CN113440544B - 一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物的制备方法，包括以下步骤：(1)取羊肚菌子实体，粉碎，按照羊肚菌子实体粉与乙醇溶液的质量体积比为1:10‑1:50(g/mL)的料液比投加乙醇溶液，在60℃～80℃温度下，加热回流提取1‑10h，过滤，收集并合并滤液，浓缩、离心，得上清液；(2)将上清液送入离子交换树脂柱中进行分离，再用洗脱溶剂对离子交换树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；(3)将洗脱液浓缩，干燥，得到羊肚菌提取物。本发明制得的羊肚菌提取物，黄酮含量高，可用于缓解结肠炎。

Description

一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物及其制备方法和其应用。
背景技术
结肠炎是指各种原因引起的结肠炎症性病变。结肠炎的临床表现腹泻、腹痛、黏液便及脓血便、里急后重、甚则大便秘结、数日内不能通大便；常伴有消瘦乏力等，多反复发作。越来越多的研究表明，结肠炎的发病与肠道菌群变化以及肠粘膜免疫功能紊乱引起的慢性炎症反应有关。
羊肚菌是一种珍稀的食药用菌，并誉为优质蛋白食品，含有7种人体必需氨基酸，氨基酸总量近40％，脂肪含量低于1％，且含有丰富的纤维素、矿质元素等。《本草纲目》记载其“味甘寒，性平，无毒，益肠胃，化痰理气”。现代医学研究证实，羊肚菌能够提升机体免疫力、并对肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞都具有杀伤能力，且具有抗疲劳、降血脂、减轻放化疗引起的毒副作用。为此，有关羊肚菌及其提取物的药用开发成为本领域的研究热点。但现有技术中尚未有羊肚菌提取物用于防治结肠炎的相关研究。
发明内容
一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取羊肚菌子实体，粉碎，按照羊肚菌子实体粉与乙醇溶液的质量体积比为1:10-1:50(g/mL)的料液比投加乙醇溶液，在60℃～80℃温度下，加热回流提取1-10h，过滤，收集并合并滤液，浓缩、离心，得上清液；
(2)将上清液送入离子交换树脂柱中进行分离，再用洗脱溶剂对离子交换树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
(3)将洗脱液浓缩，干燥，得到羊肚菌提取物。
本发明优选的技术方案中，所述粉碎为，粉碎后的羊肚菌子实体粉过10-50目筛。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)时，投加的乙醇溶液的质量浓度为60-90％。
本发明优选的技术方案中，所述提取次数为2-5次。
本发明优选的技术方案中，所述料液比为1:20-1:30(g/mL)。
本发明优选的技术方案中，所述提取时间为3-6h。
本发明优选的技术方案中，所述提取温度为65-70℃。
本发明优选的技术方案中，所述过滤为纱布过滤、离心过滤中的任一种。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)时，所述浓缩为，浓缩至滤液总体积的20％～50％。
本发明优选的技术方案中，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述浓缩温度为65-70℃。
本发明优选的技术方案中，所述离心为4-10℃温度下，在 6000-8000rpm/min的转速下，离心10-20min。
本发明优选的技术方案中，所述离子交换树脂柱为大孔树脂柱，优选为D101树脂柱、NKA树脂柱柱、X-5树脂柱柱中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述树脂柱的高径比为(3-10):1，优选为 (6-8):1。
本发明的优选技术方案，所述树脂柱的工作温度为20-25℃。
本发明优选的技术方案中，上清液送入离子交换树脂柱的上样流速为0.5-3mL/min，优选为1-2mL/min。
本发明优选的技术方案中，洗脱溶剂送入离子交换树脂柱的洗脱流速为0.5-3mL/min，优选为1-2mL/min。
本发明优选的技术方案中，洗脱溶剂为浓度为20％-85％的乙醇溶液，优选为50-80％的乙醇溶液，洗脱溶剂用量为3-5倍树脂柱体积。
本发明优选的技术方案中，所述洗脱步骤为，用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为20％或50％或80％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
本发明优选的技术方案中，所述洗脱步骤为，先用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为20％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液弃用，再用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为50％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述浓缩为，40-60℃水浴下减压浓缩为原洗脱液体积的1/10-1/50。
本发明的优选技术方案，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种。
本发明的优选技术方案，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种。
本发明的优选技术方案，所述干燥温度不低于80℃，优选为 100-110℃。
本发明优选的技术方案中，所述提取物中黄酮含量不低于10％
(w/w)，优选不低于50％(w/w)，更优选不低于60％(w/w)。
本发明的目的在于提供一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物，所述提取物中黄酮含量不低于10％(w/w)，优选不低于50％(w/w)，更优选不低于60％(w/w)。
本发明优选的技术方案中，所述提取物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取羊肚菌子实体，粉碎，按照羊肚菌子实体粉与乙醇溶液的质量体积比为1:10-1:50(g/mL)的料液比投加乙醇溶液，在60℃～80℃温度下，加热回流提取1-10h，过滤，收集并合并滤液，浓缩、离心，得上清液；
(2)将上清液送入离子交换树脂柱中进行分离，再用洗脱溶剂对离子交换树脂柱进行洗脱，收集洗脱液；
(3)将洗脱液浓缩，干燥，得到羊肚菌提取物。
本发明优选的技术方案中，所述粉碎为，粉碎后的羊肚菌子实体粉过10-50目筛。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)时，投加的乙醇溶液的质量浓度为60-90％。
本发明优选的技术方案中，所述提取次数为2-5次。
本发明优选的技术方案中，所述料液比为1:20-1:30(g/mL)。
本发明优选的技术方案中，所述提取时间为3-6h。
本发明优选的技术方案中，所述提取温度为65-70℃。
本发明优选的技术方案中，所述过滤为纱布过滤、离心过滤中的任一种。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)时，所述浓缩为，浓缩至滤液总体积的20％～50％。
本发明优选的技术方案中，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种。
本发明优选的技术方案中，所述浓缩温度为65-70℃。
本发明优选的技术方案中，所述离心为4-10℃温度下，在 6000-8000rpm/min的转速下，离心10-20min。
本发明优选的技术方案中，所述离子交换树脂柱为大孔树脂柱，优选为D101树脂柱、NKA树脂柱柱、X-5树脂柱柱中的任一种或其组合。
本发明的优选技术方案，所述树脂柱的高径比为(3-10):1，优选为 (6-8):1。
本发明的优选技术方案，所述树脂柱的工作温度为20-25℃。
本发明优选的技术方案中，上清液送入离子交换树脂柱的上样流速为0.5-3mL/min，优选为1-2mL/min。
本发明优选的技术方案中，洗脱溶剂送入离子交换树脂柱的洗脱流速为0.5-3mL/min，优选为1-2mL/min。
本发明优选的技术方案中，洗脱溶剂为浓度为20％-85％的乙醇溶液，优选为50-80％的乙醇溶液，洗脱溶剂用量为3-5倍树脂柱体积。
本发明优选的技术方案中，所述洗脱步骤为，先用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为20％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液弃用，再用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为50％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
本发明优选的技术方案中，步骤(3)中，所述浓缩为，40-60℃水浴下减压浓缩为原洗脱液体积的1/10-1/50。
本发明的优选技术方案，所述分离选自过滤、离心、膜处理的任一种。
本发明的优选技术方案，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种。
本发明的优选技术方案，所述干燥温度不低于80℃，优选为 100-110℃。
本发明优选的技术方案中，所述提取物中黄酮含量不低于10％ (w/w)，优选不低于50％(w/w)，更优选不低于60％(w/w)。
本发明的另一目的在于提供一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物在制备防治结肠炎制品中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明中采用如下方法检测：
1.黄酮含量：AlCl3比色法(参考文献：孟鹏举等，2018.滑子菇黄酮醇提工艺及抗氧化活性研究.农产品加工(上半月)(4):26-30.)
2.Shannon指数和Simpson指数：高通量测序法(参考文献：Li,Bing, etal.Characterization of tetracycline resistant bacterial community in salineactivated sludge using batch stress incubation with high-throughputsequencing analysis.Water research 47.13(2013):4207-4216.)
与现有技术相比，本发明有益的技术效果包括：
1、本发明制得的羊肚菌提取物，黄酮含量高，用于治疗结肠炎，可使得结肠炎小鼠体重升高、固缩的结肠长度恢复、结肠绒隐比显著升高，促炎因子IFN、IL-1β、IL-6、TNF-α下降，抑炎因子IL-10升高，指征结肠炎症程度的指标(DAO、D-Lactate)显著下降。
2、本发明提取得到的羊肚菌提取物，可对结肠炎小鼠的肠道菌群及其菌群代谢物产生影响，提高肠道菌群的生物多样性，增加优势菌群、减少有害菌群，达到缓解结肠炎的作用。
3、本发明工艺简单，制备方便，可用于工业化生产。
附图说明
图1：正常组、造模组和试验组中小鼠结肠组织病理学变化
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明。但本发明不局限于实施例。
实施例1
(1)将羊肚菌子实体粉碎，过10-50目筛，取过筛的羊肚菌子实体粉200g，按料液比为1:20(g/mL)加入70％的乙醇溶液，60℃下加热回流提取2次，每次提取6h，提取液用三层纱布过滤2次，合并滤液，在40℃水浴条件下减压浓缩至滤液总体积的25％，4℃下在6000rpm转速下离心15min，收集上清液。
(2)将上清液以0.5mL/min的流速，流过大孔树脂柱D101，所述树脂柱的高径比为6:1，工作温度为20℃。选择5倍柱体积、质量浓度为20％的乙醇溶液作为洗脱溶剂，以1mL/min的流速，流过树脂柱，洗脱液丢弃；再选择5倍柱体积、质量浓度为50％的乙醇溶液作为洗脱溶剂，以1mL/min的流速，流过树脂柱，收集洗脱液。
(3)将洗脱液在40℃水浴、0.08Mpa下减压浓缩干燥，浓缩为原洗脱液体积的1/50，再置于50℃烘箱烘干至恒重，得到羊肚菌提取物，检测羊肚菌提取物中的黄酮含量为63.2％。
实施例2
(1)将羊肚菌子实体粉碎，过10-50目筛，取过筛的羊肚菌子实体粉200g，按料液比为1:20(g/mL)加入70％的乙醇溶液，60℃下加热回流提取2次，每次提取6h，提取液用三层纱布过滤2次，合并滤液，在40℃水浴条件下减压浓缩至滤液总体积的25％，4℃下在6000rpm转速下离心15min，收集上清液。
(2)将上清液以0.5mL/min的流速，流过大孔树脂柱D101，所述树脂柱的高径比为6:1，工作温度为20℃。选择5倍柱体积、质量浓度为50％的乙醇溶液作为洗脱溶剂，以1mL/min的流速，流过树脂柱，收集洗脱液。
(3)将洗脱液在40℃水浴、0.08Mpa下减压浓缩干燥，浓缩为原洗脱液体积的1/50，再置于50℃烘箱烘干至恒重，得到羊肚菌提取物，检测羊肚菌提取物中的黄酮含量为71.5％。
实施例3
(1)将羊肚菌子实体粉碎，过10-50目筛，取过筛的羊肚菌子实体粉200g，按料液比为1:25(g/mL)加入70％的乙醇溶液，60℃下加热回流提取2次，每次提取6h，提取液用三层纱布过滤2次，合并滤液，在40℃水浴条件下减压浓缩至滤液总体积的25％，4℃下在6000rpm转速下离心15min，收集上清液。
(2)将上清液以0.5mL/min的流速，流过树脂柱，所述树脂柱的高径比为6:1，工作温度为40℃。选择5倍树脂柱体积、20％的乙醇溶液作为洗脱溶剂，以0.5mL/min的流速，流过树脂柱，收集洗脱液。
(3)将洗脱液在40℃水浴、0.08Mpa下减压浓缩干燥，浓缩为原洗脱液体积的1/50，置于50℃烘箱烘干至恒重，得到羊肚菌提取物，检测羊肚菌提取物中的黄酮含量为18.6％。
实施例4
(1)将羊肚菌子实体粉碎，过10-50目筛，取过筛的羊肚菌子实体粉200g，按料液比为1:20(g/mL)加入70％的乙醇溶液，60℃下加热回流提取2次，每次提取6h，提取液用三层纱布过滤2次，合并滤液，在40℃水浴条件下减压浓缩至滤液总体积的25％，4℃下在6000rpm转速下离心15min，收集上清液。
(2)将上清液以0.5mL/min的流速，流过大孔树脂柱D101，所述树脂柱的高径比为6:1，工作温度为40℃。选择5倍树脂柱体积、80％的乙醇溶液作为洗脱溶剂，以1mL/min的流速，流过树脂柱，收集洗脱液。
(3)将洗脱液在40℃水浴、0.08Mpa下减压浓缩干燥，浓缩为原洗脱液体积的1/50，置于50℃烘箱烘干至恒重，得到羊肚菌提取物，检测羊肚菌提取物中的黄酮含量为44.2％。
试验例1
将购买的C57BL/6雄性6-7周龄小鼠30只适应喂养一周后，继续常规喂养，使其自由取食、饮水，然后分为正常组、造模组、试验组，每组10只。
正常组：每只小鼠每天灌胃一次反渗透水(200μL)，持续灌胃14 天。14天中小鼠正常取食、饮水。第15天麻醉处死小鼠。
造模组：每只小鼠每天灌胃一次反渗透水(200μL)，持续灌胃14 天。第1-7天小鼠正常取食、饮水。第8-14天小鼠正常取食，饮用加入了3.5％硫代硫酸钠(DSS，v/w)的水。第15天麻醉处死小鼠。
试验组：每只小鼠每天灌胃一次羊肚菌提取物溶液(200μL，其中含实施例1的羊肚菌提取物的浓度为25mg/mL)，持续灌胃14天。第 1-7天小鼠正常取食、饮水。第8-14天小鼠正常取食，饮用加入了3.5％硫代硫酸钠(DSS，v/w)的水。第15天麻醉处死小鼠。
评价指标结果(表1)显示，连续灌胃实施例1的羊肚菌提取物溶液14天后，结肠炎小鼠体重升高、固缩的结肠长度恢复、结肠绒隐比显著升高，促炎因子IFN、IL-1β、IL-6、TNF-α下降，抑炎因子IL-10 升高，指征结肠炎症程度的指标(DAO、D-Lactate)显著下降。
表1小鼠的结肠炎相关评价指标
正常组 造模组 试验组
结肠绒毛高度(μm) 389.26±19.66 344.95±25.76<sup>**</sup> 401.99±18.94<sup>##</sup>
DAO,U/L 10.15±3.33 15.86±4.92<sup>*</sup> 11.12±2.98<sup>#</sup>
D-Lactate,pg/mL 14.91±3.71 24.49±5.28<sup>**</sup> 11.72±2.47<sup>##</sup>
IL-1β,pg/mL 8.77±1.09 15.02±2.50<sup>**</sup> 10.01±1.34<sup>##</sup>
IL-6,pg/Ml 11.30±1.77 19.53±4.64<sup>**</sup> 13.45±2.41<sup>#</sup>
IL-10,pg/mL 55.74±5.24 38.70±3.74<sup>**</sup> 53.79±4.72<sup>##</sup>
TNF-α,pg/mL 83.07±5.20 117.79±7.30<sup>**</sup> 107.51±6.86<sup>#</sup>
IFN-γ,pg/mL 49.61±5.33 77.37±9.97<sup>**</sup> 65.15±7.65<sup>#</sup>
IL-10,pg/mL 55.74±5.24 38.70±3.74** 53.79±4.72##
注：正常组与造模组相比：p＜0.05标记*，p＜0.01标记**；试验组与造模组相比：p＜0.05 标记#，p＜0.01标记##。
组织病理学切片结果显示，试验组的小鼠肠绒毛更完整、炎症水平更低(见图1)，综上，实施例1的羊肚菌提取物达到干预小鼠结肠炎的最佳功效。
Shannon指数和Simpson指数用于反映群落的多样性，包括物种丰度和物种均匀度，指数越大，说明物种多样性越高。肠道菌群结果显示(表2)，造模组肠道菌群多样性降低，与正常组相比结构失衡，试验组肠道菌群的生物多样性显著回升。表明实施例1的羊肚菌提取物能够通过调节肠道菌群的多样性，达到缓解结肠炎的作用。
表2小鼠结肠细菌群落多样性的影响
Figure BDA0003191138500000121
注：正常组与造模组相比：p＜0.05标记*，p＜0.01标记**；试验组与造模组相比：p＜0.05 标记#，p＜0.01标记##。
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (17)

1.一种具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取羊肚菌子实体，粉碎，按照羊肚菌子实体粉与乙醇溶液的质量体积比为1g：(10-50)mL的料液比投加质量浓度为60-90％的乙醇溶液，在60℃-80℃温度下，加热回流提取次数为2-5次，每次提取1-10h，过滤，收集并合并滤液，浓缩，4-10℃、6000-8000rpm/min下离心10-20min，得上清液；
(2)将上清液送入离子交换树脂柱中进行分离，所述离子交换树脂柱为D101树脂柱、NKA树脂柱、X-5树脂柱中的任一种或其组合，所述树脂柱的高径比为(3-10):1，树脂柱的工作温度为20-25℃；上清液送入离子交换树脂柱的上样流速为0.5-3mL/min，再用洗脱溶剂对离子交换树脂柱进行洗脱，所述洗脱溶剂为浓度为20％-80％的乙醇溶液，洗脱溶剂用量为3-5倍树脂柱体积，洗脱溶剂送入离子交换树脂柱的洗脱流速为0.5-3mL/min，收集洗脱液；
(3)将洗脱液浓缩，干燥，得到羊肚菌提取物,所述提取物中黄酮的重量百分含量不低于50％。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粉碎为，粉碎后的羊肚菌子实体粉过10-50目筛。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述料液比为1g:(20-30)mL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取时间为3-6h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤为纱布过滤、离心过滤中的任一种。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述浓缩选自真空浓缩、减压浓缩、薄膜浓缩、常压浓缩的任一种。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述浓缩为，浓缩至滤液总体积的20％～50％。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述树脂柱的高径比为(6-8):1。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，上清液送入离子交换树脂柱的上样流速为1-2mL/min。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗脱溶剂送入离子交换树脂柱的洗脱流速为1-2mL/min。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述洗脱步骤为，用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为20％或50％或80％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述洗脱步骤为，先用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为20％的乙醇溶液进行洗脱，洗脱液弃用，再用3-5倍树脂柱体积、质量浓度为50％的乙醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述浓缩为，在40-60℃水浴下减压浓缩为原洗脱液体积的1/50-1/10。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干燥选自真空干燥、减压干燥、常压干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、气流干燥的任一种。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述提取物中黄酮的重量百分含量不低于60％。
16.如权利要求1-15任一项所述的方法制备得到的具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物。
17.如权利要求1-15任一项所述的方法制备得到的具有防治结肠炎功效的羊肚菌提取物或权利要求16所述的羊肚菌提取物用于制备防治结肠炎制品中的应用。
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