CN202110675825.3A
Authority: CN
Inventors: 范岩; 牟洋
Original assignee: Nanjing Newfield Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Newfield Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-18
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-28

Abstract

本发明公开了能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种，所述冰冻蛋白来源于白冬孢酵母或来源于与白冬孢酵母的蛋白氨基酸序列同源性不低于99％的菌种；表达载体由包含由一个启动子序列，一个合成的核糖体结合位点，一个合成的编码冰冻蛋白的核苷酸序列和一个终止子序列组成；且该表达载体随机整合到重组宿主细胞的染色体上。本发明从摇瓶实验上清液中分析冰冻蛋白的表达量可达到5g/L以上，大大降低了冰冻蛋白的生产成本，不仅为冰冻蛋白在已知领域的广泛应用提供了成本优势，而且为冰冻蛋白在其他未知领域的应用开发提供了可能性。

Description

能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种。

背景技术

冰冻蛋白(又名抗冻蛋白)，广泛存在于生物体中，其中包含但不限于细菌类，昆虫类，鱼类及植物类，来源于不同生物体的冰冻蛋白在氨基酸序列及空间结构上都有很大的区别，甚至来自于同一种类的冰冻蛋白序列同源性也很低，这也就决定了该种类蛋白比一般传统意义上的功能蛋白具有更广泛的多样性。据文献报道，冰冻蛋白可以有效的跟冰晶结合来抑制它们的生长，并且能够改变冰核在自然生长过程中的形状和大小。更重要的是冰冻蛋白还能够有效降低溶液的冰点，抑制重结晶，是特定生物体能够抵抗冰冻环境甚至极寒条件的关键因素。

添加冰冻蛋白到食物中可以有效的延长保质期并且有效改善食物产品的质量。冰冻蛋白还不会诱发像其他蛋白引起的过敏反应，是一种安全的食品添加剂。近年来在冰冻蛋白领域已经推出大量的应用方案，特别是在冰激凌，冷冻面团和冷冻肉制品等冷冻食品领域有广泛的应用价值，但是同时冰冻蛋白高昂的价格使得它本身的应用开发受到了很大的局限性。

目前，大肠杆菌和毕赤酵母作为蛋白的表达宿主已经成功用于表达大量的异源蛋白质，但是它们在冰冻蛋白的表达水平上非常低，分别为2mg/L和61.2mg/L，不利于产业化。所以开发出能够高表达冰冻蛋白的表达宿主是解决目前冰冻蛋白产业化的关键。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种，从摇瓶实验上清液中分析冰冻蛋白的表达量可达到5g/L以上，大大降低了冰冻蛋白的生产成本，不仅为冰冻蛋白在已知领域的广泛应用提供了成本优势，而且为冰冻蛋白在其他未知领域的应用开发提供了可能性。

本发明提出的冰冻蛋白，所述冰冻蛋白来源于白冬孢酵母或来源于与白冬孢酵母的蛋白氨基酸序列同源性不低于99％的菌种，所述冰冻蛋白的编码基因序列如SEQ IDNO.1。

优选地，所述的冰冻蛋白的编码基因序列为C端截短的来源于白冬孢酵母的冰冻蛋白的编码基因，如SEQ ID NO.2所示。

优选地，所述的冰冻蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明提出的编码上述冰冻蛋白的表达载体，由一个合成的多聚核苷酸组成。

优选地，所述表达载体由包含由一个启动子序列SEQ ID NO.4，一个合成的截短的编码冰冻蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2和一个终止子序列SEQ ID NO.5组成。

优选地，所述表达载体还包括能够知道冰冻蛋白分泌的信号序列，所述信号序列位于编码冰冻蛋白的核苷酸序列的上游，优选来源于白冬孢酵母的冰冻蛋白的天然分泌肽。

本发明提出的重组的微生物宿主细胞，包含上述的表达载体。

优选地，所述表达冰冻蛋白的基因被随机整合到重组宿主细胞的染色体上。

优选地所述微生物宿主细胞为黑曲霉。

本发明提出的生产冰冻蛋白的方法，方法步骤如下：培养上述的重组的微生物宿主细胞用于表达冰冻蛋白，然后在培养的重组的微生物宿主细胞的上清液中离心过滤得到冰冻蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

通过优化冰冻蛋白表达原件(包含但不限于启动子序列，截短的编码冰冻蛋白核苷酸序列以及终止子序列)以及通过优化冰冻蛋白表达宿主黑曲霉来大幅度提高冰冻蛋白的表达量，为冰冻蛋白的工业化生产及在已知领域的广泛应用提供了成本优势。

附图说明

图1为本发明提出的含有一个完整的冰冻蛋白表达框的pYF-ISP载体。

具体实施方式

(1)pYF-ISP整合质粒的构建

pYF-ISP(图1)是一个含有完整冰冻蛋白表达框的质粒。该质粒由一个复制起点(在37℃有活性)，一个氨苄抗性基因(Amp)和一个含有完整冰冻蛋白表达框的基因序列组成。在37℃时，质粒上的复制起点可以保证该质粒在大肠杆菌中的快速的大量的复制。

本发明的编码冰冻蛋白的表达载体包含一个启动子序列SEQ ID NO.4，一个合成来自于白冬孢酵母的的截短的编码冰冻蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO.2和一个终止子序列SEQ ID NO.5组成。为了方便筛选，在终止子的下游还增加了来自构巢曲霉的乙酰胺酶编码基因amdS见SEQ ID NO.6。

pYF-ISP质粒的构建的具体过程为：将质粒pUC57用BamHI和NdeI双酶切，回收纯化2.5kbp的片段，完整的冰冻蛋白表达框序列由YF-F和YF-R引物从合成的质粒中获得。纯化后的PCR产物与上述酶切的DNA片段通过Gibson

Master Mix(NEB Labs)进行组装，得到整合质粒pYF-ISP。

其中引物YF-F的序列为：ATCGGATCCC GGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAGCAGCTTGAA GAACTAGTGG C。

引物YF-R的序列为：CAATTTCACA CAGGAAACAG CTATGACCATGATTACGCCAATGCATTGAA TGACAGTGAT ATCAGC。

(2)冰冻蛋白黑曲霉生产菌株的构建

整合质粒pYF-ISP经测序确认后由大肠杆菌Stable3扩增，扩增后的质粒经过HindIII酶切后，回收纯化5K含有完整的冰冻蛋白表达框的基因片段，用于转化黑曲霉。

本发明中涉及的黑曲霉菌株为A.Niger Strain CBS513.88，其中糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因已经通过Crispr-cas9方案被敲除。

关于黑曲霉的转化采用原生质体法实施的具体方案如下：

S1：黑曲霉菌丝体在50ml TZ(0.8％牛肉膏粉，0.2％酵母浸膏，0.5％蛋白胨，0.2％Na Cl，3％蔗糖)培养基中34℃震荡培养24小时后，经过神奇滤布(Miracloth,EMDMilipore Co.)过滤收集菌丝体。

S2：用pH 5.8的缓冲液(NaCl 5％)将菌丝冲洗一次，然后将菌丝体转移至约20ml已过滤好的酶解液(1％纤维素酶，1％蜗牛酶,0.8％溶壁酶)中，在30℃酶解约3小时。

S3：把酶解后产物放入冰盒中冷却，然后缓缓滤过预冷的擦镜纸，滤液4℃离心10min，弃上清。

S4：加入约10ml的预冷的STC(1M山梨醇，50mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)溶液，将沉淀悬浮，离心弃上清；用1ml STC液重悬沉淀得到黑曲霉原生质体。

S5：将100ul线性DNA(回收纯化含有完整的冰冻蛋白表达框的基因片段)加入1ml原生质体中，混合均匀，室温静置30min。

S6：向混合物中加入10ml PEG(60％PEG4000，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl，pH7.5)溶液，混匀，25℃静置25min。

S7：将S6中的混合物在常温下进行离心处理10min，转速为3000rpm，加入1mlSTC液体，轻轻悬浮完全。

S8：将上述液体与Amds高糖培养基(20％蔗糖，0.05％KCl，0.07％K2HPO4，0.001％FeSO4，0.024％MgSO4，0.33％CsCl，0.7％Agar，使用时添加2ml 1M过滤后的乙酰胺溶液)在50℃混合均匀，铺平板，34℃培养10天左右。随机挑取转化子提取基因组进行PCR鉴定确认整合成功。

(3)冰冻蛋白的摇瓶发酵

取一个活化的阳性转化子单克隆接种于TB3(0.3％酵母提取物，0.3％酪蛋白水解物，3％蔗糖，1.5％琼脂)平板上，34度培养48小时，然后把培养的菌丝体接种到50ml培养液中(4.0％葡萄糖，2.0％蛋白胨，1％玉米浆干粉，pH5.5)34度培养48小时。混匀后取5ml培养液接种到45ml培养液中(12％葡萄糖，2.0％蛋白胨，1％玉米浆干粉，0.4％MgSO4，0.6％CaCO3，pH5.5)，在往复摇床中200rpm振荡培养7-8天后取上清液，做SDS-PAGE分析，确定冰冻蛋白的有效分泌。

(4)冰冻蛋白分泌量(浓度)的测定

冰冻蛋白表达量用考马斯亮蓝法测定，具体的方法步骤为：将配制好的考马斯亮蓝G-250检测试剂(100mg溶于50ml 95％乙醇中，另外加入100ml 85％磷酸溶液，加水稀释至1000ml)加入标准品(0.01mg/ml,0.02mg/ml,0.03mg/ml,0.04mg/ml,0.05mg/ml,0.06mg/ml结晶牛血清蛋白)测定595nm处吸光值并绘制标准曲线。待测冰冻样品用水稀释10倍，测定595nm处吸光值并且根据标准曲线计算出冰冻蛋白的浓度为5g/L。

序列表

<110> 南京纽田科技有限公司

<120> 能表达冰冻蛋白的黑曲霉发酵菌种

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> 白冬孢酵母(Leucosporidium)

<400> 1

atgagccttc tctccatcat caccattggt cttgctggct tgggtggtct ggtcaacggc 60

cagcgtgacc tctccgttga gcttggagtt gcctccaact tcgccatcct ggccaaggcc 120

ggtatctcct ccgtgcctga ctctgccatc ctcggtgaca tcggtgtctc tcctgctgct 180

gccacctaca tcaccggctt cggtctcacc caggacagca gcaccaccta cgccacctcg 240

ccccaggtca ctggtctcat ctacgctgcc gactacagca ctcccacccc caactacctg 300

gctgctgctg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ctgctggctt cgtcgacccc 360

gacttcctgg agcttggtgc tggtgagctg cgtgaccaga ctctggtgcc tggtctctac 420

aagtggacct cctccgtctc cgttcctact gacttgacct tcgagggcaa cggcgatgcc 480

acctgggtgt tccagattgc tggtggtctc tccctcgccg atggtgttgc tttcaccctg 540

gctggtggtg ccaactcgac caacattgct ttccaggtcg gcgatgatgt cactgtcggc 600

aagggtgctc acttcgaggg tgtcctcctt gccaagcgct tcgtcaccct ccagactggc 660

tcttctctga acggccgtgt cctgagccag accgaggttg ctctccagaa ggccaccgtc 720

aactctccct tcgtccccgc tcccgaggtt gtgcagaagc gctccaacgc ccgccagtgg 780

ctataa 786

<210> 2

<211> 756

<212> DNA

<213> 白冬孢酵母(Leucosporidium)

<400> 2

atgagccttc tctccatcat caccattggt cttgctggct tgggtggtct ggtcaacggc 60

cagcgtgacc tctccgttga gcttggagtt gcctccaact tcgccatcct ggccaaggcc 120

ggtatctcct ccgtgcctga ctctgccatc ctcggtgaca tcggtgtctc tcctgctgct 180

gccacctaca tcaccggctt cggtctcacc caggacagca gcaccaccta cgccacctcg 240

ccccaggtca ctggtctcat ctacgctgcc gactacagca ctcccacccc caactacctg 300

gctgctgctg ttgccaacgc cgagactgcc tacaaccagg ctgctggctt cgtcgacccc 360

gacttcctgg agcttggtgc tggtgagctg cgtgaccaga ctctggtgcc tggtctctac 420

aagtggacct cctccgtctc cgttcctact gacttgacct tcgagggcaa cggcgatgcc 480

acctgggtgt tccagattgc tggtggtctc tccctcgccg atggtgttgc tttcaccctg 540

gctggtggtg ccaactcgac caacattgct ttccaggtcg gcgatgatgt cactgtcggc 600

aagggtgctc acttcgaggg tgtcctcctt gccaagcgct tcgtcaccct ccagactggc 660

tcttctctga acggccgtgt cctgagccag accgaggttg ctctccagaa ggccaccgtc 720

aactctccct tcgtccccgc tcccgaggtt gtgtaa 756

<210> 3

<211> 251

<212> PRT

<213> 白冬孢酵母(Leucosporidium)

<400> 3

Met Ser Leu Leu Ser Ile Ile Thr Ile Gly Leu Ala Gly Leu Gly Gly

1 5 10 15

Leu Val Asn Gly Gln Arg Asp Leu Ser Val Glu Leu Gly Val Ala Ser

20 25 30

Asn Phe Ala Ile Leu Ala Lys Ala Gly Ile Ser Ser Val Pro Asp Ser

35 40 45

Ala Ile Leu Gly Asp Ile Gly Val Ser Pro Ala Ala Ala Thr Tyr Ile

50 55 60

Thr Gly Phe Gly Leu Thr Gln Asp Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Thr Ser

65 70 75 80

Pro Gln Val Thr Gly Leu Ile Tyr Ala Ala Asp Tyr Ser Thr Pro Thr

85 90 95

Pro Asn Tyr Leu Ala Ala Ala Val Ala Asn Ala Glu Thr Ala Tyr Asn

100 105 110

Gln Ala Ala Gly Phe Val Asp Pro Asp Phe Leu Glu Leu Gly Ala Gly

115 120 125

Glu Leu Arg Asp Gln Thr Leu Val Pro Gly Leu Tyr Lys Trp Thr Ser

130 135 140

Ser Val Ser Val Pro Thr Asp Leu Thr Phe Glu Gly Asn Gly Asp Ala

145 150 155 160

Thr Trp Val Phe Gln Ile Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ala Asp Gly Val

165 170 175

Ala Phe Thr Leu Ala Gly Gly Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ala Phe Gln

180 185 190

Val Gly Asp Asp Val Thr Val Gly Lys Gly Ala His Phe Glu Gly Val

195 200 205

Leu Leu Ala Lys Arg Phe Val Thr Leu Gln Thr Gly Ser Ser Leu Asn

210 215 220

Gly Arg Val Leu Ser Gln Thr Glu Val Ala Leu Gln Lys Ala Thr Val

225 230 235 240

Asn Ser Pro Phe Val Pro Ala Pro Glu Val Val

245 250

<210> 4

<211> 1150

<212> DNA

<213> 启动子(Promoter)

<400> 4

gcagcttgaa gaactagtgg ccctgtaccc agacaccacc acgtacgggt ctccgttcag 60

gacaggcgcg gccaacaact ggtatccgca atttaagcga ttggccgcca ttctcggcga 120

cttggtcttc accattaccc ggcgggcatt cctctcgtat gcagaggaaa tctcccctga 180

tcttccgaac tggtcgtacc tggcgaccta tgactatggc accccagttc tggggacctt 240

ccacggaagt gacctgctgc aggtgttcta tgggatcaag ccaaactatg cagctagttc 300

tagccacacg tactatctga gctttgtgta tacgctggat ccgaactcca accgggggga 360

gtacattgag tggccgcagt ggaaggaatc gcggcagttg atgaatttcg gagcgaacga 420

cgccagtctc cttacggatg atttccgcaa cgggacatat gagttcatcc tgcagaatac 480

cgcggcgttc cacatctgat gccattggcg gaggggtccg gacggtcagg aacttagcct 540

tatgagatga atgatggacg tgtctggcct cggaaaagga tatatgggga tcatgatagt 600

actagccata ttaatgaagg gcatatacca cgcgttggac ctgcgttata gcttcccgtt 660

agttatagta ccatcgttat accagccaat caagtcacca cgcacgaccg gggacggcga 720

atccccggga attgaaagaa attgcatccc aggccagtga ggccagcgat tggccacctc 780

tccaaggcac agggccattc tgcagcgctg gtggattcat cgcaatttcc cccggcccgg 840

cccgacaccg ctataggctg gttctcccac accatcggag attcgtcgcc taatgtctcg 900

tccgttcaca agctgaagag cttgaagtgg cgagatgtct ctgcaggaat tcaagctaga 960

tgctaagcga tattgcatgg caatatgtgt tgatgcatgt gcttcttcct tcagcttccc 1020

ctcgtgcaga tgaggtttgg ctataaattg aagtggttgg tcggggttcc gtgaggggct 1080

gaagtgcttc ctccctttta gacgcaactg agagcctgag cttcatcccc agcatcatta 1140

cacctcagca 1150

<210> 5

<211> 329

<212> DNA

<213> 终止子(Terminator)

<400> 5

ctcgagatct agagggtgac tgacacctgg cggtagacaa tcaatccatt tcgctatagt 60

taaaggatgg ggatgagggc aattggttat atgatcatgt atgtagtggg tgtgcataat 120

agtagtgaaa tggaagccaa gtcatgtgat tgtaatcgac cgacggaatt gaggatatcc 180

ggaaatacag acaccgtgaa agccatggtc tttccttcgt gtagaagacc agacagacag 240

tccctgattt acccttgcac aaagcactag aaaattagca ttccatcctt ctctgcttgc 300

tctgctgata tcactgtcat tcaatgcat 329

<210> 6

<211> 2724

<212> DNA

<213> 乙酰胺酶编码基因(amdS)

<400> 6

ctggaaacgc aaccctgaag ggattcttcc tttgagagat ggaagcgtgt catatctctt 60

cggttctacg gcaggttttt ttctgctctt tcgtagcatg gcatggtcac ttcagcgctt 120

atttacagtt gctggtattg atttcttgtg caaattgcta tctgacactt attagctatg 180

gagtcaccac atttcccagc aacttcccca cttcctctgc aatcgccaac gtcctctctt 240

cactgagtct ccgtccgata acctgcactg caaccggtgc cccatggtac gcctccggat 300

catactcttc ctgcacgagg gcatcaagct cactaaccgc cttgaaactc tcattcttct 360

tatcgatgtt cttatccgca aaggtaaccg gaacaaccac gctcgtgaaa tccagcaggt 420

tgatcacaga ggcataccca tagtaccgga actggtcatg ccgtaccgca gcggtaggcg 480

taatcggcgc gatgatggcg tccagttcct tcccggcctt ttcttcagcc tcccgccatt 540

tctcaaggta ctccatctgg taattccact tctggagatg cgtgtcccag agctcgttca 600

tgttaacagc tttgatgttc gggttcagta ggtctttgat atttggaatc gccggctcgc 660

cggatgcact gatatcgcgc attacgtcgg cgctgccgtc agccgcgtag atatgggaga 720

tgagatcgtg gccgaaatcg tgcttgtatg gcgtccacgg ggtcacggtg tgaccggctt 780

tggcgagtgc ggcgacggtg gtttccacgc cgcgcaggat aggagggtgt ggaaggacat 840

tgccgtcgaa gttgtagtag ccgatattga gcccgccgtt cttgatcttg gaggcaataa 900

tgtccgactc ggactggcgc cagggcatgg ggatgacctt ggagtcgtat ttccatggct 960

cctgaccgag gacggatttg gtgaagaggc ggaggtctaa catacttcat cagtgactgc 1020

cggtctcgta tatagtataa aaagcaagaa aggaggacag tggaggcctg gtatagagca 1080

ggaaaagaag gaagaggcga aggactcacc ctcaacagag tgcgtaatcg gcccgacaac 1140

gctgtgcacc gtctcctgac cctccatgct gttcgccatc tttgcatacg gcagccgccc 1200

atgactcggc cttagaccgt acaggaagtt gaacgcggcc ggcactcgaa tcgagccacc 1260

gatatccgtt cctacaccga tgacgccacc acgaatccca acgatcgcac cctcaccacc 1320

agaactgccg ccgcacgacc agttcttgtt gcgtgggttg acggtgcgcc cgatgatgtt 1380

gttgactgtc tcgcagacca tcagggtctg cgggacagag gtcttgacgt agaagacggc 1440

accggctttg cggagcatgg ttgtcagaac cgagtcccct tcgtcgtact tgtttagcca 1500

tgagatgtag cccattgatg tttcgtagcc ctggtggcat atgttagctg acaaaaaggg 1560

acatctaacg acttaggggc aacggtgtac cttgactcga agctggtctt tgagagagat 1620

ggggaggcca tggagtggac caacgggtct cttgtgcttt gcgtagtatt catcgagttc 1680

ccttgcctgc gcgagagcgg cgtcagggaa gaactcgtgg gcgcagtttg tctgcacaga 1740

agccagcgtc agcttgatag tcccataagg tggcgttgtt acatctccct gagaggtaga 1800

ggggacccta ctaactgctg ggcgattgct gcccgtttac agaatgctag cgtaacttcc 1860

accgaggtca actctccggc cgccagcttg gacacaagat ctgcagcgga ggcctctgtg 1920

atcttcagtt cggcctctga aaggatcccc gatttctttg ggaaatcaat aacgctgtct 1980

tccgcaggca gcgtctggac tttccattca tcagggatgg tttttgcgag gcgggcgcgc 2040

ttatcagcgg ccagttcttc ccaggattga ggcattctgt gttagcttat agtcaggatg 2100

ttggctcgac gagtgtaaac tgggagttgg catgagggtt atgtaggctt ctttagcccc 2160

gcatccccct cattctcctc attgatcccg ggggagcgga tggtgttgat aagagactaa 2220

ttatagggtt tagctggtgc ctagctggtg attggctggc ttcgccgaat tttacgggcc 2280

aaggaaagct gcagaaccgc ggcactggta aacggtaatt aagctatcag ccccatgcta 2340

acgagtttaa attacgtgta ttgctgataa acaccaacag agctttactg aaagatggga 2400

gtcacggtgt ggcttcccca ctgcgattat tgcacaagca gcgagggcga acttgactgt 2460

cgtcgctgag cagcctgcag tcaaacatac atatatatca accgcgaaga cgtctggcct 2520

tgtagaacac gacgctccct agcaacacct gccgtgtcag cctctacggt tgttacttgc 2580

attcaggatg ctctccagcg ggcgagctat tcaaaatatt caaagcaggt atctcgtatt 2640

gccaggattc agctgaagca acaggtgcca aggaaatctg cgtcggttct catctgggct 2700

tgctcggtcc tggcgtagat ctag 2724

Claims

1.冰冻蛋白，其特征在于，所述冰冻蛋白来源于白冬孢酵母或来源于与白冬孢酵母的蛋白氨基酸序列同源性不低于99％的菌种，所述冰冻蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的冰冻蛋白，其特征在于，所述的冰冻蛋白的编码基因序列为C端截短的来源于白冬孢酵母的冰冻蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的冰冻蛋白，其特征在于，所述的冰冻蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

4.编码权利要求2或3所述的冰冻蛋白的表达载体，其特征在于，由一个合成的多聚核苷酸组成。

5.根据权利要求4所述的编码冰冻蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体由包含由一个启动子序列SEQ ID NO.4，一个合成的截短的编码冰冻蛋白的核苷酸序列SEQ IDNO.2和一个终止子序列SEQ ID NO.5组成。

6.根据权利要求5所述的编码冰冻蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括能够知道冰冻蛋白分泌的信号序列，所述信号序列位于编码冰冻蛋白的核苷酸序列的上游。

7.重组的微生物宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的表达载体。

8.根据权利要求7所述的重组的微生物宿主细胞，其特征在于，所述表达冰冻蛋白的基因被随机整合到重组宿主细胞的染色体上。

9.根据权利要求8所述的重组的微生物宿主细胞，其特征在于，所述微生物宿主细胞为黑曲霉。

10.生产冰冻蛋白的方法，其特征在于，方法步骤如下：培养权利要求7-9任一项所述的重组的微生物宿主细胞用于表达冰冻蛋白，然后在培养的重组的微生物宿主细胞的上清液中离心过滤得到冰冻蛋白。