CN113419062A - 新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于化学发光免疫检测领域，尤其是一种新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，针对现有方法灵敏度低的问题，现提出如下方案，其包括以下步骤：将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖；包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；通过酶催化底物发光，只要样本中存在痕量的抗体，即可通过光电倍增管发现并定量判断，产品灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速，自动化程度更高，检测结果更快，适用于临床急诊。

Description

新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法
技术领域
本发明涉及化学发光免疫检测技术领域，尤其涉及一种新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒是一种可引起人肺炎/肺部感染的新的冠状病毒，它与已知可引起感冒、严重急性呼吸综合症(SARS)和中东呼吸综合症(MERS)同属一个冠状病毒家族，世界卫生组织已将其命名为2019新型冠状病毒，即2019-nCoV。专利号为202010086730.3的专利公开了一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，提供了在反应膜上包被抗原来捕捉抗体的技术，结果是通过胶体金在结合处聚集显色而定性判断，缩短了检测时间，操作简单方便。
但一种2019新型冠状病毒抗体检测试剂盒及其制备方法也存在一些问题，例如，产品的灵敏度低、线性动力学范围窄、光信号持续时间短、检测结果依旧较慢，若样本中没有足够量的抗体，则无法显示颜色，造成假阴性。
发明内容
基于背景技术存在产品的灵敏度低、线性动力学范围窄、光信号持续时间短的问题，本发明提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法。
本发明提出的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖；
S2、包被有抗原抗体磁微粒用量的确定，实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；
S3、阴阳性对照品的调试，具体为：采用多份阴性血清，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品，采用抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括10份－15份的辣根过氧化物酶、6份－10份的荧光微球、6份－8份的链霉亲和4份－7份的素磁微粒，发光底物液包括A液和B液；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，具体如下：采用两步夹心法定量检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是包被重组新型冠状病毒抗原和酶标记重组新型冠状病毒抗原捕获样本中的新型冠状病毒抗体；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定，具体如下：温度：由于抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，具体为：先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗管效果。
优选地，所述在S1中，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
优选地，所述在S2中，通过考察对比确定包被新型冠状病毒抗原的使用量。
优选地，所述在S3中，阴性血清需要在60℃的温度下灭活1小时，然后再加0.05％的PC300。
优选地，所述在S3中，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，来判定阴性对照品和阳性对照品是否合格，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准。
优选地，所述在S4中，确定检测新型冠状病毒抗体酶用量的步骤具体如下：新型冠状病毒抗原在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测酶的用量应能满足强阳性的检测，通过比较不同酶用量比例，阳性RLU/阴性RLU较高值为使用比例。
优选地，所述在S4中，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀。
优选地，所述在S4中，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲。
优选地，所述在S6中，在检测时第一步加入待测样本50μL/孔，第二步检测新型冠状病毒抗体酶50μL/孔，确定样本每孔加入量。
优选地，所述在S7中，第一步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，考察不同第一步温育时间，第二步统一温育时间，比较强阳性样本的RLU值；第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育时间，考察不同第二步温育时间，比较强阳性样本的RLU值。
本发明的有益效果：
1、通过免疫化学发光检测技术原理，利用辣根过氧化物酶、荧光微球、链霉亲和素磁微粒催化发光底物液发光，只要样本中含有痕量的抗体，即可显示读出，与金标层析免疫技术相比，具有灵敏度高，假阴性概率低等优点；
2、使用高稳定性的底物使化学发光反应保持稳定，而稳定的光信号保证了检测结果的准确性和可重复性，并且试剂盒可与全自动化学发光仪器配套使用，实现从加样、孵育、洗板及读孔全过程的自动化，保证检测过程的精密度，减少人为误差；
通过酶催化底物发光，只要样本中存在痕量的抗体，即可通过光电倍增管发现并定量判断，产品灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速，自动化程度更高，检测结果更快，适用于临床急诊。
附图说明
图1为本发明提出的工作流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
参照图1，实施例一
本实施例中提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，由于采用固相载体，包被在微孔板表面的抗原是否足够就十分重要，过多会造成浪费，过少会使检测范围变窄，而免疫反应是由其免疫活性决定的，因此，对每批包被有抗原的活性必需通过实验来确定具体使用比例，下表为不同抗原稀释比例的检测数据；
Figure BDA0003129707030000041
Figure BDA0003129707030000051
实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；表中数据为发光值，实验显示包被有抗原原液稀释比例为1:5000时，P/N值最大，效果较好；
S3、阴阳性对照品的调试，采用多份阴性血清，经60℃条件下1小时灭活，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品；抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准；
当抗体阳性原料按1：200稀释时，使用国家参考品进行检测，检测结果符合要求；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，酶标记新型冠状病毒抗原蛋白在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测新型冠状病毒抗体酶的用量应能满足强阳性的检测，所以，检测新型冠状病毒抗体酶的用量也须由实验确定，检测新型冠状病毒抗体酶用量控制在1:2000时，结果较为理想，阴性RLU低，并且阳性RLU/阴性RLU达较高值，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括10份的辣根过氧化物酶、6份的荧光微球、6份的链霉亲和4份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，采用两步夹心法定性检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是新型冠状病毒抗原蛋白、以及酶标记新型冠状病毒抗原蛋白和样本中的新型冠状病毒抗体蛋白结合，故在检测时第一步待测样本50μL/孔，第二步加入酶标记新型冠状病毒抗原蛋白50μL/孔，便于操作，通过实验证明，阳性样本稀释5倍后，样本每孔加50μL为最佳；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定：
温度：与其它化学反应一样，免疫结合反应的结合速度也受温度的影响，通常温度高反应速度快，但抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，因而丧失免疫结合能力，所以只能通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
用以上选定的抗原包被微孔板，检测新型冠状病毒抗体酶，以阴性、阳性对照品为样本，第一步反应20分钟，第二步反应10分钟，温度分别为室温(20～28℃)，37℃、43℃进行实验来观察温度的影响，结果以37℃和43℃反应较好，但总体看影响不太大，优选为37℃温育；
第一步反应时间：抗原与抗体的结合反应需要一定的时间才能达到平衡，尤其采用微孔板作为固定相，只有抗体或抗原分子进入固液界面，发生适当体位的接触，才可能发生抗原与抗体的结合，液液两相反应速率更快，更充分；
实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步分别温育20、25、30、35分钟，第二步统一温育10分钟，比较强阳性样本的RLU值，在20～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育30分钟，第二步分别温育15、20、25、30、35分钟，比较强阳性样本的RLU值，在15～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，免疫反应后，洗板是分离结合和游离部分的重要环节，先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗板效果，实验结果表明，洗板注液量达到350μL后即可获得满意的洗管效果。
本发明制备的试剂盒在临床使用时，按照下列步骤进行检测：
1、平衡：从冰箱中取出试剂盒放置于室温，平衡试剂盒的温度至室温；
2、洗液：用纯化水将浓缩洗液稀释30倍，混合均匀后，转入洗板机的洗液瓶中；
3、编号：取出包被微孔板板条，设好阴性对照孔(2孔)、阳性对照孔(2孔)、检测新型冠状病毒酶(2孔)，待测样本孔；
4、加待测样本：每孔加入待测样本50μL；
5、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育30分钟；
5、加样：每孔加入检测新型冠状病毒酶50μL；
6、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育20分钟；
7、洗板：调节洗液量至每次每管350μL，去洗液；
8、发光：加发光底物液的A液和B液，每孔各50μL，混匀室温避光放置10分钟；
9、测量：用化学发光分析仪测量RLU值，测量时间0.1秒/孔。
本发明，通过将新型冠状病毒抗原蛋白包被于微孔板表面，采用辣根过氧酶催化底物发光技术，与金标免疫层析技术相比，具有灵敏度高，降低假阴性的概率。
参照图1，实施例二
本实施例中提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，由于采用固相载体，包被在微孔板表面的抗原是否足够就十分重要，过多会造成浪费，过少会使检测范围变窄，而免疫反应是由其免疫活性决定的，因此，对每批包被有抗原的活性必需通过实验来确定具体使用比例，下表为不同抗原稀释比例的检测数据；
包被抗原原液 1:7000 1:5000 1:3000
阴性样本 2651 3449 4610
抗原阳性样本 364860 526110 648843
抗原阳性P/N值 137.6 152.6 140.7
抗体阳性样本 83668 130100 153407
抗体阳性P/N值 31.6 37.7 33.3
实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；表中数据为发光值，实验显示包被有抗原原液稀释比例为1:5000时，P/N值最大，效果较好；
S3、阴阳性对照品的调试，采用多份阴性血清，经60℃条件下1小时灭活，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品；抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准；
当抗体阳性原料按1：200稀释时，使用国家参考品进行检测，检测结果符合要求；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，酶标记新型冠状病毒抗原蛋白在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测新型冠状病毒抗体酶的用量应能满足强阳性的检测，所以，检测新型冠状病毒抗体酶的用量也须由实验确定，检测新型冠状病毒抗体酶用量控制在1:2000时，结果较为理想，阴性RLU低，并且阳性RLU/阴性RLU达较高值，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括11份的辣根过氧化物酶、7份的荧光微球、7份的链霉亲和5份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，采用两步夹心法定性检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是新型冠状病毒抗原蛋白、以及酶标记新型冠状病毒抗原蛋白和样本中的新型冠状病毒抗体蛋白结合，故在检测时第一步待测样本50μL/孔，第二步加入酶标记新型冠状病毒抗原蛋白50μL/孔，便于操作，通过实验证明，阳性样本稀释5倍后，样本每孔加50μL为最佳；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定：
温度：与其它化学反应一样，免疫结合反应的结合速度也受温度的影响，通常温度高反应速度快，但抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，因而丧失免疫结合能力，所以只能通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
用以上选定的抗原包被微孔板，检测新型冠状病毒抗体酶，以阴性、阳性对照品为样本，第一步反应20分钟，第二步反应10分钟，温度分别为室温(20～28℃)，37℃、43℃进行实验来观察温度的影响，结果以37℃和43℃反应较好，但总体看影响不太大，优选为37℃温育；
第一步反应时间：抗原与抗体的结合反应需要一定的时间才能达到平衡，尤其采用微孔板作为固定相，只有抗体或抗原分子进入固液界面，发生适当体位的接触，才可能发生抗原与抗体的结合，液液两相反应速率更快，更充分；
实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步分别温育20、25、30、35分钟，第二步统一温育10分钟，比较强阳性样本的RLU值，在20～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育30分钟，第二步分别温育15、20、25、30、35分钟，比较强阳性样本的RLU值，在15～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，免疫反应后，洗板是分离结合和游离部分的重要环节，先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗板效果，实验结果表明，洗板注液量达到350μL后即可获得满意的洗管效果。
本发明制备的试剂盒在临床使用时，按照下列步骤进行检测：
1、平衡：从冰箱中取出试剂盒放置于室温，平衡试剂盒的温度至室温；
2、洗液：用纯化水将浓缩洗液稀释30倍，混合均匀后，转入洗板机的洗液瓶中；
3、编号：取出包被微孔板板条，设好阴性对照孔(2孔)、阳性对照孔(2孔)、检测新型冠状病毒酶(2孔)，待测样本孔；
4、加待测样本：每孔加入待测样本50μL；
5、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育30分钟；
5、加样：每孔加入检测新型冠状病毒酶50μL；
6、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育20分钟；
7、洗板：调节洗液量至每次每管350μL，去洗液；
8、发光：加发光底物液的A液和B液，每孔各50μL，混匀室温避光放置10分钟；
9、测量：用化学发光分析仪测量RLU值，测量时间0.1秒/孔。
本发明，通过将新型冠状病毒抗原蛋白包被于微孔板表面，采用辣根过氧酶催化底物发光技术，与金标免疫层析技术相比，具有灵敏度高，降低假阴性的概率。
参照图1，实施例三
本实施例中提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，由于采用固相载体，包被在微孔板表面的抗原是否足够就十分重要，过多会造成浪费，过少会使检测范围变窄，而免疫反应是由其免疫活性决定的，因此，对每批包被有抗原的活性必需通过实验来确定具体使用比例，下表为不同抗原稀释比例的检测数据；
包被抗原原液 1:7000 1:5000 1:3000
阴性样本 2651 3449 4610
抗原阳性样本 364860 526110 648843
抗原阳性P/N值 137.6 152.6 140.7
抗体阳性样本 83668 130100 153407
抗体阳性P/N值 31.6 37.7 33.3
实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；表中数据为发光值，实验显示包被有抗原原液稀释比例为1:5000时，P/N值最大，效果较好；
S3、阴阳性对照品的调试，采用多份阴性血清，经60℃条件下1小时灭活，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品；抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准；
当抗体阳性原料按1：200稀释时，使用国家参考品进行检测，检测结果符合要求；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，酶标记新型冠状病毒抗原蛋白在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测新型冠状病毒抗体酶的用量应能满足强阳性的检测，所以，检测新型冠状病毒抗体酶的用量也须由实验确定，检测新型冠状病毒抗体酶用量控制在1:2000时，结果较为理想，阴性RLU低，并且阳性RLU/阴性RLU达较高值，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括12份的辣根过氧化物酶、8份的荧光微球、8份的链霉亲和6份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，采用两步夹心法定性检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是新型冠状病毒抗原蛋白、以及酶标记新型冠状病毒抗原蛋白和样本中的新型冠状病毒抗体蛋白结合，故在检测时第一步待测样本50μL/孔，第二步加入酶标记新型冠状病毒抗原蛋白50μL/孔，便于操作，通过实验证明，阳性样本稀释5倍后，样本每孔加50μL为最佳；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定：
温度：与其它化学反应一样，免疫结合反应的结合速度也受温度的影响，通常温度高反应速度快，但抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，因而丧失免疫结合能力，所以只能通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
用以上选定的抗原包被微孔板，检测新型冠状病毒抗体酶，以阴性、阳性对照品为样本，第一步反应20分钟，第二步反应10分钟，温度分别为室温(20～28℃)，37℃、43℃进行实验来观察温度的影响，结果以37℃和43℃反应较好，但总体看影响不太大，优选为37℃温育；
第一步反应时间：抗原与抗体的结合反应需要一定的时间才能达到平衡，尤其采用微孔板作为固定相，只有抗体或抗原分子进入固液界面，发生适当体位的接触，才可能发生抗原与抗体的结合，液液两相反应速率更快，更充分；
实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步分别温育20、25、30、35分钟，第二步统一温育10分钟，比较强阳性样本的RLU值，在20～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育30分钟，第二步分别温育15、20、25、30、35分钟，比较强阳性样本的RLU值，在15～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，免疫反应后，洗板是分离结合和游离部分的重要环节，先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗板效果，实验结果表明，洗板注液量达到350μL后即可获得满意的洗管效果。
本发明制备的试剂盒在临床使用时，按照下列步骤进行检测：
1、平衡：从冰箱中取出试剂盒放置于室温，平衡试剂盒的温度至室温；
2、洗液：用纯化水将浓缩洗液稀释30倍，混合均匀后，转入洗板机的洗液瓶中；
3、编号：取出包被微孔板板条，设好阴性对照孔(2孔)、阳性对照孔(2孔)、检测新型冠状病毒酶(2孔)，待测样本孔；
4、加待测样本：每孔加入待测样本50μL；
5、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育30分钟；
5、加样：每孔加入检测新型冠状病毒酶50μL；
6、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育20分钟；
7、洗板：调节洗液量至每次每管350μL，去洗液；
8、发光：加发光底物液的A液和B液，每孔各50μL，混匀室温避光放置10分钟；
9、测量：用化学发光分析仪测量RLU值，测量时间0.1秒/孔。
本发明，通过将新型冠状病毒抗原蛋白包被于微孔板表面，采用辣根过氧酶催化底物发光技术，与金标免疫层析技术相比，具有灵敏度高，降低假阴性的概率。
参照图1，实施例四
本实施例中提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，由于采用固相载体，包被在微孔板表面的抗原是否足够就十分重要，过多会造成浪费，过少会使检测范围变窄，而免疫反应是由其免疫活性决定的，因此，对每批包被有抗原的活性必需通过实验来确定具体使用比例，下表为不同抗原稀释比例的检测数据；
包被抗原原液 1:7000 1:5000 1:3000
阴性样本 2651 3449 4610
抗原阳性样本 364860 526110 648843
抗原阳性P/N值 137.6 152.6 140.7
抗体阳性样本 83668 130100 153407
抗体阳性P/N值 31.6 37.7 33.3
实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；表中数据为发光值，实验显示包被有抗原原液稀释比例为1:5000时，P/N值最大，效果较好；
S3、阴阳性对照品的调试，采用多份阴性血清，经60℃条件下1小时灭活，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品；抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准；
当抗体阳性原料按1：200稀释时，使用国家参考品进行检测，检测结果符合要求；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，酶标记新型冠状病毒抗原蛋白在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测新型冠状病毒抗体酶的用量应能满足强阳性的检测，所以，检测新型冠状病毒抗体酶的用量也须由实验确定，检测新型冠状病毒抗体酶用量控制在1:2000时，结果较为理想，阴性RLU低，并且阳性RLU/阴性RLU达较高值，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括13份的辣根过氧化物酶、8份的荧光微球、8份的链霉亲和7份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，采用两步夹心法定性检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是新型冠状病毒抗原蛋白、以及酶标记新型冠状病毒抗原蛋白和样本中的新型冠状病毒抗体蛋白结合，故在检测时第一步待测样本50μL/孔，第二步加入酶标记新型冠状病毒抗原蛋白50μL/孔，便于操作，通过实验证明，阳性样本稀释5倍后，样本每孔加50μL为最佳；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定：
温度：与其它化学反应一样，免疫结合反应的结合速度也受温度的影响，通常温度高反应速度快，但抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，因而丧失免疫结合能力，所以只能通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
用以上选定的抗原包被微孔板，检测新型冠状病毒抗体酶，以阴性、阳性对照品为样本，第一步反应20分钟，第二步反应10分钟，温度分别为室温(20～28℃)，37℃、43℃进行实验来观察温度的影响，结果以37℃和43℃反应较好，但总体看影响不太大，优选为37℃温育；
第一步反应时间：抗原与抗体的结合反应需要一定的时间才能达到平衡，尤其采用微孔板作为固定相，只有抗体或抗原分子进入固液界面，发生适当体位的接触，才可能发生抗原与抗体的结合，液液两相反应速率更快，更充分；
实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步分别温育20、25、30、35分钟，第二步统一温育10分钟，比较强阳性样本的RLU值，在20～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育30分钟，第二步分别温育15、20、25、30、35分钟，比较强阳性样本的RLU值，在15～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，免疫反应后，洗板是分离结合和游离部分的重要环节，先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗板效果，实验结果表明，洗板注液量达到350μL后即可获得满意的洗管效果。
本发明制备的试剂盒在临床使用时，按照下列步骤进行检测：
1、平衡：从冰箱中取出试剂盒放置于室温，平衡试剂盒的温度至室温；
2、洗液：用纯化水将浓缩洗液稀释30倍，混合均匀后，转入洗板机的洗液瓶中；
3、编号：取出包被微孔板板条，设好阴性对照孔(2孔)、阳性对照孔(2孔)、检测新型冠状病毒酶(2孔)，待测样本孔；
4、加待测样本：每孔加入待测样本50μL；
5、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育30分钟；
5、加样：每孔加入检测新型冠状病毒酶50μL；
6、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育20分钟；
7、洗板：调节洗液量至每次每管350μL，去洗液；
8、发光：加发光底物液的A液和B液，每孔各50μL，混匀室温避光放置10分钟；
9、测量：用化学发光分析仪测量RLU值，测量时间0.1秒/孔。
本发明，通过将新型冠状病毒抗原蛋白包被于微孔板表面，采用辣根过氧酶催化底物发光技术，与金标免疫层析技术相比，具有灵敏度高，降低假阴性的概率。
参照图1，实施例五
本实施例中提出了新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，由于采用固相载体，包被在微孔板表面的抗原是否足够就十分重要，过多会造成浪费，过少会使检测范围变窄，而免疫反应是由其免疫活性决定的，因此，对每批包被有抗原的活性必需通过实验来确定具体使用比例，下表为不同抗原稀释比例的检测数据；
包被抗原原液 1:7000 1:5000 1:3000
阴性样本 2651 3449 4610
抗原阳性样本 364860 526110 648843
抗原阳性P/N值 137.6 152.6 140.7
抗体阳性样本 83668 130100 153407
抗体阳性P/N值 31.6 37.7 33.3
实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；表中数据为发光值，实验显示包被有抗原原液稀释比例为1:5000时，P/N值最大，效果较好；
S3、阴阳性对照品的调试，采用多份阴性血清，经60℃条件下1小时灭活，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品；抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准；
当抗体阳性原料按1：200稀释时，使用国家参考品进行检测，检测结果符合要求；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，酶标记新型冠状病毒抗原蛋白在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测新型冠状病毒抗体酶的用量应能满足强阳性的检测，所以，检测新型冠状病毒抗体酶的用量也须由实验确定，检测新型冠状病毒抗体酶用量控制在1:2000时，结果较为理想，阴性RLU低，并且阳性RLU/阴性RLU达较高值，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括15份的辣根过氧化物酶、10份的荧光微球、8份的链霉亲和7份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，采用两步夹心法定性检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是新型冠状病毒抗原蛋白、以及酶标记新型冠状病毒抗原蛋白和样本中的新型冠状病毒抗体蛋白结合，故在检测时第一步待测样本50μL/孔，第二步加入酶标记新型冠状病毒抗原蛋白50μL/孔，便于操作，通过实验证明，阳性样本稀释5倍后，样本每孔加50μL为最佳；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定：
温度：与其它化学反应一样，免疫结合反应的结合速度也受温度的影响，通常温度高反应速度快，但抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，因而丧失免疫结合能力，所以只能通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
用以上选定的抗原包被微孔板，检测新型冠状病毒抗体酶，以阴性、阳性对照品为样本，第一步反应20分钟，第二步反应10分钟，温度分别为室温(20～28℃)，37℃、43℃进行实验来观察温度的影响，结果以37℃和43℃反应较好，但总体看影响不太大，优选为37℃温育；
第一步反应时间：抗原与抗体的结合反应需要一定的时间才能达到平衡，尤其采用微孔板作为固定相，只有抗体或抗原分子进入固液界面，发生适当体位的接触，才可能发生抗原与抗体的结合，液液两相反应速率更快，更充分；
实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步分别温育20、25、30、35分钟，第二步统一温育10分钟，比较强阳性样本的RLU值，在20～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育30分钟，第二步分别温育15、20、25、30、35分钟，比较强阳性样本的RLU值，在15～25分钟之间变化较大，30分钟后，虽然随温育时间的延长结合率继续上升，但上升速度减缓，因此，以37℃温育30分钟已可满足要求；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，免疫反应后，洗板是分离结合和游离部分的重要环节，先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗板效果，实验结果表明，洗板注液量达到350μL后即可获得满意的洗管效果。
本发明制备的试剂盒在临床使用时，按照下列步骤进行检测：
1、平衡：从冰箱中取出试剂盒放置于室温，平衡试剂盒的温度至室温；
2、洗液：用纯化水将浓缩洗液稀释30倍，混合均匀后，转入洗板机的洗液瓶中；
3、编号：取出包被微孔板板条，设好阴性对照孔(2孔)、阳性对照孔(2孔)、检测新型冠状病毒酶(2孔)，待测样本孔；
4、加待测样本：每孔加入待测样本50μL；
5、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育30分钟；
5、加样：每孔加入检测新型冠状病毒酶50μL；
6、温育：用封板膜封好微孔口，振荡混匀后，于37℃恒温温育20分钟；
7、洗板：调节洗液量至每次每管350μL，去洗液；
8、发光：加发光底物液的A液和B液，每孔各50μL，混匀室温避光放置10分钟；
9、测量：用化学发光分析仪测量RLU值，测量时间0.1秒/孔。
本发明，通过将新型冠状病毒抗原蛋白包被于微孔板表面，采用辣根过氧酶催化底物发光技术，与金标免疫层析技术相比，具有灵敏度高，降低假阴性的概率。
对比常规的与实施例一至五制得的新型冠状病毒抗体检测试剂盒，实施例一至五制得的如下表：
SIUC 灵敏度 假阳性率 假阴性率
实施例一 0.845 93.4％ 3.1％ 2.7％
实施例二 0.851 94.8％ 2.4％ 2.2％
实施例三 0.857 95.8％ 1.4％ 1.5％
实施例四 0.855 95.6％ 1.7％ 1.8％
实施例五 0.849 94.1％ 2.1％ 2.3％
由上述表格可知，本发明提出灵敏度高、准确性具有明显提高，且实施三为最佳实施例。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将生物活性原材料包被于微孔板表面，生物活性原材料的浓度为50ng/mL，生物活性原材料包被完成后为冻干粉形式，生物活性原材料中包含10％的海藻糖；
S2、包被过程中抗原抗体磁微粒用量的确定，实验中取待测样本50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；加入检测新型冠状病毒抗体酶50μL/管，37℃温育30分钟，洗液冲洗后去上清；
S3、阴阳性对照品的调试，具体为：采用多份阴性血清，加0.05％PC300，混合均匀配制成阴性对照品，采用抗体阳性原料，经60℃条件下1小时灭活，用稀释液做适当稀释(分别按1：50、1：100、1：200、1：400、1：800)，混合均匀配制成阳性对照品；
S4、确定检测新型冠状病毒抗体酶的用量，检测新型冠状病毒抗体酶采用混合酶，混合酶包括10份－15份的辣根过氧化物酶、6份－10份的荧光微球、6份－8份的链霉亲和4份－7份的素磁微粒，选取发光底物液，发光底物液包括A液和B液；
S5、辣根过氧化物酶的活化：将15-20mg/mL的辣根过氧化物酶溶液与20-40mg/mL的过碘酸钠溶液按体积比1：1-3混匀，并在3-7℃的温度下避光反应1-2小时，制得半成品溶液；将浓度为20-40μL/mL的乙二醇水溶液与半成品溶液按照1:1混合，并在常温下避光反应20-30min，完成活化；
S6、免疫反应的加入量确定，具体如下：采用两步夹心法定量检测人血清中的新型冠状病毒抗体，检测中参与反应的是包被重组新型冠状病毒抗原和酶标记重组新型冠状病毒抗原捕获样本中的新型冠状病毒抗体；
S7、免疫结合反应温度与时间的确定，具体如下：温度：由于抗体、抗原是有活性的生物物质，温度超过一定的范围就会失去活性，通过试验在较小的范围内选择最适宜的孵育温度；
S8、洗孔体积与洗孔次数的确定，具体为：先固定洗管3次，通过改变每次注液体积，观察洗管效果。
2.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S1中，生物活性原材料为新型冠状病毒抗原生物活性原材料，新型冠状病毒抗原生物活性原材料包括合成多肽SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4；且4种合成多肽的质量比为1:1:1:1。
3.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S2中，通过考察对比确定包被新型冠状病毒抗原的使用量。
4.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S3中，阴性血清需要在60℃的温度下灭活1小时，然后再加0.05％的PC300。
5.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S3中，将配制的产品对照品与国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品同时进行检测，来判定阴性对照品和阳性对照品是否合格，要求配制的产品对照品应符合国家参考品或经国家参考品标化的企业参考品的检测标准。
6.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S4中，确定检测新型冠状病毒抗体酶用量的步骤具体如下：新型冠状病毒抗原在免疫反应中与样本中的抗体结合，根据临床需要，检测酶的用量应能满足强阳性的检测，通过比较不同酶用量比例，阳性RLU/阴性RLU较高值为使用比例。
7.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S4中，荧光微球的活化：先对荧光微球悬液进行离心处理，然后加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，接着依次加入碳二亚胺和N－羟基硫代琥珀酰亚胺溶液混合均匀后再次离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬超声混匀。
8.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S4中，A液：将70％～80％的鲁米诺、10％～15％的甜菜碱、5％～8％的碘酚、4％～7％的酪蛋白和4％～7％的缓冲液混合，缓冲液的pH为7.5-9，混合完成后避光保存；B液为过氧化脲。
9.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S6中，在检测时第一步加入待测样本50μL/孔，第二步检测新型冠状病毒抗体酶50μL/孔，确定样本每孔加入量。
10.根据权利要求1所述的新型冠状病毒检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述在S7中，第一步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，考察不同第一步温育时间，第二步统一温育时间，比较强阳性样本的RLU值；第二步反应时间：实验时，各条件与前面相同，在37℃恒温温育，第一步统一温育时间，考察不同第二步温育时间，比较强阳性样本的RLU值。
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