CN113405881A - 单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 - Google Patents
单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113405881A CN113405881A CN202110645348.6A CN202110645348A CN113405881A CN 113405881 A CN113405881 A CN 113405881A CN 202110645348 A CN202110645348 A CN 202110645348A CN 113405881 A CN113405881 A CN 113405881A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glass slide
- glass
- electrophoresis
- glue
- slide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000005778 DNA damage Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 231100000277 DNA damage Toxicity 0.000 title claims abstract description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 13
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 71
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims abstract description 39
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 25
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 24
- 230000007480 spreading Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000003892 spreading Methods 0.000 claims abstract description 23
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims abstract description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 10
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 6
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 13
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 10
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 8
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 102100024933 Protein CASP Human genes 0.000 claims description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 6
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 claims description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 101000859758 Homo sapiens Cartilage-associated protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101000916686 Homo sapiens Cytohesin-interacting protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101000726740 Homo sapiens Homeobox protein cut-like 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000761460 Homo sapiens Protein CASP Proteins 0.000 claims description 3
- 101000761459 Mesocricetus auratus Calcium-dependent serine proteinase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 3
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 claims description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 3
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims description 2
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 abstract 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 8
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 3
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000003927 comet assay Methods 0.000 description 2
- 231100000170 comet assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940048098 sodium sarcosinate Drugs 0.000 description 2
- ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M sodium;2-(methylamino)acetate Chemical compound [Na+].CNCC([O-])=O ZUFONQSOSYEWCN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000007035 DNA breakage Effects 0.000 description 1
- 206010055690 Foetal death Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 1
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 206010000210 abortion Diseases 0.000 description 1
- 231100000176 abortion Toxicity 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000004026 adhesive bonding Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- ANOBYBYXJXCGBS-UHFFFAOYSA-L stannous fluoride Chemical compound F[Sn]F ANOBYBYXJXCGBS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/44—Sample treatment involving radiation, e.g. heat
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
- G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
- G01N21/6458—Fluorescence microscopy
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种单细胞DNA损伤的快速检测方法及试剂盒,包括A、铺胶,电泳载玻片在75%乙醇中清洗擦干后铺第一层胶,铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍,在受炙面一端滴加普通琼脂糖凝胶0.1~0.3mL,用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端,然后烤干,备用;而后铺第二层胶:取30~50μL细胞悬液与150~250μL 1%低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀,再取混合液滴在铺有底胶载玻片的一侧,用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下,而后移去盖玻片;B、裂解、解旋,细胞裂解液的配制方法如下:称量Tris0.12~0.15g、NaOH 0.8~1.0g、NaCl 14.5~15.0g、Na2EDTA 3.72~4.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至10后定容至100ml,存放于4℃条件待用,用前加入曲拉通100和二甲基亚砜,终浓度均为1%;C、电泳、染色及分析。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域,具体涉及一种单细胞DNA损伤的快速检测方法以及试剂盒。
背景技术
随着中国经济的加速发展,环境污染也日趋严重。目前,全球范围内的环境污染对人体健康也受到越来越多的关注。其中,环境污染物造成DNA的损伤会影响细胞的遗传稳定性,并可能对后代产生影响,引起孕妇流产、死胎、畸胎和某些遗传性疾病等。由于细胞的DNA损伤会造成疾病,威胁人类健康,因此对细胞DNA损伤进行检测,并了解这一损伤能否引起细胞事件的变化就显得十分重要。
自从碱性彗星实验问世以来,各相关实验室已将该技术广泛应用于检测细胞DNA的损伤,与此同时,也在不断的对该方法进行改良,使之能够检测细胞内不同的DNA损伤,例如单双链的断裂、碱基的氧化损伤、DNA-DNA/DNA-蛋白质-药物交联以及修复等。
该方法将单个细胞悬浮于琼脂糖凝胶中,经裂解处理后在电场中进行短时间的电泳,再用荧光染料染色。DNA受损细胞中形成DNA降解片段,在电场中泳动速度较快,使细胞核呈现出一种彗星式的图案,而正常的无DNA断裂的核在泳动时保持圆球形,是一种非常简便的检测细胞损伤的方式。
当前操作中,一般的单细胞DNA损伤的检测,采用一层凝胶,在电泳的过程中,该层凝胶太薄易脱落。若直接将凝胶层加厚,既容易因胶层过厚不易观察,又无法使细胞尽可能的处于同一个平面;若采用多层凝胶叠加的方式,两层胶面之间无法很好附着,脱胶现象依然存在。此外,当前所用细胞裂解液,含有用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠,该物质在水中溶解度较低,导致裂解液配置时一直存在溶解性不佳的问题。
发明内容
本发明是为解决上述技术问题进行的,对当前的单细胞DNA损伤检测体系进行改进,提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测方法及试剂盒,解决胶易脱落以及溶液配置困难的问题。
本发明的第一方面,提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测方法,包括如下步骤:
A、铺胶
铺第一层胶,将电泳载玻片置于75%乙醇溶液中浸泡1~2h后擦干;铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍,在受炙面的一端滴加普通琼脂糖凝胶0.1~0.3mL,用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端,然后烤干,备用。
具体操作上,载玻片选择光面载玻片,尺寸为25mm×50mm×2mm;铺胶前,先将普通熔点的琼脂糖凝胶在75℃水浴锅中预热;铺胶后,采用涂布棒将普通琼脂糖凝胶涂匀后,采用酒精灯外焰烤干,烤干后能够长期保存,即用即取,直接进行第二层铺胶即可。
铺第二层胶:取30~50μL细胞悬液与150~250μL 1%低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀,再取混合液滴在铺有底胶载玻片的一侧,用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下,而后移去盖玻片。
具体操作上,该1%低熔点琼脂糖的配制方法如下:称量低熔点琼脂糖,加入体积为琼脂糖质量100倍的PBS溶液,置于37℃水浴锅中溶解。
细胞悬液与1%低熔点琼脂糖凝胶混匀后,混合液分五滴滴在铺有底胶载玻片的一侧,盖玻片盖上后,载波片系统被置于4℃条件下10~12min后,用水平推移的方法移去盖玻片。
B、裂解、解旋
使用表面滴加的方式,向步骤A中铺好细胞的载玻片上滴加裂解液100~500μL,用无菌水漂洗3次,将载玻片并列置于水平电泳槽内,电泳槽放于4℃,加入电泳缓冲液没过载玻片,浸泡20min,使DNA双链解螺旋,
细胞裂解液的配制方法如下:称量Tris 0.12~0.15g、NaOH 0.8~1.0g、NaCl14.5~15.0g、Na2EDTA3.72~4.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至10后定容至100ml,存放于4℃条件待用,用前加入曲拉通100和二甲基亚砜,终浓度均为1%。
发明人通过实验,配置细胞裂解液时,省去常用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠,既保持了裂解液对细胞膜的破坏,又解决了配裂解液时不好溶解的问题。
C、电泳、染色及分析
在4℃、260~320mA恒定电流情况下进行碱式电泳,电泳结束后,依次采用中和缓冲液以及双蒸水进行中和及浸泡,而后进行染色和荧光拍片分析。
其中,碱性电泳缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA 0.37~0.5g、NaOH12.0~15.0g置于烧杯中,加入800mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至13后定容至1L,存放于4℃。
中和缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA4.85~5.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至7.5后定容至100mL,现配现用。
电泳时,电泳槽中的电泳缓冲液的液面比载玻片高出1~2cm;电泳结束后,用中和缓冲液中和3次,每次5min,接下来用双蒸水浸泡3次每次10min。载玻片用无菌水浸泡三次后,用滤纸吸干玻片上的液体后放在37℃恒温箱中烘干,能够不受时间的限制,随时拿出来染色采集荧光图片。
进行染色和荧光拍片分析的步骤如下:暗环境中,取稀释好的碘化丙啶染液10~20μL滴在烘干的载玻片上,以避免任何气泡产生的方式盖上盖玻片染色30min;将载玻片编为盲片,置于荧光显微镜下,选用×20倍物镜,每张片子随机拍照10~20个视野,计数拖尾细胞以及细胞拖尾率;再选择接近于视野中心、染色清晰、拖尾形态在目标样品中占优势的60~80个左右拖尾细胞,通过SCGE图像分析系统CASP测量并计算尾长、尾/头、尾/头%DNA以及尾距。
碘化丙啶染液的配制方法如下:称量碘化丙啶试剂20~25mg于棕色试剂瓶中,加入10~50mL pH7.4的PBS溶液置于涡旋振动器上充分震荡混匀后配置成2mg/ml的溶液,于4℃保存待用;碘化丙啶工作液为用PBS溶液稀释40倍使用。
本发明的第二方面,提供了一种单细胞DNA损伤的快速检测试剂盒,内含涂覆有底胶的载玻片、盖玻片、低熔点琼脂糖凝胶、曲拉通100、二甲基亚砜、NaCl、Na2EDTA、NaOH、PBS溶液、Tris、碘化丙啶试剂。进行单细胞DNA损伤时,从中选取所需的试剂进行溶液配置。
发明技术效果
首先,铺胶时,采用两层胶法,铺第一层时,铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍,在受炙面的一端滴加普通琼脂糖凝胶,用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端,然后烤干、备用,而后按照正常步骤进行第二层铺胶。两层胶法既能使胶面很好的附着,又能使细胞尽可能的处于同一个平面,效果较好,同时第一层胶烤干后,可能够长期保存,即用即取,直接进行第二层铺胶即可,简单便易。
其次,本发明配置细胞裂解液时,省去了常用来破坏细胞膜的磷脂双分子层的肌氨酸钠,既依旧保持了裂解液对细胞膜的破坏,又解决了配裂解液时不好溶解的问题。
第三,本发明经电泳和中和操作后处理后的载玻片可以即用即取,彗星电泳后的载玻片长期保存,随时拿出来染色采集荧光图片。
因此,本发明提供了一种检测单细胞DNA损伤的更加简便的方法,解决了检测过程中易脱胶,不易观察,不易操作等问题,使检测更易操作,且使操作更加灵活,方便,随取随测。
附图说明
图1是采用本发明方法进行HepG2细胞单细胞DNA损伤的彗星实验检测结果:(A)为不同药物剂量处理后细胞的彗星图像,(B)为不同药物剂量处理条件下,细胞的彗星阳性比例。
图2为CASP软件分析过程。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明,下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解,下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的,不应以此限制本发明的保护范围。
实施例一单细胞DNA损伤的快速检测方法
1、铺胶
制胶前准备:操作前半小时打开75℃和37℃的水浴锅。
第一层胶:第一层胶即底胶,选择光面的载玻片,先将所有的载玻片洗净放在酒精中浸泡1h后用擦镜纸擦干;点上酒精灯,铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍,在受炙面的一端滴加在75℃水浴锅中预热的普通熔点的琼脂糖凝胶0.1~0.3mL,马上用三角玻璃棒水平铺拉凝胶到另一端,进而用酒精灯外焰烤干,备用。
第二层胶:取30~50μL细胞悬液与150~250μL 1%低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀,再取混合液分5滴滴在铺有底胶载玻片的一侧,然后用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下,不要有气泡产生,而后置于4℃环境中,10-12min后,用水平推移的方法移去盖玻片。
2、裂解、解旋
配制细胞裂解液:称量Tris 0.12~0.15g、NaOH 0.8~1.0g、NaCl 14.5~15.0g、Na2EDTA3.72~4.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至10后定容至100ml,存放于4℃条件待用,用前加入曲拉通100和二甲基亚砜,终浓度均为1%。
将铺好细胞的载玻片,使用表面滴加的方式,滴加裂解液100~500μL,用无菌水漂洗3次,将载玻片并列置于水平电泳槽内,电泳槽放于4℃,加入电泳缓冲液没过载玻片,浸泡20min,使DNA双链解螺旋。
3、电泳、中和
在4℃、260~320mA条件下电泳10min。电泳后,用中和缓冲液中和3次,每次5min,再用无菌水浸泡3次每次10min。用滤纸吸干玻片上的液体后放在37℃恒温箱中烘干。烘干后,能够不受时间的限制,随时拿出来染色采集荧光图片。
碱性电泳缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA0.37~0.5g、NaOH 12.0~15.0g置于烧杯中,加入800mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至13后定容至1L,存放于4℃。
中和缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA4.85~5.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至7.5后定容至100mL,现配现用。
4.染色、荧光拍片分析
取稀释好的PI染液10~20μL滴在烘干的载玻片上,盖上盖玻片(避免任何气泡)染色30min。以上各步骤均在暗环境中操作,避免光对DNA的额外损伤。每个剂量组做3次重复。将载玻片编为盲片,置于荧光显微镜下(物镜×20倍),每张片子随机拍照10~20个视野(视细胞多少而定),计数拖尾细胞,计算细胞拖尾率(形状指标),拖尾率=(拖尾细胞数/观察细胞数)×100%。再选择接近于视野中心、染色清晰、拖尾形态在目标样品中占优势的60~80个左右拖尾细胞,通过SCGE图像分析系统CASP测量并计算尾长、尾/头(长)、尾/头%DNA、尾距等较为客观的距离指标和复合指标。
实施例二验证实验
1、实验细胞
选择HepG2细胞作为实验对象。
2、供试细胞准备及损伤处理
取对数生长期的细胞制成细胞悬液,细胞经离心去掉胰酶与培养基后用新鲜培养基重新悬浮以供使用;调整细胞密度至1×105~1×106cells/ml(通过细胞计数仪进行技术),接种于6孔细胞培养板后,待24h后光镜检测细胞确认其贴壁生长正常,弃去孔中培养基,准备药物染毒细胞后继续培养。
将药物的母液用HepG2细胞培养基稀释为对应浓度(5μM、10μM、20μM、40μM)的供试药液后,在准备好的细胞培养板中每孔加入2ml供试药液置于相应的培养箱中静置培养相应的时间。对照组以0.1%二甲亚砜为空白对照组,各组试验独立重复三次。
3、结果分析
采用实施例一中的方法进行检测,电泳过程中没有出现脱胶的情况。HepG2细胞染毒不同剂量的药物后,经过彗星实验、图像采集,然后用CASP软件分析。
随着药液浓度的增加,“彗星”尾矩逐渐延长(图1A),细胞的彗星阳性比例也随着药液浓度的增加而增加(图1B),说明细胞的DNA损伤程度与药液浓度呈正相关。本发明的细胞裂解液完全能够实现细胞裂解,不会对后续电泳和染色造成任何影响。
CASP软件分析的大体过程如图2所示。各实验材料的每个梯度在平行的实验条件下,重复三次,每个重复玻片取100-150个细胞,图像输入软件中分析记录数据。各细胞DNA彗星的头长度、尾部长度,头部DNA含量、尾部DNA含量、TM值、以及OTM即可由软件自动生成,其中的尾部长度,头部DNA含量、TM值是用以分析细胞DNA损伤的指标。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (9)
1.一种单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
A、铺胶
铺第一层胶,将电泳载玻片置于75%乙醇溶液中浸泡1~2h后擦干;铺胶前将载玻片在火焰上烤一遍,在受炙面的一端滴加普通琼脂糖凝胶0.1~0.3mL,用涂布棒水平铺拉凝胶到另一端,然后烤干,备用;
铺第二层胶:取30~50μL细胞悬液与150~250μL 1%低熔点琼脂糖凝胶吹打混匀,再取混合液滴在铺有底胶载玻片的一侧,用盖玻片从有胶的一侧缓缓放下,而后移去盖玻片,
B、裂解、解旋
使用表面滴加的方式,向步骤A中铺好细胞的载玻片上滴加裂解液100~500μL,用无菌水漂洗3次,将载玻片并列置于水平电泳槽内,电泳槽放于4℃,加入电泳缓冲液没过载玻片,浸泡20min,使DNA双链解螺旋,
细胞裂解液的配制方法如下:称量Tris 0.12~0.15g、NaOH 0.8~1.0g、NaCl 14.5~15.0g、Na2EDTA 3.72~4.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至10后定容至100ml,存放于4℃条件待用,用前加入曲拉通100和二甲基亚砜,终浓度均为1%,
C、电泳、染色及分析
在4℃、260~320mA恒定电流情况下进行碱式电泳,电泳结束后,依次采用中和缓冲液以及双蒸水进行中和及浸泡,而后进行染色和荧光拍片分析。
2.如权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤A中,载玻片为光面载玻片,尺寸为25mm×50mm×2mm,
铺第一层胶时,普通熔点的琼脂糖凝胶在75℃水浴锅中预热,
采用涂布棒将普通琼脂糖凝胶涂匀后,采用酒精灯外焰烤干,烤干后能够长期保存,即用即取。
3.如权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤A中,铺第二层胶时,1%低熔点琼脂糖的配制方法如下:称量低熔点琼脂糖,加入体积为琼脂糖质量100倍的PBS溶液,置于37℃水浴锅中溶解,
细胞悬液与1%低熔点琼脂糖凝胶混匀后,混合液分五滴滴在铺有底胶载玻片的一侧,
盖玻片盖上后,载波片系统被置于4℃条件下10~12min后,用水平推移的方法移去盖玻片。
4.如权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤C中,
碱性电泳缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA 0.37~0.5g、NaOH 12.0~15.0g置于烧杯中,加入800mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至13后定容至1L,存放于4℃,
中和缓冲液的配置方法如下:称量Na2EDTA 4.85~5.0g置于烧杯中,加入80mL去离子水并用玻璃棒搅拌均匀使其完全溶解,调pH至7.5后定容至100mL,现配现用。
5.根据权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤C中,电泳时,电泳槽中的电泳缓冲液的液面比载玻片高出1~2cm,
电泳结束后,用中和缓冲液中和3次,每次5min,接下来用双蒸水浸泡3次每次10min。
6.据权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤C中,进行染色和荧光拍片分析的步骤如下:
暗环境中,取稀释好的碘化丙啶染液10~20μL滴在烘干的载玻片上,以避免任何气泡产生的方式盖上盖玻片染色30min;将载玻片编为盲片,置于荧光显微镜下,选用×20倍物镜,每张片子随机拍照10~20个视野,计数拖尾细胞以及细胞拖尾率;再选择接近于视野中心、染色清晰、拖尾形态在目标样品中占优势的60~80个左右拖尾细胞,通过SCGE图像分析系统CASP测量并计算尾长、尾/头、尾/头%DNA以及尾距。
7.根据权利要求6所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,碘化丙啶染液的配制方法如下:称量碘化丙啶试剂20~25mg于棕色试剂瓶中,加入10~50mL pH7.4的PBS溶液置于涡旋振动器上充分震荡混匀后配置成2mg/ml的溶液,于4℃保存待用;碘化丙啶工作液为用PBS溶液稀释40倍使用。
8.根据权利要求1所述的单细胞DNA损伤的快速检测方法,其特征在于:
其中,步骤C中,中和操作完成后,载玻片用无菌水浸泡三次后,用滤纸吸干玻片上的液体后放在37℃恒温箱中烘干,能够不受时间的限制,随时拿出来染色采集荧光图片。
9.一种单细胞DNA损伤的快速检测试剂盒,其特征在于,包括:
涂覆有底胶的载玻片、盖玻片、低熔点琼脂糖凝胶、曲拉通100、二甲基亚砜、NaCl、Na2EDTA、NaOH、PBS溶液、Tris、碘化丙啶试剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110645348.6A CN113405881A (zh) | 2021-06-10 | 2021-06-10 | 单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110645348.6A CN113405881A (zh) | 2021-06-10 | 2021-06-10 | 单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN113405881A true CN113405881A (zh) | 2021-09-17 |
Family
ID=77683338
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110645348.6A Pending CN113405881A (zh) | 2021-06-10 | 2021-06-10 | 单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN113405881A (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1963487A (zh) * | 2006-10-27 | 2007-05-16 | 暨南大学 | 一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法及试剂盒 |
CN103276048A (zh) * | 2013-05-07 | 2013-09-04 | 江苏大学 | 一种简便、快速检测细胞dna损伤的样品制备方法及施用于该方法的试剂盒 |
CN103952302A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 同济大学 | 一种用于单细胞胶电泳实验的新型基片 |
CN106018529A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-10-12 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种单细胞凝胶电泳检测细胞dna损伤的试剂盒及方法 |
CN107576713A (zh) * | 2017-07-12 | 2018-01-12 | 浙江省农业科学院 | 一种检测蚯蚓体腔细胞dna损伤的方法及其运用 |
CN111714638A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-09-29 | 新疆医科大学第一附属医院 | 致dna损伤化合物联合dna损伤修复抑制剂的组合物及制备方法和应用 |
-
2021
- 2021-06-10 CN CN202110645348.6A patent/CN113405881A/zh active Pending
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1963487A (zh) * | 2006-10-27 | 2007-05-16 | 暨南大学 | 一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法及试剂盒 |
CN103276048A (zh) * | 2013-05-07 | 2013-09-04 | 江苏大学 | 一种简便、快速检测细胞dna损伤的样品制备方法及施用于该方法的试剂盒 |
CN103952302A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-30 | 同济大学 | 一种用于单细胞胶电泳实验的新型基片 |
CN106018529A (zh) * | 2016-07-07 | 2016-10-12 | 中国科学院重庆绿色智能技术研究院 | 一种单细胞凝胶电泳检测细胞dna损伤的试剂盒及方法 |
CN107576713A (zh) * | 2017-07-12 | 2018-01-12 | 浙江省农业科学院 | 一种检测蚯蚓体腔细胞dna损伤的方法及其运用 |
CN111714638A (zh) * | 2020-06-23 | 2020-09-29 | 新疆医科大学第一附属医院 | 致dna损伤化合物联合dna损伤修复抑制剂的组合物及制备方法和应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Thomas et al. | Sensitivity of detecting Chlamydia trachomatis elementary bodies in smears by use of a fluorescein labelled monoclonal antibody: comparison with conventional chlamydial isolation. | |
Edström | Microextraction and microelectrophoresis for determination and analysis of nucleic acids in isolated cellular units | |
Seabold et al. | DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices | |
Di Iorio et al. | Q‐FIHC: Quantification of fluorescence immunohistochemistry to analyse p63 isoforms and cell cycle phases in human limbal stem cells | |
Gonzalez-Bellido et al. | Labeling and confocal imaging of neurons in thick invertebrate tissue samples | |
RU2619784C2 (ru) | Система и набор для получения цитологических образцов для исследования | |
US20060068408A1 (en) | Method for determining DNA damage and multi-chamber plate | |
WO2023284820A1 (zh) | 一种组织透明方法和组织学方法联合用于检测肿瘤内细菌的应用 | |
CN106018529A (zh) | 一种单细胞凝胶电泳检测细胞dna损伤的试剂盒及方法 | |
RU2536502C2 (ru) | Цитологическая и гистологическая фиксирующая композиция и способ окрашивания | |
CN107621462B (zh) | 一种组织透明化液sut及其制备和应用 | |
CN113405881A (zh) | 单细胞dna损伤的快速检测方法及试剂盒 | |
CN106918484A (zh) | 一种基于组织切片的三维模型的构建方法 | |
Rajeshwari et al. | Acid-fastness of Histoplasma in surgical pathology practice | |
Dumitriu et al. | Vamping: stereology-based automated quantification of fluorescent puncta size and density | |
WO2018016501A1 (ja) | 汗腺の動態の観察方法 | |
CN109859304B (zh) | 三维打印技术在角膜缘组织体外建立三维结构数字化模型 | |
CN108593750B (zh) | 一种缩短琼脂糖凝胶电泳染色的方法 | |
Wong et al. | Simple and Rapid Tissue Clearing Method for Three‐Dimensional Histology of the Pancreas | |
CN106198990A (zh) | 一种对组织样本进行免疫标记的方法 | |
RU2709608C1 (ru) | Способ определения белка свертываемости крови у животных | |
CN114279795A (zh) | 组织样品快速检测系统、检测方法及应用 | |
RU2304776C2 (ru) | Способ окраски мазков крови | |
Streiblová et al. | Light microscopy methods | |
CN87101986A (zh) | 真菌检测 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210917 |