KR20190103225A - 면역 반응의 조건부 효능제 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 제1 및 제2 항원에 결합하는 항체 분자에 관한 것이며, 제1 항원은 질병 항원, 예를 들면 종양 항원이고, 제2 항원은 면역 세포의 표면 상의 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체 항원이다. 항체 분자는 바람직하게는 CDR-기반 항원-결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인의 2개 이상의 구조적 루프에 위치할 수 있는 항원-결합 부위를 포함한다. 항체 분자는, 예를 들면, 암 치료법에 응용된다.

Description

면역 반응의 조건부 효능제
본 발명은 제1 및 제2 항원에 결합하는 항체 분자에 관한 것이며, 제1 항원은 질병 항원, 예를 들면 종양 항원이고, 제2 항원은 면역 세포의 표면 상의 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체 항원이다. 항체 분자는 바람직하게는 CDR-기반 항원-결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인(constant domain)의 2개 이상의 구조적 루프(structural loop)에 위치할 수 있는 항원-결합 부위를 포함한다. 본 발명의 항체 분자는, 예를 들면, 암 치료법에 응용된다.
세포 신호전달은 박테리아에서부터 고등 진핵생물에 이르기까지 모든 생물체의 생명의 필수적인 부분이다. 이것은 정상적으로 가용성 또는 표면 발현된 리간드와 상호작용하는 세포 표면 수용체를 포함한다. 이러한 상호작용은 수용체 또는 리간드 또는 둘 다에 변화를 초래하며, 이러한 변화는 수용체 세포내 도메인과 상호작용하는 세포내 단백질을 통해 형질도입된다. 리간드의 결합은 수용체에서 형태학적 변화를 유도하여 이들을 이량체 또는 올리고머로 되도록 함께 클러스터링할 수 있다. 그후 이러한 클러스터링 효과는 수용체와 이들의 세포내 신호전달 파트너 사이의 상호작용을 촉진/억제함으로써, 또는 수용체와 다른 세포 표면 수용체 사이의 상호작용을 촉진/억제함으로써 수용체의 세포내 도메인의 키나제 활성을 유도하는 것과 같은 다중 메카니즘에 의해 세포내 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 수용체 티로신 키나제 (RTK, 예를 들어, 상피 성장 인자 수용체 (EGFR)), 신데칸 (syndecans), EpH 수용체 및 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체와 같이 이런 방식으로 활성화되는 수많은 수용체 계열이 있다.
TNFRSF 수용체는 세포 표면에 단량체로서 존재하며 활성화를 위해 이들의 리간드와의 상호작용을 통해 삼량체로 클러스터링함을 필요로 한다. 이러한 클러스터링은 NFkB 세포내 신호전달 경로의 활성화를 초래한다. 이 경로는 TRAF2, 3 및 5와 같은 세포내 신호전달 단백질의 모집 및 IKKα, IKKβ, IKKγ, PI3K의 p85 서브단위, 및 AKT를 함유하는 신호전달 복합체의 형성에 의해 개시된다. 그후, 이러한 신호전달 복합체는 IκBα의 인산화 및 분해를 유도하여, NF-κB1의 활성화와 p50 및 RelA의 핵내 진입을 야기한다. 이것은 증식 및 생존 신호를 야기하는 전사 프로그램을 활성화시킨다. TNFRSF의 구성원은 B 및 T 세포 발달, 생존, 면역 활성화, 및 항암 면역 반응에 중요한 역할을 하는 몇 가지 공동-자극 단백질을 포함한다.
문헌[Wajant (2015) Cell Death Differ., 22(1): 1727-41]은 TNFRSF 수용체-특이 항체는 전형적으로 효능제 활성을 갖지 않거나 단지 매우 온건한 효능제 활성을 가지며, 충분한 수용체 활성화를 유도하기 위해, 단백질 A 또는 G 또는 이차 항체와 같은 외부 가교결합제를 사용한 항체-TNFRSF 수용체 복합체의 2차 가교결합 또는 혈장 막 국부화된 Fc 감마 수용체에의 항체의 결합을 필요로 한다고 보고하고 있다.
TNFRSF 수용체 및 암세포 둘 다를 동시에 표적화하는 폴리펩타이드를 생성하려는 몇 가지 시도가 이루어져 왔다. 예를 들면, Her2-특이 단클론 항체 (mAb) 트라스투주맙에 유전적으로 융합된 항-CD137 안티칼린 단백질은, 트라스투주맙 단독을 능가하는 종양 성장 억제의 개선 없이, 인간화 마우스 모델에서 HER2가 과발현된 부위의 림프구에서 CD137의 종양-표적-의존적 활성화를 제공하는 것으로 보고되었다 (Hinner et al., "Costimulatory T-cell engagement by PRS-343, a CD137 (4-1BB)/HER2 bispecific, leads to tumour growth inhibition and TIL expansion in humanized mouse model", poster presentation at the CRI-CIMT-AACR International Cancer Immunotherapy Conference: Translating Science into Survival; 2016 Sept 25-28; New York, NY., September 25-26, 2016, New York, NY 및 PCT 공보 제WO 2016/177802 A1호).
본 발명자들은 가변 및 불변 도메인 둘 다에 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자가 종양 항원과 같은 질병 항원의 존재하에서 TNFRSF 수용체를 조건부로 활성화시키며 질병-의존적 방식으로, 예를 들면, 종양 미세환경에서 면역 세포를 활성화시키는데 매우 효과적임을 인식하였다. 이것은, 예를 들면, 암 및 기타 질병의 치료를 위한 면역요법에서 유용할 수 있다.
상기 배경 부분에 기술된 바와 같이, TNFRSF 리간드의 이의 동족 수용체에의 초기 결찰은 수용체 삼량체화에 이은 수용체 클러스터링(clustering), 종양 괴사 인자 수용체-관련 인자 (TRAFs)의 활성화 및 강력한 항-종양 T 세포 활성의 후속적인 개시를 유도하는 일련의 사건을 개시한다. 치료제가 효율적으로 활성화를 달성하기 위해, 몇 가지 TNFRSF 단백질이 삼량체성 리간드를 모방하는 방식으로 함께 연결될 필요가 있다.
본 발명자들은 가변 및 불변 도메인에 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자(여기서, 하나의 항원-결합 부위는 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체에 결합하고 다른 것은 종양 항원에 결합한다)는 시험관내에서 종양 항원에 결합될 때 TNFRSF 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있음을 보여주었다. TNFRSF 수용체의 클러스터링 및 신호전달은 TNFRSF 수용체에 대한 결합 부위가 항체 분자의 가변 또는 불변 도메인에 위치하는지 여부에 관계없이 달성될 수 있다. 즉, 항체 분자 내의 두 개의 항원 결합 부위의 배향은, 하나는 TNFRSF 수용체에 결합되고 다른 하나는 종양 항원에 결합되는 한, 중요하지 않았다.
본 발명자들은 또한 상기한 바와 같은 두 개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자는 항체 분자에 의해 결합된 종양 항원이 가용성 다량체(multimer), 예를 들어 이량체 분자인 경우 TNFRSF 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있음을 보여주었다.
본 발명자들은 추가로 상기한 바와 같은 두 개의 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자는 생체내에서 종양 성장을 억제할 수 있음을 보여주었다. 항체 분자 중 하나는 본 발명자들에 의해 시험된 이특이성 분자와 동일한 불변 도메인을 포함하고 다른 하나는 동일한 가변 도메인을 포함하는 두 개의 항체 분자의 조합이 사용되는 경우 어떠한 종양 성장 억제도 보이지 않았다. 이것은 TNFRSF 수용체의 클러스터링과 신호전달 및 이에 따른 면역 세포 활성화 및 상응하는 항-종양 효과를 달성하기 위해 두 개의 결합 부위가 동일한 분자에 존재해야 함을 입증한다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자의 이점 중 하나는 종양 항원과 같은 질병 항원의 존재하에서 TNFRSF 수용체를 조건부로 활성화시킬 수 있다는 것이다. 구체적으로, 다가 종양 항원에 대한 항체 분자의 결합이 종양 항원 부위에서 항체 분자의 클러스터링을 유발하며, 이것이 결국 면역 세포 표면 상에서 TNFRSF 수용체의 클러스터링 및 활성화를 야기하는 것으로 생각된다. 결과적으로, 항체 분자는 종양 미세 환경 외부에서 클러스터링을, 있다 하더라도, 덜 보이기 때문에 표적을 벗어난 효과 (off target effect)를 감소시킬 가능성이 있다. 따라서, 항체 분자의 효능제 활성은 종양 항원과 TNFRSF 수용체 둘 다가 존재하는 환경으로 제한된다. 다시 말하면, 효능제 활성은 조건적이다. 또한, 다가 종양 항원의 존재하에서의 항체의 클러스터링은, 항체 분자의 효능제 활성의 증가가 항체 분자의 결합 부위 둘 다가 이들 각각의 표적에 결합될 때에는 관찰되지만 단지 하나의 결합 부위가 결합될 때에는 관찰되지 않았기 때문에, 항체 분자의 제2 결합 부위를 통해 결합된 TNFRSF 수용체의 클러스터링을 돕는 것으로 생각된다.
본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자는 이들의 가변 및 불변 도메인 둘 다에 항원-결합 부위를 포함한다. 항체 분자에 의한 종양 항원 및 TNFRSF 수용체 둘 다의 결합은 종양 미세환경에서 TNFRSF 수용체를 발현하는 면역 세포와 종양 항원 사이에 브릿징(bridging)을 야기하는 것으로 생각된다.
특히, 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자는 가변 도메인에 두 개의 항원-결합 부위를 포함하고 불변 도메인에 두 개의 항원-결합 부위를 포함한다. 따라서, 결합 부위 둘 다는 2가이다. 이것은 다수의 추가적인 이점을 갖는다. 예를 들면, 두 가지 표적 모두의 2가 결합은 종양 미세환경에서 TNFRSF 수용체를 발현하는 면역 세포와 종양 항원 간의 브릿징을 더욱 안정하게 만들고 이에 의해 면역 세포가 종양 미세환경에 국부화되어 종양에서 작용할 수 있는 시간을 연장시킬 것으로 기대된다. 예를 들면, 불변 도메인 결합 부위가 종양 항원에 2가 결합하는 경우, 이것이 종양 항원과 면역 세포 사이의 브릿징을 안정화시켜, 항체 분자의 가변 도메인 결합 부위가 면역 세포 표면 상에서 TNFRSF 수용체에 결합하여 이를 클러스터링함으로써 이들의 효과를 발휘하도록 하는 것으로 생각된다. 유사하게, 불변 도메인 결합 부위가 TNFRSF 수용체에 결합하는 경우, 이것이 또한 종양 항원과 면역 세포 사이의 브릿징을 안정화시키는 것으로 생각되며 놀랍게도 면역 세포 표면 상에서 TNFRSF 수용체의 클러스터링 및 활성화를 야기하는 것으로 나타났다. Fab 아암(arm)이 이들의 표적으로 이동하여 표적에 결합하도록 하는 힌지 영역의 항체 분자의 알려진 가요성과 비교하여 강성 구조 및 항체 분자의 불변 도메인 사이의 작은 분자 거리 (특히 두 개의 CH3 도메인)을 고려해 볼 때 이것은 놀라운 것이다. 불변 도메인 결합 부위의 단단한 기하구조에 비추어 볼 때, 불변 도메인 결합 부위가 초기에는 세포막에 아주 근접하지 않을 수 있는 TNFRSF 수용체의 클러스터링-구동 작용(agonism)을 유도할 수 있을 것으로 기대되지 않았다. 그러나, 본원에 기술된 본 발명자들에 의해 수득된 결과는, 이러한 결합이 시험관내 및 생체내 둘 다에서 가능하다는 것을 명백히 보여준다. 또한, 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자의 결합 부위 둘 다가 2가라는 사실은 결합 부위 중 어느 하나가 결합될 때 TNFRSF 수용체를 클러스터링하고 이에 따라 TNFRSF 수용체를 활성화시키는 작용을 할 수 있어, 항체 분자에서의 두 개의 결합 부위의 설계 및 배향에 유연성을 허용한다는 것을 의미한다.
대다수의 알려진 이특이성 항체는 이종이량체이며 각 Fab 아암을 통해 하나의 표적 항원에만 결합한다. 이러한 1가 상호작용은 종종 TNFRSF 수용체와 같은 항원의 클러스터링 및 이에 따라 이러한 수용체를 발현하는 면역 세포의 작용을 유도하기에는 불충분하다.
본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자의 추가의 특징은 종양 항원 및 TNFRSF 수용체에 대한 두 개의 항원 결합 부위가 둘 다 항체 구조 자체 내에 함유된다는 것이다. 특히, 항체 분자는 다른 단백질이 링커 또는 이의 표적 둘 다에 2가 결합하는 분자를 생성하는 다른 수단을 통해 항체 분자에 융합되는 것을 필요로 한다. 이것은 다수의 이점을 갖는다. 구체적으로, 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자는, 이들이 추가의 융합된 부분을 포함하지 않기 때문에, 표준 항체의 생산에 사용되는 것과 유사한 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 구조는 또한, 링커가 시간이 지남에 따라 분해되어 항체 분자의 이종 집단을 생성할 수 있기 때문에, 항체 안정성을 개선시킬 것으로 기대된다. 단지 하나의 융합된 단백질을 갖는 집단의 이러한 항체는 TNFRSF 수용체의 조건부 작용을 유도할 수 없을 것이다. 링커의 절단/분해는 환자에게 치료제를 투여하기 전 또는 투여한 후에 (예를 들어, 효소적 절단 또는 환자의 생체내 pH를 통해) 발생할 수 있으며, 이에 의해 환자에서 순환하면서 이의 효과의 감소를 초래할 수 있다. 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자에는 어떠한 링커도 없기 때문에, 항체 분자는 투여 전 및 투여 후 둘 다에서 동일한 수의 결합 부위를 보유할 것으로 기대된다. 게다가, 본 발명자들에 의해 확인된 항체 분자의 구조는, 분자가 환자에게 투여될 때 융합 단백질 또는 링커 또는 둘 다의 도입이 면역원성을 유도하여 치료제의 유효성을 감소시킬 수 있기 때문에, 분자의 면역원성의 관점에서 또한 바람직하다.
따라서, 본 발명의 측면은 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 항체 분자를 제공하며, 상기 항체 분자는 다음을 포함하고:
(i) 제1 항원을 위한 상보성 결정 영역 (CDR)-기반 항원-결합 부위; 및
(ii) 항체 분자의 불변 도메인에 위치한 제2 항원을 위한 항원-결합 부위(여기서, 상기 항원-결합 부위는 불변 도메인의 하나 이상의 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다);
여기서 제1 및 제2 항원 중의 하나는 질병 항원이고 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체이다.
바람직하게는, 항체 분자는 IgG와 같은 전체 항체(whole antibody)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 본원에 기술된 항체 분자를 암호화하는 단리된 핵산, 상기 단리된 핵산을 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 약제로서 사용하기 위한 본원에 기술된 항체 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 본원에 기술된 항체 분자; 암의 치료에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기술된 항체 분자의 용도; 및 본원에 기술된 항체 분자를 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함하여 암을 치료하는 방법을 제공한다.
기타의 측면들 및 양태들이 아래에 기술된다.
도 1은 본 발명의 2가 이특이성 항체 분자의 제안된 작용 메카니즘을 보여준다. 예시된 항체 분자는 분자의 어느 말단에 항원-결합 부위를 포함한다. 분자의 하나의 말단에서의 항원-결합 부위(들)는 종양 항원과 결합할 수 있고 반대 말단의 항원-결합 부위(들)는 면역 세포 상의 TNFRSF 수용체와 결합할 수 있다. 항체 분자의 양 말단이 예시된 바와 같이 맞물리는 경우, 이것은 매우 근접한 다중 수용체 분자의 가교결합 및, 결과적으로, 수용체의 클러스터링 및 활성화를 초래한다. 도 1에서, 항체 분자의 Fc 말단은 TNFRSF 수용체를 표적화하고 있고 Fab 말단은 종양 항원을 표적화하고 있다. 그러나, 본원에서 입증된 바와 같이, Fab 말단이 TNFRSF 수용체를 표적화하고 Fc 말단이 종양 항원을 표적화하는 반대 배향의 항체 분자가 또한 조건부 작용을 유도할 수 있다.
도 2는 다양한 항체 분자의 존재하에서 hCD20-발현 다우디(Daudi) 세포를 함유하는 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, 없음/hCD20, 없음/mTNFRX, mTNFRX/없음, mTNFRX/FITC 및 mTNFRX/hCD20)에 따라 표지된 여섯 개의 상이한 항체 분자가 이 검정에서 증가하는 농도로 사용되었다. TNFRX는 T 세포 상에서 발현되는 TNFRSF 수용체이다. 도면 범례에 명시된 바와 같은 가교결합제가 사용되었다. 이들은 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 (FITCdex) 및 항-인간 IgG Fc 항체 (a-hFc)이었다. 결과는 mTNFRX 수용체가 표적화되고 항-mTNFRX 항체가 가교결합제의 사용 및 hCD20 결합에 의해 매개되는 가교결합을 둘 다를 통해 가교결합될 때 T 세포의 활성화가 증가한다는 것을 보여준다. mTNFRX/hCD20 mAb2 항체 분자는 가교결합제의 존재하에서의 다른 항체 분자에 비해 상당히 더 낮은 EC50으로 가교결합제의 부재하에 T 세포를 활성화시킬 수 있었다.
도 3은 다양한 항체 분자의 존재하에서 EpCAM- 및 CD73-발현 4T1 세포를 함유하는 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적(없음/FITC, mTNFRX/FITC, 없음/mEpCAM, mTNFRX/mEpCAM, 없음/mCD73, mTNFRX/mCD73 및 없음/mTNFRX)에 따라 표지된 일곱 개의 상이한 항체 분자가 이 검정에서 증가하는 농도로 사용되었다. 도면 범례에 명시된 바와 같은 FITCdex 및 a-hFc 가교결합제가 사용되었다. 두 개의 mAb2 항체 분자 (mTNFRX/mEpCAM 및 mTNFRX/mCD73)는 시험된 항체 분자 중에서 T 세포를 활성화시키는데 최저 EC50 값을 가졌다. 결과는, CD73은 GPI-연결된 세포 표면 수용체이고 EpCAM은 막관통 당단백질이기 때문에, 하나 이상의 유형의 세포 표면 수용체가 항-TNFRX Fcab과 쌍을 이루기 위해 사용될 수 있음을 입증한다.
도 4는 다양한 항체 분자의 존재하에서 hEGFR-발현 CT26 세포를 함유하는 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, mTNFRX/FITC, 없음/mTNFRX, hEGFR/FITC, hEGFR/mTNFRX, 없음/hEGFR 및 mTNFRX/hEGFR)에 따라 표지된 일곱 개의 상이한 항체 분자가 이 검정에서 증가하는 농도로 사용되었다. 도면 범례에 명시된 바와 같은 FITCdex 및 a-hFc 가교결합제가 사용되었다. 결과는 mAb2 (hEGFR/mTNFRX 및 mTNFRX/hEGFR)의 배향 둘 다가 수용체 클러스터링 및 T 세포 활성화를 유도할 수 있음을 보여준다.
도 5는 단일 농도 (10 nM)의 상이한 항체 분자에 대한 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 네 개의 상이한 항체 분자가 이 검정에서 사용되었다. 이들 분자는 야생형 Fcab (비변형된 인간 IgG1 CH2 및 CH3 도메인 함유); hTNFRX mAb (없음/hTNFRX); 가용성 단량체 (1mer) 및 hTNFRX (1mer/hTNFRX) 둘 다에 결합하는 mAb2; 및 가용성 이량체 (2mer) 및 hTNFRX (2mer/hTNFRX) 둘 다에 결합하는 mAb2이었다. 결과는 가용성 이량체는 2mer/hTNFRX mAb2의 항체 가교결합을 유도할 수 있지만 가용성 단량체는 항원의 단량체 성질 때문에 1mer/hTNFRX mAb2의 항체 가교결합을 유도할 수 없음을 보여준다. 이것은 다량체성 가용성 인자는 항체 가교결합을 유도할 수 없지만 단량체성 가용성 인자는 항체 가교결합을 유도할 수 있음을 입증한다.
도 6은 다양한 항체 분자의 존재하에서 CD20-발현 다우디 세포를 함유하는 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. TNFRY는 T 세포 상에서 발현되는 TNFRSF 수용체이다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (mTNFRY/hCD20, 없음/mTNFRY, 없음/hCD20)에 따라 표지된 세 개의 상이한 항체 분자가 이 검정에서 증가하는 농도로 사용되었다. 단백질 L이 mTNFRY 단클론 항체 (없음/mTNFRY)를 위한 가교결합제로서 사용되었다. 항체 분자를 CD20-발현 다우디 세포 (CD20+ 세포)의 부재하 및 존재하에서 시험하였다. CD20+ 세포의 부재하에서의 mTNFRY 항체에 대한 결과는 도 6a에 도시되어 있고 CD20+ 세포의 존재하에서의 결과는 도 6b에 도시되어 있다. 결과는 mAb2 형식이 제2 TNFRSF 수용체의 작용을 유도하는데 사용될 수 있고 mTNFRX/hCD20 mAb2 항체 분자가 mTNFRX-표적화 mAb 항체 분자에 비해 상당히 더 낮은 EC50으로 T 세포를 활성화시킴을 입증한다.
도 7은 다양한 항체 분자의 존재하에서 인간 EphA2-발현 HPAC 세포를 함유하는 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, 없음/EphA2, 없음/mTNFRX, mTNFRX/FITC, mTNFRX/FITC + 없음/EphA2 및 mTNFRX/EphA2)에 따라 표지된 여섯 개의 상이한 항체 분자 또는 조합이 증가하는 농도로 이 검정에서 사용되었다. TNFRX는 T 세포 상에서 발현되는 TNFRSF 수용체이다. 7a : 결과는 EphA2 발현 HPAC 세포의 존재하에서 mTNRFX/EphA2 mAb2 항체에 의해 T 세포의 활성화가 증가함을 보여준다. 이 결과는 T 세포의 활성화를 증가시키기 위해 mTNRFX 표적화 항체에 대한 가교결합이 필요하며 mTNRFX/EphA2 mAb2 항체는 단지 HPAC (EphA2+) 세포의 존재에 의해 가교결합될 수 있고 추가의 비-생리학적 가교결합제를 필요로 하지 않는 유일한 분자임을 입증한다. 7b : 도면 요점에 나타낸 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 여섯 개의 상이한 항체 분자 또는 조합을 시험하였다. 이들은 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 (FITCdex) 및 항-인간 IgG Fc 항체 (a-hFc)이었다. 결과는 mTNFRX 수용체가 표적화되고 항-mTNFRX 항체가 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가함을 보여준다. 이 결과는 T 세포의 활성화를 증가시키기 위해 mTNRFX 표적화 항체에 대해 가교결합이 필요함을 입증한다.
도 8은 Balb/c 마우스 코호트에서 CT26 공통유전자 모델의 종양 성장 곡선을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, mTNFRX/없음, mTNRFX/없음 + 없음/EphA2, mTNFRX/EphA2)에 따라 표지된 네 개의 상이한 항체 분자 또는 조합을 종양 접종 후 10일, 12일 및 14일에 1 mg/kg으로 투여하였다. 평균 종양 체적 플러스 또는 마이너스 표준 오차 평균이 플롯팅되어 있으며 최종일의 종양 체적을 양측 t-검정을 사용하여 상이한 그룹에 걸쳐 비교하였다. mTNFRX/EphA2 mAb2 항체 처리군은 대조군 항체 없음/FITC 처리군에 비해 통계적으로 유의적인 종양 체적 감소를 보였다. 이러한 결과는 mTNRFX/EphA2 mAb2 항체가 mTNFRX/없음 및 없음/EphA2 항체의 조합보다 EphA2 발현 종양에 대해 생체내에서 보다 양호한 항-종양 효능을 가짐을 입증하며, 이것은 mTNRFX/EphA2 mAb2에 의해 매개된 mTNRFX 및 EphA2의 이특이성 맞물림에 의한 mTNRFX의 생체내 가교결합이 종양 성장을 제어하는데 효과적임을 나타낸다.
도 9는 Balb/c 마우스 코호트에서 CT26.hEGFR 공통유전자 모델의 종양 성장 곡선을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, 없음/EGFR, mTNFRY/없음 + 없음/hEGFR 및 mTNFRY/hEGFR)에 따라 표지된 네 개의 상이한 항체 분자 또는 조합을 종양 접종 후 7, 9 및 11일에 1mg/kg으로 투여하였다. 평균 종양 체적 플러스 또는 마이너스 표준 오차 평균이 플롯팅되어 있으며 최종일의 종양 체적을 양측 t-검정을 사용하여 상이한 그룹에 걸쳐 비교하였다. mTNFRY/hEGFR mAb2 항체 처리군은 대조군 항체 없음/EGFR 처리군에 비해 통계적으로 유의적인 종양 체적 감소를 나타내었다. 이 결과는 mTNRFY/hEGFR mAb2 항체가 mTNFRX/없음 및 없음/hEGFR 항체의 조합보다 EGFR 발현 종양에 대해 생체내에서 더 양호한 항-종양 효능을 가짐을 입증하며, 이것은 mTNRFY/hEGFR mAb2에 의해 매개된 mTNRFY 및 hEGFR의 이특이성 맞물림에 의한 mTNRFY의 생체내 가교결합이 종양 성장을 제어하는데 효과적임을 나타낸다.
도 10은 단일 농도 (10 nM)의 상이한 항체 분자에 대한 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 다섯 개의 상이한 항체 분자가 도면 범례에 명시된 바와 같은 상이한 가교결합제와 함께 이 검정에 사용되었다. 이들은 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 (FITCdex), 항-인간 IgG Fc 항체 (a-hFc), 및 VEGF이었으며 1:1 몰 비로 사용되었다. 이들 분자는 음성 대조군 항체 (없음/FITC); mAb 결합 VEGF (없음/VEGF); mTNFRX mAb (없음/mTNFRX); FITC 및 mTNFRX 둘 다에 결합하는 mAb2 (mTNFRX/FITC); 및 VEGF 및 mTNFRX 둘 다에 결합하는 mAb2 (mTNFRX/VEGF)이었다. 결과는 mTNRFX 항체는 가교결합될 때에만 T 세포의 활성화를 증가시킬 수 있으며 이특이성 mAb2 항체는 항-인간 IgG Fc 항체에 의해 또는 Fab 표적 (mTNRFX/FITC의 경우에는 FITCdex 및 mTNRFX/VEGF의 경우에는 VEGF)에 의해 가교결합될 수 있음을 보여준다. mTNRFX/VEGF mAb2 항체는 가능하게는 활성화된 T 세포에 의한 VEGF의 생산으로 인해 T 세포 활성화의 보다 높은 백그라운드를 보여주었다. 이것은 종양 미세환경에서 증가된 수준으로 존재하는 가용성 인자인 VEGF가 mTNRFX/VEGF mAb2 항체를 가교결합시키고 T 세포 활성화를 증가시킬 수 있음을 입증한다.
도 11은 다양한 항체 분자의 존재하에서 T 세포 활성화 검정을 위한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, 없음/VEGF, mTNFRX/FITC, mTNFRX/VEGF)에 따라 표지된 네 개의 상이한 항체 분자가 증가하는 농도로 이 검정에서 사용되었다. TNFRX는 T 세포 상에서 발현되는 TNFRSF 수용체이다. 도면 범례에 명시된 바와 같은 가교결합제가 사용되었다. 이들은 플루오레세인 이소티오시아네이트-덱스트란 (FITCdex), 항-인간 IgG Fc 항체 (a-hFc) 및 VEGF이었다. 결과는 mTNFRX 수용체가 표적화되고 항-mTNFRX mAb2 항체가 이들의 Fab 표적에 의해 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가함을 보여준다. 이러한 결과는 VEGF가 인공 가교결합제 (FITCdex)에 필적하는 효능 (EC50 및 최대 반응)으로 mTNRFX/VEGF mAb2 항체를 가교결합시킬 수 있음을 입증한다.
도 12는 Balb/c 마우스 코호트에서 CT26 공통유전자 모델의 종양 성장 곡선을 보여준다. 이들의 Fcab/Fab 표적 (없음/FITC, 없음/VEGF, mTNRFX/없음 + 없음/VEGF, mTNFRX/VEGF)에 따라 표지된 네 개의 상이한 항체 분자, 또는 이의 조합을 종양 접종 후 10, 12 및 14일에 1 mg/kg으로 투여하였다. 평균 종양 체적 플러스 또는 마이너스 표준 오차 평균이 플롯팅되어 있으며 최종일의 종양 체적을 양측 t-검정을 사용하여 상이한 그룹에 걸쳐 비교하였다. mTNFRX/VEGF mAb2 항체 처리군은 대조군 항체 없음/FITC 처리군에 비해 통계적으로 유의적인 종양 체적 감소를 보였다. 이 결과는 mTNRFX/VEGF mAb2 항체가 mTNFRX/없음 및 없음/VEGF 항체의 조합보다 이의 미세환경에서 증가된 VEGF 농도를 갖는 것으로 기술된 종양에 대해 생체내에서 더 양호한 항-종양 효율을 가짐을 입증하며, 이것은 mTNRFX/VEGF mAb2에 의해 매개되는 mTNRFX 및 VEGF의 이특이성 맞물림에 의한 mTNRFX의 생체내 가교결합이 종양 성장을 제어하는데 효과적임을 나타낸다.
본 발명은 제1 항원을 위한 상보성 결정 영역 (CDR)-기반 항원-결합 부위 및 항체 분자의 불변 도메인에 제2 항원을 위한 항원-결합 부위를 포함하는 항체 분자에 관한 것이다. 제1 및 제2 항원 중의 하나는 질병 항원, 바람직하게는 종양 항원이고, 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체이다.
질병 항원 결합의 부재하에서 면역 세포 표면 상의 TNFRSF 수용체에 대한 항체 분자의 결합은 TNFRSF 수용체가 세포내 신호전달 경로를 자극하고 면역 세포를 활성화시키는 클러스터를 형성하도록 유발하지 않는다.
면역 세포 표면 상의 TNFRSF 수용체 및 질병 항원 둘 다에 대한 항체 분자의 결합은 TNFRSF 수용체가 면역 세포 표면 상에 클러스터를 형성하도록 유발하며, 이것이 차례로 세포내 신호전달 경로를 자극하고 면역 세포를 활성화시킨다. 면역 세포는 질병 항원의 존재하에서만 활성화되기 때문에, 항체 분자는 질병 항원의 환경에서는 선택적으로 면역 세포를 활성화시키지만 다른 곳에서는 그렇지 않은 조건부 효능제이다. 예를 들면, 질병 항원은 종양 항원일 수 있으며 항체 분자는 암 환자에서 종양의 미세환경에서는 선택적으로 면역 세포를 활성화시킬 수 있지만 다른 곳에서는 그렇지 않다.
또한, 본원에 기술된 항체 분자는 외부 가교결합제와 같은 다른 메카니즘에 의한 가교결합 또는 Fc 감마 수용체 상호작용을 통한 가교결합에 의존하는 항체 분자에 비해 증가된 면역 세포 활성화를 나타낸다. TNFRSF 수용체의 활성화가 더욱 효율적이기 때문에, 면역 세포 활성화는 다른 항체 분자에 비해 보다 낮은 농도의 본원에 기술된 항체 분자에서 달성될 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 항체 분자는 Fc 감마 수용체 상호작용 및/또는 단백질 A 또는 G 또는 이차 항체와 같은 외부 가교결합제의 부재하에서 TNFRSF 수용체의 클러스터링을 유발할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 면역 세포의 질병-표적 구동된 활성화 및, 특히, 면역 세포의 종양-표적 구동된 활성화를 가능하게 한다. 종양의 환경에서 면역 세포의 활성화는 면역요법에서, 예를 들면 암의 치료를 위해 유용할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 CDR-기반 항원-결합 부위 및 불변 영역 항원 결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 적합한 항체 분자는 면역글로불린 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
항체 분자는 천연 또는 부분적으로 또는 전적으로 합성에 의해 생산된, 예를 들면 재조합 분자일 수 있다.
바람직한 양태에서, 항체 분자는 전체 항체이다. 예를 들면, 항체 분자는 IgG, IgA, IgE 또는 IgM, 바람직하게는 IgG, 또는 동형 서브-클래스 중의 어느 것, 특히 IgG1, IgG2 및 IgG4일 수 있다. 예를 들면, 항체 분자는 mAb2 (TM) 이특이성 항체일 수 있다. mAb2 이특이성 항체는, 본원에서 언급된 바와 같이, 가변 영역(variable region)의 각각에 CDR-기반 항원 결합 부위 및 불변 영역, 바람직하게는 CH3 도메인에 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 IgG 면역글로불린이다.
또 다른 양태에서, 항체 분자는 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원-결합 부위 및 제2 항원을 위한 불변 도메인 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편일 수 있다. CDR 서열과 CH3 도메인 둘 다를 포함하는 항체 단편의 예는 미니바디이며, 이것은 CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함한다 (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61). 따라서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 용어 "항체 분자"는, 본원에서 사용되는 바와 같이, "항체 분자 또는 이의 단편"에 해당한다. 바람직한 항체 단편은 하나 이상의 CDR-기반 항원-결합 부위 및/또는 불변 도메인을 포함할 수 있으며, 즉, 이들은 다가일 수 있다.
항체 분자는 단클론성일 수 있다.
항체 분자는 키메라, 인간화 또는 인간 분자일 수 있다. 따라서, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 키메라 분자 또는 등가물이 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 제EP-A-0120694호 및 제EP-A-0125023호에 기술되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는, 다른 폴리펩타이드 및/또는 혈청 성분에 결합할 수 있는 항체와 같은 오염물이 없다는 의미로 단리될 수 있다.
항체 및 이들의 작제 및 사용을 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[Holliger & Hudson, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 (2005)]에 기술되어 있다. 원래 항체의 특이성을 보유하는 다른 항체 또는 키메라 분자를 생산하기 위해 단클론 항체 및 기타 항체를 취하여 재조합 DNA 기술의 기법을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 기법은 CDR, 가변 부위, 및/또는 제2 항원-결합 부위를 제공하는 불변 도메인 서열을 상이한 면역글로불린에 도입함을 포함할 수 있다. 또 다른 면역글로불린으로의 하나의 면역글로불린의 CDR의 도입이, 예를 들면, 제EP-A-184187호, 제GB 2188638A호 및 제EP-A-239400호에 기술되어 있다. 유사한 기법들이 관련 불변 도메인 서열에 사용될 수 있다. 대안적으로, 하이브리도마 또는 항체 분자를 생산하는 다른 세포는 생성된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 변경시키지 않을 수 있는 유전적 돌연변이 또는 기타 변화를 겪을 수 있다.
본원에 기술된 항체 분자는 Fc 수용체 및/또는 보체에 대한 결합을 감소시키거나 없애기 위해 변형될 수 있다. 이것은 항체-의존적 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체 분자의 보체-의존적 세포독성 (CDC) 활성을 감소시키는데 유용할 수 있다. 예를 들면, 항체 분자의 CH2 도메인은 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIII와 같은 하나 이상의 Fcγ 수용체 및/또는 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나 이상의 Fcγ 수용체 및 보체에 대한 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이는 알려져 있으며 문헌[Bruhns, et al., Blood 113(16):3716-25 (2009) and Xu et al., Cellular Immunology 200(1):16-26 (2000)]에 기술된 "LALA 돌연변이"를 포함한다. 따라서, 항체 분자는 CH2 도메인을 포함할 수 있고, 여기서 CH2 도메인은 CH2 도메인의 위치 1.3 및 1.2에 알라닌 잔기를 포함하며, 여기서 번호매김은 IMGT 번호매김 체계에 따른다.
몇몇 양태에서, 본원에 기술된 항체 분자는 Fcγ 수용체 결합 부위가 결핍될 수 있으며 Fcγ 수용체에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않음을 나타낼 수 있다. 게다가, 또는 대안적으로, 본원에 기술된 항체 분자는 C1q 결합 부위가 결핍될 수 있으며 C1q에 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않음을 나타낼 수 있다. C1q에의 결합을 없애기 위한 돌연변이는 당업계에 알려져 있다.
항체 분자는 항체의 하나 이상의 특성, 예를 들면 동력학, 예를 들어 친화도, 온(on) 및 오프(off)-속도 및/또는 다른 생물물리학적 특징, 예를 들어 기능적 반감기를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기술된 항체 분자는 종양 항원과 같은 질병 항원에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위, 및 TNFRSF 수용체에 결합하는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 이 문맥에서 결합은 특이 결합을 가리킬 수 있다. 용어 "특이적(specific)"은 항체 분자가 이의 특이 결합 파트너(들) 이외의 분자에 임의의 유의적인 결합을 보이지 않는 상황을 가리킬 수 있다. 용어 "특이적"은 항체 분자가 다수의 항원이 지니는 특정 에피토프, 예를 들어 종양 항원 및 TNFRSF 수용체 상의 에피토프에 대해 특이적인 경우에도 적용 가능하며, 이 경우 항체 분자는 에피토프를 지니는 다양한 항원에 결합할 수 있을 것이다.
본 발명의 항체 분자는 제1 항원을 위한 하나 이상의 CDR-기반 항원-결합 부위를 포함한다.
CDR-기반 항원-결합 부위는 항체 가변 영역의 항원-결합 부위이다. CDR-기반 항원-결합 부위는 여섯 개의 CDR에 의해 형성된다; 세 개의 경쇄 가변 도메인 (VL) CDR 및 세 개의 중쇄 가변 도메인 (VH) CDR. 항원의 결합에 대한 상이한 CDR의 기여는 상이한 항원 결합 부위에서 다양할 수 있다. 종양 항원 또는 TNFRSF 수용체와 같은 주어진 항원에 대한 항체 분자의 제조, 및 이러한 항체 분자의 CDR 서열의 결정은 잘 확립되어 있으며 여러 적절한 기술들이 당업계에 공지되어 있다.
CDR-기반 항원-결합 부위는 TNFRSF 수용체 또는 질병 항원, 예를 들어 종양 항원에 결합하는 항체의 HCDR3을 포함할 수 있다. HCDR3은 항체 분자의 특이성을 결정하는데 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719). CDR-기반 항원-결합 부위는 TNFRSF 수용체 또는 질병 항원, 예를 들어 종양 항원에 결합하는 항체의 HCDR1, HCDR2, LCDR1, LCDR2 및/또는 LCDR3을 추가로 포함할 수 있다.
CDR의 서열은 일상적인 기법을 사용하여 임의의 주어진 항체의 VH 및 VL 도메인 서열로부터 쉽게 결정될 수 있다. CDR 서열은, 예를 들면, 카바트 (Kabat, E.A et al (1991). Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edit., NIH Publication no. 91-3242. U.S.Department of Health and Human Services) 또는 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템 (IMGT: Lefranc, M.-P. et al. Nucleic Acids Res. 43, D413-22 (2015))에 따라 결정될 수 있다.
항원-결합 부위의 세 개의 VH 도메인 CDR은 면역글로불린 VH 도메인 내에 위치할 수 있고 세 개의 VL 도메인 CDR은 면역글로불린 VL 도메인 내에 위치할 수 있다. 예를 들면, CDR-기반 항원-결합 부위는 항체 가변 영역에 위치할 수 있다.
항체 분자는 제1 항원을 위한 하나의 또는 바람직하게는 하나 이상의, 예를 들면 두 개의 CDR-기반 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 따라서, 항체 분자는 하나의 VH 및 하나의 VL 도메인을 포함할 수 있지만 바람직하게는 자연-발생적 IgG 분자의 경우에서와 같이 두 개의 VH 및 두 개의 VL 도메인, 즉, 두 개의 VH/VL 도메인 쌍을 포함한다.
몇몇 바람직한 양태에서, 항체 분자는 두 개의 가변 영역을 포함하는 IgG 분자일 수 있으며, 상기 각각의 가변 영역은 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명의 항체 분자는 불변 영역에 위치한 제2 항원을 위한 항원-결합 부위 (즉, 불변 영역 항원-결합 부위)를 포함한다.
제2 항원을 위한 항원-결합 부위는 항체 분자의 임의의 불변 영역에 위치할 수 있다. 예를 들면, 제2 항원을 위한 항원-결합 부위는 CH4, CH3, CH2, CH1 또는 CL 도메인 중의 하나 이상, 바람직하게는 CH3 또는 CH2 도메인, 가장 바람직하게는 CH3 도메인에 위치할 수 있다.
항원 결합 부위는 항체 분자의 불변 도메인의 하나 이상, 예를 들면 하나, 둘, 셋, 또는 그 이상의 구조적 루프로 구성될 수 있다.
항체 불변 도메인의 구조적 루프는 AB, BC, CD, DE, EF, 및 FG 구조적 루프를 포함한다. 항원 결합 부위는 불변 도메인의 AB, BC, CD, DE, EF, 및 FG 구조적 루프 중의 둘 이상, 가장 바람직하게는 AB, CD 및/또는 EF 구조적 루프를 포함할 수 있다.
항체 불변 도메인에서 구조적 루프의 위치는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, CH3 도메인의 구조적 루프는 CH3 도메인의 잔기 7-21 (AB 루프), 25-39 (BC 루프), 41-81 (CD 루프), 83-85 (DE 루프), 89-103 (EF 루프) 및 106-117 (FG 루프)에 위치하며, 여기서 잔기는 IMGT (ImMunoGeneTicsTM) 번호매김 체계에 따라 번호매겨진다. 다른 불변 도메인에서의 구조적 루프 위치의 장소는 쉽게 결정될 수 있다.
불변 도메인의 구조적 루프는 제2 항원을 위한 항원-결합 부위를 형성하기 위해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 변형은 아미노산 치환, 부가, 또는 결실을 포함할 수 있다. 표적 항원을 위한 항원-결합 부위를 생성하기 위해 항체 불변 도메인의 구조적 루프 영역에 아미노산 변형을 도입하는 것은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[Wozniak - Knopp G et al. (2010) Protein Eng Des. 23 (4): 289-297; 제WO2006/072620호 및 제WO2009/132876호]에 기술되어 있다. 불변 도메인 결합 부위의 예가 아래에 제공되어 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 항체 분자는 각각 CH3 도메인의 위치 7-21, 41-81, 및/또는 89-103에 위치한 AB, CD 및/또는 EF 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형 (치환, 부가, 및/또는 결실)을 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 CH3 도메인의 위치 11-18, 43-78 및/또는 92-101에 하나 이상의 아미노산 변형 (치환, 부가, 및/또는 결실)을 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항체 분자는 본원에 제시된 바와 같은 제1 항원을 위한 항원-결합 부위를 제공하기 위해 CH3 도메인의 위치 12-18, 45.1 내지 78, 92 내지 94, 및/또는 97-98에 하나 이상의 아미노산 변형 (치환, 부가, 및/또는 결실)을 포함한다. 비변형된 CH3 도메인은 바람직하게는 서열 번호 3에 제시된 서열을 포함하거나 구성된다. 잔기 번호매김은 IMGT 번호매김 체계를 따른다.
항체 분자는 제2 항원을 위한 하나, 둘 또는 둘 이상의 불변 도메인 항원-결합 부위를 포함할 수 있다.
제2 항원을 위한 불변 도메인 항원-결합 부위를 함유하는 항체 Fc 영역을 Fcab라고 할 수 있다. 몇몇 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 제1 항원과 결합하는 항체를 제공하고 이의 Fc 영역을 제2 항원과 결합하는 Fcab로 대체함으로써 생산될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 또한 제1 항원과 결합하는 항체를 제공하고 이의 CH3 도메인을 제2 항원과 결합하는 CH3 도메인으로 대체하거나, 또는 대안적으로, CH3 도메인의 단편을 제2 항원에 결합하는 CH3 도메인 단편으로 대체함으로써 생산될 수 있다.
바람직한 양태에서, 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 항체이며, 상기 항체 분자는 다음을 포함하고:
(i) 면역글로불린 VH 도메인 및 면역글로불린 VL 도메인에 의해 형성된 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원-결합 부위; 및
(ii) 항체 분자의 CH3 도메인에 위치한 제2 항원을 위한 항원-결합 부위(여기서, 상기 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 하나 이상의 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다);
여기서 제1 및 제2 항원 중의 하나는 종양 항원이고 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체이다.
추가의 바람직한 양태에서, 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 항체이며, 상기 항체 분자는 다음을 포함하고:
(i) 면역글로불린 VH 도메인 및 면역글로불린 VL 도메인에 의해 각각 형성된, 제1 항원을 위한 두 개의 CDR-기반 항원-결합 부위; 및
(ii) 항체 분자의 두 개의 CH3 도메인에 위치한 제2 항원을 위한 두 개의 항원-결합 부위(여기서, 상기 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 하나 이상의 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다);
여기서 제1 및 제2 항원 중의 하나는 종양 항원이고 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체이다.
추가의 바람직한 양태에서, 항체는 제1 항원 및 제2 항원에 결합하는 완전 면역글로불린 분자, 예를 들어 완전 IgG1 분자이며, 상기 면역글로불린 분자는 다음을 포함하고:
(i) 면역글로불린 VH 도메인 및 면역글로불린 VL 도메인에 의해 각각 형성된, 제1 항원을 위한 두 개의 CDR-기반 항원-결합 부위; 및
(ii) 면역글로불린 분자의 두 개의 CH3 도메인에 위치한 제2 항원을 위한 두 개의 항원-결합 부위(여기서, 상기 항원-결합 부위는 CH3 도메인의 하나 이상의 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다);
여기서 제1 및 제2 항원 중의 하나는 종양 항원이고 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체이고,
여기서 면역글로불린 분자는 CH1, CH2 및 CL 도메인을 추가로 포함한다.
제2 항원 결합 부위가 통상적으로 링커를 통한 항체 또는 이의 단편에의 제2 항원-결합 모이어티의 접합을 통해 제공되는 이특이성 분자가 당업계에 공지되어 있다. 이러한 분자는 링커 절단이 제2 항원 결합 부위의 손실을 초래할 수 있다는 점에서 잠재적인 단점을 갖는다. 본 발명의 맥락에서, 두 개의 결합 부위 중 하나의 손실은 본 발명의 항체 분자를 비활성으로 되게 할 것이다. 따라서, 본 발명의 항체 분자는 바람직하게는, 예를 들어, 항체 분자의 C-말단에, 예를 들면 링커 서열을 통해 접합된 제2 항원-결합 모이어티 (예를 들어, 안티칼린, 단일 도메인 항체 (dAb), 단일 가변 도메인 (sVD), 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 또는 항원-결합 단편 (Fab))를 포함하지 않는다. 본원에 기술된 항체 분자는 CDR-기반 항원 결합 부위를 통해 제1 항원에 결합하고 불변 도메인 항원 결합 부위를 통해 제2 항원에 결합한다.
몇몇 양태에서, 제1 항원은 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체일 수 있고, 제2 항원은 종양 항원과 같은 질병 항원일 수 있다.
또 다른 양태에서, 제1 항원은 종양 항원과 같은 질병 항원일 수 있고, 제2 항원은 TNFRSF 수용체일 수 있다.
항체 분자는 50 nM 미만, 40 nM 미만, 30 nM 미만, 20 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 1 nM 미만의 제1 및/또는 제2 항원에 대한 해리 상수를 가질 수 있다. 예를 들면, 항체 분자는 0.1 내지 50 nM, 예를 들어 0.5 내지 10 nM의 제1 및/또는 제2 항원에 대한 친화도를 가질 수 있다. 항체 분자의 결합 동력학 및 친화도 (평형 해리 상수, Kd로서 표현됨)는 표면 플라스몬 공명과 같은 표준 기술을 사용하여, 예를 들어 BIAcore 분석을 사용하여 결정될 수 있다.
종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체는 종양 괴사 인자 상과 (TNFSF)의 하나 이상의 리간드와 결합하는 세포외 시스테인 풍부 도메인을 포함하는 막-결합된 사이토킨 수용체이다.
TNFRSF 수용체는 면역 세포의 표면 상에 위치할 수 있다. TNFRSF 리간드의 결합시, TNFRSF 수용체는 면역 세포 표면 상에 면역 세포를 활성화시키는 클러스터를 형성한다. 예를 들면, 리간드 결합된 TNFRSF 수용체는 다량체, 예를 들어 삼량체, 또는 다량체의 클러스터를 형성할 수 있다. 리간드-결합된 TNFRSF 수용체의 클러스터의 존재는 면역 세포를 활성화시키는 세포내 신호전달 경로를 자극한다.
세포 표면 상의 TNFRSF 수용체 및 종양 항원 둘 다를 맞물리게 함으로써, 본원에 기술된 항체 분자는 TNFRSF 수용체가 클러스터링하여 면역 세포를 활성화시키도록 한다.
TNFRSF 수용체는 CD27, CD40, EDA2R, EDAR, FAS, LTBR, RELT, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF4, TNFRSF6B, TNFRSF8, TNFRSF9, TNFRSF10A-10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21 및 TNFRSF25를 포함한다.
CD27 (TNFRSF7: Gene ID 939)은 NP_001233.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001242.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. CD40 (TNFRSF5: Gene ID 958)은 NP_001241.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001250.5의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. EDA2R (TNFRSF27: Gene ID 60401)은 NP_001186616.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001199687.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. EDAR (Gene ID 10913)은 NP_071731.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_022336, 3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. FAS (TNFRSF6: Gene ID 355)는 NP_000034.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_000043.5의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. LTBR (TNFRSF3: Gene ID 4055)은 NP_001257916.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001270987.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. RELT (TNFRSF19L: Gene ID 84957)는 NP_116260.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_032871.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF1A (Gene ID 7132)는 NP_001056.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001065.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF1B (Gene ID 7133)는 NP_001057.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001066.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF4 (Gene ID 7293)는 NP_003318의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003327)의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF6B (Gene ID 8771)는 NP_003814.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003823.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF8 (Gene ID 943)은 NP_001234.3의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001243.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF9 (Gene ID 3604)는 NP_001552의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM001561)의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF10A (Gene ID 8797)는 NP_003835.3의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003844.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF10B (Gene ID 8795)는 NP_003833.4의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003842.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF10C (Gene ID 8794)는 NP_003832.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003841.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF10D (Gene ID 8793)는 NP_003831.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_003840.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF11A (Gene ID 8792)는 XP_011524547.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 XM_11526245.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF11B (Gene ID 4982)는 NP_002537.3의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_002546.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF12A (Gene ID 51330)는 NP_057723.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_016639.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF13B (Gene ID 23495)는 NP_0036584.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_012452.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF13C (Gene ID 115650)는 NP_443177.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_052945.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF14 (Gene ID 8764)는 NP_001284534.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001297605.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF17 (Gene ID 608)은 NP_001183.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001192.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF18 (Gene ID 8784)은 NP_004195.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_004186,1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF19 (Gene ID 55504)는 NP_001191387.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001204458.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. NFRSF21 (Gene ID 27242)은 NP_055267.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_014452.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. TNFRSF25 (DR3: Gene ID 8718)는 리간드 TNFSF15 (TL1A)에 결합하고 NP_001034753.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001039664.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
몇몇 양태에서, TNFRSF 수용체는 신경 성장 인자 수용체(NGFR)가 아니다.
몇몇 양태에서, TNFRSF 수용체는 CD40, TNFRSF4, TNFRSF9, CD27, 또는 GITR이 아니다. 예를 들면, TNFRSF 수용체는 CD27, EDA2R, EDAR, FAS, LTBR, RELT, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6B, TNFRSF8, TNFRSF10A-10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21 및 TNFRSF25로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
이의 표면 상에 TNFRSF 수용체를 발현하는 면역 세포는 T 세포, 항원 제시 세포 (APC), NK 세포 및/또는 B 세포, 바람직하게는 T 세포일 수 있다.
질병 항원의 근처에서 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자에 의한 활성화 후, 활성화된 면역 세포는 면역 반응, 예를 들면 병원체 또는 암세포에 대한 면역 반응을 개시하거나, 촉진시키거나, 이에 참여할 수 있다. 암세포를 인식하고 근절시키는데 있어서의 면역계의 역할에 대한 개요가 문헌[Chen and Mellman, Immunity 2013 39(1):1-10]에 제공되어 있다.
질병 항원은 질병 부위에는 존재하지만 개체의 다른 곳에는 존재하지 않는 항원이다. 질병 항원은 병원성 항원 및 종양 항원을 포함할 수 있다.
병원성 항원은 감염성 질환과 관련된 바이러스 또는 박테리아로부터의 항원을 포함할 수 있다. 병원성 항원의 근처에서의 본원에 기술된 바와 같은 면역 세포의 활성화가 감염성 질환의 치료에 유용할 수 있다.
바람직하게는, 질병 항원은 종양 항원이다. 종양 항원은 종양의 환경에 주로 존재하는 항원이며, 개체의 다른 곳에는 편재하여 존재하지 않는다. 예를 들면, 종양 항원은 종양 세포의 표면 상에 존재할 수 있거나 종양 미세환경의 다른 간질 세포 상에 또는 종양 부근의 생물학적 체액에 존재할 수 있다. 따라서, 종양 항원은 개체에서 종양 세포의 위치의 마커이다.
몇몇 양태에서, 종양 항원은 암세포의 표면 상에 위치하는 항원일 수 있다. 바람직하게는, 종양 항원은 종양 세포 상에서 상향조절되거나 과발현되는 반면, 종양이 없는 동일한 조직으로부터의 상응하는 정상 체세포에 의해서는 풍부하게 발현되지 않는다.
몇몇 양태에서, 종양 항원은 종양이 없는 상응하는 정상 조직의 간질 세포와 비교하여, 종양 미세환경의 간질 세포 상에서 상향조절되거나 과발현된다.
바람직한 종양 항원은 세포 표면 상에 존재하며 급속하게 내재화되지 않는다.
본 발명의 항체 분자에 의해 표적화하는데 적합한 종양 항원은 당업계에 공지되어 있는 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들면, TNFRSF 수용체 및 종양 항원을 표적화하는 항체 분자는 TNFRSF 수용체 발현 세포를 종양 항원 발현 세포와 공동-배양하여 TNFRSF 수용체 발현 세포의 활성화를, 예를 들면 ELISA, 증식 검정 또는 세포독성 검정에 의해 측정하는 검정법에서 사용될 수 있다.
세포 표면 종양 항원은 종양-관련 항원 (TAA) 또는 종양-특이 항원 (TSA)일 수 있다.
암세포에 의해 발현되는 종양 항원은, 예를 들면, 암-생식 계열 유전자에 의해 암호화되는 암-고환 (CT) 항원, 예를 들어 MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE- A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, BAGE-I, RAGE- 1, LB33/MUM-1, PRAME, NAG, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE- C1/CT7, MAGE-C2, NY-ESO-I, LAGE-I, SSX-I, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-I 및 XAGE 및 이의 면역원성 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다 (Simpson et al. Nature Rev (2005) 5, 615-625, Gure et al., Clin Cancer Res (2005) 11, 8055-8062; Velazquez et al., Cancer Immun (2007) 7, 1 1 ; Andrade et al., Cancer Immun (2008) 8, 2; Tinguely et al., Cancer Science (2008); Napoletano et al., Am J of Obstet Gyn (2008) 198, 99 e91-97).
다른 세포 표면 종양 항원은, 예를 들면, AFP, αvβ3 (비트로넥틴 수용체), αvβ6, CA125 (MUC16), CD4, CD20, CD22, CD33, CD52, CD56, CD66e, CD80, CD140b, CD227 (MUC1), EGFR (HER1), EpCAM, GD3 강글리오시드, HER2, 전립선-특이 막 항원 (PSMA), 전립선 특이 항원 (PSA), CD5, CD19, CD21, CD25, CD37, CD30, CD33, CD45, HLA-DR, 항-이디오타입, 암배아 항원 (CEA), 예를 들어 암배아 항원-관련 세포 접합 분자 5 (CEACAM5), TAG-72, 폴레이트-결합 단백질, A33, G250, 페리틴, 당지질, 예를 들어 강글리오시드, 탄수화물, 예를 들어 CA-125, IL-2 수용체, 섬유아세포 활성화 단백질 (FAP), IGF1R, B7H3, PDL1, CD200, EphA2, 및 메소텔린 또는 이의 변이체를 포함한다. 이들 및 다른 세포 표면 종양 항원이 문헌[Carter et al., Endocr Relat Cancer 11(4): 659-87 (2004), Scott, A. M. and Renner, C. (2001). Tumour Antigens Recognized by Antibodies. eLS and Cheever et al., Clin Cancer Res (2009) 15(17): 5323-37]에 기술되어 있다.
다른 종양 항원은 "스트레스를 받은" 암세포에 의해 사용되는 비-AUG 번역 개시 메카니즘에 의해 생성된 프레임을 벗어난 펩타이드(out-of-frame peptide)-MHC 복합체를 포함한다 (Malarkannan et al. Immunity 1999 Jun; 10(6):681-90).
다른 종양 항원은 종양 세포 또는 종양 미세환경의 세포의 표면 상의 펩타이드-MHC 복합체를 포함하며, 여기서 펩타이드-MHC 복합체는 돌연변이된 세포내 종양 항원의 종양-특이 신생항원 펩타이드 단편을 포함하고, 펩타이드 신생항원은 하나 이상의 종양-특이 돌연변이를 지닌다 (Gubin et al J Clin Invest. (2015) 125(9): 3413-21). 다른 종양 항원이 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들면, 문헌 참조; WO00/20581; Cancer Vaccines and Immunotherapy (2000) Eds Stern, Beverley and Carroll, Cambridge University Press, Cambridge) 이러한 종양 항원의 서열은 공공 데이터베이스에서 쉽게 이용 가능하지만 제WO 1992/020356 A1호, 제WO 1994/005304 A1호, 제WO 1994/023031 A1호, 제WO 1995/020974 A1호, 제WO 1995/023874 A1호 및 제WO 1996/026214 A1호에서도 찾아볼 수 있다.
바람직한 종양 항원은 HER2, FAP, EpCAM, CEACAM5, CD20, CD73, PSMA, 메소텔린, EphA2, IGF1R, CD200, αvβ6, PDL1, B7H3 및 EGFR을 포함한다.
HER2 (ERBB2; Gene ID 2064)는 NP_001005862.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001005862.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. FAP (Gene ID 2191)는 NP_001278736.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001291807.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. EpCAM (Gene ID 4072)은 NP_002345.2의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_002354.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. CEACAM5 (Gene ID 1048)는 NP_001278413.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001291484.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. CD20 (MS4A1; Gene ID 931)은 NP_068769.2의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_021950.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. CD73 (NT5E; Gene ID 4907)은 NP_001191742.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001204813.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. PSMA (FOLH1; Gene ID 2346)는 NP_001014986.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001014986.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 메소텔린 (MSLN; Gene ID 10232)은 NP_001170826.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001177355.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. EphA2 (Gene ID 1969)는 NP_001316019.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001329090.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. IGF1R (Gene ID 3480)은 NP_000866.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_000875.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. CD200 (Gene ID 4345)은 NP_001004196.2의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001004196.3의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. αvβ6은 인테그린 아단위 알파 V 및 인테그린 아단위 베타 6으로 구성된 이형이량체이다. 인테그린 아단위 알파 V (ITGAV; Gene ID 3685)는 NP_001138471.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001144999.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 인테그린 아단위 베타 6 (ITGB6; Gene ID 3694)은 NP_000879.2의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_000888.4의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. PDL1 (CD274; Gene ID 29126)은 NP_001254635.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001267706.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. B7H3 (CD276; Gene ID 80381)은 NP_001019907.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001024736.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. EGFR (Gene ID 1956)은 NP_001333826.1의 기준 아미노산 서열을 가질 수 있고 NM_001346897.1의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 종양 항원은 가용성 종양 항원, 예를 들면 암세포에 의해 또는 암세포에 반응하여 생산되는 성장 인자일 수 있다. 가용성 인자는 종양 근처의 생물학적 체액에서 상향조절되거나 과발현될 수 있다. 가용성 종양 항원은 다량체, 예를 들면 이량체 또는 삼량체일 수 있다. 가용성 종양 항원은 환자의 신체의 다른 곳보다 종양 부위 또는 종양 미세환경에서 더 높은 농도로 존재할 수 있다. 종양 미세환경 및 관련 가용성 종양 항원은 문헌[Bhome et al., Front Cell Dev Biol. 2015 3:33]에 보다 상세하게 기술되어 있다.
적합한 가용성 종양 항원은 VEGF, HGF 및 SDF1을 포함한다.
VEGF (VEGFA; gene ID 7422)는 NP_001020537.2의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_001025366.2의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. HGF (gene ID 3082)는 NP_000592.3의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_000601.5의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. SDF1 (CXCL12; gene ID 6387)은 NP_000600.1의 기준 아미노산 서열을 갖고 NM_000609.6의 기준 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 항체 분자를 암호화하는 단리된 핵산을 제공한다. 숙련가는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 이러한 핵산을 제조하는데 어려움이 없을 것이다. 단리된 핵산은, 예를 들면, 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류 숙주 세포에서의 발현에 의해 상기한 항체 분자를 생산하는데 사용될 수 있다. 바람직한 숙주 세포는 CHO, HEK 또는 NS0 세포와 같은 포유류 세포이다. 핵산은 일반적으로 발현을 위한 재조합 벡터의 형태로 제공될 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
프로모터 서열, 터미네이터 단편, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함한 적절한 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터가 선택 또는 작제될 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 포유류 세포에서 핵산의 발현을 유도하는 적절한 조절 서열을 함유한다. 벡터는 또한 이. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 숙주에서 이의 선택, 발현 및 복제를 가능하게 하는 복제 기점, 프로모터 영역 및 선택 가능한 마커와 같은 서열을 포함할 수 있다.
벡터는 경우에 따라 플라스미드, 바이러스성, 예를 들어 파지, 또는 파지미드일 수 있다. 추가의 상세한 설명을 위해서는, 예를 들면, 문헌[Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press]을 참조한다. 핵산의 조작, 예를 들면, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 유발, 서열분석, 세포로의 DNA 도입 및 유전자 발현에 대한 다수의 공지된 기술 및 프로토콜은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992]에 상세하게 기술되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 핵산 또는 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 기술된 바와 같은 항체 분자를 포함하거나 이들로 구성된 폴리펩타이드를 발현하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
재조합 항체 분자의 생산에 적합한 광범위한 숙주 세포가 당업계에 공지되어 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 세포, 특히 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli) 및 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)와 같은 박테리아 및 CHO 및 CHO-유래 세포주(Lec 세포), HeLa, COS, HEK293 및 HEK-EBNA 세포와 같은 포유류 세포, 제노푸스 난모 세포와 같은 양서류 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), Sf9 및 Sf21과 같은 곤충 세포 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 같은 효모 세포를 포함한 진핵 세포를 포함할 수 있다.
핵산을 세포에 도입하기 위한 기술은 당업계에 널리 확립되어 있으며 특정 상황에 따라 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적합한 기술은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포솜-매개된 형질감염 및 레트로바이러스 또는 다른 바이러스, 예를 들어 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 백시니아를 사용한 형질도입을 포함할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 적합한 기술은 염화칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 사용한 형질감염을 포함할 수 있다.
항생제 내성 또는 감수성 유전자와 같은 마커 유전자가, 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 관심있는 핵산을 함유하는 클론을 동정하는데 사용될 수 있다.
도입된 핵산은 세포내의 염색체외 벡터 상에 있을 수 있거나 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진시키는 핵산 또는 벡터 내에 서열을 포함시킴으로써 통합이 촉진될 수 있다.
방법은 항체 분자를 단리 및/또는 정제함을 추가로 포함할 수 있다. 이것은 당업계에 공지된 임의의 편리한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 재조합 항체 분자의 정제를 위한 기술은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 HPLC, FPLC 또는, 예를 들어 단백질 A 또는 단백질 L을 사용한 친화도 크로마토그래피를 포함한다. 몇몇 양태에서, 정제는 상기한 바와 같이 폴리펩타이드 상에 친화성 태그를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 숙주 세포에서 상기한 항체 분자를 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계 및 임의로 이렇게 하여 생성된 항체 분자를 단리 및/또는 정제하는 단계를 포함하여 상기한 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다.
기술된 바와 같이 제조된 항체 분자는 추가로 조사될 수 있으며, 예를 들면 약리학적 특성 및/또는 활성이 결정될 수 있다. 단백질 분석의 방법 및 수단은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 치료 분야에 유용할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 암의 치료를 위해 개체에 투여될 수 있다.
항체 분자는 단독으로 투여될 수 있지만, 항체 분자는 통상적으로 항체 분자 이외에 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약제학적 조성물의 형태로 투여될 것이다. 방법은 항체 분자를 임의로 적어도 하나의 성분, 예를 들면 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 아래 기술되는 바와 같은 다른 물질과 약제학적 조성물로 제형화함을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기한 항체 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은, 항체 분자 이외에, 약제학적으로 허용되는 부형제, 담체, 완충제, 안정제 또는 당업계의 숙련가들에게 널리 공지된 기타 물질들을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "약제학적으로 허용되는"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제나 합병증 없이, 대상체 (예를 들어, 사람)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비를 갖는 화합물, 물질, 조성물, 또는 투여 형태와 관련이 있다. 각각의 담체, 부형제 등은 또한 제형의 다른 성분들과 양립할 수 있다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 투여 경로에 따라 좌우될 것이며, 이것은 주입, 주사 또는 아래에 논의되는 바와 같은 임의의 다른 적합한 경로에 의해 이루어질 수 있다.
비경구, 예를 들면, 피하 또는 정맥내 투여, 예를 들어 주사에 의한 투여의 경우, 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 피로겐을 함유하지 않고 적절한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. 당업계의 관련 숙련가들은 염화나트륨 주사, 링거 주사, 락테이트 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 잘 제조할 수 있다. 완충제, 예를 들어 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 방부제 (예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥산올; 3'-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이트화제, 예를 들어 EDTA; 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 짝-이온, 예를 들어 나트륨; 금속 착물 (예를 들어 Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 사용될 수 있다.
몇몇 양태에서, 항체 분자는 투여 전 재구성하기 위한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 항체 분자는 개체에게 투여하기 전에 멸균 수에서 재구성되고 염수와 혼합될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 항체 분자는 예방적 또는 방지적 치료를 포함한, 인간 또는 동물 신체의 치료 방법에서 사용될 수 있다. 치료 방법은 항체 분자를 이를 필요로 하는 개체에게 투여함을 포함할 수 있다. 본 발명의 관련 측면들은 다음을 제공한다;
(i) 약제로서 사용하기 위한 상기한 항체 분자,
(ii) 환자에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 상기한 항체 분자,
(iii) 환자에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의 상기한 항체 분자의 용도; 및
(iv) 치료학적 유효량의 상기한 항체 분자를 개체에게 투여함을 포함하여, 개체에서 암을 치료하는 방법.
암은 악성 암세포의 비정상적인 증식을 특징으로 할 수 있으며 백혈병, 예를 들어 AML, CML, ALL 및 CLL, 림프종, 예를 들어 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종 및 다발성 골수종, 및 고형 암, 예를 들어 육종, 피부암, 흑색종, 방광암, 뇌암, 유방암, 자궁암, 난소암, 전립선암, 폐암, 결장직장암, 자궁경부암, 간암, 두경부암, 식도암, 췌장암, 신장암, 부신암, 위암, 고환암, 담낭 및 담도의 암, 갑상선암, 흉선암, 골암, 및 뇌암을 포함할 수 있다.
개체 내의 암세포는 개체의 정상 체세포와는 면역학적으로 구별될 수 있다 (즉, 암성 종양은 면역원성일 수 있다). 예를 들면, 암세포는 암세포에 의해 발현되는 하나 이상의 항원에 대해 개체에서 전신 면역 반응을 이끌어낼 수 있다. 면역 반응을 이끌어내는 항원은 종양 항원일 수 있거나 정상 세포와 공유될 수 있다.
상기한 바와 같은 치료에 적합한 개체는 포유동물, 예를 들어 설치류 (예를 들어, 기니 피그, 햄스터, 래트, 마우스), 쥣과 (예를 들어, 마우스), 개과 (예를 들어, 개), 고양잇과 (예를 들어, 고양이), 말과 (예를 들어, 말), 영장류, 원숭이과 (예를 들어, 원숭이 또는 유인원), 원숭이 (예를 들어, 마모셋, 개코원숭이), 유인원 (예를 들어, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 긴팔원숭이), 또는 인간일 수 있다.
몇몇 바람직한 양태에서, 개체는 인간이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 비-인간 포유동물, 특히 인간에서 치료 효능을 입증하기 위한 모델로서 통상적으로 사용되는 포유동물 (예를 들어, 뮤린, 영장류, 돼지, 개, 또는 토끼 동물)이 사용될 수 있다.
몇몇 양태에서, 개체는 초기 암 치료 후 최소 잔존 질환 (MRD)을 가질 수 있다.
암을 가진 개체는 당업계에 알려진 임상 표준에 따라 암을 진단하기에 충분한 적어도 하나의 식별 가능한 징후, 증상, 또는 검사 소견을 나타낼 수 있다. 이러한 임상 표준의 예는 문헌[Harrison's Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001]과 같은 의학 교재에서 찾을 수 있다. 몇몇 경우에, 개체에서 암의 진단은 개체로부터 수득된 체액 또는 조직의 샘플에서의 특정 세포 유형 (예를 들어, 암세포)의 확인을 포함할 수 있다.
치료는 인간이든 동물(예를 들어, 수의학 분야에서)이든 간에 어떠한 치료 및 치료법일 수 있으며, 여기서 몇몇 목적하는 효과는, 예를 들면, 병태의 진행의 억제 또는 지연에 의해 달성되며, 진행 속도의 감소, 진행 속도의 중단, 병태의 개선, 병태의 완치 또는 완화 (부분적 또는 전체적이든 간에), 병태의 하나 이상의 징후 및/또는 증상의 예방, 개선, 지연, 완화 또는 억제 또는 치료의 부재하에서 예상되는 것 이상의 대상체 또는 환자의 생존 기간 연장을 포함한다.
예방적 조치 (즉, 예방)로서의 치료가 또한 포함된다. 예를 들면, 암이 발병 또는 재발하기 쉽거나 위험이 있는 개체가 본원에 기술된 바와 같이 치료될 수 있다. 이러한 치료는 개체에서 암의 발병 또는 재발을 방지하거나 지연시킬 수 있다.
특히, 치료는 완전한 암 완화를 포함한 암 성장 억제, 및/또는 암 전이 억제를 포함할 수 있다. 암 성장은 일반적으로 보다 발전된 형태로의 암 내에서의 변화를 나타내는 많은 지표 중 어느 하나를 가리킨다. 따라서, 암 성장의 억제를 측정하기 위한 지표는 암세포 생존의 감소, 종양 체적 또는 형태의 감소 (예를 들면, 컴퓨터 단층 촬영 (CT), 초음파 검사 또는 기타 영상 방법을 사용하여 결정되는 바와 같음), 지연된 종양 성장, 종양 혈관 구조의 파괴, 지연된 과민성 피부 시험에서의 개선된 성능, 항암 면역 세포 또는 다른 항암 면역 반응의 활성 증가, 및 종양-특이 항원 수준의 감소를 포함한다. 개체에서 암성 종양에 대한 면역 반응을 활성화시키거나 향상시키는 것은 암 성장, 특히 대상체에 이미 존재하는 암의 성장에 저항하는 개체의 능력을 향상시킬 수 있고/있거나 개체에서 암 성장 경향을 감소시킬 수 있다.
투여는 "치료학적 유효량"으로 이루어질 수 있으며, 이것은 환자에게 이득을 나타내는데 충분하다. 투여되는 실제 양 및 투여의 속도 및 시간-코스는 치료되는 것의 특성 및 중증도, 치료되는 특정 환자, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 조성물의 전달 부위, 항체 분자의 유형, 투여 방법, 투여 스케줄링 및 의사에게 알려진 다른 인자들에 따라 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반 의사 및 다른 의사의 책임 내에 있으며, 증상의 중증도 및/또는 치료되는 질환의 진행에 따라 좌우될 수 있다. 항체 분자의 적합한 용량은 당업계에 널리 공지되어 있다 (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; and Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). 투여되는 항체 분자에 대해 적합한 것으로 본원에 명시되거나 문헌[Physician's Desk Reference (2003)]에 명시된 특정 투여량이 사용될 수 있다. 항체 분자의 치료학적 유효량 또는 적합한 용량은 동물 모델에서 시험관내 활성 및 생체내 활성을 비교함으로써 결정될 수 있다. 인간에게 마우스 및 다른 시험 동물에서의 유효 투여량을 외삽하는 방법은 공지되어 있다. 정확한 용량은 치료되는 부위의 크기와 위치, 및 항체 분자의 정확한 특성을 포함한 다수의 요인에 따라 결정될 것이다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주 2회, 주간 또는 월간 간격으로 반복될 수 있다.
전형적인 항체 용량은 전신 적용의 경우 100 μg 내지 1 g의 범위이고 국소 적용의 경우 1 μg 내지 1 mg의 범위일 것이다. 초기 더 높은 부하 용량에 이어 한 번 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 전형적으로, 항체는 전체 항체, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4 이소타입일 것이다. 이것은 성인 환자의 단일 치료를 위한 용량이며, 소아 및 유아를 위해서는 비례적으로 조정될 수 있고 분자량에 비례하여 다른 항체 형식에 대해 조정될 수도 있다. 치료는 의사의 재량에 따라 매일, 주 2회, 주간 또는 월간 간격으로 반복될 수 있다. 개체에 대한 치료 스케줄은 항체 조성물의 약동학적 및 약력학적 특성, 투여 경로 및 치료되는 병태의 성질에 의존적일 수 있다.
치료는 주기적일 수 있으며, 투여 사이의 기간은 약 2주 이상, 예를 들어, 약 3주 이상, 약 4주 이상, 약 1개월에 한 번 이상, 약 5주 이상, 또는 약 6주 이상일 수 있다. 예를 들면, 치료는 2주 내지 4주마다 또는 4주 내지 8주마다 일 수 있다. 적합한 제형 및 투여 경로는 위에 기술되어 있다.
본 방법은 환자에게 적어도 하나의 부가적인 치료제를 투여함을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 치료제는 화학요법제, 항-종양 백신, 방사성 핵종, 면역치료제, 예를 들면, 치료학적 항체 분자 또는 이의 치료학적 단편, 사이토킨, 종양용해성 바이러스, CAR-T 세포, 또는 호르몬 요법을 위한 제제를 포함할 수 있다.
화학요법제는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다: 탁산, 세포독성 항생제, 티로신 키나제 억제제, PARP 억제제, B_RAF 효소 억제제, 알킬화제, 백금 유사체, 뉴클레오시드 유사체, 탈리도미드 유도체, 항신생물 화학요법제 및 기타. 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀 및 nab-파클리탁셀을 포함하고; 세포독성 항생제는 악티노마이신, 블레오마이신, 안트라사이클린, 독소루비신 및 발루비신을 포함하고; 티로신 키나제 억제제는 에를로티닙, 게피티닙, 악시티닙, PLX3397, 이마티닙, 코베미티닙 및 트라메티닙을 포함하고; PARP 억제제는 피라파립을 포함하고; B-Raf 효소 억제제는 베무라페닙 및 다브라페닙을 포함하고; 알킬화제는 다카르바진, 사이클로포스파미드, 테모졸로미드를 포함하고; 백금 유사체는 카보플라틴, 시스플라틴 및 옥살리플라틴을 포함하고; 뉴클레오시드 유사체는 겜시타빈 및 아자시티딘을 포함하고; 항신생물제는 플루다라빈을 포함한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 화학요법제는 메토트렉세이트, 데팍티닙, 엔티노스타트, 페메트렉세드, 카페시타빈, 에리불린, 이리노테칸, 플루오로우라실, 및 빈블라스틴을 포함한다.
추가적인 치료제는 항-종양 백신을 포함할 수 있다. 암 치료를 위한 예방접종 전략은 클리닉에서 실행되어 왔으며 과학 문헌[예를 들어, 문헌 참조; Rosenberg, S. 2000 Development of Cancer Vaccines] 내에 상세히 논의되었다. 이것은 면역계가 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)를 갖거나 갖지 않는 예방접종 방법으로서 이들 세포를 사용함으로써 자가 또는 동종 암세포에 의해 발현되는 다양한 세포 마커에 반응을 일으키도록 하는 전략을 주로 포함한다. GM-CSF는 항원 제시에 있어서 강한 반응을 일으키며 상기 전략들과 사용될 때 특히 잘 작용한다.
본 발명의 또 다른 측면과 양태는 용어 "로 이루어진(consisting of)"에 의해 대체된 용어 "포함하는(comprising)"을 갖는 상기한 측면과 양태 및 용어 "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)"으로 대체된 용어 "포함하는 (comprising)"을 갖는 상기한 측면과 양태를 제공한다.
문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 출원은 상기한 측면 및 양태 중의 어느 것의 서로간의 모든 조합을 개시하는 것으로 이해해야 한다. 유사하게, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 본 출원은 바람직한 및/또는 임의의 특징의 모든 조합을 단독으로 또는 임의의 다른 측면과 함께 개시한다.
상기 양태의 변경, 추가의 양태 및 이의 변경은 본 개시내용의 판독시 숙련가에게 자명할 것이며, 이와 같이 이들은 본 발명의 범위 내에 있다.
이 명세서에서 언급된 모든 문서 및 서열 데이터베이스 항목은 모든 목적을 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다.
"및/또는"은 본원에서 사용되는 경우 다른 명시된 특징 또는 성분의 존재 또는 부재하에서의 두 개의 명시된 특징 또는 성분 각각의 구체적인 개시로서 간주되어야 한다. 예를 들면, "A 및/또는 B"는 각각이 개별적으로 본원에 제시되는 것처럼 (i) A, (ii) B 및 (iii) A와 B의 각각의 구체적인 개시로서 간주되어야 한다.
본 발명의 특정 측면 및 양태는 이하에서 상기한 도면을 참조하여 실시예에 의해 예시될 것이다.
실험
실시예 1 - Fcab 및 mAb 2 의 제조
1.1 Fcab 분자의 선택
1.1.1 mTNFRX Fcab 클론의 나이브 선택
효모 세포 표면 상의 Fcab 클론을 발현하는 라이브러리를 뮤린 IgG Fc 도메인에 융합된 비오틴화된 재조합 뮤린 TNF 수용체 (mTNFRX)와 함께 배양하고(mTNFRX-mFc) 스트렙트아비딘 코팅된 비드를 사용하여 MACS에 의해 분류하였다. 그후, 5배 몰 과량의 mFc의 존재하에 감소하는 농도의 비오틴화된 mTNFRX-mFc를 사용하여 세 차례의 FACS 선택을 수행하였다. 세포를 스트렙트아비딘-알로피코시아닌 (APC) (BD Bioscience, 349024) 또는 항-비오틴-APC (Miltenyi Biotec, 130-090-856)로 염색하고 FACSAria (BD Bioscience)를 사용하여 분류하였다. 농축된 집단으로부터의 개별 클론을 항원 결합에 대해 스크리닝하고, 양성 결합제를 HEK Expi293 세포에서 (절두된 힌지를 함유하는) 가용성 Fcab로서 서브클로닝하고 발현시켰다 (Expi293F 세포 [ThermoFisher Scientific, A14527]로 ExpiFectamine 293 형질감염 키트 [ThermoFisher Scientific, A14524]를 사용하여 형질감염된 pTT5 벡터 [캐나다 국립 연구위원회]로 클로닝된 Fcab). 추가 성숙을 위한 Fcab를 세포 결합에 대해 스크리닝함으로써 확인하였다.
"야생형" Fcab는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 서열을 포함한다. 이것은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 LALA 돌연변이의 존재 및 부재 둘 다에서 제시되어 있다. 이러한 실험을 위해 선택된 Fcab 클론은 CH3 도메인의 AB 루프 (잔기 7-21), CD 루프 (잔기 41-81) 및 EF 루프 (잔기 89-103) 내에 돌연변이를 함유하였다. 모든 잔기는 IMGT 번호매김 체계에 따라 번호매겨진다.
1.1.2 TNFRX Fcab의 친화도 성숙
친화도 성숙 라이브러리는 시스테인을 제외한 아미노산의 등몰 분포를 사용하여 AB 루프의 7개 잔기 (잔기 12-18), CD 루프의 6개 잔기 (잔기 45.1-78) 및 EF 루프의 5개 잔기 (92-94 및 97-98)를 랜덤화함으로써 작제하였다.
친화도 성숙 라이브러리를 파지에서 생성하고 스트렙트아비딘-코팅된 (ThermoFisher Scientific, 11205D) 및 뉴트라비딘-코팅된 (ThermoFisher Scientific, 14203 and A2666) 디나비드(Dynabead) 사이를 번갈아가는 비오틴화 mTNFRX-mFc에 대해 세 차례 선택을 수행하였다. 고친화도 결합제를 확인하기 위해 50 nM 내지 10 nM 및 1 nM의 감소하는 항원 농도를 사용하였다. 세 차례의 출력을 파지 ELISA로 스크리닝하고, 양성 결합제를 상기한 바와 같이 서브클로닝하고 발현시켰다.
친화도 성숙에서 확인된 26개 CD 및 36개 EF 루프를 셔플링하고 상기한 바와 같이 HEK Expi293 세포에서 (절두된 힌지를 함유하는) 가용성 Fcab로서 발현시켰다. Fcab를 함유하는 HEK 상청액을 Octet QKe 시스템 (Pall ForteBio) 상에서 Dip 및 ReadTM 스트렙트아비딘 바이오센서 (Pall ForteBio, 18-5050)를 사용하여 비오틴화 mTNFRX-mFc에 대한 결합을 측정함으로써 개선된 오프-속도에 대해 및 실시예 1.3에 기술된 바와 같이 세포 결합에 대해 스크리닝하였다.
1.1.3 mTNFRY Fcab 클론의 나이브 선택
효모 세포 표면 상의 Fcab 클론을 발현하는 라이브러리를 뮤린 IgG Fc 도메인에 융합된 비오틴화된 재조합 뮤린 TNF 수용체 (mTNFRY)와 함께 배양하고(mTNFRY-mFc) 스트렙트아비딘 코팅된 비드를 사용하여 MACS에 의해 분류하였다. 그후, 5배 몰 과량의 mFc의 존재하에 감소하는 농도의 비오틴화된 mTNFRY-mFc를 사용하여 FACS 선택을 수행하였다. 세포를 스트렙트아비딘-알로피코시아닌 (APC) (BD Bioscience, 349024) 또는 항-비오틴-APC (Miltenyi Biotec, 130-090-856)로 염색하고 FACSAria (BD Bioscience)를 사용하여 분류하였다. 농축된 집단으로부터의 개별 클론을 항원 결합에 대해 스크리닝하고 양성 결합제를 가용성 모의 mAb2 (mTNFRY/HelD1.3)로서 서브 클로닝하고 발현시켰다.
"야생형" Fcab는 인간 IgG1의 CH2 및 CH3 도메인 서열을 포함한다. 이것은 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 LALA 돌연변이의 존재 및 부재 둘 다에서 제시되어 있다. 이러한 실험을 위해 선택된 Fcab 클론은 CH3 도메인의 AB 루프 (잔기 7-21) 및 EF 루프 (잔기 89-103) 내에 돌연변이를 함유하였다. 모든 잔기는 IMGT 번호매김 체계에 따라 번호매겨진다.
아래에서 1.2에 언급되어 있고 아래 실시예 5 및 7에서 확인되는 mTNFRY/hCD20 및 mTNFRY/hEGFR mAb2 항체의 작제에 사용하기 위해 선택되는 항-mTNFRY Fcab 클론은 어떠한 친화도 성숙도 겪지 않은 나이브 클론이었다.
1.2 mAb2의 작제 및 발현
항-마우스 TNFRX Fcab 및 항-마우스 TNFRY Fcab는 mAb2 포맷에서 이들 Fcab의 특성화를 가능하게 하기 위해, 다양한 mAb2의 제조에서 사용하기 위해 상기 1.1에 기술된 실험 과정으로부터 확인하고 선택하였다. 이러한 mAb2는 선택된 항-마우스 TNFRX 및 항-마우스 TNFRY Fcab로부터 제조하였으며 항체의 가변 영역은 표 1에 상세하게 나타내어져 있다.
mAb2에 대해 사용되는 명명 시스템은 Fcab/Fab이며, 여기서 Fcab는 Fc 변형된 영역 (Fcab)의 결합 표적을 기술하고 Fab는 mAb2의 Fab 아암의 결합 표적을 기술한다. 두 경우 모두에서, "m"이 표적 이름 앞에 오는 경우 이것은 표적의 뮤린 버전에 대한 결합을 나타내고 "h"가 표적 이름 앞에 오는 경우 이것은 표적의 인간 버전에 대한 결합을 나타낸다. "m"이나 "h" 어느 것도 표적 이름 앞에 오지 않는 경우, 이것은 표적의 뮤린 및 인간 버전 둘 다에 대한 결합을 나타낸다. G1이 Fcab에 사용되는 경우 이것은 변하지 않은 인간 IgG1 Fc 영역(WT)을 나타낸다. LALA 돌연변이는 중쇄의 CH2 도메인에 위치하고 결합 Fc 감마 수용체 결합을 감소시키는 것으로 알려져 있다 (Bruhns, P., et al. (2009); and Xu, D. et al. (2000)). mAb2는 HEK293-6E 세포에서 일과성 발현에 의해 생성하고 mAb 선택 SuRe 단백질 A 컬럼을 사용하여 정제하였다.
mTNFRX-mFc에 대한 mTNFRX/hEGFR의 친화도는 Biacore T200을 사용하여 결정하였다. 5000 RU의 EGFR-Fc (R&D Systems, 344-ER)를 Series S CM5 칩 (GE Healthcare, BR100530) 상에 고정시켰다. 5 nM mTNFRX/hEGFR을 10 μl/min로 1 min 동안 주사한 다음 mTNFRX-mFc를 다양한 농도에서 70 μl/min로 3 min 동안 주사하고 완충액을 10 min 동안 주사하였다. 30 mM NaOH를 30 μl/min에서 10 s 동안 주사함으로써 칩을 재생시켰다. 데이터는 이중 참조를 빼고 BIAevaluation 3.2 소프트웨어를 사용하여 분석하여 반응 속도 상수(kinetic constant)를 계산하였다.
이의 mTNFRY 표적에 대한 mTNFRY/HelD1.3의 친화도는 이의 mTNFRX 표적에 대한 mTNFRX/hEGFR의 친화도를 결정하는데 사용된 바와 유사한 Biacore 방법을 사용하여 결정하였다.
1.3 유동 세포 계측법에 의해 결정된 바와 같은 세포 상에 발현된 마우스 TNFRX에 대한 Fcab의 결합 친화도
렌티바이러스 형질도입 방법을 Lenti-X HTX 패키징 시스템 (Clontech, Cat. No 631249)을 사용하여 마우스 TNFRX를 과발현하는 DO11.10 세포 (National Jewish Health)를 생성하는데 사용하였다. 마우스 TNFRX cDNA를 함유하는 렌티-X 발현 벡터 (pLVX) (Clontech, Cat. No 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 믹스로 Lenti-X 293T 세포주 (Clontech, Cat. No 632180)에 공동-형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. DO11.10 세포주를 Lenti-X HTX 패키징 시스템으로 생성된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다.
마우스 TNFRX를 발현하는 세포 (마우스 TNFRX로 형질감염된 DO11.10 세포주)에 대한 항-마우스 TNFRX Fcab 및 mAb2의 친화도를 유동 세포 계측법을 사용하여 측정하였다. mAb2 및 대조 mAb 희석물 (2 x 최종 농도)을 1 x DPBS (Gibco, 14190-094) 중에서 삼중으로 제조하였다. DO11.10-mTNFRX 세포 현탁액을 PBS+2%BSA (Sigma, A7906) 중에서 제조하고 V-바닥 96-웰 플레이트 (Costar, 3897)에 4 x 10-6개 세포/ml로 하여 50 μl/웰로 접종하였다. 50μl의 mAb2 또는 대조 mAb (없음/mTNFRX) 희석물을 세포를 함유하는 웰에 첨가하고 (최종 체적 100 μl) 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척한 다음 PBS+2% BSA 중에서 1:1000으로 희석시킨 100μl/웰의 이차 항체 (항-인간 Fc-488 항체, Jackson ImmunoResearch, 109-546-098)를 첨가하고 암흑에서 4℃에서 30 mins 동안 배양하였다. 플레이트를 세척하고 DAPI (Biotium, 40043)를 함유하는 PBS 100 μl에서 1 mg/ml로 재현탁시켰다. 플레이트를 Canto II 유동 세포계측기 (BD Bioscience)를 사용하여 판독하였다. 죽은 세포는 배제하고 FITC 채널 (488nm/530/30)에서 형광을 측정하였다. GraphPad Prism 소프트웨어에서 로그 (효능제) 대 응답을 사용하여 데이터를 피팅하였다.
실시예 2 - mAb 2 가교결합을 통한 조건부 수용체 작용 (mTNFRX-X 배향)
활성화된 T 세포는 이들의 세포 표면 상에서 수용체 TNFRX를 발현한다. TNFRX의 클러스터링은 TNFRX 신호전달 및 추가의 T 세포 활성화에 필수적인 것으로 알려져 있다. T 세포 활성화 검정이 아래에 기술된 항체 분자의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하는데 사용되었다. T 세포 활성화는 IL-2의 방출에 의해 결정되었다.
2.1 T 세포의 단리 및 활성화
T 세포를 단리하기 위해, 비장을 4-8주령 암컷 Balb/C 마우스 (Charles River)로부터 수집하였다. 마우스를 인도적으로 안락사시키고 비장을 절개에 의해 단리하였다. 5 ml 플라스틱 주사기의 내부를 사용하여 70 μm 세포 여과기 (cell strainer) (Corning)를 통해 비장을 밀어넣음으로써 비장세포를 단리하였다. 세포 여과기를 1ml 둘베코 인산염-완충 염수 (DPBS) (Gibco)로 10회 세척하고 용리액을 50ml 관에 수집하였다. 용리액에 존재하는 적혈구를 제조사의 지시에 따라 10 ml 적혈구 용해 완충액 (eBioscience)의 첨가를 통해 용해시켰다. 제조사의 지시에 따라 pan T 세포 단리 키트 II (Miltenyi Biotec Ltd)를 사용하여 용리액에 존재하는 비장세포로부터 T 세포를 단리하였다.
마우스 T-활성인자 CD3/CD28 디나비드 (Life technologies)를 보텍싱에 의해 재현탁시켰다. 비드를 T 세포 배지 (10% FBS [Life Technologies], 1x 페니실린 스트렙토마이신 [Life Technologies], 나트륨 피루베이트 [Gibco], 10mM Hepes [Gibco], 2mM L-글루타민 [Gibco] 및 50μM 2-머캅토에탄올 [Gibco])을 갖는 RPMI 배지 [Life Technologies])로 2회 세척하였다.
T 세포 배지 중의 1.0 x106개 세포/ml의 농도의 필요량의 T 세포를 T-25 플라스크 (Sigma) 속에서 2:1 세포 대 비드 비로 세척한 마우스 T-활성인자 CD3/CD28 디나비드 (Life Technologies 11452D)로 자극하고 37℃ + 5% CO2에서 밤새 배양하여 T 세포를 활성화시켰다.
2.2 T 세포를 CD-20 발현 다우디 세포와 배양
밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x 106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96-웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에 희석시킨 2.5 μg/ml 항-마우스 CD3 항체 (Biolegend)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 2회 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이들의 세포 표면 상에 CD20을 발현하는 다우디 세포 (ATCC, CCL-213)를 10% FBS (Life Technologies) 및 나트륨 피루베이트 (Gibco)를 갖는 RPMI 배지 (Life Technologies)에서 유지시켰다. 다우디 세포를 T 세포 배지에서 한 번 세척하고 필요한 경우 2.5 x 104개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
2.3 mAb2 분자 가교결합은 mTNFRX 수용체 클러스터링의 효과적인 유도를 야기한다
T 세포 활성화 검정을 아래 표 2에 상세하게 기술된 항체 분자의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하는데 사용하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 2 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:10 (30 μl + 270 μl)으로 추가로 희석시켜 200 nM 희석물을 수득하였다. 가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; 또는 FITCdex, Sigma)를 필요한 경우 시험 항체와 1:1 몰 비로 웰에 첨가하였다.
96 웰 플레이트에서, 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물의 6개의 5배 연속 희석물을 제조하였다 (60 μl + 240 μl T 세포 배지). 100μl의 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다.
T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience 또는 R&D systems)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 마우스 IL-2 (mIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 비하여 플롯팅하고 생성된 곡선을 GraphPad Prism에서 로그 (효능제) 대 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다. 표 3은 시험된 mAb2 및 mAb의 존재하에 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC50 값 및 최대 반응을 보여준다. 도 2는 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다.
도 2는 TNFRX 수용체가 표적화되고 항-TNFRX 항체가 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가됨을 보여준다. T 세포 활성화는 가교결합제 (다우디 세포, 항-Fc 항체 또는 FITCdex)의 부재하에 단일 고농도 (100 nM)의 임의의 항체에서는 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 항-CD20 및 항-FITC 항체는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 항-TNFRX 항체는 다우디 세포 (없음/mTNFRX)의 존재하에서 고 농도에서 일부 T 세포 활성화를 유도한다. 이러한 항체는 항-Fc 항체 (없음/mTNFRX+ a-hFc)에 의해 가교결합되는 경우 보다 높은 수준의 T 세포 활성화를 유도하며 보다 낮은 EC50를 갖는다 (표 3 참조). 항-TNFRX Fcab는 항-Fc 항체 (mTNFRX/없음 + a-hFc)에 의해 가교결합되는 경우 TNFRX 항체 (없음/mTNFRX)에 필적하는 EC50를 갖지만 더 낮은 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. 동일한 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-FITC Fab와 쌍을 이루는 경우 FITCdex에 의해 가교결합될 때 TNFRX 항체 (mTNFRX/FITC + FITCdex)에 필적하는 EC50 및 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. 동일한 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-CD20 Fab와 쌍을 이루는 경우 다우디 세포의 존재하에서 TNFRX 항체 (mTNFRX/hCD20)보다 100배 더 낮은 EC50 및 필적하는 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다.
이러한 데이터는 관찰되는 T 세포 활성화가 다우디 세포, 항-인간 Fc 항체를 사용하여 또는 이특이성 항체의 Fab 아암의 맞물림에 의해 항-TNFRX 항체의 가교 결합시에만 일어난다는 것을 보여준다. mTNFRX/hCD20 mAb2에 대한 다우디 세포의 부재에서의 T 세포 활성화의 결핍은 이들 분자가 Fab 표적의 존재하에서 T 세포 활성화만을 유도하는 조건부 효능제임을 입증한다. 이러한 조건부 작용은 mTNFRX/hCD20 및 mTNFRX/FITC mAb2 둘 다에 존재하며, 이것은 세포 표면 수용체 및 가용성 인자 둘 다가 가교결합을 위한 Fab 표적으로서 사용될 수 있음을 입증한다.
TNFRX 항체 (없음/mTNFRX)에 대한 다우디 세포의 가교결합 효과는 Fc 감마 수용체 상호반응을 통해 일어나며 낮은 수준의 T 세포 활성화 및 단지 높은 항체 농도를 초래한다. 대조적으로 mTNFRX/hCD20 mAb2는 Fab 아암이 다우디 세포의 표면에서 발현되는 CD20 수용체에 의해 맞물리는 경우 매우 낮은 항체 농도에서 높은 수준의 T 세포 활성화를 나타낸다. 이것은 mAb2 포맷이 항체 가교결합 및 이에 따른 수용체 클러스터링에 매우 근접한 Fc 감마 수용체 발현 세포 및 TNFRX 발현 세포의 존재에 의존하는 항체 (mAb)보다 효능제 수용체를 가교결합시키는데 더 우수하다는 것을 입증한다.
2.4: 다른 세포 표면 수용체가 mAb2 가교결합을 통해 조건부 수용체 작용을 유도하는데 사용될 수 있다
T 세포 활성화 검정이 아래 표 4에 열거된 항체의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하는데 사용되었다.
T 세포를 실시예 2.1에 상세하게 설명된 바와 같이 단리하고 활성화시켰다. 밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x 106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96 웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에서 희석시킨 2.5 μg/ml 항-마우스 CD3 항체 (Biolegend)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 2회 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x 105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이들의 세포 표면 상에 EpCAM 및 CD73을 발현하는 4T1 세포 (ATCC, CRL-2539)를 10% FBS (Life Technologies)를 갖는 DMEM 배지 (Life Technologies)에서 유지시켰다. 4T1 세포를 T 세포 배지에서 한 번 세척하고 필요한 경우 2.5 x 104개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 4 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:10 (30 μl + 270 μl)으로 추가로 희석시켜 200 nM 희석물을 수득하였다.
가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; 또는 FITCdex, Sigma)를 필요한 경우 시험 항체와 1:1 몰 비로 웰에 첨가하였다.
96-웰 플레이트에서, 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물의 6개의 5배 연속 희석물을 제조하였다 (60 μl + 240 μl T 세포 배지). 100μl의 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다. T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience 또는 R&D systems)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 마우스 IL-2 (mIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 비하여 플롯팅하고 생성된 곡선을 GraphPad Prism에서 로그 (효능제) 대 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다. 표 5는 시험된 mAb2 및 mAb의 존재하에 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC50 값 및 최대 반응을 보여준다. 도 3은 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다.
도 3은 TNFRX 수용체가 표적화되고 항-TNFRX 항체가 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가됨을 보여준다. T 세포 활성화는 가교결합제 (4T1 세포, 항-Fc 항체 또는 FITCdex)의 부재하에 단일 고농도 (100 nM)의 임의의 항체에서는 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 항-마우스 EpCAM, 항-마우스 CD73 및 항-FITC 항체는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 항-마우스 TNFRX 항체는 항-Fc 항체 (없음/mTNFRX + a-hFc)에 의해 가교결합될 때 일부 T 세포 활성화를 유도한다 (표 5 참조). 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-FITC Fab와 쌍을 이룰 경우 FITCdex (mTNFRX/FITC + FITCdex)에 의해 가교결합될 때 TNFRX 항체 (없음/mTNFRX)보다 더 낮은 EC50 및 더 높은 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. 동일한 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-마우스 EpCAM Fab 또는 항-마우스 CD73 Fab와 쌍을 이룰 경우 4T1 세포의 존재하에서 TNFRX/FITC mAb2 (mTNFRX/mEpCAM 또는 mTNFRX/mCD73)보다 더 낮은 EC50 및 필적하는 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다.
이 데이터는 관찰되는 T 세포 활성화가 항-인간 Fc 항체를 사용하거나 이특이성 항체의 Fab 아암의 맞물림에 의해 항-TNFRX 항체의 가교결합시에만 발생한다는 것을 보여준다. 마우스 EpCAM 및 마우스 CD73 둘 다를 발현하는 4T1 세포의 존재하에서 mTNFRX/mEpCAM 및 mTNFRX/mCD73 mAb2로 관찰되는 T 세포 활성화는 하나 이상의 유형의 세포 표면 수용체가 항 TNFRX Fcab와 쌍을 이루는데 사용될 수 있음을 입증하며, 이것은 CD73이 GPI-결합된 세포 표면 수용체이고 EpCAM이 막관통 당단백질이기 때문이다.
실시예 3 - mAb 2 가교결합은 양 배향으로 작동한다
T 세포 활성화 검정이 아래 표 6에 열거된 항체의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하는데 사용되었다. T 세포 활성화는 IL-2의 방출에 의해 결정하였다.
3.1 인간 EGFR을 과발현하는 세포주의 생산
렌티바이러스 형질도입 방법을 Lenti-X HTX 패키징 시스템 (Clontech, Cat. No 631249)을 사용하여 인간 EGFR을 과발현하는 CT26 세포 (ATCC, CRL-2638)를 생성하는데 사용하였다. 인간 EGFR cDNA를 함유하는 Lenti-X 발현 벡터 (pLVX) (Clontech, Cat. No 631253)를 Lenti-X HTX 패키징 믹스로 Lenti-X 293T 세포주 (Clontech, Cat. No 632180)에 공동-형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. CT26 세포주를 Lenti-X HTX 패키징 시스템으로 생성된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다.
3.2 T 세포 활성화 검정
T 세포를 실시예 2.1에 제시된 바와 같이 단리하고 활성화시켰다.
밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96 웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에서 희석시킨 2.5 μg/ml 항-마우스 CD3 항체 (Biolegend)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 두 번 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이들의 세포 표면 상에 hEGFR을 발현하도록 형질도입된 CT26 세포 (ATCC, CRL-2638)를 10% FBS (Life Technologies)를 갖는 DMEM 배지 (Life Technologies)에서 유지시켰다. CT26.hEGFR 세포를 T 세포 배지에서 한 번 세척하고 필요한 경우 2.5 x 104개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 6 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:10 (30 μl + 270 μl)으로 추가로 희석시켜 200 nM 희석물을 수득하였다. 가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; 또는 FITCdex, Sigma)를 필요한 경우 시험 항체와 1:1 몰 비로 웰에 첨가하였다.
96-웰 플레이트에서, 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물의 6개의 5배 연속 희석물을 제조하였다 (60 μl + 240 μl T 세포 배지). 100μl의 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다. T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience 또는 R&D systems)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 마우스 IL-2 (mIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 비하여 플롯팅하고 생성된 곡선을 GraphPad Prism에서 로그 (효능제) 대 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다.
3.3 T 세포 활성화 검정의 결과
시험된 mAb2 및 mAb의 존재하에 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC50 값 및 최대 반응이 표 7에 나타내어져 있다. 도 4는 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다.
도 4는 TNFRX 수용체가 표적화되고 항-TNFRX 항체가 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가함을 보여준다. T 세포 활성화는 가교결합제 (CT26.hEGFR 세포, 항-Fc 항체 또는 FITCdex)의 부재하에 단일 고농도 (100 nM)의 임의의 항체에서는 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음). 항-EGFR (G1AA/Cx) mAb 및 항-EGFR (FS1-67AA/4420) Fcab 및 항-FITC 항체 (없음/hEGFR)는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 항-TNFRX 항체는 항-Fc 항체 (없음/mTNFRX + a-hFc)에 의해 가교결합될 때 T 세포 활성화를 유도한다 (표 7 참조). 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-FITC Fab와 쌍을 이룰 경우 FITCdex에 의해 가교결합될 때 TNFRX 항체 (mTNFRX/FITC + FITCdex)보다 더 낮은 EC50 및 더 높은 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. 동일한 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-EGFR Fab와 쌍을 이룰 경우 CT26.hEGFR 세포의 존재하에서 TNFRX/FITC (mTNFRX/hEGFR)보다 더 낮은 EC50 및 더 낮은 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. TNFRX 항체는 mAb2에서 EGFR Fcab와 쌍을 이룰 경우 CT26.hEGFR 세포의 존재하에서 TNFRX/FITC (hEGFR/mTNFRX)보다 더 낮은 EC50 및 필적하는 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다.
이 데이터는 mAb2의 양 배향이 수용체 클러스터링 및 T 세포 활성화를 유도할 수 있어서 mAb2의 Fcab 및 Fab 부분 둘 다가 TNFRX 또는 TAA 유형의 수용체를 표적화할 수 있음을 보여준다.
실시예 4 - 가용성 인자와의 mAb 2 가교결합
T 세포 활성화 검정이 가용성 인자가 아래 표 8에 열거된 항체의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있는지의 여부를 결정하는 데 사용되었다. 1mer은 가용성 단량체 인자이고 2mer은 가용성 이량체 인자이다.
T 세포를 실시예 2.1에 기술된 바와 같이 단리시키고 활성화시켰다.
밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96-웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에서 희석시킨 1 μg/ml 항-인간 CD3 항체 (Biotechne clone UCHT1)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 두 번 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 8 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:100 (3 μl + 297 μl)으로 추가로 희석시켜 20 nM 희석물을 수득하였다. 가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; 또는 인간 2mer Peprotech; 또는 인간 1mer)를 필요한 경우 시험 항체와 항-인간 Fc 항체 또는 인간 2mer의 경우 1:1 몰 비로 또는 1mer의 경우 2:1 몰 비로 웰에 첨가하였다. 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물 (100μl/well)을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다.
T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 인간 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 표 9는 T 세포 활성화 검정에서 시험된 mAb2 및 mAb의 존재에 반응하여 생산된 인간 IL-2 수준을 보여준다. 도 5는 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다.
도 5는 TNFRX 수용체가 표적화되고 항-TNFRX 항체가 가교결합되는 경우 T 세포의 활성화가 증가됨을 보여준다. T 세포 활성화는 가교결합제 (항-Fc 항체, 2mer 또는 1mer)의 부재하에 단일 고농도 (100 nM)의 임의의 항체에서는 관찰되지 않았다. WT Fcab는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 항-TNFRX 항체는 항-인간 Fc 항체 (없음/hTNFRX + a-hFc)로 가교결합될 때에만 T 세포 활성화를 유도한다. 동일한 항-인간 TNFRX Fab는 mAb2에서 1mer를 표적화하는 Fcab와 쌍을 이룰 경우 항-Fc 항체 (1mer/hTNFRX + a-hFc)에 의해 가교결합될 때에는 T 세포를 활성화시키지만 2mer 또는 1mer (1mer/hTNFRX + 2mer 및 1mer/hTNFRX + 1mer)로 가교결합될 때에는 그렇지 않다. 동일한 항-인간 TNFRX Fab는 mAb2에서 2mer를 표적화하는 Fcab와 쌍을 이룰 경우 항-Fc 항체 (2mer/hTNFRX + a-hFc)에 의해 가교결합될 때 및 또한 2mer (2mer/hTNFRX + 2mer)로 가교결합될 때에는 T 세포를 활성화시키지만 가용성 1mer (2mer/hTNFRX + 1mer)에서는 그렇지 않다.
이 데이터는 가용성 인자가 Fab 아암을 통해 TNFRX를 표적화하고 Fcab를 통해 가용성 인자를 표적화하는 mAb2의 항체 가교결합을 유도하는데 사용될 수 있음을 보여준다. 이러한 가교결합은 T 세포 상에 TNFRX 수용체를 클러스터링함으로써 T 세포 활성화를 초래한다. 1mer의 존재하에 1mer/TNFRX mAb2에서 관찰되는 활성의 결여는 모든 가용성 인자가 T 세포 활성화에 필요한 항체 가교결합 효과를 유도할 수 있는 것은 아님을 시사한다. 2mer가 이량체이고 1mer가 단량체라는 사실은 적어도 n=2의 다량체 가용성 인자에 대한 필요성을 나타내며, 여기서 n은 가용성 인자의 서브유닛의 수를 나타낸다.
실시예 5 - 또 다른 TNF 수용체 ( TNFRY )의 조건부 수용체 작용
T 세포 활성화 검정은 mAb2 포맷이 T 세포 상에서 발현되는 다른 TNF 수용체 (TNFRY)를 활성화시키는데 사용될 수 있음을 확인하는데 사용되었다.
마우스 TNFRY를 발현하는 세포 (마우스 TNFRY로 형질감염된 DO11.10 세포주)를 hCD20 발현 다우디 세포 (CD20+ 세포)의 존재 또는 부재하에 T 세포 활성화 실험에 사용하였다. 이 실험에 사용된 항체 분자의 세부사항은 표 10에 나타내어져 있다. 단백질 L을 가교결합제로서 사용하고 mTNFRY 수용체 활성화를 자극하기 위해 mTNFRY 단클론 항체 (없음/mTNFRY)와 함께 첨가하였다.
T 세포 활성화는 mIL-2 사이토킨 방출을 초래하며, 이것은 ELISA에 의해 정량하였다. 도 6a 및 도 6b는 다양한 항체 분자의 존재하에서의 T 세포 활성화에 대한 결과를 보여준다. 검정은 도 6a 및 도 6b에 각각 예시된, hCD20 발현 세포의 부재 (열린 사각형, 파선) 및 존재 (닫힌 사각형, 실선) 둘 다에서 mTNFRY 항체 (없음/mTNFRY)에 대해 수행하였다. EC50 결과가 표 11에 나타내어져 있다. hCD20 발현 다우디 세포의 부재하에서, mTNFRY/hCD20 mAb2는 최소의 T 세포 활성화를 야기한다 (열린 원, 파선). 동일한 mTNFRY/hCD20 mAb2는 hCD20 발현 다우디 세포의 존재하에서 T 세포를 활성화시켜 (닫힌 원, 실선) 가교결합제 (없음/mTNFRY)의 존재하에서의 mTNFRY 항체보다 30배 더 낮은 EC50을 초래한다. CD20+ 세포의 첨가는 mTNFRY 항체에 대해 유사한 수준의 T-세포 활성화를 야기하였다 (도 6b).
이 실험은 hCD20 발현 세포의 존재하에서만 mTNFRY/hCD20 mAb2가 높은 수준의 T 세포 활성화를 나타냄을 입증하며, 조건부 효능제로서의 mAb2 포맷의 적합성을 추가로 입증한다. 게다가, mAb2는 낮은 항체 농도에서 높은 수준의 T 세포 활성화를 보이는 반면, 외부 가교결합제의 존재하에 T 세포 활성화를 유도하기 위해서는 높은 수준의 mTNFRY 항체가 필요하였다. 이것은 효능제 수용체를 가교결합하는데 있어서 mAb2 분자의 우수성을 추가로 입증한다.
hTNFRY/hCD20 mAb2, 즉 mTNFRY/hCD20 mAb2에 의해 결합된 뮤린 TNFRY 항원과 대조적으로 상응하는 인간 TNFRY 항원에 결합하는 mAb2를 또한 상기한 실험 장치를 사용하여 T 세포 활성화 검정에서 시험하였다. hTNFRY/hCD20 mAb2가 hCD20 발현 다우디 세포 (CD20+ 세포)의 존재 또는 부재하에 TNFRY의 인간 버전을 발현하는 T 세포 (인간 TNFRY로 형질감염된 DO11.10 세포주)를 활성화시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해 분석을 수행하였다. 수득된 결과는 상기한 mTNFRY/hCD20 mAb2로 수득된 결과에 필적하였다.
실시예 6 - 다른 세포 표면 수용체가 시험관내 및 생체내에서 mAb 2 가교결합을 통해 조건부 수용체 작용을 유도하는데 사용될 수 있다
6.1. 다른 세포 표면 수용체가 시험관내에서 mAb 2 가교결합을 통해 조건부 수용체 작용을 유도하는데 사용될 수 있다
T 세포 활성화 검정이 아래 표 12에 열거된 시험 항체의 존재하에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하는데 사용되었다.
T 세포를 실시예 2.1에 상세히 설명된 바와 같이 단리하고 활성화시켰다. 밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x 106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96-웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에서 희석시킨 2.5 μg/ml 항-마우스 CD3 항체 (Biolegend)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 2회 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x 105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다. 이들의 세포 표면 상에서 인간 EphA2를 발현하는 HPAC 세포 (ATCC, CRL2119TM)를 10% FBS (Life Technologies)를 갖는 DMEM 배지 (Life Technologies)에서 유지시켰다. HPAC 세포를 T 세포 배지로 한 번 세척하고 필요한 경우 2.5 x 104개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 12 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:10 (30 μl + 270 μl)으로 추가로 희석시켜 200 nM 희석물을 수득하였다.
가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; 또는 FITCdex, Sigma)를 필요한 경우 시험 항체와 1:1 몰 비로 웰에 첨가하였다.
96-웰 플레이트에서, 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물의 6개의 5배 연속 희석물을 제조하였다 (60 μl + 240 μl T 세포 배지). 100μl의 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다. T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience 또는 R&D systems)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 마우스 IL-2 (mIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 비하여 플롯팅하고 생성된 곡선을 GraphPad Prism에서 로그 (효능제) 대 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다. 표 13은 시험된 mAb2 및 mAb의 존재하에서 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC50 값 및 최대 반응을 보여준다. 도 7a 및 b는 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다.
도 7a는 TNFRX 수용체 및 EphA2 수용체를 표적화하는 이특이성 항체가 존재하는 경우에는 EphA2 발현 세포 (HPAC)의 존재하에서 T 세포의 활성화가 증가하지만 TNRFX 수용체를 표적화하는 다른 항체가 존재하지만 가교결합되지 않은 경우에는 그렇지 않음을 보여준다. 이것은 이특이성 항체가 두 개의 표적, TNFRX 및 EphA2에 결합함으로써 가교결합됨을 나타낸다. 도 7b는 TNFRX 수용체를 표적화하는 임의의 항체가 비-생리적 가교결합제 (항-Fc 항체 또는 FITCdex)의 존재하에서 T 세포를 활성화시킴을 보여준다. 항-EphA2 및 항-FITC 항체는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. 항-마우스 TNFRX 항체는 항-Fc 항체 (없음/mTNFRX + a-hFc)에 의해 가교결합될 때 일부 T 세포 활성화를 유도한다 (표 13 참조). 항-TNFRX Fcab는 mAb2에서 항-FITC Fab와 쌍을 이룰 경우 FITCdex (mTNFRX/FITC + FITCdex)에 의해 가교결합될 때 TNFRX 항체 (없음/mTNFRX)보다 낮은 EC50 및 더 높은 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다. 동일한 항-TNFRX Fcab는 mAb2 (mTNFRX/EphA2)에서 항-EphA2 Fab와 쌍을 이룰 경우 HPAC 세포의 존재하에서 mTNFRX/FITC mAb2에 비해 더 낮은 EC50 및 필적하는 최대 반응으로 T 세포를 활성화시킨다.
이 데이터는 관찰되는 T 세포 활성화가 항-인간 Fc 항체를 사용하거나 이특이성 항체의 Fab 아암의 맞물림에 의해 항-TNFRX 항체의 가교결합시에만 발생한다는 것을 보여준다. EphA2를 발현하는 HPAC 세포의 존재하에서 mTNFRX/EphA2 mAb2로 관찰되는 T 세포 활성화는 이 수용체가 EphA2 및 mTNRFX에 대한 특이성을 갖는 mAb2 이특이성 항체에 의해 표적화되는 경우 mTNFRX 수용체의 가교결합을 또한 매개할 수 있음을 입증한다.
세포 표면 종양 항원 hPSMA를 발현하는 세포의 존재 또는 부재하에 mTNFRX를 발현하는 T 세포를 활성화시키기 위해 mAb2 포맷 (mTNFRX/hPSMA)으로 항-인간 PSMA Fab와 쌍을 이루는 mTNFRX Fcab의 능력을 시험하기 위한 T 세포 활성화 실험을 또한 수행하였으며 상기한 mTNFRX/hEpCAM mAb2, 뿐만 아니라 본원의 다른 곳에 기술된 mTNFRX/hCD20, mTNFRX/mCD73, mTNFRX/hEGFR, 및 mTNFRX/VEGF mAb2 쌍에 대해 T 세포 활성화 검정으로부터 수득된 것에 필적하는 결과를 제공하였다.
Fcab가 뮤린 TNFRX보다는 인간 TNFRX에 결합된 mAb2가 T 세포 활성화 검정에서 T 세포를 활성화시킬 수 있는지를 시험하기 위해 유사한 T 세포 활성화 검정을 또한 수행하였다. 시험된 분자는 hTNFRX/mEpCAM, hTNFRX/hEGFR, hTNFRX/EphA2 및 hTNFRX/hCEACAM5 mAb2이었다. T 세포 활성화 검정에서 사용된 T 세포는 TNFRX의 인간 버전을 발현하였으며, mAb2의 Fab 부분에 의해 결합된 관련 세포 표면 종양 항원을 발현하는 세포, 즉, 각각 mEpCAM, hEGFR, EphA2 또는 hCEACAM5의 존재 또는 부재하에 시험하였다. 결과는 mTNFRX Fcab, 및 본원에 기술된 바와 같이 hCD20, hEpCAM, mCD73, hEGFR, EphA2, VEGF 또는 hPSMA에 결합하는 Fab 부분을 포함하는 mAb2 분자 (즉, mTNFRX/hCD20, mTNFRX/hEpCAM, mTNFRX/mCD73, mTNFRX/hEGFR, mTNFRX/EphA2, mTNFRX/VEGF 및 mTNFRX/hPSMA)로 T 세포 활성화 검정에서 수득되는 것에 필적하였다.
6.2 시험관내 조건부 수용체 작용을 할 수 있는 mAb 2 는 생체내에서 종양 성장을 억제한다
CT26 세포가 뮤린 EphA2를 발현하고 CT26 종양으로부터 단리된 종양 침윤 림프구 (TIL)가 mTNFRX를 발현하기 때문에 CT26 공통유전자 종양 모델을 이 실험에서 사용하였다. mTNFRX/EphA2 mAb2를 CT26 공통유전자 마우스 종양 성장 모델에서 생체내 활성에 대해 시험하였다. 종양 성장을 억제하는 mAb2의 능력을 mTNRFX/없음 mAb2, mTNFRx/없음 mAb2와 없음/EphA2 mAb의 조합, 및 없음/FITC mAb 대조군의 능력과 비교하였다. 각각 체중이 20-25 g인 8-10주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 전에 1주일 동안 쉬게 하였다. 모든 동물을 마이크로 칩으로 채워져 고유 식별자를 부여하였다. 각 코호트는 12 마리의 마우스를 가졌다. CT26 결장 암종 세포주 (ATCC, CRL-2638)를 초기에 확장시키고 저장한 다음 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원균에 대해 IDEXX Bioresearch에 의해 사전-스크리닝하였으며 병원균 비함유인 것으로 나타났다. CT26 세포 (대략 3-5 x 106개)를 -150℃ 저장으로부터 해동시키고 T175 조직 배양 플라스크에서 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 갖는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 마우스를 이소플루란 (Abbott Laboratories)을 사용하여 마취시켰으며 각 동물은 왼쪽 옆구리에 피하 주사된 1 x 106개 세포를 제공받았다. 종양 세포 접종 후 10일째에, 마우스를 건강 및 종양 성장에 대해 모니터링하고 분류하여 연구 코호트로 무작위화하였다. 이 시점에서 종양을 갖지 않았던 마우스는 연구에서 제외시켰다.
mAb2 분자 및 대조군 항체 모두를 SEC-HPLC 프로파일링에 의해 주사한지 24시간 이내에 분석하고 불순물에 대해 확인하였다. 항체는 PBS에서 1 mg/kg의 최종 농도로 제조하였다. mAb2 분자 및 대조군 항체를 종양 접종 후 10, 12 및 14일에 복강내 (IP) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 동물들은 마취하에 일주일에 세 번씩 블라인드 방식으로 건강 검진을 받았으며, 이 시간 동안 종양의 정확한 측정이 이루어졌다. 종양 체적을 캘리퍼스로 측정하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 결정하였다. 다음 공식을 사용하여 종양 체적을 계산하였다:
L x (S2) / 2
(여기서, L = 가장 긴 축; S = 가장 짧은 축)
종양 부담이 한계에 가깝다고 간주되는 20일째에 시험을 중단하고 모든 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 결과가 도 8에 나타내어져 있다. 최종 종양 체적의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 패키지 내의 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다.
종양 성장을 억제하는데 있어서 mTNRFX/EphA2 mAb2 및 없음/FITC 대조군 (정상 성장) 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 입증되었다. 이러한 통계적으로 유의적인 차이는 mTNFRX/없음과 없음/EphA2 또는 mTNFRX/없음의 조합 대 없음/FITC 대조군에서는 관찰되지 않았다.
CT26 종양 모델은 공격적이고 빠르게 성장하는 종양 모델이며, 장 전이를 일으키는 마우스에서 내재적으로 발생하기 쉽고, 그 결과 매우 제한된 치료 범위(therapeutic window)를 갖는다. 놀랍게도, mTNFRX 및 EphA2를 표적화하는 항체의 조합은 IgG 대조군 코호트에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제하지 못했다. 그러나, mTNFRX/EphA2 처리된 코호트는 IgG 대조군에 비해 유의적인 성장 억제를 나타냈다. 이 시험은, 관찰된 시험관내 결과와 유사하게, 종양 세포에서 발현된 EphA2 및 TILs에서 발현된 mTNRFX를 표적화하는 mAb2 이특이성 항체에 의한 mTNFRX의 가교결합이 대조군에서 관찰되는 것 이상으로 T 세포 활성화 및 후속적인 종양 성장 조절을 야기한다는 것을 보여준다.
실시예 7 - mTNFRY / EGFR mAb 2 의 생체내 항-종양 활성
7.1 레트로바이러스 형질도입에 의해 인간 EGFR을 과발현하는 세포주의 생산
레트로바이러스 형질도입 방법을 MSCV 레트로바이러스 발현 시스템 (Clontech, Cat. No 634401)을 사용하여 인간 EGFR을 과발현하는 CT26 세포 (ATCC, CRL-2638)를 생성하는데 사용하였다. 인간 EGFR cDNA를 함유하는 MSCV 발현 벡터 (pMSCV-hyg) (Clontech, Cat. No 631461)를 RetroPack PT67 세포주 (Clontech, Cat. No 631510)에 형질감염시켜 바이러스를 생성하였다. CT26 세포주를 MSCV 레트로바이러스 발현 시스템으로 생산된 레트로바이러스 벡터를 사용하여 형질도입하였다.
7.2 mAb2의 생체내 항-종양 활성
CT26.hEGFR 공통유전자 종양 모델은 상기 7.1에 기술된 바와 같이 인간 EGFR 발현 레트로바이러스를 CT26 세포에 형질도입함으로써 생산하였다. 이들 세포를 이들의 생체내 성장 특성에 대해 시험하였으며 야생형 CT26 세포에 필적하게 성장하는 것으로 나타났다. 그후, 이들 세포를 mTNFRY/hEGFR mAb2의 생체내 항-종양 활성을 시험하는데 사용하였다. 종양 성장을 억제하는 mAb2의 능력을 다음의 대조군의 능력과 비교하였다: mTNFRY/없음 mAb2와 없음/hEGFR mAb의 조합; 없음/FITC mAb; 및 없음/hEGFR mAb 단독.
각각 체중이 20-25 g인 8-10주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 전에 1주일 동안 쉬게 하였다. 모든 동물을 마이크로 칩으로 채워져 고유 식별자를 부여하였다. 각 코호트는 12 마리의 마우스를 가졌다. CT26.hEGFR 세포 (대략 3-5 x 106개)를 -150℃ 저장으로부터 해동시키고 T175 조직 배양 플라스크에서 10% FCS (Gibco, 10270-106) 및 100 ug/ml 히그로마이신 (Gibco, 10687010)을 갖는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 마우스를 이소플루란 (Abbott Laboratories)을 사용하여 마취시켰으며 각 동물은 왼쪽 옆구리에 피하 주사된 1 x 106개 세포를 제공받았다. 종양 세포 접종 후 7일째에, 마우스를 건강 및 종양 성장에 대해 모니터링하고 분류하여 연구 코호트로 무작위화하였다. 이 시점에서 종양을 갖지 않았던 마우스는 연구에서 제외시켰다.
mAb2 분자 및 대조군 항체 모두를 SEC-HPLC 프로파일링에 의해 주사한지 24시간 이내에 분석하고 불순물에 대해 확인하였다. 항체는 PBS에서 1 mg/kg의 최종 농도로 제조하였다. mAb2 분자 및 대조군 항체를 종양 접종 후 7, 9 및 11일에 복강내 (IP) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 동물들은 마취하에 일주일에 세 번씩 블라인드 방식으로 건강 검진을 받았으며, 이 시간 동안 종양의 정확한 측정이 이루어졌다. 종양 체적을 캘리퍼스로 측정하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 결정하였다. 다음 공식을 사용하여 종양 체적을 계산하였다:
L x (S2) / 2
(여기서, L = 가장 긴 축; S = 가장 짧은 축)
종양 부담이 한계에 가깝다고 간주되는 20일째에 시험을 중단하고 모든 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 결과가 도 9에 나타내어져 있다. 최종 종양 체적의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 패키지 내의 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다.
mTNRFY/hEGFR mAb2와 없음/hEGFR 대조군 사이에는 통계적으로 유의적인 차이가 입증되었지만 다른 그룹에서는 그렇지 않았다. 없음/EGFR 대조군이 없음/FITC 대조군보다 약간 더 빠른 종양 성장을 보이는 이유는 명확하지 않다. 그러나, mTNFRY/hEGFR mAb2가 CT26.hEGFR 종양 모델에서 종양 성장의 억제를 보이는 것은 분명하다. mTNFRY/없음과 없음/hEGFR 대조군의 조합 대 없음/hEGFR 대조군은 통계적으로 유의적인 차이를 보이지 않았다.
CT26.hEGFR 종양 모델은 CT26 종양 모델과 동일한 속도로 생체내에서 성장하며, CT26 종양 모델은 공격적이고 빠르게 성장하는 종양 모델이며, 장 전이를 일으키는 마우스에서 내재적으로 발생하기 쉽고, 그 결과 매우 제한된 치료 범위를 갖는다. 놀랍게도, mTNFRY 및 hEGFR을 표적화하는 항체의 조합은 IgG 대조군 코호트에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제하지 못했다. 그러나, mTNFRY/hEGFR 처리된 코호트는 없음/hEGFR 대조군에 비해 유의적인 성장 억제를 나타냈다.
실시예 8 - 가용성 인자는 생체내 , 뿐만 아니라 시험관내에서 mAb 2 가교결합을 통해 조건부 수용체 작용을 유도하는데 사용될 수 있다
8.1 가용성 인자는 시험관내에서 mAb2 가교결합을 통해 조건부 수용체 작용을 유도하는데 사용될 수 있다.
이 실시예에서 시험된 항체 세트가 시험관내에서 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 이들을 상기 실시예 4에서 시험된 항체에 대해 기술된 바와 같이 시험하였다.
구체적으로, T 세포 활성화 검정을 사용하여 아래 표 14에 열거된 항체의 존재하에 TNFRX 수용체의 클러스터링 및 신호전달을 평가하였다.
T 세포는 실시예 2.1에 상세하게 설명된 바와 같이 단리하고 활성화시켰다.
밤새 배양한 후, 활성화된 T 세포를 디나비드로부터 세척하고 2.0 x106개 세포/ml의 농도로 T 세포 배지에 재현탁시켰다. 96-웰 평저 플레이트를 37℃ + 5% CO2에서 2시간 동안 PBS에서 희석시킨 2.5 μg/ml 항-마우스 CD3 항체 (Biolegend)와의 배양을 통해 항-마우스 CD3 항체로 코팅한 다음 PBS로 두 번 세척하였다. 활성화된 T 세포를 1.0 x105개 세포/웰로 플레이트에 첨가하였다.
각 시험 항체 (세부사항에 대해서는 표 15 참조)의 2 μM 희석물을 DPBS (Gibco) 중에서 제조하고 T 세포 배지에서 1:10 (30 μl + 270 μl)으로 추가로 희석시켜 200 nM 희석물을 수득하였다.
가교결합제 (a-hFc, Jackson Immunoresearch; FITCdex, Sigma; 또는 murine VEGF 165, Peprotech)를 필요한 경우 시험 항체와 1:1 몰 비로 웰에 첨가하였다.
96-웰 플레이트에서, 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물의 6개의 5배 연속 희석물을 제조하였다 (60 μl + 240 μl T 세포 배지). 100μl의 희석된 항체 또는 항체/가교결합 항체 혼합물을 플레이트 상의 활성화된 T 세포에 첨가하였다. T 세포를 37℃, 5% CO2에서 72시간 동안 배양하였다. 상청액을 수집하고 제조자의 지침에 따라 마우스 IL-2 ELISA 키트 (eBioscience 또는 R&D systems)로 분석하였다. 플레이트를 Gen5 소프트웨어, BioTek를 갖는 플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하였다. 450 nm의 흡광도 값에서 630 nm의 흡광도 값을 공제하였다 (보정). 사이토킨 농도를 계산하기 위한 표준 곡선은 4 파라미터 로지스틱 곡선 맞춤 (Gen5 Software, BioTek)에 기초하였다. 표 15는 T 세포 활성화 검정에서 시험된 mAb2 및 mAb의 존재에 반응하여 생산된 인간 IL-2 수준을 보여준다. 도 10은 T 세포 활성화 검정에 대한 IL-2 방출의 대표적인 플롯을 보여준다. 도 11에서, 마우스 IL-2 (mIL-2)의 농도를 항체의 로그 농도에 비하여 플롯팅하고 생성된 곡선을 GraphPad Prism에서 로그 (효능제) 대 반응 방정식을 사용하여 피팅하였다. 표 16은 시험된 mAb2 및 mAb의 존재하에서 T 세포 활성화 검정에서 관찰된 IL-2 방출의 EC50 값 및 최대 반응을 보여준다.
도 10은 단일 농도 (10nM)에서 상이한 가교결합제의 존재하에서의 상이한 항체들의 활성을 보여준다. 당해 도면은 mTNFRX 표적화 항체가 가교결합될 때에만 T 세포의 활성화가 증가함을 보여준다. 대조군 항체 (없음/mTNFRX 및 mTNFRX/FITC)는 비-생리학적 가교결합제 (항-hFc, FITCdex)에 의해 가교결합될 수 있지만 VEGF에 의해서는 그렇지 않은 반면, mTNFRX/VEGF mAb2는 종양 부위에서 과발현될 수 있는 생리학적 가용성 인자를 나타내는 VEGF에 의해 가교결합된다. mTNFRX/VEGF로 관찰된 보다 높은 백그라운드는 활성화된 T 세포에 의해 생산된 잔류 VEGF의 결과일 가능성이 있다 (J. Immunol. 2004 Apr 1;172(7):4618-23.). 항-VEGF 및 항-FITC 항체는 예상되는 바와 같이 가교결합제의 존재하에서 T 세포 활성화를 유도하지 않는다. mTNFRX/VEGF mAb2의 가교결합된 활성을 항체 농도를 적정함으로써 대조군 mTNFRX/FITC mAb2와 비교할 경우, 도 11에 도시된 바와 같이 두 개의 mAb2 이특이성 항체의 EC50 및 최대 반응 둘 다는 필적한다 (표 16 참조). mTNFRX/VEGF mAb2는 보다 높은 농도 (10nM)에서 약간의 백그라운드 활성을 갖지만 보다 낮은 농도 (예를 들어, 1nM)에서는 감소되는 반면 1:1 VEGF 비로 가교결합된 mAb2의 활성은 이러한 보다 낮은 농도에서 유지된다.
이 데이터는 관찰된 T 세포 활성화가 항-TNFRX 항체의 가교결합시에만 일어난다는 것을 보여준다. 가교결합은 하나 이상의 mTNFRX 표적화 항체, 예를 들면 없음/mTNFRX + a-hFc에 결합하고 이러한 방식으로 TNFRX를 클러스터링하는 이차 항체 (a-hFc)의 결과일 수 있다. 이것은 또한 하나의 말단은 TNFRX를 표적화하고 다른 하나의 말단은 VEGF와 같은 종양 부위에서 과발현될 수 있는 가용성 인자를 표적화하는 mAb2 이특이성 항체의 항원-결합 말단 둘 다와 맞물린 결과일 수 있다.
8.2 시험관내에서 조건부 수용체 작용을 할 수 있는 mAb2는 생체내에서 종양 성장을 억제한다
mTNFRX/VEGF mAb2를 CT26 공통유전자 마우스 종양 성장 모델에서 생체내 활성에 대해 시험하였다.
CT26 종양이 증가된 농도의 VEGF를 갖고 (Voron T, Colussi O, Marcheteau E, et al. VEGF-A modulates expression of inhibitory checkpoints on CD8+ T cells in tumors. The Journal of Experimental Medicine. 2015;212(2):139-148) CT26 종양으로부터 단리된 종양 침윤 림프구 (TILs)가 mTNFRX를 발현하는 것으로 기술되어 있기 때문에 CT26 공통유전자 종양 모델을 이 실험에서 사용하였다.
종양 성장을 억제하는 mTNFRX/VEGF mAb2의 능력을 다음의 대조군의 능력과 비교하였다: mTNFRX/없음 mAb2와 없음/VEGF mAb의 조합; 없음/FITC mAb; 및 없음/VEGF mAb 단독.
각각 체중이 20-25 g인 8-10주령의 BALB/c 암컷 마우스 (Charles River)를 연구 시작 전에 1주일 동안 쉬게 하였다. 모든 동물을 마이크로 칩으로 채워져 고유 식별자를 부여하였다. 각 코호트는 15 마리의 마우스를 가졌다. CT26 결장 암종 세포주 (ATCC, CRL-2638)를 초기에 확장시키고 저장한 다음 IMPACT I 프로토콜을 사용하여 병원균에 대해 IDEXX Bioresearch에 의해 사전-스크리닝하였으며 피로겐 비함유인 것으로 나타났다. CT26 세포 (대략 3-5 x 106개)를 -150℃ 저장으로부터 해동시키고 T175 조직 배양 플라스크에서 10% FCS (Gibco, 10270-106)를 갖는 20 ml DMEM (Gibco, 61965-026)에 첨가하였다. 마우스를 이소플루란 (Abbott Laboratories)을 사용하여 마취시켰으며 각 동물은 왼쪽 옆구리에 피하 주사된 1 x 106개 세포를 제공받았다. 종양 세포 접종 후 10일째에, 마우스를 건강 및 종양 성장에 대해 모니터링하고 분류하여 연구 코호트로 무작위화하였다. 이 시점에서 종양을 갖지 않았던 마우스는 연구에서 제외시켰다.
mAb2 분자 및 대조군 항체 모두를 SEC-HPLC 프로파일링에 의해 주사한지 24시간 이내에 분석하고 불순물에 대해 확인하였다. 항체는 PBS에서 1 mg/kg의 최종 농도로 제조하였다. mAb2 분자 및 대조군 항체를 종양 접종 후 10, 12 및 14일에 복강내 (IP) 주사에 의해 마우스에 투여하였다. 동물들은 마취하에 일주일에 세 번씩 블라인드 방식으로 건강 검진을 받았으며, 이 시간 동안 종양의 정확한 측정이 이루어졌다. 종양 체적을 캘리퍼스로 측정하여 종양의 가장 긴 축과 가장 짧은 축을 결정하였다. 다음 공식을 사용하여 종양 체적을 계산하였다:
L x (S2) / 2
(여기서, L = 가장 긴 축; S = 가장 짧은 축)
종양 부담이 한계에 가깝다고 간주되는 24일째에 시험을 중단하고 모든 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 결과가 도 12에 나타내어져 있다. 최종 종양 체적의 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어 패키지 내의 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 수행하였다.
종양 성장을 억제하는데 있어서 mTNRFX/VEGF mAb2 및 없음/FITC 대조군 (정상 성장) 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 입증되었다. 이러한 통계적으로 유의적인 차이는 mTNFRX/없음과 없음/VEGF 대조군 또는 없음/VEGF 대조군의 조합 대 없음/FITC 대조군에서는 관찰되지 않았다.
CT26 종양 모델은 공격적이고 빠르게 성장하는 종양 모델이며, 장 전이를 일으키는 마우스에서 내재적으로 발생하기 쉽고, 그 결과 매우 제한된 치료 범위를 갖는다. 놀랍게도, mTNFRX 및 VEGF를 표적화하는 항체의 조합은 IgG 대조군 코호트에 비해 종양 성장을 유의적으로 억제하지 못했다. 그러나, mTNFRX/VEGF 처리된 코호트는 IgG 대조군에 비해 유의적인 성장 억제를 나타냈다. 이 시험은, 관찰된 시험관내 결과와 유사하게, 종양 세포에 의해 또는 종양 미세환경 내에서 또는 종양 미세환경에서 과발현된 VEGF 및 TILs에서 발현된 mTNRFX를 표적화하는 mAb2 이특이성 항체에 의한 mTNFRX의 가교결합이 대조군에서 관찰되는 것 이상으로 T 세포 활성화 및 후속적인 종양 성장 조절을 야기한다는 것을 보여준다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
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Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
서열 목록
LALA 돌연변이가 없는 "야생형" Fcab CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 1) .
Figure pct00017
LALA 돌연변이 (밑줄친)를 포함하는 "야생형" Fcab CH2 및 CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 2)
Figure pct00018
"야생형" Fcab CH3 도메인의 아미노산 서열 (서열 번호 3)
Figure pct00019

Claims (42)

  1. 제1 항원과 제2 항원에 결합하며,
    (i) 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원-결합 부위; 및
    (ii) 항체 분자의 불변 도메인(constant domain)에 위치한 제2 항원을 위한 항원-결합 부위(여기서, 상기 항원-결합 부위는 불변 도메인의 하나 이상의 구조적 루프(structural loop)에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다)를 포함하고;
    여기서, 제1 및 제2 항원 중의 하나는 종양 항원이고 다른 하나는 면역 세포의 표면 상의 종양 괴사 인자 수용체 상과 (TNFRSF) 수용체인 항체 분자.
  2. 제1항에 있어서, 항체 분자가 종양 항원의 존재하에서 면역 세포 상의 TNFRSF 수용체를 활성화시킬 수 있는 항체 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, TNFRSF 수용체 및 종양 항원에 대한 항체 분자의 결합이 면역 세포 상의 TNFRSF 수용체의 클러스터링(clustering)을 야기하는 항체 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 항원이 종양 항원이고 제2 항원이 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체인 항체 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 항원이 면역 세포의 표면 상의 TNFRSF 수용체이고 제2 항원이 종양 항원인 항체 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 세포 상에서 발현되는 TNFRSF 수용체가 활성화를 위해 세 개 이상의 수용체의 클러스터링을 필요로 하는 항체 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, TNFRSF 수용체가 CD27, EDA2R, EDAR, FAS, LTBR, RELT, TNFRSF1A, TNFRSF1B, TNFRSF6B, TNFRSF8, TNFRSF10A-10D, TNFRSF11A, TNFRSF11B, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21 및 TNFRSF25로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 항체 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 종양 항원이 암세포 상의 세포 표면 항원인 항체 분자.
  10. 제9항에 있어서, 종양 항원이 종양 관련 항원 (TAA)인 항체 분자.
  11. 제10항에 있어서, 종양 관련 항원 (TAA)이 MHC/펩타이드 신생항원 또는 종양 미세환경 항원인 항체 분자.
  12. 제10항에 있어서, TAA가 HER2, FAP, EpCAM, CEACAM5, CD20, CD73, PSMA, 메소텔린, EphA2, IGF1R, CD200, αvβ6, PDL1, B7H3 또는 EGFR로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 분자.
  13. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 종양 항원이 가용성 다량체(multimer)인 항체 분자.
  14. 제13항에 있어서, 가용성 다량체가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 같은 적어도 이량체인 항체 분자.
  15. 제14항에 있어서, 가용성 다량체가 적어도 삼량체인 항체 분자.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, 전체 항체(whole antibody)인 항체 분자.
  17. 제16항에 있어서, IgG인 항체 분자.
  18. 제1항 내지 제17항 중의 어느 한 항에 있어서, Fcγ 수용체에 결합하지 않는 항체 분자.
  19. 제1항 내지 제18항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 Fcγ 수용체에 대한 항체 분자의 CH2 도메인의 결합을 감소시키거나 없애도록 변형된 항체 분자.
  20. 제19항에 있어서, Fcγ 수용체가 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIII으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 분자.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, 불변 영역에 제2 항원을 위한 하나 이상의 항원-결합 부위를 갖는 항체 분자.
  22. 제1항 내지 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 불변 도메인이 CH3, CH2, CH1 및 CL로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체 분자.
  23. 제22항에 있어서, 불변 도메인이 CH3 도메인 또는 CH2 도메인인 항체 분자.
  24. 제23항에 있어서, 불변 도메인이 CH3 도메인인 항체 분자.
  25. 제23항에 있어서, 하나 이상의 구조적 루프가 AB, CD 및 EF 루프로부터 선택되는 항체 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 아미노산 변형이 아미노산 치환, 부가, 또는 결실인 항체 분자.
  27. 제1항 내지 제26항 중의 어느 한 항에 있어서, 제2 항원을 위한 항원-결합 부위가 불변 도메인의 둘 이상의 구조적 루프에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 항체 분자.
  28. 제1항 내지 제27항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원 결합 부위가 세 개의 VH 도메인 CDR과 세 개의 VL 도메인 CDR을 포함하는 항체 분자.
  29. 제28항에 있어서, CDR-기반 항원 결합 부위가 면역글로불린 VH 도메인 및 면역글로불린 VL 도메인에 의해 형성되는 항체 분자.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 제1 항원을 위한 CDR-기반 항원 결합 부위가 항체 분자의 가변 영역(variable region)에 위치하는 항체 분자.
  31. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 항원을 위한 두 개의 CDR-기반 항원 결합 도메인을 갖는 항체 분자.
  32. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자를 암호화하는 핵산.
  33. 제32항의 핵산을 포함하는 벡터.
  34. 제32항의 핵산, 또는 제33항의 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  35. 제34항의 재조합 숙주 세포를 항체 분자의 생산을 위한 조건하에서 배양함을 포함하여, 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자를 생산하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 항체 분자를 단리 및/또는 정제함을 추가로 포함하는 방법.
  37. 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  38. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자.
  39. 환자에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자.
  40. 환자에서 암을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서의, 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자의 용도.
  41. 환자에게 치료학적 유효량의 제1항 내지 제31항 중의 어느 한 항에 따르는 항체 분자를 투여함을 포함하여, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  42. 적어도 하나의 추가의 치료제를 환자에게 투여함을 추가로 포함하는, 제39항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 따르는. 사용을 위한 항체, 용도 또는 치료방법.
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