CN113429488A

CN113429488A - GITR/TGF-β双靶向融合蛋白及其用途

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Publication number: CN113429488A
Application number: CN202110796450.6A
Authority: CN
Inventors: 周雅琼; 高章照; 吴振华; 聂磊; 胡锋; 齐健; 王海彬
Original assignee: Zhejiang Borui Biopharmaceutical Co ltd; Haizheng Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Zhejiang Borui Biopharmaceutical Co ltd; Haizheng Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2021-07-14
Filing date: 2021-07-14
Publication date: 2021-09-24
Anticipated expiration: 2041-07-14
Also published as: CN113429488B; WO2023284733A1

Abstract

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明公开了GITR/TGF‑β双靶向融合蛋白、包含其的缀合物和药物组合物，以及所述融合蛋白或缀合物在制备药物中的用途。

Description

GITR/TGF-β双靶向融合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体而言，本发明公开了GITR/TGF-β双靶向融合蛋白、包含其的缀合物和药物组合物，以及所述融合蛋白或缀合物在制备药物中的用途。

背景技术

免疫疗法治疗选择广泛，包括多种方法。迄今为止，最成功的治疗方案之一是免疫检查点抑制剂(例如抗PD-L1抗体和抗PD-1抗体)治疗，其可在多种晚期肿瘤中表现出高度持久的反应和显著延长的整体生存期。尽管检查点抑制剂在抗癌治疗中取得了进展，但绝大多数患者对检查点抑制剂仍无响应。

转化生长因子-β(TGF-β)是属于转化因子超家族的多功能细胞因子。TGF-β信号通路由TGF-βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)和TGF-βⅡ型受体(TGF-βRⅡ)组成的TGF-β受体复合物介导，调控细胞生长、增殖、分化、凋亡、迁移等重要细胞过程。TGF-β信号通路与肿瘤发生和发展密切相关。在一方面，TGF-β有助于肿瘤细胞上皮-间充质转化(EMT)，促进肿瘤细胞浸润和转移。在另一方面，TGF-β抑制T细胞和B细胞的增殖并抑制B淋巴细胞产生免疫因子，也可以通过抑制抗原提呈细胞(如树突状细胞)的功能减弱T细胞的活性，通过多种机制抑制免疫系统的抗肿瘤反应。此外，TGF-β可以通过刺激血管生成促进肿瘤细胞的生长和转移。

现有技术中已开发了一些TGF-β抑制剂，例如TGF-βTrap(二聚的TGF-βRⅡ的胞外结构域，参见例如WO2015118175A2和WO2018205985A1)和抗TGF-β单克隆抗体fresolimumab(参见例如US7723486B2)。临床上使用TGF-β抑制剂与抗PD-L1抗体或抗PD-1抗体联合疗法解除免疫系统的抑制，从而增强抗肿瘤治疗效果。例如，WO2018205985A1和WO2015118175A2公开了的抗PD-L1抗体和TGF-βTrap的双功能分子，可以同时阻断TGF-β信号通路并抑制免疫检查点，用于癌症治疗。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor，GITR或AITR)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)中的一员。GITR在调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)表面高表达，在幼稚T细胞和记忆T细胞表面有较低的表达。当效应T细胞(effector T cells，Teff)被激活后，GITR的表达水平会在短时间内快速升高。GITR信号传导在免疫调节中起重要作用。一方面，Teff表面GITR的激活可以促进Teff细胞的增殖和存活，从而增强免疫功能。在另一方面，Treg表面GITR的激活促使Treg细胞衰竭，从而间接的起到激活Teff功能的作用。

发明内容

在一方面，本发明提供一种靶向GITR和TGF-β的双靶向融合蛋白，其从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

或者

第三多肽–第二多肽–第一多肽式(2)；

其中

所述第一多肽包含TGF-βRⅡ的胞外结构域(TGFBR2-ECD)；

所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Dd为二聚化结构域；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头或不存在；并且

所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃，

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域；

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头或不存在。

在一实施方案中，所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一具体实施方案中，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一实施方案中，所述二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，优选人IgG1的CH2和CH3结构域。

在一实施方案中，所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，其从N端至C端包含免疫球蛋白的铰链区或其部分、CH2和CH3结构域，优选人IgG1的Fc片段；优选地，所述铰链区或其部分包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头。

在一具体实施方案中，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

在另一方面，本发明提供一种多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。本发明还提供一种表达载体或宿主细胞，其包含编码本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明还涉及一种缀合物，其包含与至少一种治疗剂缀合的本发明的融合蛋白。优选地，所述治疗剂选自可检测标记物、化疗剂、细胞毒素、放射性核素、免疫检查点抑制剂、细胞因子和酶。

在又一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含：

(ⅰ)本发明的融合蛋白，以及

(ⅱ)药学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明还涉及所述融合蛋白、多核苷酸、缀合物或者药物组合物的用途。

附图说明

图1：通过还原性蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)分析融合蛋白C15和C2。使用蛋白标准品指示的分子量(kDa)在左侧示出。泳道1：C15；泳道2：C2。

图2：通过ELISA分析的B22、C15、C12和C2对TGF-β的结合活性。

图3：通过Fortebio分析的C12、336B11和36E5对hGITR的体外结合亲和力和动力学。

图4：通过FACS分析的C12和C15体外结合CHOS-hGITR细胞的活性。

图5：通过GITR Blockade Bioassay分析的C12、C15和36E5体外激活GITR的活性。IgG同种型(IgG Isotype)用作阴性对照。

图6：通过TGF-β受体报告基因实验分析的C12和抗TGF-β抗体BMK-R2体外阻断TGF-β的活性。人IgG1用作阴性对照。

图7：通过ELISA分析的C12、336B11以及36E5体外激活T细胞的活性。蛋白样品：336B11、C12、IgG Isotype(IgG同种型，阴性对照)和36E5。对于每组样品，蛋白浓度从左至右：10、1、0.1μg/ml。medium(培养基)作为空白对照。

图8：C12、C15以及36E5体外激活T细胞的活性。蛋白样品：C12、C15、36E5和IgGIsotype(IgG同种型，阴性对照)。对于每组样品，蛋白浓度从左至右：50、10、2、0.4、0.08μg/ml。Medium(培养基)作为空白对照。

图9：在鼠源结肠癌MC38-OVA模型中，经对照和融合蛋白C12处理的小鼠肿瘤体积的生长曲线。注：肿瘤体积表示为“平均值±标准误差(SEM)”。

具体实施方式

定义

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文所用，“至少一个(种)”或“一个(种)或多个(种)”可以表示1、2、3、4、5、6、7、8个(种)或更多个(种)。

如本文所用，术语“约”、“大约”当与数值变量联合使用时，通常指该变量的数值和该变量的所有数值在实验误差内(例如对于平均值95％的置信区间内)或在指定数值的±10％内，或更宽范围内。

如本文所用，表述“包含”或与其同义的类似表述“包括”、“含有”和“具有”等是开放性的，不排除额外的未列举的元素、步骤或成分。表述“由…组成”排除未指明的任何元素、步骤或成分。表述“基本上由…组成”指范围限制在指定的元素、步骤或成分，加上任选存在的不会实质上影响所要求保护的主题的基本和新的特征的元素、步骤或成分。应当理解，表述“包含”涵盖表述“基本上由…组成”和“由…组成”。

如本文所用，术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，融合蛋白任选地包含接头涵盖包含或者不包含接头的情况。

如本文所用，术语“多肽”指包含至少两个通过肽键连接的氨基酸或其衍生物的聚合物。在本文中，术语“多肽”和“蛋白”通常可以互换使用。在一些实施方案中，蛋白可以由一条或更多条多肽以共价或非共价方式形成，例如二聚体蛋白。

在本文中，当指定氨基酸在多肽中的位置时，第n位氨基酸指从多肽的氨基端(N端)的第1个氨基酸开始数的第n个氨基酸。

在本文中，氨基端(N端)和羧基端(C端)可以表示多肽中两个或多个氨基酸序列的相对位置，并不表示所述两个或多个氨基酸序列紧邻，例如在本发明的融合蛋白中，第一多肽可以位于第二多肽的N端，第二多肽可以位于第三多肽的N端，并且第一多肽与第二多肽之间和/或第二多肽与第三多肽之间可以包含其他的组分(例如氨基酸序列，例如接头)。或者，氨基端(N端)和羧基端(C端)也可以表示指定氨基酸或氨基酸序列在其所处于的多肽中的位置，例如本发明的第一多肽可以位于本发明融合蛋白的N端也可以位于本发明融合蛋白的C端。

如本文所用，术语“融合蛋白”或“融合多肽”指包含共价连接的至少两个多肽的蛋白，所述至少两个多肽在自然环境下通常不共价连接。可以通过化学、酶促或重组DNA技术使至少两个多肽共价连接形成融合蛋白。

如本文所用，术语“突变”是指多肽中包含一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加。所述取代可以是保守或非保守取代。在多肽或蛋白中，合适的保守氨基酸取代是本领域技术人员已知的，并且一般可以进行保守氨基酸取代而不改变所得分子的生物活性。通常，本领域技术人员认识到多肽的非必需区中的单个氨基酸取代基本上不改变期望的生物活性(参见，例如Watson et al.,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,TheBenjamin/Cummings Pub.co.,p.224)。例如，Fc片段可以包含突变，例如删除CH3结构域中C端的赖氨酸。

如本文所用，“野生型”多肽或蛋白是指天然存在的，未经人为改造的多肽或蛋白。多肽或蛋白的“突变型”或“突变体”相对于“野生型”的多肽或蛋白带有突变。例如，野生型TGF-βRⅡ胞外结构域包含SEQ ID NO:4的序列。TGF-βRⅡ胞外结构域突变体相对于SEQ IDNO:4带有突变。

如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”指包含至少两个连接的核苷酸或核苷酸衍生物的寡聚体或聚合物，包括通常通过磷酸二酯键连接在一起的脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

本发明的融合蛋白或多核苷酸可以是“分离的”。表述“分离的”指多肽或多核苷酸可以例如是经过人工改造的，和/或与其天然存在的环境中的其他物质分离的。诸如cDNA分子的“分离的”多核苷酸可以在通过重组技术制备时基本上不含其他细胞物质或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学成分。

如本文所用，“载体”是用于将外源核酸导入宿主细胞的媒介，当载体转化入适当的宿主细胞时，外源核酸得以扩增或表达。载体包括那些通常通过限制酶切消化和连接可以将编码多肽或其片段的核酸引入其中的载体。载体还包括那些包含编码多肽的核酸的载体。载体通常保持游离，但是可以设计为使基因或其部分整合入基因组的染色体。还考虑人工染色体的载体，例如酵母人工载体和哺乳动物人工染色体。如本文所用，载体的定义涵盖质粒、线性化质粒、病毒载体、粘粒、噬菌体载体、噬菌粒、人工染色体(例如，酵母人工染色体和哺乳动物人工染色体)等。如本文所用，载体可以在宿主细胞中表达或复制。

如本文所用，“表达”指通过多核苷酸的转录和翻译产生多肽的过程。“表达载体”包括能够表达多肽的载体，其包含编码目标多肽的多核苷酸序列。编码目标多肽的多核苷酸序列与能够影响其表达的调控序列可操作地连接。这类调控序列可以包括启动子和终止子序列，并且任选地可以包括一个或多个复制起点、一个或多个选择标记、增强子、多腺苷酸化信号等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或者可以包含这两者的元件。因此，表达载体可以指重组DNA或RNA构建体，例如质粒、噬菌体载体、重组病毒或其他载体，当引入适当的宿主细胞时，导致克隆DNA或RNA的表达。适当的表达载体是本领域技术人员公知的，并且包括在真核细胞和/或原核细胞中可复制的表达载体以及保持游离的表达载体或者整合入宿主细胞基因组的表达载体。

如本文所用，“宿主细胞”是用于接受、保持、复制或扩增载体的细胞。宿主细胞还可以用来表达核酸或载体所编码的多肽。宿主细胞可以是真核细胞或原核细胞。合适的宿主细胞包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLa细胞和HEK细胞(例如HEK293细胞)。

如本文所用，“亲和力”或“结合亲和力”用来衡量分子与其配体之间通过非共价作用力相互结合的强度，例如本发明的融合蛋白与其靶点之间的结合强度，例如GITR与GITRL胞外结构域之间或者TGFBR2-ECD与TGF-β之间的结合强度。亲和力的大小通常报告为平衡解离常数K_D，常通过测量结合速率常数(k_on)和解离速率常数(k_dis)并计算k_dis除以k_on的商来确定(K_D＝k_dis/k_on)。K_D可以利用常规技术容易地测定，例如可以使用的方法包括但不限于：平衡透析法；生物膜层干涉技术，例如通过Octet RED96检测系统；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；表面等离子体共振(SPR)法；或者通过技术人员已知的其他方法。

“特异性结合”是指两个分子之间以较高的亲和力相互结合，通常，特异性结合的两个分子之间的K_D值可以为10^-6、10^-7、10^-8到10^-9M或更低。例如，GITR与GITRL胞外结构域之间可以以10^-6到10^-9M或更低的K_D值特异性结合，TGFBR2-ECD与TGF-β之间可以以10^-6到10^-9M或更低的K_D值特异性结合。

术语“治疗”是指防止、治愈、改善、减缓、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状。因此，需要治疗的受试者包括但不限于：患有疾病或病症者；有患病风险者；以及欲预防体内的病症者。在癌症或肿瘤的情况下，若受试者显示出下列的一或多项，则受试者成功地被根据本发明的方法“治疗”：免疫反应增加、抗肿瘤反应增加、免疫细胞的溶细胞活性增加、免疫细胞杀死肿瘤细胞增加、癌细胞数目减少或完全不存在；肿瘤尺寸缩小；癌细胞浸润到周围器官中(包括癌细胞扩散入软组织和骨骼中)受抑制或不存在；肿瘤或癌细胞转移受抑制或不存在；癌症生长受抑制或不存在；与特定癌症相关的一种或多种症状缓解；发病率和死亡率降低；生活质量提升；致瘤性降低；癌干细胞的数目或频率减少；或某些效果的组合。

如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”指施用于受试者之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或组合物的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，治疗有效量的本发明的融合蛋白或药物组合物优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％，优选至少约80％。抑制肿瘤生长的作用可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价；或者，也可以通过检查抑制细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的本发明的融合蛋白或药物组合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状如预防和/或治疗转移或复发。本领域技术人员理解，治疗有效量受多种因素影响，例如受试者的体重、症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。可以在一次或多次施用中给予治疗有效量。

融合蛋白

在一方面，本发明提供一种融合蛋白，其从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

或者

第三多肽–第二多肽–第一多肽式(2)；

其中所述第一多肽包含TGF-βRⅡ胞外结构域，所述第二多肽包含二聚化结构域，并且所述第三多肽包含3个GITRL胞外结构域。

本发明的融合蛋白是GITR/TGF-β双靶向融合蛋白，其同时特异性结合TGF-β和GITR。本发明的融合蛋白通过结合TGF-β抑制TGF-β信号通路，起到TGF-β抑制剂的作用；同时本发明的融合蛋白通过结合GITR激活GITR信号通路，起到GITR激动剂的作用。本发明的融合蛋白可以作为免疫治疗剂来诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应，特别是诱导、促进、增强、激活或延长针对肿瘤细胞的免疫反应。

第一多肽

在一些实施方案中，第一多肽包含TGF-βRⅡ胞外结构域(TGFBR2-ECD)。

如本文所用，术语“TGF-βRⅡ胞外结构域”或“TGFBR2-ECD”是指TGF-βⅡ型(TGF-βRⅡ)受体的胞外区，其具有结合TGF-β的活性。二聚化TGFBR2-ECD可以作为TGF-βTrap结合和捕获TGF-β二聚体，从而抑制TGF-β信号通路以及消除TGF-β信号通路相关的免疫抑制。可以使用本领域已知的各种检测方法确定TGF-β信号通路的抑制，例如检测TGF-β信号通路控制的下游基因的表达。

第一多肽中包含的TGFBR2-ECD可以是野生型或其突变体。关于野生型TGFBR2-ECD描述可以参见例如WO2015118175A2。示例性野生型TGFBR2-ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

发明人发现，野生型TGFBR2-ECD容易在N端第1-24位氨基酸中发生断裂，不利于后续的成药性开发。为解决这一问题，发明人开发了TGFBR2-ECD突变体，其为相对于野生型TGFBR2-ECD的改进型多肽。相比于包含野生型TGFBR2-ECD的融合蛋白，包含TGFBR2-ECD突变体的融合蛋白在生产过程中不易产生降解，具有更好的成药性。

在一实施方案中，所述TGFBR2-ECD突变体包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含野生型TGFBR2-ECD。在一具体实施方案中，所述野生型TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。

在一些实施方案中，第一多肽包含TGFBR2-ECD突变体。在一具体实施方案中，所述TGFBR2-ECD突变体包含SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

在一具体实施方案中，第一多肽包含TGFBR2-ECD，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，第一多肽包含TGFBR2-ECD，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在又一具体实施方案中，第一多肽包含TGFBR2-ECD，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。

第二多肽

如本文所用，“二聚化结构域”是指能够促进两条或更多条多肽通过共价或非共价作用组合成二聚体或多聚体(例如三、四、五、六、七、八或九聚体)的多肽。据信，二聚化的TGF-βRⅡ胞外结构域可以作为TGF-βTrap(参见例如WO2015118175A2和WO2018205985A1)结合TGF-β二聚体并抑制TGF-β信号通路。二聚化结构域促进本发明的融合蛋白形成二聚体或多聚体，从而本发明的融合蛋白可以作为TGF-βTrap发挥作用。

二聚化结构域的非限制性实例可以包括免疫球蛋白IgG、IgA、IgD的重链恒定区3(CH3)以及IgM和IgE的重链恒定区4(CH4)。二聚化结构域可以进一步包含特定类型的免疫球蛋白的其他结构域，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的铰链区或其部分和/或重链恒定区2(CH2)，以获得具有期望的特性的融合蛋白，例如增强抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖的细胞胞吞作用(ADCP)、补体依赖的细胞毒性作用(CDC)以及和FcRn结合的结合活性以延长融合蛋白的半衰期等。

在一实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，优选人IgG1的CH2和CH3结构域。

在优选的实施方案中，二聚化结构域进一步包含免疫球蛋白的铰链区或其部分。优选地，所述铰链区为人IgG1的铰链区。在一具体实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白的Fc片段，优选人IgG1的Fc片段。

如本文所用，“免疫球蛋白Fc片段”或“Fc片段”是指免疫球蛋白的铰链区或其部分以及重链恒定区CH2、CH3、CH4中的两个或更多结构域。例如，IgG的Fc片段可以包含免疫球蛋白的铰链区或其部分以及CH2和CH3结构域，而IgM和IgE的Fc片段可以包含免疫球蛋白的铰链区或其部分、CH2、CH3和CH4结构域。Fc片段可以衍生自任何免疫球蛋白，例如，IgG、IgM、IgD、IgE、IgA和IgY中的任何类别或亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgG2a和IgG2b。Fc片段中的各部分(例如铰链区、CH2和CH3)可以衍生自相同或不同的免疫球蛋白。优选地，Fc片段中的各部分衍生自相同的免疫球蛋白，优选人IgG，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。Fc片段可以是通过酶促处理全长抗体所产生的抗体衍生物(例如木瓜蛋白酶切割后的非抗原结合部分)，以及通过化学合成或基因工程技术(例如DNA重组技术)产生的衍生物。

本领域技术人员可以根据已知的算法和软件判断CH2、CH3、CH4和铰链区在免疫蛋白中的位置和氨基酸序列，可以应用的算法和软件的描述可以参见例如WilliamR.Strohl,Lila M.Strohl,(2012),Antibody structure–function relationships,InWoodhead Publishing Series in Biomedicine,Therapeutic Antibody Engineering,Woodhead Publishing,pp.37-56。可以通过本领域技术人员熟知的方法获得各种类型免疫球蛋白Fc片段的氨基酸序列，例如使用公共数据库(例如Uniprot或NCBI)获得免疫球蛋白重链恒定区各个部分的氨基酸序列。并且，本领域技术人员知晓，可以根据需要对Fc片段进行修饰。例如可以在铰链区、CH2和/或CH3结构域中添加、取代或缺失一个或多个氨基酸，例如修饰CH2以改变Fc片段的糖基化修饰，或者在铰链区中增加或缺失用于形成分子间二硫键的一个或多个半胱氨酸。

在其他实施方案中，第二多肽进一步包含融合至所述二聚化结构域N端和/或C端的接头。所述接头如本文所述。

在一些实施方案中，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Dd为二聚化结构域；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头或不存在。

在一些实施方案中，二聚化结构域包含CH2、CH3、CH4结构域或其组合。在一些实施方案中，二聚化结构域包含至少一个CH3结构域。在一些实施方案中，二聚化结构域从N端至C端包含CH2和CH3结构域，优选人IgG1的CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，所述CH2和CH3结构域衍生自人IgG1。在一些实施方案中，二聚化结构域从N端至C端包含衍生自人IgG1的CH2和CH3结构域。在一实施方案中，所述CH3结构域的C端赖氨酸缺失。在一实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在一些实施方案中，二聚化结构域包含免疫球蛋白的铰链区或其部分以及CH2、CH3、CH4结构域或其组合。在一些实施方案中，二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的铰链区或其部分、CH2和CH3结构域，优选人IgG1的Fc片段。所述CH2和CH3结构域如上所述。在一些实施方案中，所述铰链区衍生自人IgG1。在一些实施方案中，所述铰链区不包含一个或多个半胱甘酸。在一实施方案中，所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

在一具体实施方案中，二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，其中所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在一具体实施方案中，二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的铰链区或其部分、CH2和CH3结构域，其中所述铰链区或其部分包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述接头包含5-25个氨基酸，所述氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。在一具体实施方案中，所述接头包含(GGGGS)_n，其中n选自1-10的整数。在一具体实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一具体实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Lk₁和Lk₂都不存在，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Dd；

其中

Dd为二聚化结构域，所述二聚化结构域如前定义。

在一些实施方案中，Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，所述二聚化结构域如前定义；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，所述接头如前定义。

在一些实施方案中，Lk₁为接头，Lk₂不存在，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd；

或者

Lk₁不存在，Lk₂为接头，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，所述二聚化结构域如前定义；

Lk₁和Lk₂各自为接头，所述接头如前定义。

在一具体实施方案中，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，其从N端至C端包含铰链区、CH2和CH3结构域，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，所述接头如前定义。

在一具体实施方案中，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在一具体实施方案中，第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，其从N端至C端包含铰链区、CH2和CH3结构域，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，其中Lk₁包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，Lk₂包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。

第三多肽

在本发明的实施方案中，第三多肽包含3个GITRL胞外结构域。不受任何理论所束缚，相比于单个GITRL胞外结构域(单体GITRL胞外结构域)，包含3个GITRL胞外结构域的单链多肽(单链GITRL胞外结构域三聚体)在细胞表面形成与全长GITRL蛋白类似的三聚体，这样的三聚体作为GITR激动剂具有更高的GITR激活活性。

糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumornecrosis factor receptor，GITR)是肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)中的一员。不受任何理论束缚，据信GITR信号传导的激活(或激动)可以激活效应T细胞，并抑制调节性T细胞的免疫抑制活性。如本文所用，“GITR激动剂”是指能够诱导、促进、增强、激活或延长GITR信号传导的物质。可以使用本领域已知的各种检测方法确定GITR信号传导的激活，例如通过本文描述的检测方法。GITR激动剂包括但不限于GITRL、GITRL胞外结构域、GITR激动剂抗体。本发明的融合蛋白或缀合物可以作为GITR激动剂来诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应，例如诱导、促进、增强、激活或延长针对肿瘤或肿瘤细胞的免疫反应。

如本文所用，“GITR配体(Glucocorticoid-induced TNF-related ligand，GITRL)”或“糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体”是指糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(Glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR)蛋白的结合配体。在一些实施方案中，GITRL是指人GITRL蛋白。人GITRL(hGITRL)蛋白由TNFSF18基因编码，其氨基酸序列如GenBank登录号NP_005083.2(或Uniprot ID:Q9Y5U5)所示。如本文所用，“GITRL胞外结构域”是指人GITRL蛋白的胞外区，其特异性结合并激动GITR。本领域技术人员会理解，GITRL胞外结构域可以包含的确切氨基酸序列可以变化而不影响其激动GITR的功能。通常，GITRL胞外结构域可以包含NP_005083.2的约第71-199位氨基酸，例如NP_005083.2的第72-199位氨基酸(SEQ ID NO:1)或第75-199位氨基酸(SEQ ID NO:2)。在一些实施方案中，GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

第三多肽还可以进一步包含位于所述GITRL胞外结构域之间的接头。所述接头如本文所述。

在一些实施方案中，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域；

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头或不存在。

在一些实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述接头包含5-25个氨基酸，所述氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。在一具体实施方案中，所述接头包含(GGGGS)_n，其中n选自1-10的整数。在一具体实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一具体实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在一些实施方案中，Ln₁和Ln₂都不存在，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Sd₂–Sd₃；

其中Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域，所述GITRL胞外结构域如前定义。

在另一些实施方案中，Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域，所述GITRL胞外结构域如前定义；

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，所述接头如前定义。

在一些实施方案中，Ln₁为接头，Ln₂不存在，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Sd₃；

或者

Ln₁不存在，Ln₂为接头，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Ln₁和Ln₂各自为接头，所述接头如前定义。

在一具体实施方案中，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，所述接头如前定义。

在又一具体实施方案中，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在另一具体实施方案中，第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在一具体实施方案中，第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

接头

融合蛋白的各组分之间(例如第一和第二多肽之间，第二和第三多肽之间，第三多肽中的第一、第二和第三GITRL胞外结构域之间)任选地通过接头连接。优选地，接头可以包含1-50个氨基酸，优选1-25个、3-25个、5-25个、4-10个氨基酸，例如4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸。氨基酸通常为无空间位阻的氨基酸，例如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)。合适的接头为本领域技术人员熟知的，例如接头可以包含甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或其组合。示例性的接头可以包括但不限于：多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、GGA、GS、GGSG、GGGS、GGGSGGG和GGGGSSGS。

在一实施方案中，接头包含(GGGGS)_n，其中n为选自1-10的整数。在优选的实施方案中，n为选自2-5的整数。在一实施方案中，n为4(SEQ ID NO:10)。在另一实施方案中，n为2(SEQ ID NO:11)。

在又一具体实施方案中，接头包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

信号肽

本发明的融合蛋白任选地包含信号肽。信号肽(又称为信号序列、转运肽、前导序列或前导肽)是引导新生蛋白定位、转移和/或分泌的短肽(通常包含5-30个氨基酸)。在本发明中，优选的信号肽改善融合蛋白的表达水平和确保融合蛋白的正确折叠，并且帮助将融合蛋白分泌至细胞外。分泌信号肽通常在蛋白的分泌过程中被切割，使得蛋白作为成熟蛋白释放到细胞外。包含分泌信号肽的本发明的融合蛋白又可称为融合蛋白前体，其同样包括在本发明的融合蛋白范围之内。

信号肽可以位于融合蛋白的任何位置。优选地，信号肽位于融合蛋白的N端。

信号肽可以是本领域已知的任何信号肽，优选通常在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)表达中使用的分泌信号肽。在一具体实施方案中，所述信号肽序列包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

融合蛋白的具体实施方案

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

或者

第三多肽–第二多肽–第一多肽式(2)；

其中

所述第一多肽包含TGF-βRⅡ的胞外结构域(TGFBR2-ECD)；

所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Dd为二聚化结构域；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头或不存在；并且

所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃，

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域；并且

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头或不存在。

在一些实施方案中，所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在优选的实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述二聚化结构域包含CH2和CH3结构域。在优选的实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述二聚化结构域包含铰链区、CH2和CH3结构域。在一实施方案中，所述铰链区包含SEQID NO:9的氨基酸序列。在一实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:8的氨基酸序列。在一优选实施方案中，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述二聚化结构域包含铰链区、CH2和CH3结构域，其中所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述接头包含5-25个氨基酸，所述氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。在优选的实施方案中，所述接头包含(GGGGS)_n，其中n选自1-10的整数。在一实施方案中，所述接头包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

在一实施方案中，所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃；

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头。

在一些实施方案中，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，Ln₁和Ln₂各自独立地为接头，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一具体的实施方案中，所述第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

在一实施方案中，所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Dd为二聚化结构域，其从N端至C端包含铰链区、CH2和CH3结构域，所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头。

在一些实施方案中，所述二聚化结构域从N端至C端包含铰链区、CH2和CH3结构域，所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列，Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，其中Lk₁包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，Lk₂包含SEQID NO:11的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

或者

第三多肽–第二多肽–第一多肽式(2)；

其中

所述第一多肽包含TGFBR2-ECD，其包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，其包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列；并且

所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃，

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域，其包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列；

在一具体实施方案中，本发明的融合蛋白从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

其中

所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Dd为二聚化结构域，其从N端至C端包含铰链区、CH2和CH3结构域，所述铰链区包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头，其中Lk₁包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列，Lk₂包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；并且

所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃，

其中

在其他实施方案中，如前所述的任一融合蛋白还包含信号肽。优选地，信号肽位于融合蛋白的N端。在一具体实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

在一实施方案中，如前所述的任一融合蛋白在N端包含信号肽，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述融合蛋白形成二聚体或多聚体。

核酸、载体和宿主细胞

在另一方面，本发明提供分离的多核苷酸，其编码本发明的融合蛋白。在一些优选实施方式中，所述多核苷酸编码本发明的融合蛋白的前体。可以通过本领域公知的方法获得所述多核苷酸，例如，重组DNA技术、化学合成等。通常可以针对用于表达的宿主细胞对多核苷酸进行密码子优化。

本发明还提供一种表达载体，其包含本发明的多核苷酸。利用本发明的多核苷酸构建合适的表达载体的方法是本领域技术人员所公知的，包括但不限于体外重组DNA、化学合成和体内重组(遗传重组)等。

本发明还提供一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸或表达载体。合适的宿主细胞包括但不限于原核细胞(例如，大肠杆菌)和真核细胞(例如，酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞)。在优选的实施方案中，宿主细胞为猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293F细胞或免疫效应细胞(例如效应T细胞)。在一实施方案中，宿主细胞为酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。在一实施方案中，宿主细胞为效应T细胞。

融合蛋白的生产方法

本发明的另一方面涉及一种方法，其用于生产本发明的融合蛋白，所述方法包括：

(i)在适合多核苷酸或表达载体表达的情况下培养本发明的宿主细胞，和

(ⅱ)从所述宿主细胞或其培养物回收本发明的融合蛋白。

可以采用本领域已知的各种方法将本发明的多核苷酸或表达载体(特别是本发明的编码融合蛋白表达前体的多核苷酸或表达载体)导入合适的宿主细胞中。这类方法包括但不限于脂质体转染、电穿孔、稳定转染、磷酸钙转染等。在一些实施方案中，为了进一步纯化本发明的融合蛋白，可以使用常规的亲和层析、离子交换层析、疏水性相互作用层析、反相层析、凝胶过滤或其组合。

缀合物

本发明进一步提供一种缀合物，其包含与至少一种治疗剂缀合的本发明的融合蛋白。

如本文所用，“缀合”是指两个或多个部分通过共价或非共价作用相互连接。优选地，本发明的融合蛋白和至少一种治疗剂共价缀合。

在一些实施方案中，所述治疗剂选自可检测标记物、化疗剂、细胞毒素、放射性核素、免疫检查点抑制剂、细胞因子和酶。

在一些实施方案中，治疗剂为可检测标记物，例如荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。

在一些实施方案中，治疗剂为细胞毒素。细胞毒素的实例包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、癌霉素、刺孢霉素、美坦生、阿里他汀、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。

在一些实施方案中，治疗剂为化疗剂。化疗剂的实例包括但不限于抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺)、烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(Ⅱ)(DDP)顺铂)、氨茴霉素类(例如，柔红菌素和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素D、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。在一些实施方案中，治疗剂为生物活性蛋白，例如具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素。

在一些实施方案中，治疗剂为细胞因子。细胞因子的实例包括但不限于肿瘤坏死因子(例如TNFα和TNFβ)、干扰素(例如INFα、INFβ和INFγ)、白介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL21和IL-23)、集落刺激因子(例如巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子、多重集落刺激因子、干细胞因子)、生长因子(例如VEGF、HGF、FGF、FGF-2、PDGF、IGF、TGF、NGF、EPO和EGF)和趋化因子。

在一些实施方案中，治疗剂为免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂的实例包括针对免疫检查点分子(例如PD-L1、PD-1、CTLA4、LAG-3、BTLA、TIM-2、LAIR1、HVEM和TIM-4)的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段可以选自合成抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、人抗体、非人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、单域抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)₂片段、Fv片段、dsFv片段、Fd片段、Fd’片段、scFv、scFab、双抗体。

在一些实施方案中，治疗剂为放射性核素。放射性核素的例子包括但不限于碘125、碘131、铟111、铟131、钇90、铑105、铋212和镥177。

治疗剂还可以是能够产生可检测产物的酶(例如辣根过氧化物酶)、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))和任何形式的纳米颗粒等。

制备缀合物的方法是本领域技术人员已知的。例如，可以利用本领域使用的接头技术将上述治疗剂与本发明的融合蛋白缀合。已经用于细胞毒素缀合的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和肽接头。或者，可以利用重组DNA技术将编码蛋白治疗剂(例如如上所述的细胞因子、抗体或其抗原结合片段、生物活性蛋白或者酶)的多核苷酸与编码本发明的融合蛋白的多核苷酸可操作地连接并在合适的宿主细胞中表达。

药物组合物

本发明进一步提供一种药物组合物，其包含：(ⅰ)本发明的融合蛋白或缀合物；以及(ⅱ)药学上可接受的载剂。

在本文中，“药学上可接受的载剂”包括生理学相容的任何和所有的物质。药学上可接受的载剂的非限制性实例包括：溶剂(例如水或油)、分散剂、助悬剂、包衣、稀释剂、佐剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯、亚硫酸钠、丁羟茴醚(BHA)、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、α-生育酚等)、赋形剂、防腐剂(例如抗细菌剂和抗真菌剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯类、泊洛沙姆、triton、辛基糖苷钠、十二烷基硫酸钠、月桂硫酸钠、月桂基-磺基甜菜碱、聚乙二醇、聚丙二醇等)、湿润剂、乳化剂、填充剂、碳水化合物(例如果糖、蔗糖、海藻糖、甘露糖、葡聚糖、环糊精等)、氨基酸(例如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸)、缓冲剂(例如醋酸、盐酸、硫酸、组氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐)、稳定剂、螯合剂(例如EDTA)、等渗剂和延迟吸收剂(例如单硬脂酸盐和明胶)等。优选地，载剂适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。

本发明的融合蛋白、缀合物或药物组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。或者，本发明的融合蛋白、缀合物或药物组合物也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

可以将药物组合物制备成各种适于给药的剂型，例如溶液、悬液、微乳状液、乳剂、脂质体、片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释剂等形式。在一些实施方案中，将所述药物组合物制备为注射液、粉剂或脂质体。

治疗

本发明提供的融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物用于治疗和/或预防癌症。在一实施方案中，所述融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物用于激活GITR信号传导和抑制TGF-β信号传导。在一实施方案中，所述融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物用于在有需要的受试者中诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应。在一实施方案中，所述融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物用于诱导、促进、增强、激活或延长有需要的受试者中针对肿瘤或肿瘤细胞的免疫反应。在一实施方案中，所述融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物用于激活效应T细胞，例如CD8⁺效应T细胞。

本发明还涉及本发明的融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物在制备药物中的用途。在一实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防癌症。在一实施方案中，所述药物用于激活GITR信号传导和抑制TGF-β信号传导。在一实施方案中，所述药物用于在有需要的受试者中诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应。在一实施方案中，所述药物用于诱导、促进、增强、激活或延长有需要的受试者中针对肿瘤或肿瘤细胞的免疫反应。在一实施方案中，所述药物用于激活效应T细胞。在一实施方案中，所述T细胞为CD8⁺效应T细胞。

本发明进一步提供一种治疗和/或预防癌症的方法，其包括向有需要的受试者给药治疗有效量的本发明的融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物。在一实施方案中，所述方法诱导、促进、增强、激活或延长有需要的受试者中针对肿瘤或肿瘤细胞的免疫反应。

本发明还提供一种诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应的方法，其包括施用本发明的融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物。

本发明还提供一种激活GITR信号传导和抑制TGF-β信号传导的方法，和/或激活效应T细胞的方法，其包括施用本发明的融合蛋白、多核苷酸、缀合物或药物组合物。

在本文中，术语“癌症”或“肿瘤”是指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理状况。癌症的非限制性的实例包括但不限于腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤和白血病。癌症的更具体实例包括：鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌诸如肝细胞癌、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤(诸如多发性骨髓瘤)、唾液腺癌、肾癌诸如肾细胞癌和威尔曼瘤、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌及各种类型的头颈癌。

在一实施方案中，癌症选自腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、威尔曼瘤、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌和头颈癌。

如本文中所使用的，术语“受试者”是指哺乳动物，包括但不限于，山羊、绵羊、猪、大鼠、小鼠、兔、豚鼠、牛、马、狗、猫、非人灵长类动物(例如大猩猩、狒狒和黑猩猩)和人。在一些实施方案中，所述受试者是人。

联合治疗

本发明的融合蛋白、缀合物或药物组合物可以与其他治疗剂联用。其他治疗剂包括例如化疗剂、免疫检查点抑制剂或靶向肿瘤相关抗原的抗体。在一实施方案中，其他治疗剂为免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点抑制剂为抗PD-L1抗体、抗PD-1抗体、抗CTLA4抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体或其组合。

本发明的融合蛋白、缀合物或药物组合物和其他治疗剂可以全部在一次施用或分开施用。当分开施用时(采用互相不同的施用方案的情况下)，它们可以连续施用而不中断或以预定的间隔施用。本发明的融合蛋白或本发明的药物组合物还可以与放疗联合使用，例如包括向患者施用电离辐射，其早于、在其过程中和/或晚于本发明的融合蛋白或药物组合物的施用过程。

试剂盒

本发明还涉及一种试剂盒，其包括本发明的融合蛋白、编码其的多核苷酸或表达载体或者其组合，以及使用说明。试剂盒一般包括表明试剂盒内容物的预期用途和/或使用方法的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式随试剂盒提供的任何书面的或记录的材料。

有益效果

本发明的融合蛋白实现以下有益效果：

1)以较高的亲和活性结合TGF-β和GITR；

2)优异的激活GITR信号传导和抑制TGF-β信号传导的活性；

3)优异的T细胞激活活性；以及

4)优异的肿瘤抑制活性。

进一步的，本发明的融合蛋白可以包含TGFBR2-ECD突变体，与包含野生型TGFBR2-ECD的融合蛋白相比，包含TGFBR2-ECD突变体的融合蛋白在生产过程中不易发生断裂和降解，表现出更高的稳定性。

此外，本发明的融合蛋白靶向GITR和TGF-β双靶点，能够在激活GITR的同时阻遏TGF-β。相比于单靶向GITR的GITRL胞外结构域三聚体蛋白336B11和抗GITR激动剂抗体36E5，本发明的融合蛋白激活效应T细胞的活性更高。本发明首次提出了这种双靶向融合蛋白产品，在临床上有较大的应用潜力。

实施例

通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。

除非另外指明，实施例部分中所用的试剂和仪器都是可商购的。

实施例1 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白的构建与生产

将野生型TGFBR2-ECD(SEQ ID NO:4)和单链GITRL胞外结构域三聚体(SEQ ID NO:3，其包含由接头连接的3个GITRL胞外结构域)通过Fc片段连接，构建并产生GITR/TGF-β双靶向融合蛋白C2(SEQ ID NO:17)(见表2)。

带有野生型TGFBR2-ECD的融合蛋白C2(如实施例2所示)容易发生降解，产生包含单链GITRL胞外结构域三聚体和Fc片段的大片段和含有TGFBR2-ECD的小片段(见图1)。经质谱检测发现，融合蛋白发生降解的位点主要位于野生型TGFBR2-ECD的N端的三个区域，即第一区域Q-K-S和第二区域N-NDM-I(其中“-”表示断裂点)，以及第三区域“DNNG”(见表1)。此外，由于断裂产生的主要降解物中Fc部分结构完整，以常规的Protein A介质无法有效去除降解产物，对下游纯化工艺的开发带来巨大挑战，严重影响分子成药性开发。因此在采用TGFBR2-ECD作为融合蛋白一部分时，不管在融合蛋白中的顺序如何，都需要针对三个区域或三个区域及其上下游序列同时进行针对性的有效突变，从而获得高质量的融合蛋白。

基于野生型TGFBR2-ECD的序列(SEQ ID NO:4)，针对上述三个区域及其上下游区域进行突变改造，获得TGFBR2-ECD突变体用于融合蛋白的制备。具体地，向野生型TGFBR2-ECD的三个区域的中引入亲水性的甘氨酸(G)和/或亲水性且可发生潜在O-糖基化修饰的丝氨酸(S)，获得的TGFBR2-ECD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；向野生型TGFBR2-ECD的上述三个区域及其上下游区域引入广泛的亲水性氨基酸，特别是可发生潜在O-糖修饰的丝氨酸(S)和苏氨酸(T)，获得的TGFBR2-ECD突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示(见表1)。

表1

注：三个区域用下划线示出；TGFBR2-ECD突变体中包含的氨基酸突变以加粗字体示出。

最终构建GITR/TGF-β双靶向融合蛋白C12(TGFBR2-ECD突变体位于融合蛋白的N端，式(1)，SEQ ID NO:15)、C15(TGFBR2-ECD突变体位于融合蛋白的C端，式(2)，SEQ ID NO:16)和C2(野生型TGFBR2-ECD位于融合蛋白的C端，式(2)，SEQ ID NO:17)(见表2)。

同时构建并产生单靶向蛋白336B11(氨基酸序列参见CN107406878A中的336B11)和B22作为对比蛋白，其中336B11为GITR单靶向蛋白(单链GITRL胞外结构域三聚体融合至Fc片段的N端)，B22为TGF-β单靶向蛋白(野生型TGFBR2-ECD融合至Fc片段的N端)(见表2)。

利用基因全合成及分子克隆技术将编码GITR/TGF-β双靶向融合蛋白或者对比蛋白(均在N端包含分泌信号肽，信号肽的示例性序列示于SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)的多核苷酸序列克隆至表达载体pCDNA3.4(购自Thermo Fisher)中，将获得的真核表达载体瞬转ExpiCHOS进行常规表达，经过10天左右的无血清细胞培养，收集培养上清用Protein A介质柱层析进行纯化，得到的本发明融合蛋白和对比蛋白的结构示于表2。

表2

实施例2 SDS-PAGE检测GITR/TGF-β双靶向融合蛋白的纯度情况

如实施例1所述的融合蛋白C15和C2经Protein A介质一步纯化后，通过还原性蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白纯度检测。

还原性蛋白凝胶电泳：取样品加入适量上样缓冲液，其中一份样品加入DTT进行还原，还原样品70℃水浴加热10分钟后，上样2μg，经10％蛋白凝胶电泳分离。实验结果如图1所示，泳道1为C15(含有TGFBR2-ECD突变体)，泳道2为C2(含有野生型TGFBR2-ECD)。

由图1可知，泳道1中显示一条主要蛋白条带，其与目的蛋白C15(SEQ ID NO:15)的预期分子量一致。泳道2中显示三条主要蛋白条带，其中分子量最大的条带与目的蛋白C2(SEQ ID NO:16)的预期分子量一致，另外两条蛋白条带为C2在TGFBR2-ECD的N端发生分子间断裂而产生的降解产物，分别对应于包含单链GITRL胞外结构域三聚体和Fc片段的大片段(降解条带1)和含有TGFBR2-ECD的小片段(降解条带2)。由此可见，C2相比于C15发生显著降解。通过包含TGFBR2-ECD突变体，GITR/TGF-β双靶向融合蛋白的降解得到有效控制。

实施例3 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外结合TGF-β的活性

测试目的：通过ELISA检测单靶向和双靶向融合蛋白对TGF-β的结合活性，来比较不同结构设计的双靶向融合蛋白样品体外对TGF-β结合的优劣，其中B22用作阳性对照。

测试样品：如实施例1制备的B22、C15、C12和C2。

测试步骤：

a.将0.5μg/ml浓度的人源TGF-β(购自Acro)直接包被至96孔板，100μl/孔，4℃过夜。

b.250μl/孔1×PBS洗涤3次，加入250μl/孔2％BSA-PBS，37℃封闭2小时。

c.250μl/孔1×PBS洗涤3次，加入梯度稀释的样品B22、C15、C12和C2，100μl/孔，37℃孵育1小时。

d.250μl/孔1×PBST洗涤3次，加入100μl/孔anti-human Fc antibody-HRP(1：5000)，37℃孵育1小时。

e.250μl/孔1×PBST洗涤3次，加入100μl/孔TMB，37℃孵育10分钟，2M盐酸终止反应。

f.酶标仪上检测450nm吸收值，Graphpad Prism5分析数据。

结果：融合蛋白体外结合TGF-β的ELISA结果如图2和表3所示，结果显示C2、C12和C15均具有TGF-β结合活性。从EC₅₀(nM)来看，C12和C15的TGF-β结合活性相当，并且与B22相当，表明双靶向蛋白C12和C15对TGF-β的结合活性与野生型TGFBR2-ECD相当。此外，C12和C15对TGF-β的结合活性均优于C2，其中C15组合顺序与C2一致，但C12、C15均采用了TGFBR2-ECD的突变体，而C2采用的野生型TGFBR2-ECD。如实施例2所示，包含野生型TGFBR2-ECD的双靶向融合蛋白C2容易发生降解，这可能是导致其TGF-β结合活性较低的原因之一。

表3

实施例4 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外结合hGITR的亲和力和动力学

检测目的：通过

Octet RED96测定GITR/TGF-β双靶向融合蛋白对hGITR的亲和力。

检测样品：如实施例1制备的C12和336B11以及抗GITR激动剂抗体36E5(氨基酸序列参见CN103951753A)。

检测流程：

a.偶联配体：本方法采用HIS1K(Anti-Penta-HIS biosensor，ForteBio)芯片，提前用SD缓冲液浸泡芯片10-15分钟，以50μg/ml浓度加载配体(hGITR)，预设时长300秒，配体Loading预设值1nm，用运行缓冲液(SD缓冲液)浸润芯片至基线平稳，去除游离配体。

b.动力学实验：将C12、336B11和36E5用SD缓冲液各自稀释至50nM。以样品为分析物，hGITR为配体，进行亲和力检测实验。配体与分析物结合时间(Association)200秒，分析物解离时间(Dissociation)300秒。

c.以ForteBio Data Analysis 9.0采用静态拟合模型进行分析。

检测结果：动力学分析过程如图3所示，亲和力结果如表4所示。从表4可知，C12对hGITR的亲和力显著优于36E5，并且与336B11的亲和力相当。

表4

样品	K<sub>D</sub>(M)	k<sub>on</sub>(1/Ms)	k<sub>dis</sub>(1/s)
				C12	5.17E-10	6.34E+05	3.28E-04
336B11	5.24E-10	5.39E+05	2.82E-04
				36E5	3.56E-09	2.07E+05	7.38E-04

实施例5 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外结合CHOS-hGITR细胞的活性

检测样品：如实施例1制备的C12和C15。

检测流程：

a.以膜蛋白hGITR全序列(Uniprot ID:Q9Y5U5)重组载体转染CHOS细胞，转染24小时后加压筛选，采用选择培养基(CD FortiCHO^TM培养基+15μmol/L MSX+10μg/ml嘌呤霉素)，直至细胞活率上升。采用有限稀释法筛选单克隆细胞株，将单克隆细胞株与336B11共孵育，随后去除上清，加入anti-human IgG-488(Invitrogen，1:2000)作为检测抗体，使用流式细胞仪筛选出平均荧光强度(MFI)较高且峰形较好的细胞株，作为稳定转染CHOS-hGITR细胞株待用。

b.将样品C12和C15按照浓度梯度与CHOS-hGITR单克隆细胞株在室温下孵育1小时；用PBS冲洗2次，加入anti-human IgG-488(Invitrogen，1:2000)与细胞在室温下孵育45分钟，再用PBS冲洗2次；然后用流式细胞仪检测荧光信号并计算EC₅₀。

检测结果：结果如图4和表5所示，从EC₅₀(nM)的结果可以看出C12对CHOS-hGITR细胞的结合活性略优于C15。

表5

实施例6 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外激活GITR的活性

GITR Blockade Bioassay是依赖细胞的生物发光检测方法，其检测原理是：当向表达GITR的遗传工程化的细胞系GS-H3/GITR细胞(金斯瑞提供)加入GITR激动剂时，引起GITR激活和NFAT控制下的萤光素酶基因的表达，随后可以通过加入萤光素酶检测试剂(Bio-Glo，Promega；含有萤光素酶底物萤光素和反应缓冲液)来检测萤光素酶催化底物产生的发光(luminescence)信号，从而评价GITR激动剂激活GITR的活性。

检测样品：如实施例1制备的C12和C15，抗GITR激动剂抗体36E5(阳性对照)以及IgG同种型(阴性对照)。

GITR激动剂功能活性检测实验步骤如下：

a.离心收集靶细胞，使用含有10％FBS的EMEM Nutrient Mixture培养基重悬细胞并调整细胞密度，接种于384孔实验板中。

b.将实验板转移至细胞培养箱(37℃/5％CO₂)中孵育16小时。

c.使用测定缓冲液配置2×浓度的对照品和供试品。

d.离心收集效应细胞，使用测定缓冲液重悬细胞并调整细胞密度。

e.将完成孵育的384孔实验板从细胞培养箱中取出并移除培养基，依次转移对照品和供试品工作液及效应细胞悬液至384孔实验板中。

f.将实验板转移至细胞培养箱(37℃/5％CO₂)中孵育约6小时。

g.配制荧光素酶底物工作液。

h.将完成孵育的384孔实验板从细胞培养箱中取出，转移荧光素酶底物工作液至384孔实验板中。

i.在PHERA Star FSX上读取化学发光值，记录数据。

j.数据分析：依据相对化学发光信号值(Relative Luminescence Unit)和最终检测浓度的对应关系建立相应的量效曲线图。

检测结果如图5和表6所示，抗GITR激动剂抗体36E5可有效结合GITR，并激活下游通路产生信号，阴性对照IgG同种型无法和GITR结合，无法激活下游通路产生信号。C12和C15均可以激活下游信号通路，活性相当，并且样品的量效曲线EC₅₀以及量效最大值都明显优于36E5。

表6

实施例7 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白的体外抑制TGF-β活性

TGF-β受体报告基因实验(TGF-βreceptor Reporter Gene Bioassay)是依赖基因工程化的细胞系的生物发光检测方法。当TGF-β蛋白与细胞表面的TGF-β受体结合之后，受体介导的信号转导通路被激活从而诱导萤光素酶的表达，然后通过加入萤光素酶检测试剂(Bio-Glo，Promega)来读取萤光素酶催化底物产生的发光信号。加入抗TGF-β抗体或抑制剂之后阻断TGF-β与其受体结合，导致发光信号降低。本实验采用A549/SBE细胞(金斯瑞提供)作为功能性细胞系，以抗体TGF-β抗体BMK-R2(金斯瑞)作为阳性对照，用以评估GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外阻断TGF-β的活性。

检测样品：如实施例1制备的C12和抗TGF-β抗体BMK-R2。

实验流程描述如下：

a.离心收集靶细胞，使用含有10％FBS的F12K Nutrient Mixture培养基重悬细胞并调整细胞密度，接种于96孔实验板中。

b.将实验板转移至细胞培养箱(37℃/5％CO₂)中孵育16小时。

c.使用测定缓冲液配置7×浓度的EC100对照品和供试品。

d.将完成孵育的96孔实验板从细胞培养箱中取出，依次转移TGF-β1(EC100)，对照品和供试品工作液至96孔实验板中。

e.将实验板转移至细胞培养箱(37℃/5％CO₂)中孵育约24小时。

f.配制荧光素酶底物工作液。

g.将完成孵育的96孔实验板从细胞培养箱中取出，转移荧光素酶底物工作液至96孔实验板中。

h.在PHERA Star FSX上读取化学发光值，记录数据。

i.数据分析，依据相对化学发光信号值(Relative Luminescence Unit)和最终检测浓度的对应关系建立相应的量效曲线图。

实验结果示于图6和表7。由图6和表7可知：阳性对照(BMK-R2)可有效和TGF-β结合，并抑制下游通路产生信号，其量效曲线的IC₅₀为0.226nM，阴性对照(Human IgG1)无法和TGF-β结合，无法抑制下游通路产生信号。样品C12可有效和TGF-β结合，并抑制下游通路产生信号，其量效曲线的IC₅₀为0.29nM，与BMK-R2活性相当。

表7

实施例8 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白体外活化效应T细胞的活性

检测样品：如实施例1制备的C12、C15、336B11以及抗GITR激动剂抗体36E5。

实验采用Raji细胞交联方式检测融合蛋白活化T细胞的活性，检测指标为IFN-γ，步骤如下：

1.包被0.2μg/ml OKT3至96孔板上；

2.加入分离的T细胞(购自睿智化学)，培养4天；

3.取出T细胞，停止预刺激，放置2天；

4.以1×10⁵细胞/孔将Raji细胞加入预先结合2μg/ml OKT3的96孔中；

5.加入样品蛋白C12、C15、36E5和336B11，最高浓度为50μg/ml或者10μg/ml，5倍梯度稀释，每个样品4个浓度梯度，每个浓度3个复孔；

6.混合T细胞，按照1E5/孔的浓度加入96孔板，培养4天；

7.收集上清，用ELISA检测IFN-γ含量。

结果如图7和图8所示：根据T细胞被激活后释放的细胞因子IFN-γ含量，可以得知C12活化效应T细胞的活性远高于阳性对照抗体36E5和单靶向蛋白336B11，并且高于C15。由此可见，本发明的双靶向融合蛋白C12活化效应T细胞的活性优于单靶向GITR的GITRL胞外结构域三聚体蛋白336B11和抗GITR激动剂抗体36E5。另外C12的效果优于C15，推测C12的结构对双靶向融合蛋白最为有利，C15可能在功能发挥上存在空间位阻，这与实施例5和实施例6结果一致。

实施例9 GITR/TGF-β双靶向融合蛋白的体内肿瘤抑制活性

在鼠源结肠癌MC38-OVA细胞株皮下移植C57BL/6-hGITR雌性转基因小鼠动物模型中测试本发明的融合蛋白的抗肿瘤作用。

收集指数生长期的MC38-OVA细胞(中美冠科生物技术有限公司)，以1×10⁶细胞/小鼠的剂量于第0天(Day 0)在右侧背部皮下接种C57BL/6-hGITR小鼠，接种肿瘤细胞后第3天(Day 3)，称量所有动物的体重。根据小鼠的体重对其分组，以保证不同组别间的体重相似，每组9只，共2组。腹腔注射给药，分别于接种肿瘤细胞后第3、6、9、12天给药，共给药四次。给药剂量试验组为C12 30mg/kg，对照组为等体积溶媒(PBS溶液)，从第6天(Day 6)开始，每周测量两次小鼠的体重和肿瘤的大小。

结果显示，实验过程中，动物健康状态良好，小鼠对各治疗抗体耐受性良好。治疗组和对照组的肿瘤生长情况见图9。溶媒对照组小鼠在给药结束后第8天(Day 20)的平均肿瘤体积为897.16mm³。融合蛋白C12(30mg/kg)治疗组在Day 20的平均肿瘤体积为363.98mm³，相对肿瘤抑制率TGI(％)为59％，相较对照组统计学上有显著性差异(p＝0.0498)。溶媒对照组小鼠在给药结束后第12天(Day 24)的平均肿瘤体积为2025.13mm³。融合蛋白C12(30mg/kg)治疗组在Day 24的平均肿瘤体积为1039.94mm³，相对肿瘤抑制率TGI(％)为49％。表明本发明的双靶向融合蛋白C12有显著的肿瘤抑制活性。

相对肿瘤抑制率TGI(％)的计算公式如下：

TGI(％)＝(1-T/C)×100％，其中T和C分别为治疗组和对照组在某一特定时间点的肿瘤体积(TV)。

序列表

序列表

<110> 海正生物制药有限公司

浙江博锐生物制药有限公司

<120> GITR/TGF-β双靶向融合蛋白及其用途

<130> I2021TC5706CS

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 128

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GITRL胞外结构域

<400> 1

Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu

1 5 10 15

Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys

20 25 30

Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe

50 55 60

Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn

65 70 75 80

Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly

85 90 95

Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn

100 105 110

Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

115 120 125

<210> 2

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GITRL胞外结构域

<400> 2

Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys

1 5 10 15

Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp

20 25 30

Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln

35 40 45

Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg

50 55 60

Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys

65 70 75 80

Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile

85 90 95

Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

115 120 125

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GITRL胞外结构域三聚体

<400> 3

Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys

1 5 10 15

Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp

20 25 30

Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln

35 40 45

Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg

50 55 60

Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys

65 70 75 80

Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile

85 90 95

Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ala Lys Glu Pro Cys Met Ala Lys Phe Gly

130 135 140

Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser Glu Pro Pro Cys Val

145 150 155 160

Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu Gln Asn Gly Leu Tyr

165 170 175

Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn Tyr Asn Asp Val Ala

180 185 190

Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp Met Ile Gln Thr Leu

195 200 205

Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly Thr Tyr Glu Leu His

210 215 220

Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser Glu His Gln Val Leu

225 230 235 240

Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu Ala Asn Pro Gln Phe

245 250 255

Ile Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser Thr Ala Lys Glu Pro Cys

260 265 270

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

275 280 285

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

290 295 300

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

325 330 335

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

340 345 350

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

355 360 365

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

370 375 380

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

385 390

<210> 4

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型TGFBR2-ECD

<400> 4

Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr

1 5 10 15

Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 5

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TGFBR2-ECD突变体

<400> 5

Ile Pro Pro His Val Gly Gly Ser Val Gly Gly Ser Gly Ile Val Thr

1 5 10 15

Gly Gly Ser Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 6

<211> 136

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TGFBR2-ECD突变体

<400> 6

Thr Pro Pro His Thr Gln Thr Ser Thr Asn Asn Ser Met Ile Thr Thr

1 5 10 15

Gly Thr Ser Gly Ala Thr Lys Tyr Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp

20 25 30

Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys

35 40 45

Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val

50 55 60

Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp

65 70 75 80

Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro

85 90 95

Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met

100 105 110

Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu

115 120 125

Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp

130 135

<210> 7

<211> 222

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH2-CH3

<400> 7

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

1 5 10 15

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

20 25 30

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

35 40 45

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

50 55 60

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

65 70 75 80

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

485 490 495

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

500 505 510

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

515 520 525

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

530 535 540

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

545 550 555 560

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

565 570 575

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

580 585 590

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

595 600 605

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

610

Claims

1.一种融合蛋白，其从N端至C端包含：

第一多肽–第二多肽–第三多肽式(1)；

或者

第三多肽–第二多肽–第一多肽式(2)；

其中

所述第一多肽包含TGF-βRⅡ的胞外结构域(TGFBR2-ECD)；

所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂，

其中

Dd为二聚化结构域；

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头或不存在；并且

所述第三多肽从N端至C端具有如下结构：

Sd₁–Ln₁–Sd₂–Ln₂–Sd₃，

其中

Sd₁、Sd₂和Sd₃各自独立地为GITRL胞外结构域；

Ln₁和Ln₂各自独立地为接头或不存在。

2.权利要求1的融合蛋白，其中所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQID NO:6的氨基酸序列；优选地，所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

3.权利要求1或2的融合蛋白，其中所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的氨基酸序列；优选地，所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中所述第三多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。

5.权利要求1-4中任一项的融合蛋白，其中所述二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，优选人IgG1的CH2和CH3结构域；更优选地，所述CH2和CH3结构域包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

6.权利要求1-5中任一项的融合蛋白，其中所述第二多肽从N端至C端具有如下结构：

Lk₁–Dd–Lk₂；

其中

Lk₁和Lk₂各自独立地为接头。

7.权利要求1-6中任一项的融合蛋白，其中

所述TGFBR2-ECD包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列；

所述GITRL胞外结构域包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列；并且

所述二聚化结构域从N端至C端包含免疫球蛋白的铰链区或其部分、CH2和CH3结构域，所述铰链区或其部分包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，所述CH2和CH3结构域包含SEQ IDNO:7或SEQ ID NO:8的氨基酸序列。

8.权利要求1-7中任一项的融合蛋白，其中所述接头包含5-25个氨基酸，所述氨基酸各自独立地选自甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸；优选地，所述接头包含(GGGGS)_n，其中n选自1-10的整数；更优选地，所述接头包含SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12的氨基酸序列。

9.权利要求1的融合蛋白，其包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列。

10.一种多核苷酸，其编码权利要求1-9中任一项的融合蛋白。

11.一种表达载体，其包含权利要求10的多核苷酸。

12.一种宿主细胞，其包含权利要求10的多核苷酸或权利要求11的表达载体；

优选地，所述宿主细胞为真核细胞；更优选地，所述宿主细胞为酵母细胞、哺乳动物细胞或免疫效应细胞；进一步优选地，所述宿主细胞为效应T细胞。

13.一种缀合物，其包含与至少一种治疗剂缀合的权利要求1-9中任一项的融合蛋白；优选地，所述治疗剂选自可检测标记物、化疗剂、细胞毒素、放射性核素、免疫检查点抑制剂、细胞因子和酶。

14.一种药物组合物，其包含：

(ⅰ)权利要求1-9中任一项的融合蛋白，以及

(ⅱ)药学上可接受的载剂；

优选的，所述药物组合物制备为注射液。

15.权利要求1-9中任一项的融合蛋白、权利要求10的多核苷酸、权利要求13的缀合物或者权利要求14的药物组合物在制备药物中的用途；

优选地，所述药物用于治疗和/或预防癌症；

或者

所述药物用于激活GITR信号传导和抑制TGF-β信号传导；或者

所述药物用于在有需要的受试者中诱导、促进、增强、激活或延长免疫反应；或者

所述药物用于诱导、促进、增强、激活或延长有需要的受试者中针对肿瘤或肿瘤细胞的免疫反应；

优选地，所述癌症选自腺癌、淋巴瘤、母细胞瘤、黑素瘤、肉瘤、白血病、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、胶质母细胞瘤、神经胶质瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、肝细胞癌、膀胱癌、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤、唾液腺癌、肾癌、肾细胞癌、威尔曼瘤、基底细胞癌、黑素瘤、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、睾丸癌、食管癌和头颈癌。