CN113439211B - 通过使亚硝酸盐或固态酸性试剂浸渗于疏水性材料而能够控制样本展开的用于提取并测定糖链抗原的免疫层析试验片 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于提供用于控制免疫层析试验片上的样本的展开，适当控制通过酸性试剂、亚硝酸盐和中和试剂的处理的免疫层析试验片及使用该试验片的免疫层析方法。一种免疫层析试验片，其特征在于，用于提取样本中的糖链抗原而进行测定，包含：用于添加与亚硝酸盐或酸性溶液混合而得的样本的样品垫、包含标识了对于糖链抗原的抗体的标识抗体的标识体区域以及将对于所述糖链抗原的抗体进行了固相化的检测区域，在检测区域形成抗体‑糖链抗原‑标识抗体的复合体，并测定糖链抗原，在所述标识体区域的上游具有浸渗有中和试剂的区域，进而在浸渗有该中和试剂的区域的上游，在使用与亚硝酸盐混合而得的样本时具有浸渗有固态酸性试剂的区域，在使用与酸性溶液混合而得的样本时具有浸渗有亚硝酸盐的区域，在浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的区域使用疏水性的材料。

Description

通过使亚硝酸盐或固态酸性试剂浸渗于疏水性材料而能够控 制样本展开的用于提取并测定糖链抗原的免疫层析试验片

技术领域

本发明涉及能够在免疫层析试验片上进行糖链抗原的亚硝酸提取处理的用于提取并测定糖链抗原的免疫层析试验片。

背景技术

以免疫层析法为原理的快速诊断药的大部分作为快速、简便地测定病毒或细菌感染症、确定治疗方针的一个手段而广泛使用。

一般的以免疫层析法为原理的快速诊断药是使样本悬浮于样本悬浮液后，通过将该悬浮液供给至免疫层析试验片，能够快速、简便地进行测定。

为了检测A群β溶血性链球菌(A群β溶连菌)、口腔内链球菌等属于链球菌属的微生物，有必要提取糖链抗原，并测定糖链抗原。

例如，报告了通过预先使亚硝酸钠和中和试剂包含于免疫层析试验片，仅通过将样本悬浮于乙酸等酸性溶液而供给至免疫层析试验片的操作，即可在免疫层析试验片上进行亚硝酸提取处理的方法(专利文献1)。

另外，还有预先使酸性试剂和中和试剂包含于免疫层析试验片，将样本悬浮于亚硝酸盐而供给至免疫层析试验片的方法。

进而，报告了在免疫层析试验片上有效地进行糖链抗原的亚硝酸提取处理的方法(专利文献2～4)。

但是，在使用在设备上提取的机构时，为了达成作为目标的性能，需要在设备上保证一定的提取时间。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开WO2005/121794号公报

专利文献2：日本特开2018-151329号公报

专利文献3：日本特开2018-151330号公报

专利文献4：日本特开2018-151331号公报

发明内容

发明要解决的技术问题

现在市售的以免疫层析法为原理的A群β溶连菌(Strep A)抗原检测试剂大部分采用使将亚硝酸盐溶液(R1)和酸溶液(R2)混合而产生的酸性亚硝酸通过免疫层析法用检测试剂(试验片)上的干燥状态的中和剂(R3)中和而反应的技术，但也已知通过将R1或者R2涂布于垫，省略了R1和R2的必需制备及提取工序的一步骤化的技术。在一步骤的A群β溶连菌抗原检测试剂中，在测试设备上进行提取工序，因此在样品滴下后，必须保证一定的提取时间。但是，在使用在设备上提取的机构时，为了达成作为目标的性能，必须在设备上保证一定的提取时间。为了保证一定的提取时间，浸渗的垫能够使用具有亲水性、具有厚度的材料，但由于样本的粘性，能够保持的时间产生差别，难以控制。另外，通过在疏水性高的垫上保持试样能够确保提取时间，但仍然由于样本的粘性，提取时间产生差别，存在样本一直不展开、在5分钟的判定时间内液体不能展开完全的问题。

本发明的目的在于，提供用于控制样本在免疫层析试验片上的展开，适当控制基于酸性试剂、亚硝酸盐和中和试剂的处理的免疫层析试验片及使用该试验片的免疫层析方法。

用于解决技术问题的技术方案

本发明的发明人等对控制样本在免疫层析试验片上的展开，适当控制基于酸性试剂、亚硝酸盐和中和试剂的处理的方法进行了深入研究。

其结果发现，通过用于浸渗固态酸性试剂或亚硝酸盐的材料使用具有疏水性的材料，从而使反应时间提高。

还发现，通过调节涂布于材料的表面活性剂的浓度，能够控制最适的亚硝酸提取时间，能够调节信号的强度。

即，本发明如下。

[1]一种免疫层析试验片，其特征在于，用于提取样本中的糖链抗原而进行测定，包含：样品垫，添加与亚硝酸盐或酸性溶液混合的样本；标识体区域，包含标识了对于糖链抗原的抗体的标识抗体；以及，检测区域，将对于所述糖链抗原抗体固相化；在检测区域使抗体-糖链抗原-标识抗体的复合体形成，测定糖链抗原，在所述标识体区域的上游具有浸渗有中和试剂的区域，进而在浸渗有该中和试剂的区域的上游，在使用与亚硝酸盐混合而得的样本时具有浸渗有固态酸性试剂的区域，在使用与酸性溶液混合而得的样本时具有浸渗有亚硝酸盐浸渗的区域，

在浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的区域使用疏水性材料。

[2]根据[1]的免疫层析试验片，在浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的疏水性材料使表面活性剂浸渗。

[3]根据[2]的免疫层析试验片，表面活性剂是聚氧乙烯辛基苯基醚。

[4]根据[3]的免疫层析试验片，聚氧乙烯辛基苯基醚是Triton X-100。

[5]根据[1]～[4]的任一者的免疫层析试验片，浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的具有疏水性的材料从由聚酯、聚乙烯、嫘萦、尼龙及这些的任两种以上的混合物组成的组选择。

[6]根据[1]～[5]的任一者的免疫层析试验片，在样品垫上存在浸渗有固态酸性试剂或者亚硝酸盐的区域。

[7]根据[1]～[6]的任一者的免疫层析试验片，固态酸性试剂从由丙二酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸及酒石酸组成的组选择。

[8]根据[1]～[7]的任一者的免疫层析试验片，中和试剂是三羟甲基氨基甲烷或氢氧化钠。

[9]根据[1]～[8]的任一者的免疫层析试验片，糖链抗原是原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体、衣原体或病毒的糖链抗原。

[10]一种免疫层析试验试剂盒，包含[1]～[9]的任一者的免疫层析试验片和亚硝酸盐溶液或者酸性溶液。

[11]一种方法，使用[1]～[10]的任一者的免疫层析试验片通过免疫层析法测定样本中的糖链抗原，

包括：在免疫层析试验片具有浸渗有固态酸性试剂的区域时将样本与亚硝酸溶液混合，在免疫层析试验片具有浸渗有亚硝酸盐的区域时将样本与酸性溶液混合，添加至所述免疫层析试验片的样品垫，

在浸渗有固态酸性试剂浸渗的区域或使亚硝酸盐的区域，通过亚硝酸盐和固态酸性试剂的反应产生的亚硝酸的作用从样本提取出糖链抗原，

在浸渗有中和试剂的区域，中和包含所述糖链抗原的酸性溶液，

在检测区域，形成抗体-糖链抗原-标识抗体的复合体，通过免疫层析法，控制在免疫层析试验片上的样本的展开速度和或展开方向，控制通过酸性试剂和亚硝酸盐和中和试剂的处理，测定样本中的糖链抗原。

本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2019-012974号的公开内容。

发明效果

在一步骤的A群β溶连菌抗原检测试剂中，作为用于浸渗亚硝酸盐或固态的酸性试剂的材料使用疏水性材料时，通过调节表面活性剂浓度，能够将基于固态酸性试剂和亚硝酸盐的处理所需的时间调节为最适的时间，作为结果，提供能够发挥目标的性能(线显色时间早，灵敏度高)的免疫层析试验片。

附图说明

图1是示意性示出具有固态酸性试剂区域及中和试剂区域的免疫层析试验片中固态酸性试剂区域兼作样品垫的免疫层析试验片(两片垫试验片)的结构的图。

图2是示意性示出具有固态酸性试剂区域及中和试剂区域的免疫层析试验片中固态酸性试剂区域及中和试剂区域兼作样品垫的免疫层析试验片(一片垫试验片)的结构的图。

图3是示意性示出具有固态酸性试剂区域及中和试剂区域的免疫层析试验片中固态酸性试剂区域兼作中和试剂区域而样品垫单独存在的免疫层析试验片(两片垫试验片)的结构的图。

图4是示意性示出PET片贴附于固态酸性试剂区域和中和试剂区域之间、具有固态酸性试剂区域及中和试剂区域的免疫层析试验片的结构的图。

图5是示意性示出PET片贴附于固态酸性试剂区域和中和试剂区域之间、具有固态酸性试剂区域及中和试剂区域的免疫层析试验片的结构的图，是示出各部分之间的距离的图。

具体实施方式

以下详细地说明本发明。

本发明涉及简便化糖链抗原的亚硝酸提取处理以使其能够在免疫层析试验片上进行，能够快速且正确地测定作为被检测物质的糖链抗原的免疫层析试验片或包含该免疫层析试验片和亚硝酸溶液或酸性溶液的试剂盒。

免疫层析试验片具备：具有固定了捕捉被检测物质(抗原等)的抗体(抗体1)的检测区域的支承体、具有可移动的标识抗体(抗体2)的标识体区域、用于添加样本的样品垫、吸收展开的样本液的吸收带、用于将这些部件贴合成一者的底衬片等。

本发明的免疫层析试验片可以存放于存放容器内，通过该存放容器能够防止例如紫外线、空气中的湿气引起的劣化。另外，在使用具有污染性、感染性的样本试样的情况下，能够通过存放容器防止进行分析的试验者受到污染或感染。例如将适当大小的树脂制盒作为存放容器使用，在该盒中收纳本发明的装置即可。另外，也可以将固定了抗原或抗体的试验片的表面由树脂制膜等(PET片)覆盖。有时将存放容器和收纳于其中的试验片统称为免疫层析装置。

需要说明的是，检测区域的数量及标识体区域所包含的标识抗体的种类不限定于一种，通过使用多个与被检测物质对应的抗体，能够在同一试验片测定两个以上的抗原。

支承体是具有固定用于捕捉被检测物质(抗原)的抗体的性能的材料，且具有不妨碍液体向水平方向通行的性能。优选具有毛细管作用的多孔性薄膜(膜片)，通过吸收液体及其中分散的成分而能够输送的材料。形成支承体的材质不是特别限定的物质，例如可以列举纤维素、硝化纤维素、纤维素乙酸酯、聚偏二氟乙烯(PVDF)、玻璃纤维、尼龙、聚酮等。其中优选使用硝化纤维素作为薄膜或膜片的物质。将固定了抗体的膜片称为抗体固定化膜片。

标识体区域由包含标识抗体的多孔性基材形成，基材的材质能够使用一般所使用的玻璃纤维(glass fiber)、无纺布等。该基材使大量的标识抗体浸渗，因此优选厚度0.3mm～0.6mm左右的垫状。将浸渗有标识抗体并干燥后的多孔性基材也称为干燥垫。

标识抗体的标识中大多使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶之类的酶、金胶体之类的金属胶体、二氧化硅粒子、纤维素粒子、磁性粒子、荧光粒子、染色聚苯乙烯粒子及染色乳胶粒子等。在使用金属胶体粒子、染色聚苯乙烯粒子、染色乳胶粒子等染色粒子的情况下，通过这些标识试剂凝聚而发生染色，测定该染色。将固定了抗体的粒子称为抗体固定化粒子。

检测区域是指固定了捕捉被检测物质(抗原)的抗体的支承体的一部分的区域。检测区域至少设置一个固定了用于捕捉抗原的抗体的区域。检测区域包含于支承体即可，支承体上固定抗体即可。

样品垫是用于添加样本的部位，是多孔性材料。样品垫是位于免疫层析试验片的最上游的部位。该材料中能够使用一般所使用的滤纸、玻璃纤维、无纺布等。为了用于免疫测定大量的样本，优选是厚度0.3mm～1mm左右的垫状。样本中还包含将样本悬浮于其他溶液而得到的试样等使用样本而制备的试样。

吸收带是用于吸收供给至支承体且在检测区域未参与反应的成分。材料中能够使用由一般的天然高分子化合物、合成高分子化合物等形成的保水性高的滤纸、海绵等，但为了促进样本的展开，优选吸水性高的物质。

底衬片是用于将前述的所有的材料、即支承体、样品垫、标识体区域、吸收带等部分重叠地贴附、固定的部件。只要将这些材料以最适的间隔配置、固定，底衬片也不是必须的，但从制造上或使用上的便利性出发，一般优选使用。

本发明的免疫层析试验片中，进而可以存在对照显示区域(部件)。对照显示区域是示出试验正确实施的部位。例如，对照显示区域存在于检测区域的下游，样本试样通过检测区域，到达对照显示区域时通过染色等发出信号。在对照显示区域，可以固相化有与结合有标识载体的抗体进行结合的物质，也可以固相化有在样本到达时颜色发生变化的pH指示剂等试剂。在结合有标识载体的抗体是小鼠单克隆抗体的情况下，可以使用抗小鼠IgG抗体。

免疫层析试验片的大小未限定，例如是纵向长度数cm～十数cm、横向长度数mm～数cm左右。

在上述形态的试验片中，样本通过由样品垫、标识体区域、支承体、检测区域、吸收带等一系列的连接而形成的多孔性流路。因此，在本形态中，这些均成为样本移动区域。通过各构成材料的材质、形态，能够具有样本不渗透材料内部地在表面通行的形态，但本说明书中定义的样本移动区域与材料的内部或表面无关，因此该形态的试验片也包含于本说明书的范围。

在使用本发明的免疫层析试验片测定样本中的糖链抗原的情况下，首先需要提取样本中的糖链抗原。糖链抗原的提取由将包含糖链抗原的样本通过亚硝酸处理而进行。亚硝酸能够通过将亚硝酸钠等亚硝酸盐与酸混合而产生，由这样操作而产生的亚硝酸处理包含糖链抗原的样本即可。提取的抗原与在免疫层析试验片上固相化的抗体通过抗原抗体反应而结合，此时，反应系中残留酸时，反应系显酸性，阻碍抗原抗体反应。因此，有必要中和反应系的酸。

本发明中，在亚硝酸盐和酸混合产生亚硝酸，通过该亚硝酸提取样本中的糖链抗原并中和酸后，使糖链抗原与在免疫层析试验片上固相化的抗体结合并测定糖链抗原，在这样的方法中，作为提取糖链抗原而进行测定的方法可以列举以下的方法。在任意方法中，通过亚硝酸的糖链抗原的提取和中和均在免疫层析试验片上进行。为了将通过亚硝酸的糖链抗原的提取在免疫层析试验片上进行，只要预先使免疫层析试验片上包含酸性试剂或亚硝酸盐即可。为了将中和在免疫层析试验片上进行，只要预先使免疫层析试验片上浸渗中和试剂即可。

(A)预先将样本和酸性溶液混合，添加至使亚硝酸盐和中和试剂浸渗的免疫层析试验片的样品垫。混合液到达浸渗有亚硝酸盐的区域时，亚硝酸盐与酸反应，产生亚硝酸，提取样本中的糖链抗原。在免疫层析试验片上的浸渗有中和试剂的区域中和糖链抗原的提取液，糖链抗原与在免疫层析试验片上固相化的抗体结合而能够检测。在该方法中，作为使用的酸性溶液，可以列举乙酸、盐酸、丙二酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸等。

(B)预先将样本和亚硝酸盐溶液混合，添加浸渗有酸性试剂和中和试剂的免疫层析试验片的样品垫。混合液到达浸渗有酸性试剂的区域时，亚硝酸盐与酸反应，产生亚硝酸，提取样本中的糖链抗原。在免疫层析试验片上的浸渗有中和试剂的区域中和糖链抗原的提取液，糖链抗原与在免疫层析试验片上固相化的抗体结合而能够检测。

在为了进行上述的(A)或(B)的方法的本发明的免疫层析试验片中，在比标识体区域更上游(样本流动的上游，存在样品垫一侧)、即样品垫内或样品垫和标识体区域之间浸渗有亚硝酸盐的免疫层析试验片能够用于上述(A)的方法。另外，在样品垫内或样品垫和标识体区域之间浸渗有酸性试剂的免疫层析试验片能够用于上述(B)的方法。需要说明的是，作为酸性试剂，能够使用固态酸性试剂。通过这些方法，无论将受检试样中的被检测物质供给至受检试样的试验的量，均能够正确地进行特异性测定。

将浸渗了固态酸性试剂的区域称为固态酸性试剂区域，将浸渗了酸性试剂的区域称为酸性试剂区域，将浸渗了中和试剂的区域称为中和试剂区域。

就所述固态酸性试剂或亚硝酸盐而言，可以使其浸渗于样品垫，也可以使其浸渗于样品垫以外的其他由无纺布等多孔性材料形成的垫，可以将得到的浸渗有固态酸性试剂的多孔性材料或浸渗有亚硝酸盐的多孔性材料配置于样品垫和标识体区域之间、即标识体区域的上游侧。在此，浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域和样品垫或标识体区域既可以接触，也可以不接触。在本发明中，也将浸渗有试剂浸渗的区域称为浸渗有试剂的垫。

所述中和试剂配置于比浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域更下游处。就中和试剂而言，可以使其浸渗于支承体，也可以使其浸渗于支承体以外的其他由无纺布等多孔性材料形成的垫，可以将得到的浸渗有中和试剂的多孔性材料配置于浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域和标识体区域之间。即在标识体区域的上游具有浸渗有中和试剂的区域，进而在使该中和试剂浸渗的区域的上游具有浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域。

在此，浸渗有中和试剂的区域和浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域或标识体区域既可以接触，也可以不接触。

作为浸渗有固态酸性试剂或亚硝酸盐的区域的多孔性材料的材料，使用具有疏水性的材料。具体而言可以列举由聚酯形成的无纺布、由聚乙烯形成的无纺布等、由嫘萦形成的无纺布等、由尼龙形成的无纺布等或作为这些的任两种以上的具有疏水性的材料的混合物的无纺布等、或者作为这些的任两种以上的具有疏水性的材料和具有亲水性的材料的混合物的无纺布。

另外，具有疏水性的材料优选浸渗有表面活性剂的物质。表面活性剂未限定，能够使用非离子系表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂的任一者。具体而言，可以列举Triton X-100、Triton X-114等聚氧乙烯辛基苯基醚；苯扎氯铵、苄索氯铵等季铵化合物；Tween 20、Tween 80等聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯；Brij-35、Brij-58等聚氧乙烯烷基醚；胆酸钠、去氧胆酸等具有类固醇骨架的胆酸系；十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠等阴离子系表面活性剂等表面活性剂。其中，优选Triton X-100、Triton X-114等聚氧乙烯辛基苯基醚。就表面活性剂的浓度而言，根据种类，适宜浓度不同，过高时灵敏度降低(提取时间过短，灵敏度降低)，过低时看不到效果。在Triton X-100的情况下，0.1～2％时有效果，0.2～0.5％更佳。其中，该数值因每一次测试的涂布的量和表面活性剂的种类、涂布的材料的疏水度而不同。

作为用于使中和试剂浸渗的区域的多孔性材料的材料，具体而言，可以列举由纤维素的棉纤维形成的滤纸、由玻璃纤维形成的玻璃滤纸等。

具有固态酸性试剂区域或者亚硝酸盐区域和中和试剂区域的免疫层析试验片在支承体上从上游具有样品垫、固态酸性试剂区域或者亚硝酸盐区域、中和试剂区域、标识体区域、检测区域及吸收带，可以在样品垫上具有固态酸性试剂区域或亚硝酸盐区域。另外，就样品垫、固态酸性试剂区域或者亚硝酸盐区域、中和试剂区域、标识体区域、检测区域及吸收带而言，相邻的区域相互可以接触，也可以不接触。

本发明中使用的固态酸性试剂在常温是固态的物质，在高温不挥发的物质。

作为本发明所使用的优选的固态酸性试剂，可以列举丙二酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸、酒石酸。

另外，作为本发明中使用的优选的固态酸性试剂，只要使用例如柠檬酸之类的价数多的酸，即可以以更少量进行提取。另外，如果价数相同，则酸解离常数更小的酸、例如马来酸、酒石酸效率好。

另外，作为本发明中使用的优选的固态酸性试剂，在免疫层析试验片上不会被染色的试剂，具体而言，优选在干燥状态是白色或在干燥热、氧化下难以染色的试剂。

作为本发明中使用的亚硝酸盐，可以列举亚硝酸钠、亚硝酸钾等。

本发明所使用的固态酸性试剂或亚硝酸盐的使用量、即向免疫层析试验片浸渗的量没有特别限定，通常，免疫层析试验片的每一片试验片是0.01μg～1mg左右，优选是0.1μg～0.1mg左右。最优选根据使用的固态酸性试剂或亚硝酸盐的种类、样本悬浮液的组成及添加量等选择能够得到效果的最适的量。

为了使固态酸性试剂或亚硝酸盐浸渗于样品垫或多孔性材料，先使固态酸性试剂或亚硝酸盐溶解，涂布并使其干燥。例如，只要涂布并干燥0.1～数M的固态酸性试剂或亚硝酸盐溶液即可。

本发明所使用的中和试剂是在常温是固态的物质，在高温不挥发的物质。也将中和试剂称为碱性试剂。

作为本发明所使用的优选的中和试剂，可以列举Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)、氢氧化钠、磷酸氢二钾、柠檬酸三钠、在碱区域具有缓冲能力的古德氏缓冲液。

本发明所使用的中和试剂的使用量、即在免疫层析试验片浸渗的量，没有特别限定，通常，免疫层析试验片的每一片试验片是0.01μg～1mg左右，优选是0.1μg～0.1mg左右。最优选根据使用的中和试剂的种类、样本悬浮液的组成、添加量等选择能够得到效果的最适的量。

为了使中和试剂浸渗于多孔性材料，先使中和试剂溶解，将溶液涂布于多孔性材料，之后使其干燥即可。例如，只要涂布并干燥0.1～数M，优选0.5～数M的中和试剂溶液即可。

图1～3是示出典型的免疫层析试验片的优选的一个方式的图。图1所示的免疫层析试验片是浸渗有固态酸性试剂及中和试剂的免疫层析试验片，但也可以代替固态酸性试剂而浸渗有亚硝酸盐，在该情况下，成为浸渗有亚硝酸盐及中和试剂的免疫层析试验片。即在以下的试验片的说明中，存在代替固态酸性试剂区域而设置亚硝酸盐试剂区域的情况。如果是本领域技术人员，就能够适宜地设计并制造浸渗有亚硝酸盐及中和试剂的免疫层析试验片。需要说明的是，免疫层析试验片不是限定于图1～3所示的物质。图1中，1是指支承体，2是指标识体区域，3是指检测区域，7是指吸收带，8是指底衬片。

图1及2示出固态酸性试剂区域5兼作样品垫10的试验片。图1A是俯视图，图1B是剖切剖视图。在图1的例中，在标识体区域2的上游存在固态酸性试剂区域5和/或中和试剂区域6，它们重叠，由此形成连续的侧流层析的流路。在图1所示的试验片中，固态酸性试剂区域5兼作样品垫10。即固态酸性试剂区域5存在于样品垫10上。在该试验片上，固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6分别设于两片多孔性材料(垫)上，因此有时称为两片垫试验片。在固态酸性试剂区域的上游进而可以存在样品垫。固态酸性试剂区域和样品垫可以分别存在。

就图2的试验片而言，样品垫10兼作固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6，固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6存在于样品垫10上。图2A是俯视图，图2B是剖切剖视图，图2C示出中和试剂区域6与固态酸性试剂区域5或者亚硝酸试剂区域的位置关系。在该试验片上，固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6设于一片多孔性材料(垫)上，因此有时称为一片垫试验片。

就图3的试验片而言，样品垫10与固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6分别存在，固态酸性试剂区域5兼作中和试剂区域6，样品垫单独存在。样品垫10中未浸渗试剂，仅作为样品垫发挥功能。图3A是俯视图，图3B是剖切剖视图，图3C示出中和试剂区域6和固态酸性试剂区域5或者亚硝酸试剂区域的位置关系。就图3的试验片而言，兼作固态酸性试剂区域及中和试剂区域的多孔性材料(垫)和样品垫设于作为分别的两片多孔性材料(垫)，因此能够称为两片垫试验片。图中虽未示出，样品垫10、固态酸性试剂区域5及中和试剂区域6的三者可以分别存在。

测定通过使样本或使用样本而制备的试样与亚硝酸盐溶液接触混合，使样本悬浮于亚硝酸盐溶液，向样品垫10、兼作固态酸性试剂区域5的样品垫10、或兼作中和试剂区域6和固态酸性试剂区域5的样品垫10添加供给来开始。此时，将样本5～100μL和0.1M～8M的亚硝酸盐0.01～2mL混合，将5～200μL供给至样品垫10、兼作固态酸性试剂区域5的样品垫10、或兼作中和试剂区域6和固态酸性试剂区域5的样品垫10即可。作为亚硝酸盐，可以列举亚硝酸钠、亚硝酸钾等。

供给至样品垫10、兼作固态酸性试剂区域5的样品垫10、或兼作中和试剂区域6和固态酸性试剂区域5的样品垫10的包含作为被检测物质的糖链抗原的样本通过毛细管作用，向样品垫10、兼作固态酸性试剂区域5的样品垫10、或者兼作中和试剂区域6和固态酸性试剂区域5的样品垫10及中和试剂区域6展开。此时，在固态酸性试剂区域5和中和试剂区域6之间，存在作为PET片的顶部层压片。由此，能够抑制样本从固态酸性试剂区域5向中和试剂区域6的流动，且能够防止暂时进入了中和试剂区域6的样本逆流至固态酸性试剂区域5。接下来，样本依次向标识体区域2、支承体1、吸收带7向水平方向展开。在固态酸性试剂区域5，混合于样本的亚硝酸盐与固态酸性试剂区域5上的固态酸性试剂反应，产生游离的亚硝酸，通过该亚硝酸的作用，从样本提取糖链抗原。提取的糖链抗原与酸性的展开溶液一起向中和试剂区域6展开移动，在中和试剂区域6中和包含糖链抗原的酸性的展开溶液的pH，调整至中性区域。其结果，糖链抗原在中性条件下进而向下游展开移动。在标识体区域2，在样本试样的展开的同时，标识抗体放出至液体中，向支承体1展开。在样本试样中存在糖链抗原的情况下，在支承体1的检测区域3通过捕捉抗体特异性地捕捉糖链抗原，此外，糖链抗原也与标识抗体通过特异性反应形成复合体。由此，在检测区域3实现经由糖链抗原的抗体的夹心体，能够在检测区域3测定标识抗体-糖链抗原复合物。

根据使用本发明的免疫层析试验片的方法，样本中的糖链抗原的提取能够在免疫层析试验片上进行，因此在使用免疫层析试验片的测定之前无需预先提取样本中的糖链抗原，能够通过一步骤测定样本中的糖链抗原。

在使用本发明的免疫层析试验片的方法中，成为样本的生物体试样没有特别限定，可以列举血清、血浆、血液、尿、粪便、唾液、组织液、脑脊液、擦拭液等体液等或其稀释物。

在使用本发明的免疫层析试验片的方法中，成为测定对象的被检测物质是通过利用免疫分析、即抗原抗体反应的分析能够测定的糖链抗原。作为抗原，可以列举通过亚硝酸提取处理而能够提取的存在于细菌的细胞壁的作为糖链抗原的多糖体等。也能够测定包含这些物质的原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体、衣原体、病毒等。通过使用本发明的免疫层析试验片的方法，能够确认受试体的生物体试样中是否包含来自于原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体、衣原体、病毒等的糖链抗原，在包含糖链抗原的情况下，能够判断受试体罹患原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体、衣原体、病毒等引起的感染症。例如，能够检测有无A群β溶血性链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌、军团菌、弯曲杆菌等的感染。

使用本发明的免疫层析试验片的方法不限于使亚硝酸盐或酸性试剂和中和试剂浸渗于免疫层析试验片的情况，也能够在免疫层析试验片上浸渗有多个、即2个至n个效果不同的应避免保存中发生反应的试剂时利用。

实施例

通过以下的实施例对本发明进行具体地说明，但本发明不是由这些实施例限定的发明。

在以下的实施例中，除非另有说明，％表示重量体积比(w/v％)。

实施例1

A群溶连菌连链球菌测定免疫层析试验片的例

作为亚硝酸盐、固态酸性试剂及中和试剂使用以下的物质。

亚硝酸盐(液状试剂)2.0M亚硝酸钠

固态酸性试剂(浸渗于免疫层析试验片)500mM柠檬酸、0.0～2.5％TritonX-100

中和试剂(浸渗于免疫层析试验片)3.0MTris盐酸盐(Trizma BASE)

1.抗Streptococcus pyogenes(A群β溶血性链球菌)抗体在硝化纤维素膜片(支承体)上的固定化

准备抗A群β溶血性链球菌抗体的稀释液及抗兔IgG抗体，分别在内衬PET膜的硝化纤维素膜片的样品垫侧线状地涂布抗A群β溶血性链球菌抗体，在吸收带侧线状地涂布抗兔IgG抗体。之后，使硝化纤维素膜片干燥，得到抗A群β溶血性链球菌抗体固定化膜片。在本实施例中将该膜片称为“抗体固定化膜片”。

2.抗A群β溶血性链球菌抗体在染色聚苯乙烯粒子上的固定化

向抗A群β溶血性链球菌抗体稀释液加入染色聚苯乙烯粒子，搅拌后，加入碳二亚胺，进而搅拌。通过离心操作去除上清，再悬浮于缓冲液，得到抗A群β溶血性链球菌抗体结合染色聚苯乙烯粒子悬浮液。在本实施例中将该粒子称为“抗体固定化粒子(染色聚苯乙烯)”。

3.抗A群β溶血性链球菌抗体结合染色聚苯乙烯粒子的涂布、干燥

将2中制作的抗体固定化染色聚苯乙烯粒子悬浮液以规定量涂布于无纺布，使其干燥。在本实施例中将得到的无纺布称为“C.Pad”。

4.中和试剂(碱性试剂)的涂布

将上述的中和试剂(碱性试剂)涂布于滤纸。

5.固态酸性试剂浸渗垫的制作

将上述的固态酸性试剂涂布至具有疏水性的材料的无纺布(聚酯、聚乙烯混合)。涂布后立刻干燥，得到作为固态酸性试剂浸渗区域的固态酸性试剂浸渗垫。

6.A群β溶血性链球菌检测用免疫层析试验片的制作

在条状的底衬片，首先将抗体固定化膜片(支承体)贴附于距离下游20mm的部分。

在膜片的下游，贴附用于使液体吸收的吸收带。

在膜片的上游，使与膜片之间具有2mm的重叠的方式，贴附涂布了抗体结合染色聚苯乙烯粒子的10mm宽的玻璃纤维(C.Pad)。

使C.Pad和浸渗有中和试剂的垫的重叠成为4mm的方式，贴附浸渗有中和试剂的垫(浸渗有中和试剂的区域)。

以与免疫层析试验片的上部对齐的方式贴附作为PET片的顶部层压片(60mm)。

最后，在浸渗有中和试剂的垫之上，将浸渗有固态酸性试剂的垫(浸渗有固态酸性试剂的区域)以顶部层压片介于它们之间、并且浸渗有固态酸性试剂的垫与浸渗有中和试剂的垫接触的方式，与免疫层析试验片的上游(下端)对齐而贴附。

将这样操作而制作的免疫层析试验片的结构示于图4。另外，在图5的模式图一同示出各部分之间的距离(mm)。需要说明的是，在图4及图5中，浸渗有固态酸性试剂的垫和浸渗有中和试剂的垫表示为即使在两垫之间不存在顶部层压的部位也不接触而分离，但实际上，在没有顶部层压的部分两垫接触。

能够得到固态酸性试剂的Triton X-100的浓度是(1)0.0％、(2)0.1％、(3)0.2％、(4)0.5％、(5)1.0％、(6)1.5％、(7)2.0％、(8)2.5％的免疫层析试验片。

实施例2

向实施例1制作的免疫层析试验片滴加75μL悬浮了10⁵cfc/mL的A群β溶血性链球菌的2M亚硝酸Na溶液成倍稀释至2倍的样本，观察经过。

在表面活性剂的浓度越高的条件下，直到展开开始的时间(直到在判定窗口能看到试样的时间)缩短。

另外，通过(3)、(4)之类的表面活性剂的浓度，通过亚硝酸控制糖链抗原的提取时间，能够调节每个展开时间的信号的强度(表1)。

[表1]

ND；不能确定(对照线无显色，因此不能判定)

符号说明

1 支承体(包含检测区域)

2 标识体区域

3 检测区域

5 固态酸性试剂区域

6 中和试剂区域

7 吸收带

8 底衬片

9 顶部层压片

10 样品垫

工业可利用性

使用本发明的免疫层析设备能够正确地检测A群β溶血性链球菌的感染。

本说明书中引用的所有刊物、专利及专利申请通过原文引用合并入本说明书。

Claims (9)

1.一种免疫层析试验片，其特征在于，用于提取样本中的糖链抗原并进行测定，该免疫层析试验片包含：

样品垫，用于添加与亚硝酸盐或酸性溶液混合而得的样本；

标识体区域，包含标识了对于糖链抗原的抗体的标识抗体；以及，

检测区域，将对于所述糖链抗原的抗体进行了固相化，

在检测区域形成抗体-糖链抗原-标识抗体的复合体，并测定糖链抗原，

在所述标识体区域的上游具有浸渗有中和试剂的区域，进而在浸渗有该中和试剂的区域的上游，在使用与亚硝酸盐混合而得的样本时具有浸渗有固态酸性试剂的区域，在使用与酸性溶液混合而成的样本时具有使亚硝酸盐浸渗的区域，

在浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的区域使用作为疏水性材料的聚酯和聚乙烯混合而成的无纺布，进而使该材料浸渗以w/v计0.2％～0.5％的聚氧乙烯辛基苯基醚。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试验片，其中，

聚氧乙烯辛基苯基醚是Triton X-100。

3.根据权利要求1或2所述的免疫层析试验片，其中，

浸渗有亚硝酸盐或固态酸性试剂的具有疏水性材料从由聚酯、聚乙烯、嫘萦、尼龙及它们中的任两种以上的混合物组成的组中选择。

4.根据权利要求1或2所述的免疫层析试验片，其中，

在样品垫上存在浸渗有固态酸性试剂或者亚硝酸盐的区域。

5.根据权利要求1或2所述的免疫层析试验片，其中，

固态酸性试剂从由丙二酸、苹果酸、马来酸、柠檬酸及酒石酸组成的组中选择。

6.根据权利要求1或2所述的免疫层析试验片，其中，

中和试剂是三羟甲基氨基甲烷或氢氧化钠。

7.根据权利要求1或2所述的免疫层析试验片，其中，

糖链抗原是原生动物、真菌、细菌、支原体、立克次体、衣原体或病毒的糖链抗原。

8.一种免疫层析试验试剂盒，

包含权利要求1至7中任一项所述的免疫层析试验片和亚硝酸盐溶液或者酸性溶液。

9.一种测定样本中的糖链抗原的方法，

使用权利要求1至7中任一项所述的免疫层析试验片通过免疫层析法测定样本中的糖链抗原，

所述测定样本中的糖链抗原的方法包括：在免疫层析试验片具有浸渗有固态酸性试剂的区域时将样本与亚硝酸溶液混合，在免疫层析试验片具有浸渗有亚硝酸盐的区域时使样本与酸性溶液混合，并添加至所述免疫层析试验片的样品垫，

在浸渗有固态酸性试剂的区域或浸渗有亚硝酸盐的区域，通过由亚硝酸盐与固态酸性试剂的反应而产生的亚硝酸的作用从样本提取出糖链抗原，

在浸渗有中和试剂的区域，包含所述糖链抗原的酸性溶液被中和，

在检测区域，形成抗体-糖链抗原-标识抗体的复合体，

所述测定样本中的糖链抗原的方法通过免疫层析法控制样本在免疫层析试验片上的展开速度和/或展开方向，控制基于酸性试剂、亚硝酸盐和中和试剂的处理，并测定样本中的糖链抗原。