CN113430229B - 一种人源bav-taa疾病多能干细胞模型的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人源BAV‑TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，属于细胞模型技术领域；该构建方法包括以下步骤：对离体的BAV/TAA患者来源的血管组织进行体外培养，获得原代细胞；通过电转方法将含有重编程因子的附加体质粒导入所述原代血管细胞进行重编程，得到特异性iPSC细胞株；对所述特异性iPSC细胞株进行定向分化，得到人源BAV‑TAA疾病血管细胞模型。通过将体外分离的患者原代血管细胞重编程成为诱导多能干细胞，然后通过扩增并将其定向诱导分化，从而源源不断获得所需的细胞模型，为该疾病的研究提供大量特定细胞类型。

Description

一种人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型的构建方法
技术领域
本发明涉及细胞模型领域，特别是涉及一种人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型的构建方法。
背景技术
主动脉瓣二叶畸形(Bicuspid aortic valve，BAV)是一种常见的先天性心脏病，发病率为1-2％，常表现为胸主动脉瘤(TAA)，虽然之间的关系已经确立，但到目前为止，导致BAV-TAA的确切分子和细胞机制仍不完全清楚。流行病学研究表明，BAV-TAA的一些高危因素，包括年龄增加、糖尿病和高胆固醇血症、主动脉瓣关闭不全、吸烟以及遗传缺陷。据报道，BAV在家系中聚集，一些基因，如NOTCH1，GATA5，ROBO4突变与其相关。据报道，还有30多个基因突变与胸主动脉瘤有关。从BAV-TAA获得患者特异性iPSC可能为阐明BAV-TAA的分子机制提供一种新的体外人类细胞模型。迄今为止，关于BAV-TAA疾病发生的分子机制研究并不清楚，且存在很大争议。目前，胸主动脉瘤的研究主要在动物水平上进行，由于种属差异，动物模型与人类在各种生理系统上存在很大差异，很多研究结果不能直接应用于人类疾病。因此，如何建立一个“人源性”血管细胞模型对于BAV-TAA等心血管疾病的研究十分重要。
人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了革命性的技术，也为人类遗传性疾病的疾病模型机制研究提供了新手段和大量细胞来源。最初，2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸胎瘤生成能力、分化潜能等方面都与胚胎干细胞相似。2007年11月，Thompson实验室和Yamanaka实验室几乎同时报道，利用重编程技术同样可以诱导人皮肤纤维细胞成为几乎与胚胎干细胞完全一样的iPSCs。基于诱导多能干细胞的产生与运用，对细胞模型的构建提供了新途径，而目前还没有BAV-TAA疾病多能干细胞模型构建的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，以解决上述现有技术存在的问题，通过将体外分离的患者原代细胞重编程成为诱导多能干细胞，然后通过扩增并将其定向诱导分化，从而源源不断获得所需的细胞模型，为该疾病的研究提供大量特定细胞类型。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
对离体的BAV/TAA患者来源的血管组织进行体外培养，获得原代血管细胞；
通过电转方法将含有重编程因子的附加体质粒导入所述原代血管细胞进行重编程，得到特异性iPSC细胞株；
对所述特异性iPSC细胞株进行定向分化，得到人源BAV-TAA疾病血管细胞模型。
优选的是，所述原代血管细胞的获得包括以下步骤：
对获取的离体BAV-TAA患者主动脉组织块剪成约1mm3小块，并贴附于培养瓶，加入含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基，贴附组织块一面朝上培养一段时间后，翻转培养瓶，继续培养，至大量细胞长出，进一步扩增，得到原代血管细胞。
优选的是，所述血管细胞包括成纤维细胞和血管平滑肌细胞。
优选的是，所述特异性iPSC细胞株的获得包括以下步骤：
步骤1：待所述血管细胞培养至细胞密度80-90％时，消化成单个细胞，离心，取细胞沉淀；
步骤2：将含重编程因子的附加体质粒与电转液混合后，重悬所述细胞沉淀，然后进行电转；
步骤3：电转之后加入培养液重悬细胞，再将细胞悬液接种于含有10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基中，每天换液，直至培养细胞密度90％，进行细胞消化，并将消化后的细胞接种到混合液-1中，培养一天后，更换成所述混合液-2，待观察到特异性iPSC细胞株克隆时，更换成培养液，获得所述单克隆细胞；
步骤4：将所述单克隆细胞与周围原代血管细胞分离后，用所述培养基扩增培养，得到特异性iPSC细胞株。
优选的是，所述混合液-1包括：(hiPSC/hESC培养液+10ng/ml Human bFGF+0.25mMNaB):(DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基)体积比为1:1混合而成；
所述混合液-2包括：hiPSC/hESC培养液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM NaB；
所述培养液为：hiPSC/hESC培养液。
优选的是，所述重编程因子的附加体质粒包括含有重编程因子基因OCT4、KLF4、SOX2、Lin28、l-myc以及shP53的质粒。
优选的是，对所述特异性iPSC细胞株进行定向分化包括以下步骤：
S1：将所述特异性iPSC细胞株接种于所述培养液培养，得到待分化细胞；
S2：将所述待分化细胞在N2B27-1培养基中进行第一次分化培养，得到第一次分化后细胞；
S3：将所述第一次分化后细胞在N2B27-2培养基中进行第二次分化培养，得到第二次分化后细胞，即为人源BAV-TAA疾病多能干细胞来源的平滑肌细胞；
S4：将所述第一次分化后细胞在StemPro-34 SFM(1X)培养基中进行第二次分化培养，得到第三次分化后细胞，即为人源BAV-TAA疾病多能干细胞来源的内皮细胞模型。
优选的是，所述N2B27-1培养基包括：N2B27培养基+1μM CP21R7+25μg/ml BMP4；
所述N2B27-2培养基包括：N2B27培养基+10ng/ml PDGF-BB+2ng/ml Activin A；
所述StemPro-34 SFM(1X)培养基包括StemPro-34 SFM(1X)+200ng/ml的VEGF和2uM Forskolin；
其中，所述N2B27培养基中，DMEM-F12+神经细胞基础培养液(Neubrobasalmedium)各占总培养液量的48.5％，不包含维生素A的B27占总培养液总量的2％，N2占总培养液总量的1％。
本发明还提供根据所述的构建方法构建的人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型。
本发明还提供根据所述的构建方法或所述的人源BAV-TAA多能干细胞疾病模型在如下(a)或(b)中的应用：
(a)制备用于筛选治疗和/或预防BAV-TAA疾病的临床药物中的应用；
(b)研究BAV-TAA相关疾病的细胞分子机制中应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明建立的二叶式主动脉瓣畸形合并升主动脉瘤(BAV-TAA)特异性的iPSC疾病模型具有患者特异性的遗传背景，从而可更好的反应患者的病理状态和疾病的发生发展过程。
(2)目前iPSC的建立主要利用慢病毒(会整合到基因组中)、仙台病毒(制备方法难度较大)等，本研究利用附加体质粒电转方法将转录因子直接转入细胞。该种方法操作简便，节省时间，为BAV-TAA疾病细胞模型建立创造了良好的条件。
(3)本发明利用小分子化合物诱导的2D单层分化方法，操作简便，分化快捷与高效，可以源源不断获得所需的细胞模型，为BAV-TAA疾病的研究提供大量特定细胞类型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为BAV-TAA患者原代培养的主动脉血管细胞；A:BAV-TAA患者主动脉组织爬出的原代细胞形态；B:原代细胞传代培养的细胞形态；
图2为BAV-TAA患者原代培养的主动脉血管细胞重编程为iPSC；A:电转后Day6，部分细胞出现聚集样生长；B:电转后Day13，肉眼可见的小克隆出现；C:电转后Day15，小克隆逐渐长大；D:电转后Day17，中等大小的克隆；E:电转后Day19，高质量大克隆，可挑取克隆至培养板中扩增培养，P0代；F:培养板中的P1代克隆；
图3为BAV-TAA患者特异性iPSC多能性鉴定；A:碱性磷酸酶染色；B:染色体的核型分析；C:多能性基因免疫荧光染色；D:多能性基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳；E:多能性基因mRNA的RT-qPCR表达；OCT4，NANOG，SOX2，TRA-1-60，TRA-1-81为干细胞多能性基因，SMC:BAV-TAA病人原代细胞，H1ESC:人胚胎干细胞；F:拟胚体(embryonic body，EB)的形成；G:EB介导形成的中胚层细胞标记物α-SMA鉴定；H:EB介导形成的内胚层细胞标记物α-Fetoprotein鉴定；I:EB介导形成的外胚层细胞标记物TUJ1鉴定；
图4为BAV-TAA患者特异性iPSC存在ROBO4基因突变；
图5为BAV-TAA患者特异性iPSC诱导分化为内皮细胞；Day1:iPS细胞株接种后的第一天，未加分化液之前；Day2:iPSC细胞株接种后的第二天，加入第一次分化液后24h；Day3:iPS细胞株接种后的第三天，加入第一次分化液后48h；Day4:iPSC细胞株接种后的第四天，加入第一次分化液后72h；Day5:iPS细胞株接种后的第五天，加入第二次分化液后24h；Day6:iPS细胞株接种后的第六天，加入第二次分化液后48h；
图6为BAV-TAA患者特异性iPSC来源的内皮细胞标志基因表达；4,5,6,7代表在分化的第4，5，6，7天；A:内皮细胞特异性标记膜蛋白CD31的表达(血小板内皮细胞粘附分子)；B:血管内皮细胞钙黏连蛋白复合体VE-cadherin的表达；C:血管性假血友病因子vWF的表达；
图7为BAV-TAA患者特异性iPSC来源的内皮细胞标志蛋白的表达；A:内皮细胞的标记基因CD31的免疫荧光图；B:内皮细胞的标记基因VE-cadherin的免疫荧光图；
图8为BAV-TAA患者来源的特异性iPSC细胞株分化为血管平滑肌细胞；A:iPSC细胞株接种后的Day1，未加分化液之前；B:iPSC细胞株接种后的Day2，加入第一次分化液后24h；C:iPSC细胞株接种后的Day3，加入第一次分化液后48h；D:iPSC细胞株接种后的Day4，加入第一次分化液后72h；E:iPSC细胞株接种后的Day5，加入第二次分化液后24h；F:iPS细胞株接种后的Day6，加入第二次分化液后48h；
图9为BAV-TAA患者特异性iPSC来源的血管平滑肌细胞标志基因表达；4,5,6,7代表在分化的第4，5，6，7天；A：平滑肌细胞标记基因α-SMA表达鉴定；B:平滑肌细胞标记基因SM22α表达鉴定。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1一种人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
1)患者组织体外培养获得原代细胞
组织来源于温州医科大学第一附属医院一位56岁的女性，是主动脉瘤病变血管替换手术所获得，其被诊断为主动脉瓣膜二叶式畸形(BAV)，心脏瓣膜钙化，胸主动脉瘤(TAA)，冠状动脉粥样硬化。
将获得的BAV-TAA患者主动脉组织块用DPBS润洗，吸走DPBS，加入DMEM培养基，将组织块剪碎成约1mm3大小，贴附于培养瓶壁上，翻转培养瓶，加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于37℃、5％CO2培养箱2-3h后反转培养瓶，持续培养2-3天，而后每隔2天换液。当培养皿中原代细胞长满后获得P0代原代细胞(其形态如图1A)，冻存保种并传代扩增培养。
其中，上述DPBS为磷酸盐缓冲液，DMEM是本领域熟知的一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。FBS是胎牛血清，DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基中的百分比按体积比计算。
2)BAV-TAA病人特异性iPSC细胞株的建立
待原代细胞90％长满后(其形态如图1B)，用0.05％TE消化成单个细胞。离心并吸弃上清，将四种质粒(含有重编程因子基因OCT4、KLF4、SOX2、Lin28、l-myc及shP53，购自Addgene，#27077，#27078，#27080，#37624)与电转液(Lonza,#V4XP-3024)混合后重悬细胞沉淀，然后进行nucleofector电转,电转程序为FF-120。
电转之后加入培养液重悬细胞，将细胞悬液接种于DMEM+10％FBS+1％青链霉素的培养基，每天换液，第6天细胞的状态(图2A)，细胞密度约90％。第6天将细胞消化后的细胞数接种到预先铺有Matrigel的35mm培养皿上,选用配制的重编程培养液(NuwacellTM-ncEpic hiPSC/hESC培养液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM)与原代细胞培养液(DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基)＝1:1混合进行培养一天后，用配置的重编程培养液隔天换液，克隆长出后(图2B-C)用Nuwacell hiPSC/hESC medium-ncEpic(Nuwacell,#PR01001)培养液每天换液。克隆长大后(图2D-E)挑取克隆并进行扩增培养建立特异性iPSC细胞系。
其中，Matrigel为基底膜基质胶，NuwacellTM-ncEpic hiPSC/hESC培养液是产自中盛溯源公司的人多能干细胞无血清培养基。
Episomal vector质粒：
pCXLE-hOCT3/4-shp53(Addgene,#27077)
pCXLE-hSK(Addgene,#27078)
pCXLE-hUL(Addgene,#27080)
pCXWB-EBNA1(Addgene,#37624)
电转液来源于P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L(Lonza,#V4XP-3024)，电转程序参照试剂盒说明书。
BAV-TAA病人特异性诱导多能干细胞在制备过程中的形态如图2所示，结果显示，在电转培养至5天时部分细胞初步发生形态改变，培养13天时部分细胞聚集成团，形成小克隆，培养至19天时，部分细胞聚集成团，形成较大克隆。最终克隆形成的动脉夹层特异性诱导多能干细胞如图2E所示，干细胞原代细胞系和子代细胞系的细胞形态稳定性高，均表现为细胞较小，核质比高，细胞核显著，细胞呈集落状生长，紧密堆积在一起形成克隆，克隆内细胞无明显细胞界限。
3)BAV-TAA病人特异性iPS细胞株的鉴定
将iPSC细胞株与胚胎干细胞(hESC)相对比，通过碱性磷酸酶染色，多能性基因免疫荧光染色，多能性基因RT-PCR检测，拟胚体(EB)介导的三胚层分化；核型分析等方法来确定重编程的细胞株具有与胚胎干细胞(hESC)相似的细胞生物学与分子生物学特性。具体检测方法如下所示：
碱性磷酸酶染色实验(APS)鉴定iPSC的多能性:
按照说明书BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit的指导,进行碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，APS)染色。
具体过程如下：吸弃培养基用PBS洗涤细胞，用4％多聚甲醛在室温固定20min，PBS洗涤固定的细胞，然后加入新制备的APS染色工作液避光染色约10分钟。停止反应，吸弃染色工作液，加入适量ddH2O。APS结果显示，iPSC细胞表面均有紫色的不可溶性颗粒，结果显示均为阳性；
多能性基因免疫荧光染色：
免疫荧光染色结果显示细胞核中多能性标志——OCT4、NANOG、SOX2及细胞表面的多能性标志——TRA-1-60、TRA-1-81均明显表达，显示为阳性结果。
具体过程如下：将iPSC在12孔板的盖玻片上培养，然后用4％多聚甲醛中固定20分钟并在含0.5％Triton X-100的PBS中封闭1小时,然后将细胞与以下抗体在4℃孵育过夜：兔抗OCT4；兔抗SOX2；兔抗NANOG；鼠抗TRA-1-60；鼠抗TRA-1-81；鼠抗α-SMA；鼠抗CNN1；兔抗SM22α；鼠抗TUJ1；兔抗α-Fetoprotein。之后与以下荧光标记的二抗在室温避光孵育1小时：AF594A Goat Anti-Mouse IgG；AF488A Goat Anti-Rabbit IgG。用ddH2O洗涤细胞后用含4'，6-二脒基-2-苯基吲哚的封片剂进行封片，然后在Nikon荧光显微镜下观察拍照。
多能性基因RT-PCR检测：
具体过程如下：H1ESC作为阳性对照,原代培养细胞作为阴性对照。结果显示作为阴性对照的原代培养细胞的多能性标志无表达，而BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株及作为阳性对照的H1ESC均有明显表达，从而说明BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株具有良好的多能性。
选用Trizol裂解法提取iPSC中总的RNA,使用PrimerScript RT Reagent Kit(Takara，RR037A)试剂盒将RNA逆转录成cDNA，通过加入OCT4；SOX2；NANOG等胚胎干细胞多能性基因的引物，在Taq DNA polymerase作用下对其多能性基因进行特异性扩增。其扩增后的产物，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。OCT4基因DNA片段的大小为138bp,SOX2基因DNA片段的大小为397bp,NANOG基因DNA片段的大小为811bp,琼脂糖凝胶电泳曝光后显示在该区段均有明显的DNA分子的片段。
多能性基因RT-qPCR检测：
H1 hESC作为阳性对照,原代平滑肌细胞作为阴性对照。结果显示作为阴性对照的原代平滑肌细胞的多能性标志低表达，而BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株及作为阳性对照的H1ESC均有明显表达，从而说明BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株具有良好的多能性。
具体过程如下：选用Trizol裂解法提取iPSC中总的RNA,使用Takara试剂盒将RNA逆转录成cDNA，通过加入OCT4；SOX2；NANOG等胚胎干细胞多能性基因的引物(如表1所示)，在iTaq Universal SYBR Green Supermix作用下实时荧光定量PCR仪能检测到实时荧光信号，通过对累积的荧光信号的分析来反应基因本底表达水平，从而检测基因的表达水平。
表1 PCR扩增引物
Figure BDA0003128600920000131
拟胚体(EB)介导的三胚层分化：
具体过程如下：我们将BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株在低附着培养皿中定向分化为拟胚体(EB)，拟胚体(EB)是在形态学上与哺乳动物早期的胚胎发育阶段有着很高相似度的一种球状结构，其能分化为内胚层、中胚层和外胚层，如图所示，三个胚层的标志——Fetoprotein(内胚层)、α-SMA(中胚层)、TUJ1(外胚层)均显示阳性，验证了BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株具有良好的多能性。
EB的分化:
将密度约80％-90％iPSC用玻璃针沿着培养皿纵轴与横轴将其切割为较小团块；加入胶原酶Ⅳ，将培养皿放置于37℃恒温培养箱约30min,待细胞团块边缘卷曲时，停止消化，吸弃胶原酶Ⅳ，加入EB生成培养基，使卷曲的细胞团块漂浮于培养液中，再将细胞悬液全部移入低附着培养皿中，培养皿倾斜45°角放入37℃恒温培养箱中进行培养6天即形成EB。
EB生成培养基的制备(不含b-FGF)，如表2所示。
表2 EB生成培养基的制备
Figure BDA0003128600920000141
核型分析：
核型分析显示BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株具有正常核型，未发生染色体变异。
具体过程如下：将密度约60％iPSC，加入浓度为50ng/ml的秋水仙胺，37℃处理2h。再将细胞消化成单个细胞，1200rpm，5min离心收集，使用PBS重悬清,洗一次。提前37℃预热低渗KCl，然后用低渗KCl重悬细胞后将细胞悬液全部转入15ml离心管中，用低渗KCl补至10ml，37℃处理20-40min。加入甲醇：冰醋酸(3:1)固定液，1000rpm，离心10min，去上清，保留1ml上清。轻柔吹打悬液，缓慢加入固定液，边加边振荡，直至离心管满，1500rpm，离心5min。轻柔吹打悬液，缓慢加入固定液，边加边振荡，直至离心管满，静置15min。1500rpm，5min，离心弃上清，缓慢加入固定液，边加边振荡，直至离心管满，4℃静置过夜。次日弃上清，取出-20℃预冷的载玻片，立即滴片。75℃，干燥1-2h。染片时在玻片上进行编号，然后用胰酶进行消化、用生理盐水终止消化，最后用吉姆萨染液(5ml吉姆萨+45ml PBS)进行染色，而后在室温下干燥。最后将玻片放置于至徕卡扫片机进行扫片后再对染色体核型进行分析。
碱性磷酸酶染色结果如图3A所示，染色体的核型分析结果如图3B，免疫荧光染色结果如图3C，多能性基因RT-PCR结果如图3D，多能性基因RT-qPCR表达如图3E，拟胚体(EB)介导的三胚层分化鉴定如图3(F,G,H,I)。
4)BAV-TAA患者特异性iPSC细胞株潜在的ROBO4基因突变
主动脉瓣二叶式畸形(BAV)与胸主动脉瘤(TAA)疾病的具体发病机制尚未清晰，人们从遗传学角度对其认识一步一步加深。到目前为止，至少有30多个致病基因已被鉴定与胸主动脉瘤相关，20多个基因已被报道与主动脉瓣二叶式畸形有关。我们通过全外显子测序发现ROBO4基因存在低频错义突变(c.161T>C,p.Q54R)，可能与疾病发病有关。突变鉴定测序信息结果如图4所示。
5)BAV-TAA患者特异性内皮细胞的定向诱导分化
采用细胞因子诱导的2D单层分化方案，其基本技术路线为：第1～3天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第4～7天完成中胚层向内皮细胞的诱导分化。其分化形态图如图5所示。
首先，将iPSCs接种至培养皿中，第二天可进行分化操作，在分化当天，吸尽培养基，加入6ml含1μM CP21和25μg/mlBMP4的N2B27培养基；而后2天不换液；分化第四天更换成3ml含200ng/ml的VEGF和2uM Forskolin的StemProTM-34SFM(1X)培养基；第5-7天继续换液。此时，如果分化效果良好可看到成片经EC marker特异性鉴定呈阳性的内皮细胞，表明“人源性”BAV-TAA疾病iPSC可以成功诱导分化为内皮细胞。
上述的N2B27培养基中，DMEM-F12+神经细胞基础培养液(Neubrobasal medium)各占总培养液量的48.5％％，B27(without vitamin A)占总培养液总量的2％，N2占总培养液总量的1％。
选用trizol裂解法提取ipsc中总的RNA,使用Takara试剂盒将RNA逆转录成cDNA，通过加入CD31；VE-cad；vWF等血管内皮细胞标志基因的引物(如表1所示)，在iTaqUniversal SYBR Green Supermix作用下实时荧光定量PCR仪能检测到实时荧光信号，通过对累积的荧光信号的分析来反应基因本底表达水平，从而检测基因的表达水平。
iPSCs-EC的分化需要7天，day1-3是诱导中胚层的形成阶段，day4-7是诱导内皮细胞形成阶段。在4-7天，通过qPCR检测内皮细胞标志基因CD31；VE-cad；vWF等的表达水平，来验证分化产生的细胞即为内皮细胞(图6)。
对分化第7天的细胞进行免疫荧光染色，图7A为内皮细胞的标记基因CD31的免疫荧光图；图7B为内皮细胞的标记基因VE-cadherin的免疫荧光图。CD31,VE-cadherin表达在内皮细胞膜上，图7显示CD31,VE-cadherin表达均阳性，且荧光显示在细胞膜上。
6)BAV-TAA病人特异性平滑肌细胞的获得
采用细胞因子诱导的2D单层分化方案，其基本技术路线为：第1～3天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第4～6天完成中胚层向平滑肌细胞的诱导分化。其分化形态图如图8所示。
首先，将iPSCs接种至35mm培养皿中，第二天可进行分化操作，在分化当天，吸尽陈旧培养基，加入6ml含1μM CP21和25μg/ml BMP4的N2B27培养基；而后2天不换液；分化第四天更换成3ml含10ng/ml的PDGF-BB和2ng/ml的Activin A的N2B27，分化第五天，第六天换液加入新鲜3ml含10ng/ml的PDGF-BB和2ng/ml的Activin A的N2B27培养基，第七天，对细胞进行重新铺板，将细胞全部接种到培养皿上。此时，如果分化效果良好可看到成片经SMCmarker特异性鉴定呈阳性的细胞，表明“人源性”BAV-TAA疾病SMC模型建立成功。
上述的N2B27培养基中，DMEM-F12+神经细胞基础培养液(Neubrobasal medium)各占总培养液量的48.5％，B27(without vitamin A)占总培养液总量的2％，N2占总培养液总量的1％。
选用trizol裂解法提取ipsc中总的RNA,使用Takara试剂盒将RNA逆转录成cDNA，通过加入α-SMA；SM22α等平滑肌细胞标记基因的引物，在iTaq Universal SYBR GreenSupermix作用下实时荧光定量PCR仪能检测到实时荧光信号，通过对累积的荧光信号的分析来反应基因本底表达水平，从而检测基因的表达水平。
iPSCs-SMC的分化需要7天，day1-3是诱导中胚层的形成阶段，day4-7是诱导平滑肌细胞形成阶段。在4-7天，通过qPCR检测平滑肌细胞标志基因α-SMA；SM22α等的表达水平，来验证分化产生的细胞即为平滑肌细胞(图9)
7)BAV-TAA模型的表型鉴定：
应用内皮细胞特异性标志物血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)、血管内皮钙粘素(VE-Cadherin)对获得的细胞进行免疫染色，鉴定诱导获得的细胞为内皮细胞。如见图7所示，本发明制备的BAV-TAA模型能够获得大量的内皮细胞。
通过上述实施例中BAV-TAA模型的构建以及对其的鉴定分析结果易分析出，应用iPSC技术能够建立可靠、稳定的人源性BAV-TAA疾病模型，形态与功能均符合BAV-TAA特征，该模型适合用于BAV-TAA相关病理机制的基础研究，并可用于BAV-TAA及TAA疾病治疗及预防药物的研究。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种内皮细胞分化异常的人源BAV TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
对离体的BAV/TAA患者来源的血管组织进行体外培养，获得原代血管细胞；所述血管细胞包括成纤维细胞和血管平滑肌细胞；
通过电转方法将含有重编程因子的附加体质粒导入所述原代血管细胞进行重编程，得到特异性iPSC细胞株；所述重编程因子的附加体质粒包括含有重编程因子基因OCT4、KLF4、SOX2、Lin28、l-myc以及shP53的质粒；
对所述特异性iPSC细胞株进行定向分化，得到人源BAV-TAA疾病血管细胞模型；
所述特异性iPSC细胞株的获得包括以下步骤：
步骤1：待所述血管细胞培养至细胞密度80-90％时，消化成单个细胞，离心，取细胞沉淀；
步骤2：将含重编程因子的附加体质粒与电转液混合后，重悬所述细胞沉淀，然后进行电转；
步骤3：电转之后加入培养液重悬细胞，再将细胞悬液接种于含有10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基中，每天换液，直至培养细胞密度90％，进行细胞消化，并将消化后的细胞接种到混合液-1中，培养一天后，更换成所述混合液-2，待观察到特异性iPSC细胞株克隆时，更换成培养液，获得所述单克隆细胞；所述混合液-1包括：(hiPSC/hESC培养液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM NaB):(DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基)体积比为1:1混合而成；所述混合液-2包括：hiPSC/hESC培养液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM NaB；所述培养液为：hiPSC/hESC培养液；
步骤4：将所述单克隆细胞与周围原代血管细胞分离后，用所述培养基扩增培养，得到特异性iPSC细胞株；
对所述特异性iPSC细胞株进行定向分化包括以下步骤：
S1：将所述特异性iPSC细胞株接种于所述培养液培养，得到待分化细胞；
S2：将所述待分化细胞在N2B27-1培养基中进行第一次分化培养，得到第一次分化后细胞；所述N2B27-1培养基包括：N2B27培养基+1μM CP21R7+25μg/ml BMP4；
S3：将所述第一次分化后细胞在N2B27-2培养基中进行第二次分化培养，得到第二次分化后细胞，即为人源BAV-TAA疾病多能干细胞来源的平滑肌细胞；所述N2B27-2培养基包括：N2B27培养基+10ng/ml PDGF-BB+2ng/ml Activin A；
S4：将所述第一次分化后细胞在StemPro-34 SFM(1X)培养基中进行第二次分化培养，得到第三次分化后细胞，即为人源BAV-TAA疾病多能干细胞来源的内皮细胞模型；所述StemPro-34 SFM(1X)培养基包括StemPro-34 SFM(1X)+200ng/ml的VEGF和2uM Forskolin；
其中，所述N2B27培养基中，DMEM-F12+神经细胞基础培养基各占总培养液量的48.5％，不包含维生素A的B27占总培养液总量的2％，N2占总培养液总量的1％。
2.根据权利要求1所述的内皮细胞分化异常的人源BAV TAA疾病多能干细胞模型的构建方法，其特征在于，所述原代血管细胞的获得包括以下步骤：
对获取的离体BAV-TAA患者主动脉组织块剪成约1mm小块，并贴附于培养瓶，加入含10％胎牛血清和1％青链霉素的DMEM培养基，贴附组织块一面朝上培养一段时间后，翻转培养瓶，继续培养，至大量细胞长出，进一步扩增，得到原代血管细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的构建方法构建的内皮细胞分化异常的人源BAV-TAA疾病多能干细胞模型。
4.根据权利要求1-2任一项所述的构建方法或权利要求3所述的内皮细胞分化异常的人源BAV-TAA多能干细胞疾病模型在如下(a)或(b)中的应用：
(a)制备用于筛选治疗和/或预防BAV-TAA疾病的临床药物中的应用；
(b)研究BAV-TAA相关疾病的细胞分子机制中应用。
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