CN113402509A - 一组美沙达唑类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组美沙达唑类化合物，是如式(Ⅰ)所示结构的化合物之一。该类化合物是由黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36CCTCC NO：M 2021520经过培养和发酵，从其发酵液中分离获得的。实验证实：本发明所述美沙达唑类化合物能明显促进血管破损斑马鱼的血管的生成，同时还对血栓具有一定的缓解作用。提示本发明的化合物有望增益其在促进血管生成和抗血栓活性中的应用价值，为制备新一代心血管系统药物的开发和应用提供新的途径，在临床应用中具有较好的社会效益、经济价值和市场前景。

Description

一组美沙达唑类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一组美沙达唑类化合物，以及美沙达唑类化合物的发酵分离制备和其在制备治疗和预防心血管疾病药物中的应用。属于微生物技术及其制品与应用技术领域。

背景技术

黏细菌是一类革兰氏阴性细菌，具有复杂的细胞社会行为和多细胞发育周期，能够滑行、形成形态特异的子实体、生孢和捕食其他细菌，其次级代谢产物丰富和生物活性多样，越来越受到国内外学者的关注(J.

F.J.Marcos-Torres,E.García-Bravo,A.

J.Pérez,Front.Microbiol.2016,7,781-781.)。黏细菌更是杂合型天然产物的一大丰富的来源，其中最为著名的当属纤维堆囊菌(Sorangiumcellulosum)合成的一系列NRPS-PKS杂合体埃博霉素epothilones，其合成类似物伊沙匹隆(ixabepilone)和优替德隆 (utidelone)分别经FDA和SFDA批准于2007年和2021年上市。因此黏细菌具有极大的新颖活性产物的合成潜力和挖掘前景。

美沙达唑类化合物是一类黏细菌来源的异噁唑环的脂肪酸链与N-核糖醇基-5,6-二甲基苯并咪唑杂合而成的生物碱新骨架。异噁唑环在自然界中十分稀有，目前仅从放线菌和真菌中发现了5个含异噁唑片段的天然产物：环丝氨酸(M.-L.Svensson,S.Gatenbeck,Arch.Microbiol. 1982,131,129-131)、阿西维辛和4-羟基阿西维辛(S.J.Gould,S.Ju,J.Am.Chem.Soc.1993, 114,10166-10172)、毒蝇蕈醇(M.Onda,H.Fukushima,M.Akagawa,Chem.Pharm.Bull.1964, 12,751-751)、鹅膏蕈氨酸(K.Bowden,A.C.Drysdale,G.A.Mogey,Nature 1965,206, 1359-1360)。而美沙达唑类化合物是异噁唑环在黏细菌中的首例发现。更为引人注目的是，二甲基苯并咪唑在此之前仅报道存在于维生素B₁₂中，这也更凸显了美沙达唑结构的新颖性。经检索，有关美沙达唑类的各种化合物以及美沙达唑类化合物的发酵分离制备和其在制备治疗和预防心血管疾病药物中的应用还未见报道。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的在于提供一组美沙达唑类化合物，及其制备方法，以及其在在制备促血管生成和/或抗血栓作用药物中的应用。

本发明所述的一组美沙达唑类化合物，其特征在于：该美沙达唑类化合物是如式(Ⅰ) 所示结构的化合物之一：

其中：

	7'构型	R基团	命名
				化合物1	S	R＝Me	美沙达唑A<sub>1</sub>
化合物2	R	R＝Me	美沙达唑A<sub>2</sub>
				化合物3	R	R＝H	美沙达唑B<sub>2</sub>
化合物4	S	R＝H	美沙达唑B<sub>1</sub>

上述的美沙达唑类化合物，优选是命名为美沙达唑A₁的化合物1；或是命名为美沙达唑 A₂的化合物2；或是命名为美沙达唑B₂的化合物3。

本发明所述美沙达唑类化合物的制备方法，其特征在于：所述美沙达唑类化合物是由黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCC NO：M 2021520经过液体发酵后，从其发酵产物中得到。

本发明所述美沙达唑类化合物在制备促血管生成和/或抗血栓作用药物中的应用。

其中：所述所述美沙达唑类化合物优选是命名为美沙达唑A₁的化合物1；或是命名为美沙达唑A₂的化合物2；或是命名为美沙达唑B₂的化合物3。

实验证实：本发明所述美沙达唑类化合物能明显促进血管破损斑马鱼的血管的生成，在 10μM和25μM剂量下可对PTK787诱导破坏掉的血管进行修复，其修复能力与丹红注射液(阳性对照)的修复能力相当。同时，还证实：美沙达唑类化合物在10μM和25μM浓度下对血栓也具有一定的缓解作用，治疗效果分别为31.7％和59.0％(阳性对照组为阿司匹林71.1％)；其中命名为美沙达唑A₁的化合物1效果最佳。

本发明进一步公开了一种含美沙达唑类化合物的促血管生成药物，其特征在于：所述药物含有治疗有效量的美沙达唑类化合物和药学上可接受的载体。

本发明进一步公开了一种含美沙达唑类化合物的抗血栓作用药物，其特征在于：所述药物含有治疗有效量的美沙达唑类化合物和药学上可接受的载体。

本发明进一步公开了一种含美沙达唑类化合物的促血管生成药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是治疗有效量的美沙达唑类化合物与治疗有效量的丹红注射液、丹参素钠的一种或其任意组合制备的促血管生成药物组合物。

本发明进一步公开了一种含美沙达唑类化合物的抗血栓作用药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是治疗有效量的美沙达唑类化合物与治疗有效量的阿司匹林、氯吡格雷、丹参多酚酸、盐酸地尔硫卓、血栓通、血塞通中的一种或其任意组合制备的抗血栓作用药物组合物。

上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等，粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明的美沙达唑类化合物较适于以组合物的形式通过口服、鼻吸入或肠胃外给药的方式施用于需要所述病症治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。优选的形式是片剂、包衣片剂、胶囊、栓剂、鼻喷雾剂和注射剂，特别优选在肠道的特定部位释放的制剂。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备，例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的药物组合物优选含有重量比(或体积比)为0.1％–99.5％的活性成分，最优选含有重量比(或体积比)为0.5％–95％的活性成分。

本发明的美沙达唑类化合物施用量可根据用药途径、患者的年龄、体重、所治疗的疾病的类型和严重程度等变化，其日剂量可以是0.01–10mg/kg体重，优选0.1–5mg/kg体重。可以一次或多次施用。

本发明公开了一组美沙达唑类化合物，及其制备方法，以及其在制备促血管生成和/或抗血栓作用药物中的应用。其中所述美沙达唑类化合物是异噁唑-苯并咪唑杂合的新骨架天然产物，也是异噁唑化合物在黏细菌中的首次发现。实验证实：本发明所述美沙达唑类化合物能明显促进血管破损斑马鱼的血管的生成，在10μM和25μM剂量下可对PTK787诱导破坏掉的血管进行修复，其修复能力与丹红注射液(阳性对照)的修复能力相当。同时，还证实：美沙达唑类化合物在10μM和25μM浓度下也对血栓具有一定的缓解作用，治疗效果分别为 31.7％和59.0％(阳性对照组为阿司匹林71.1％)。提示该类化合物能在体内促进转基因斑马鱼的血管生成且具有一定的抗血栓活性。新型心血管系统药物开发对于心血管疾病预防和治疗十分必要且意义重大，本发明所获得的美沙达唑类化合物有望增益其在促进血管生成和抗血栓活性中的应用价值，为制备新一代心血管系统药物的开发和应用提供新的途径，产生较好的社会效益和经济价值。本发明提供的美沙达唑类化合物临床应用和市场前景广阔。

附图说明

图1：菌株SDU36的进化位置在黏细菌目中的进化位置。

图2：美沙达唑A₁/A₂(1–2)的关键HMBC和¹H-¹H COSY信号。

图3：美沙达唑B₂(3)的关键HMBC和¹H-¹H COSY信号。

图4：美沙达唑A₁(1)核糖醇链的耦合常数分析。

图5：维生素B12降解成为N-核糖醇基-二甲基苯并咪唑。

图6：美沙达唑A₁/A₂(1–2)的立体构型。

其中：图左为化合物1，图右为化合物2。

图7：CP3概率分析。

图8：美沙达唑A₁/A₂(1–2)的分子内氢键相互作用分析。

其中：(A)美沙达唑A₁/A₂(1–2)的AIM拓扑分析图。圈内为关键化学键临界点(BCP)。美沙达唑A₁(1，图左)具有5个氢键，而美沙达唑A₂(2，图右)具有4个氢键。(B)美沙达唑A₁/A₂(1–2)的结构示意图。在美沙达唑A₁(1，图左)中，虚线突出显示的C-11'， C-12'，C-13'中的三个亚甲基不受束缚可灵活旋转；在美沙达唑A₂(2，图右)中，C-11'，C-12'， C-13'中的三个亚甲基处在氢键形成的刚性环中，单键不能旋转，从而造成亚甲基上两氢原子化学不等价。

图9：美沙达唑A₂/B₂(2–3)的ECD光谱对比。

图10：美沙达唑A₁/A₂/B₂(1–3)对斑马鱼的促血管生成作用和抗血栓作用。

其中：图A和B表示化合物的促血管生成活性：(A)斑马鱼节间血管(ISV)图像。 (B)斑马鱼中ISV的长度的定量分析。图C和D表示化合物的抗血栓活性：(C)斑马鱼心脏中的红细胞图像，其中放大区域中的黑点表示心脏中的红细胞。(D)斑马鱼心脏中红细胞的染色强度的定量分析。

图11：美沙达唑A₁/A₂/B₂(1–3)组合物对斑马鱼的促血管生成作用和抗血栓作用。

其中：图A和B表示化合物的促血管生成活性：(A)斑马鱼节间血管(ISV)图像。 (B)斑马鱼中ISV的长度的定量分析。图C和D表示化合物的抗血栓活性：(C)斑马鱼心脏中的红细胞图像，其中放大区域中的黑点表示心脏中的红细胞。(D)斑马鱼心脏中红细胞的染色强度的定量分析。

图12：美沙达唑A₁的¹H核磁共振谱。

图13：美沙达唑A₁的¹³C核磁共振谱(DEPTQ)。

图14：美沙达唑A₁的HSQC二维核磁共振谱。

图15：美沙达唑A₁的HMBC二维核磁共振谱。

图16：美沙达唑A₁的¹H-¹H COSY二维核磁共振谱。

图17：美沙达唑A₁的高分辩质谱。

图18：美沙达唑A₂的¹H核磁共振谱。

图19：美沙达唑A₂的¹³C核磁共振谱(DEPTQ)。

图20：美沙达唑A₂的HSQC二维核磁共振谱。

图21：美沙达唑A₂的HMBC二维核磁共振谱。

图22：美沙达唑A₂的¹H-¹H COSY二维核磁共振谱。

图23：美沙达唑A₂的高分辩质谱。

图24：美沙达唑B₂的¹H核磁共振谱。

图25：美沙达唑B₂的¹³C核磁共振谱(DEPTQ)。

图26：美沙达唑B₂的HSQC二维核磁共振谱。

图27：美沙达唑B₂的HMBC二维核磁共振谱。

图28：美沙达唑B₂的¹H-¹H COSY二维核磁共振谱。

图29：美沙达唑B₂的高分辩质谱。

图30：美沙达唑A₁的HECADE-HSQC二维核磁共振谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

本发明所述黏球菌SDU36是以常规方法分离自西藏自治区改则县洞措湖湖底泥土样，由山东大学微生物国家重点实验室鉴定为黏细菌(Myxococcus sp.)SDU36，并与2021年5月 12日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)，保藏中心编号为：黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCC NO：M 2021520。

实施例1菌株的获得、保藏及及美沙达唑类化合物的分离纯化(以美沙达唑A₁、美沙达唑A₂、美沙达唑B₂为例)

1.1菌株的分离

分离方法如下：WCX培养基凝固后，涂抹上大肠杆菌。将新鲜或风干样品(西藏自治区改则县洞措湖湖底泥土样)均匀的撒在大肠杆菌菌垫上。培养至第3d后，每天在体视显微镜下检查平板是否有黏细菌的子实体或菌膜出现。若有则小心挑取子实体顶部或刮取菌膜边缘，转接至新的有大肠杆菌菌垫的WCX培养基平板上或者VY/2培养基上进行纯化。实验中得到一株黄色细菌，命名为SDU36。

其中，上述WCX培养基的配方：CaCl₂·2H₂O 0.1g/100ml，琼脂1.5g/100ml，pH 7.2。灭菌后加入放线菌酮至终浓度25μg/mL。VY/2培养基的配方及配制方法：安琪酵母粉0.5 g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.1g/100ml，CaCl₂ 0.07g/100ml，pH 7.2。VY/2固体培养基需添加1.5g/100ml的琼脂。

对SDU36菌株进行生理生化反应测定和16S rRNA基因序列分析，确认菌株SDU36的16S rRNA基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该菌株被鉴定为黏球菌属(Myxococcussp.) (图1)。

上述黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36革兰氏染色呈阴性，菌株的营养细胞呈杆状，两头稍尖，大小8～10μm×0.2～0.8μm。菌落生长为黄色，薄而向边缘扩展，有滑动痕迹，黏孢子为卵圆形或椭圆形。菌株SDU36能够吸附刚果红及产生过氧化氢酶，不能利用尿素、明胶、淀粉、纤维素和蔗糖，不产生氧化酶和不能还原硝酸盐。

上述黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36生长温度为25–35℃，最适生长温度为30℃。

上述黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36在CTT培养基中生长，摇床培养48小时后，菌体密度达到2.23±0.05，pH值为6.2±0.1。CTT培养基的配方：酪蛋白胨1g/100ml，Tris-HCl(pH ＝7.6)10mM，PBS(pH＝7.6)10mM，MgSO₄·7H₂O 0.1g/100ml。

上述菌株已于2021年5月12日保藏于“中国典型培养物保藏中心”(地址：中国武汉，武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021520。

发明人的研究表明：黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCC NO：M 2021520为美沙达唑类化合物的产生菌。利用该菌的液体发酵和液质联用检测的方法，发明人从中检测和分离到了本发明所述的美沙达唑类化合物，美沙达唑A₁、美沙达唑A₂、美沙达唑B₂。

1.2黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCC NO：M 2021520的发酵和化合物的提取

以常规方法从上述固体WCX培养基上挑取黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCCNO： M 2021520菌体接种至VY/2平板。30℃培养3–4天后刮取菌体(10μL接菌环满环)，接种至100ml液体VY/2培养基摇瓶，30℃培养4–5天，达到对数生长期后，以10％作为接种量转接至新鲜VY/2液体培养基进行扩培。在30℃，200rpm条件下继续培养7天，过滤掉菌体，向每100ml培养液中加入2g的吸附树脂HP-20，30℃，200rpm条件下过夜吸附，收集树脂，以制备美沙达唑类化合物。

例如：收集80L发酵液中的吸附树脂HP-20，置于40℃烘箱烘干多余水分，将树脂装入玻璃层析柱中，用20L甲醇洗脱树脂，旋转蒸发仪减压45℃蒸干浸提取液，得含美沙达唑类的粗提物(8.0g)。

上述VY/2培养基的配方及配制方法：安琪酵母粉0.5g/100ml，MgSO₄·7H₂O 0.1g/100ml， CaCl₂ 0.07g/100ml，用氢氧化钠调节pH至7.2。其中，VY/2固体培养基需添加1.5％的琼脂。

1.3美沙达唑类化合物的分离纯化

将含有上述美沙达唑类化合物的粗提物(8.0g)进一步采用反相中低压柱层析(仪器：歩琦Pure C-810，配备FlashPure EcoFlex C18色谱柱)，以甲醇水体系做梯度洗脱(流速12 ml/min；10％–100％：0–180min；100％：30min)，依据TLC检测结果，最终合并分别得到10个子馏分。再通过液质检测，在Fr 5(50％洗脱段)和Fr 6(60％洗脱段)中检测到上述美沙达唑类化合物。

采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(装填100g)分离Fr 5(300.0mg)，甲醇洗脱，以4ml/瓶手动接收洗脱液，根据TLC检测，最终合并成5个组分，液质检测显示，组分Fr 5–1 中含有上述美沙达唑类化合物。再次用反相中压液相柱层析洗脱组分Fr 5–1(121.1mg)，甲醇–水体系梯度洗脱(洗脱条件为流速5ml/min：10％–100％：0–60min；100％，15min)。除去杂质后，通过高效液相色谱纯化得到2个美沙达唑类化合物，它们分别是命名为美沙达唑A₁的化合物1(t_R＝14.0min)和命名为美沙达唑B₂的化合物3(t_R＝12.4min)。液相色谱仪型号为戴安U3000；采用菲诺美Luna-C₁₈ 5μm色谱柱(10×250mm)，紫外检测波长为210 nm，洗脱条件为流速1.8ml/min，70％甲醇水。

采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱(装填100g)分离Fr 6(146.3mg)，甲醇洗脱，以4ml/ 瓶手动接收洗脱液，根据TLC检测，合并成10个组分，液质检测显示，组分Fr 6–4中含有美沙达唑类化合物。遂采用高效液相色谱法对组分Fr F-4(21.3mg)进行纯化，在1.8mL/min 的流速下以40％乙腈水洗脱，在t_R＝10.9min收集到命名为美沙达唑A₂的化合物2。

1.4美沙达唑类化合物理化性质及波谱数据

进一步地，对上述富集到的美沙达唑化合物进行高分辨质谱、核磁、圆二色谱、旋光、红外光谱的检测。

仪器型号：核磁测试Bruker AvanceⅢ(600MHz)；HRESIMS测试LTQ-Orbitrap XL；UV/ECD测试Chirascan；旋光测试Anton Paar MCP 200；红外测试Nicolet iN 10微型FTIR光谱仪。

本发明所述美沙达唑类化合物的理化性质及波谱数据如下：

美沙达唑A₁(1):浅黄色油状物；

UV(MeOH)λ_max(logε)279 (3.40),287(3.35)nm；ECD(MeOH):203(Δε+16.34),224(Δε+5.38)nm；IRν_max 3340,2929, 1679,1563,1470,1133cm^-1；for ¹H NMR and ¹³C NMR核磁数据,见表1；HRESIMS atm/z 546.3168[M]⁺(calcd for C₂₉H₄₄O₇N₃,546.3174).

美沙达唑A₂(2):黄色固体；

UV(MeOH)λ_max(logε)279(3.69), 287(3.64)nm；ECD(MeOH):203(Δε+5.73),218(Δε+5.40)nm；IRν_max 3397,2953,2925,1651, 1561,1403,1135cm^-1；for ¹H NMR and ¹³C NMR核磁数据,见表1；HRESIMS atm/z 546.3178 [M]⁺(calcd for C₂₉H₄₄O₇N₃,546.3174).

美沙达唑B₂(3):黄色固体；

UV(MeOH)λ_max(logε)279(3.80), 286(3.75)nm；ECD(MeOH):202(Δε+7.50),216(Δε+4.09)；IRν_max 3351,2957,2930,1654, 1561,1403cm^-1；for ¹H NMR and ¹³C NMR核磁数据,见表1；HRESIMS at m/z532.3016[M]⁺ (calcd for C₂₈H₄₂O₇N₃,532.3017).

实施例2化合物1，化合物2以及化合物3的结构鉴定

2.1化合物1的平面结构鉴定

高分辨质谱给出化合物1的准分子离子峰[M+H]⁺m/z546.3168(calcd 546.3174)，从而推测其分子量为545，分子式为C₂₉H₄₄N₃O₇，不饱和度为10。

红外吸收光谱分别在3340cm^-1和1563cm^-1处显示了羟基(缔合型)和强N–O伸缩振动的特征吸收带。

化合物1的DEPTQ谱(¹³C谱的一种)给出29个碳信号：包括4个甲基，9个亚甲基， 5个次甲基(三个连氧)，10个芳族碳和1个羧基(表1)。¹H–¹H COSY和相关的HMBC 信号表明结构中包含3套自旋耦合体系，它们分别是：从C-1'到C-7'的脂肪链、从C-11'到 C-14'的脂肪酸链以及从C-1”到C-5”的戊糖醇链(图2)。氢谱显示该化合物共有有4个芳香氢信号，包括H-2(δ_H9.91)、H-4(δ_H7.82)、H-7(δ_H7.86)和H-9'(δ_H6.74)。其中，在δ_C141.4 处次甲基C-2的特征性低场质子[H-2(δ_H9.91)]提示该处与氮原子相连。发明人通过关键性 HMBC信号[H-2/C-3a、C-7a]推导出存在咪唑环，同时又基于HMBC信号[H-4(δ_H7.82)/C-6、 C-7a、5-CH₃和H-7(δ_H7.86)/C-3a,C-5和6-CH₃]确定该咪唑环片段与邻二甲基苯片段稠合从而形成了5,6-二甲基苯并咪唑。另外，另一关键性的HMBC信号H₂-1”(δ_H4.66和4.41)/C-3a、 C-2表明戊糖醇侧链连接在上述5,6-二甲基苯并咪唑片段的N-3上。同样地，结合已推导出的脂肪酸链片段，发明人应用关键性HMBC信号[H-9'(δ_H6.74)/C-10'、C-11'，H-7'/C-8'、C-9' 和H-11'/C-9'、C-10']，推导出一条十四元长链脂肪酸。为满足结构的分子式和不饱和度以及特征化学位移的要求，该十四元长链脂肪酸C-8'–C-10'位置须形成异噁唑杂环且C-14'须以羧酸根的形式存在(与苯并咪唑1位N⁺形成内盐)。综上，发明人合理地确定了化合物1的平面构型，该化合物为以内盐形式存在的N-核糖醇基-5,6-二甲基苯并咪唑与C-8'–C-10'出形成异噁唑杂环十四元脂肪酸的杂合体，含有一个罕见的异噁唑–苯并咪唑的母核。

表1：化合物1–3的核磁共振数据(氢谱600MHz；碳谱150MHz)

2.2化合物2平面构型的确定

高分辨质谱给出化合物2的准分子离子峰[M+H]⁺m/z546.3178(calcd 546.3174)，其分子量也为545，分子式也为C₂₉H₄₄N₃O₇。

化合物2的DEPTQ谱给出29个信号：包括4个甲基，9个亚甲基，5个次甲基(三个连氧)，10个芳族碳和1个羧基(表1)。化合物2与化合物1分子式相同并且1D和2D核磁数据都十分相似(表1和图2)，由此发明人推测化合物2与化合物1互为非对映异构体。

2.3化合物3平面构型的确定

高分辨质谱给出化合物3的准分子离子峰[M+H]⁺m/z 532.3016(calcd532.3017)，其分子量为531，化合物的分子式为C₂₈H₄₂N₃O₇，相比化合物1和2少了一个亚甲基CH₂(14Da)。

进一步地，其HSQC，HMBC和COSY信号，证实了化合物3在C-1'处不存在异支链(图3)，这是化合物3的平面构型与化合物1和2唯一的差别。

2.4化合物1–3的立体构性的确定

发明人基于耦合常数对化合物1戊糖醇侧链进行了构型分析(J-basedconfiguration analysis，JBCA，一种确定碳链上的手性中心相对构型的经验方法，G.Bifulco,P.Dambruoso, L.Gomez-Paloma,R.Riccio,Chem.Rev.2007,107,3744-3779.)，确定了1–3戊糖基片段中 C2”–C3”–C4”处三个连续手性中心的相对构型(图4)。中等强度的³J_H2”-H3”(4.6Hz)表明 C2”和C3”之间发生了快速构象互变。基于1,2-二次甲基系统的耦合常数分析，小耦合值³J_C4”-H2”和中耦合值³J_C1”-H3”表明C2”–C3”为赤式。同样地，大耦合值²J_C3”-H4”和²J_C4”-H3”也证明C3”–C4”为赤式。此外，在相同的氘代溶剂(DMSO-d₆)中测得的核黄素的核糖醇侧链部分的¹³C化学位移和³J_HH较为吻合(Y.Hu,K.Wang,J.B.MacMillan,Org.Lett.2013,15,390-393.)。结合α-D-核糖基还原性开环生成核糖醇的生源推测(图5)，化合物1–3中的C2”–C3”–C4”的绝对构型被指定为2”S,3”S,4”R。

由于化合物1和2中均为核糖醇基，因此我们推测它们是一对由氮杂-Micheal加成反应进攻方向相反而引起的C-7'差向异构体(图6)。相反的比旋值(1为正，2为负)证实发明人的猜测。进一步地，发明人通过核磁计算以及CP3的统计学结果发现：化合物1为 7'S,2”S,3”S,4”R(核磁计算中的构型a)和化合物2为7'R,2”S,3”S,4”R(核磁计算中的构型b) 的概率为100％(图7)。因此，化合物1和2的立体构型被确定为7'S,2”S,3”S,4”R和7'R,2”S,3”S,4”R。化合物1和化合物2中C-11',C-12',C-13'位亚甲基的化学等价与否也给发明人提供了构型验证的重要线索。考虑到化合物的结构特点，发明人认为在分子内氢键作用下，化合物2结构内有稳固的刚性环形成，使得处于环上的三个亚甲基被固定进而阻止了单键旋转造成其化学不等价。为了证明这一点，发明人应用分子中的原子量子拓扑理论(quantumtopological atoms in molecules，QTAIM)，对化合物1和2的最优构象进行分析，结果显示，在化合物2中存在一个关键的分子内氢键C_9'-H···O＝C_14'-O^-促成了一个较为稳定的刚性环，位于环上的三个亚甲基受到束缚，造成化学不等价(图8)。由此也进一步证实了核磁计算得出化合物1和2构型的结论是正确的。综上，发明人确定化合物1和2的立体构型分别为 7'R,2”S,3”S,4”R和7'S,2”S,3”S,4”R，被命名为美沙达唑A₁和A₂。化合物3中C-11'，C-12'， C-13'位的3个亚甲基的化学不等价，表明其相对构型与化合物2的相同。此外，化合物3与化合物2的比旋值同为负值、ECD曲线趋势一致(图9)表明化合物3与化合物2绝对构型相同，也为7'R,2”S,3”S,4”R，被命名为美沙达唑B₂。

表2：用于NMR计算的所有构象的Boltzmann分布^a

^a加粗为每种构型的最优构象

表3：化合物1和2的实际化学位移及异构体a和b的计算化学位移

表4.化合物1和2的氢键临界点的性质

2.5量子化学计算方法

2.5.1构象搜索

将异构体的结构(a和b)，输入Multiwfn程序中，生成.xyz初始结构。通过xtb程序，在GFN0-xTB下对所有构象进行动力学模拟生成一批合理的初始构象。通过Molclus调用xtb，在GFN0-xTB下对动力学的每一帧进行批量优化，经过isostat去重排序得到一批构象(Molclus 软件中的isostat模块)，再通过Molclus调用xtb，对上述产生的每一个构象用GFN2-xTB在隐式溶剂DMSO中进行批量优化，通过isostat去重排序。通过Molclus调用Gaussian，对上一步筛选出来的构象在真空下做优化和振动分析得到较可靠的结构和自由能热校正量 (B3LYP-D3(BJ)/6-31G*)，再调用ORCA程序计算每个构象在DMSO溶剂中的单点能 (PWPB95-D3(BJ)/def2-QZVPP)，通过isostat去重排序，最终得到能量最低的一批构象。

2.5.2高精度单点能计算

使用Gaussian(以DMSO作为溶剂，以IEFPCM作为溶剂模型)，在DFT (M06-2X/def2TZVP)级别上对上述最优构象进行单点能量计算，用于分析氢键相互作用。

2.5.3核磁计算

使用GIAO方法在mPW1PW91-SCRF/6-311+G(2d,p)水平上计算出化合物1 (7'S,2”S,3”S,4”R)(异构体a)和化合物2(7'R,2”S,3”S,4”R)(异构体b)的屏蔽常数。DMSO 用作溶剂，IEFPCM用作溶剂模型。使用标度法计算化学位移，通过δ_scaled＝(δ_calc–截距)/斜率的公式来消除系统误差。

2.6化合物1和2的原子在分子中(AIM)拓扑分析

通过AIMALL软件包，对化合物1和2进行AIM分析，研究分子内氢键的性质。氢键临界点BCP处的拓扑参数(ρ，

和ε等)用于预测氢键相互作用的性质。拓扑参数的定量分析通过软件Multiwfn 3.8获得。通过软件VMD 1.9.4得到AIM拓扑分析图。在 M06-2X/def2TZVP水平上计算得到氢键结合能E。

实施例3化合物1–3的促血管生成活性测试

健康斑马鱼幼虫(AB系)和转基因品系Tg(fli1-EGFP)均由山东省科学院生物研究所提供。根据《斑马鱼手册》，将它们置于活性炭过滤的自来水封闭流通系统中，28℃下，10个小时黑暗和14个小时光照间隔培养。AB系野生型斑马鱼可用于血栓的观察。由于转基因品系斑马鱼Tg(fli1-EGFP)的内皮细胞内存在绿色荧光蛋白(GFP)的表达，可用于血管生成实验的观察。

血管生成活性的方法参照文献(M.Zhang,P.Li,F.Wang,S.Zhang,H.Li,Y.Zhang,X. Wang,K.Liu,X.Li,Food Funct.2021,12,2282-2291.)。PTK787诱导的斑马鱼节间血管(ISV) 损伤模型用于评估化合物1–3对血管生成的影响。

取同一亲代斑马鱼，收集受精卵放于28℃光照培养箱中待发育24h，胚胎脱模处理后随机分组，置于24孔板中(10枚/孔，每空培养液2mL)。首先在培养液中加入VEGFR酪氨酸激酶抑制剂PTK787(终浓度0.225μg/mL)来建立ISV损伤模型，对照组加入0.1％体积比的DMSO处理。孵育3小时后，将造模成功的斑马鱼随机分成3组，以丹红注射液处理 (终浓度9μL/mL)作为阳性对照组，以0.1％体积比的DMSO处理作为ISV损伤模型组，并分别用受试化合物1–3在10μM和25μM的两种终浓度下处理作为实验组。接下来，将斑马鱼幼虫再培养24小时，用荧光显微镜(日本Olympus IX53)拍照，并使用Image Pro Plus 5.1计算血管长度。所有处理均一式两份进行。

促血管生成活性的浓度梯度实验表明，随化合物的加药量增大，ISV相对生成率逐渐上升，10μM、25μM时，促血管生成最为显著，但随后逐渐下降。确定10μM和25μM剂量为优选。

实验结果结果表明，化合物1–3在10μM和25μM剂量下均可对PTK787诱导破坏掉的ISV进行修复，其修复能力与9μL/mL丹红注射液(阳性对照)的修复能力相当(图10， A和B)。

实施例4化合物1–3的抗血栓活性测试

抗血栓活性测试的方法参照文献(M.Zhang,P.Li,F.Wang,S.Zhang,H.Li,Y.Zhang,X. Wang,K.Liu,X.Li,Food Funct.2021,12,2282-2291.)。

在受精后72小时，选择健康的斑马鱼幼虫(AB系)，随机置于24孔板中(10枚/孔，每空培养液2mL)。阳性对照组加入阿司匹林(终浓度166μM)，实验组中分别加入化合物1–3(受试浓度10μM和25μM)，正常对照组和模型对照组中加入0.1％体积比的DMSO 处理。在光照条件下孵育6小时后，将所有组(正常对照组除外)的培养基替换为含有80μM 花生四烯酸的新鲜培养液(用于造成血栓模型)。进一步温育1小时，将斑马鱼置于暗室中，用1mg/mL的邻联二苯胺染色10分钟。

通过显微镜(×100)观察每枚斑马鱼，Image Pro Plus 5.1计算斑马鱼心脏中红细胞的染色强度(SI)。所有处理均一式两份进行。

根据以下公式评估药物的抗血栓形成作用：

治疗功效(％)＝(SI_药物–SI_模型)/(SI_对照–SI_模型)×100％。

抗血栓的浓度梯度实验表明，随化合物的加药量增大，斑马鱼心脏内红细胞逐渐增多， 10μM、25μM时，抗血栓的治疗效果较好，但随后逐渐下降。确定10μM和25μM剂量为优选。

实验结果表明，与阳性对照组阿司匹林71.1％的治疗率相比，化合物1在10μM和25μM 浓度下也对血栓具有一定的缓解作用，治疗效果分别为31.7％和59.0％(图10，C和D)。同样地，其他化合物也应具有促进血管生成和抗血栓的活性。

表5.化合物1–3的促血管生成和抗血栓作用^a

^a相对比值为加药组血管长度的模型组血管长度比值

实施例5：一种含美沙达唑A₁的促血管生成和抗血栓作用的片剂

制备方法：将美沙达唑A₁与乳糖和玉米淀粉混合，用水均匀湿润，过筛并干燥，再过筛，加入硬脂酸镁，均匀后压片，每片重240mg，美沙达唑A₁含量为1mg。

实施例6：一种含美沙达唑A₁的促血管生成和抗血栓作用的胶囊剂

制备方法：将美沙达唑A₁与乳糖和硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，每个胶囊重200mg，美沙达唑A₁含量为1mg。

实施例7：一种含美沙达唑A₁的促血管生成和抗血栓作用的注射剂

制备方法：将美沙达唑A₁和氯化钠溶解于适量的注射用水中，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中。

实施例8：

同样地，按实施例5–7所述的方法和配方以美沙达唑A₂或B₂分别制备促血管生成和抗血栓作用的片剂、胶囊、注射液；其中美沙达唑A₂或B₂的含量均为1mg。

实施例9：一种含美沙达唑类化合物(A₁、A₂、B₂)的促血管生成药物组合物

按实施例7所述的方法及相关配方将美沙达唑A₁或A₂或B₂均制成0.5mg/mL药物含量的注射剂，将制得的美沙达唑A₁或A₂或B₂注射剂分别与市售丹红注射液(Danhonginjection， DHI，国药准字Z20026866，2mL/支)以体积比1：9混合，过滤所得溶液在无菌条件下装入安瓿瓶中，即得到美沙达唑A₁或A₂或B₂与丹红注射液的药物组合物。

按实施例3的实验步骤，对上述美沙达唑A₁和丹红注射液的组合物(1+DHI)、美沙达唑A₂和丹红注射液的组合物(2+DHI)、美沙达唑B₂和丹红注射液的组合物(3+DHI)进行促血管生成活性测定，结果见图11(A和B)。显示组合物1+DHI、2+DHI、3+DHI(终浓度9μL/mL)均能显著修复PTK787造成的节间血管的损伤，其中：组合物2+DHI的修复效果优于阳性对照组(9μL/mL DHI)。

实施例10：一种含美沙达唑类化合物(A₁、A₂、B₂)的抗血栓作用药物组合物

按实施例6所述的方法及相关配方将美沙达唑A₁或A₂或B₂分别与阿司匹林(ASP)、氯吡格雷、丹参多酚酸或盐酸地尔硫卓粉末以重量比1：9混合后，取混合物1mg与197mg 乳糖和2mg硬脂酸镁混合，过筛，在合适的容器中均匀混合，把得到的混合物装入硬明胶胶囊，制得每个胶囊重200mg的药物组合物胶囊。

按实施例4的实验步骤，对上述美沙达唑A₁和阿司匹林的组合物(1+ASP)、美沙达唑 A₂和阿司匹林的组合物(2+ASP)、美沙达唑B₂和阿司匹林的组合物(3+ASP)进行抗血栓活性测定，结果见图11(C和D)。显示组合物1+ASP、2+ASP、3+ASP(终浓度6mg/mL) 均可在一定程度上增加心脏内红细胞数目，有潜在的抗血栓作用。

序列表

<110>山东大学

<120>一组美沙达唑类化合物及其制备方法和应用

<141>2021-05-12

<160>1

<210>1

<211> 1525

<212> DNA

<213>黏球菌（Myxococcus sp.）

<221>黏球菌（Myxococcus sp.）SDU36 CCTCC NO：M 2021520 16S rRNA基因核苷酸序列

<222>（1）…（1525）

agagtttgat cctggctcag aacgaacgct ggcggcgtgc ctaacacatg caagtcgagc 60

gcgaataggg gcaaccctta gtagagcggc gcacgggtgc gtaacacgtg gataatctgc 120

ctgagtgctc gggataacca gtcgaaagat tggctaatac cggataagcc cacggtctct 180

tcggagactg agggaaaagg tggcctctgt atacaagcta tcacattcag atgagtccgc 240

ggcccatcag ctagttggcg gggtaatggc ccaccaaggc aacgacgggt agctggtctg 300

agaggacgat cagccacact ggaactgaga cacggtccag actcctacgg gaggcagcag 360

tggggaattt tgcgcaatgg gcgaaagcct gacgcagcaa cgccgcgtgt gtgatgaagg 420

tctttggatt gtaaagcact ttcgaccggg aagaaaaccc gttggctaac atccaacggc 480

ttgacggtac cgggagaaga agcaccggct aactctgtgc cagcagccgc ggtaatacag 540

agggtgcaag cgttgttcgg aattattggg cgtaaagcgc gtgtaggcgg cgtgacaagt 600

cgggtgtgaa agccctcagc tcaactgagg aagtgcgccc gaaactgtcg tgcttgagtg 660

ccggagaggg tggcggaatt cccaagtaga ggtgaaattc gtagatatgg ggaggaacac 720

cggtggcgaa ggcggccacc tggacggtaa ctgacgctga gacgcgaaag cgtggggagc 780

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagaactag gtgtcgtggg 840

agttgacccc cgcggtgccg aagctaacgc attaagttct ccgcctggga agtacggtcg 900

caagactaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960

attcgacgca acgcgcagaa ccttacctgg tcttgacatc ctcagaatcc ttcagagatg 1020

agggagtgcc cgcaagggaa ctgagagaca ggtgctgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 1080

gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctc gcctttagtt gccacgcaag 1140

tggatctcta gagggactgc cggtgttaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc 1200

tcatggcctt tatgaccagg gctacacacg tgctacaatg gccggtacag agcgttgcca 1260

acccgcgagg gggagctaat cgcataaaac cggtctcagt tcagattgga gtctgcaact 1320

cgactccatg aaggaggaat cgctagtaat cgcagatcag cacgctgcgg tgaatacgtt 1380

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtc gattgctcca gaagtcatct 1440

caccaagagg tgcccaagga gtggtcggta actggggtga agtcgtaaca aggtagccgt 1500

aggggaacct gcggctggat cacct 1525

Claims (9)

1.一组美沙达唑类化合物，其特征在于：所述美沙达唑类化合物是如式(Ⅰ)所示结构的化合物之一：

其中：

7'构型 R基团 命名 化合物1 S R＝Me 美沙达唑A₁ 化合物2 R R＝Me 美沙达唑A₂ 化合物3 R R＝H 美沙达唑B₂ 化合物4 S R＝H 美沙达唑B₁

。

2.根据权利要求1所述的美沙达唑类化合物，其特征在于：所述美沙达唑类化合物是命名为美沙达唑A₁的化合物1；或是命名为美沙达唑A₂的化合物2；或是命名为美沙达唑B₂的化合物3。

3.权利要求1或2所述美沙达唑类化合物的制备方法，其特征在于：所述美沙达唑类化合物是由黏球菌(Myxococcus sp.)SDU36 CCTCC NO：M 2021520经过液体发酵后，从其发酵产物中得到。

4.权利要求1所述美沙达唑类化合物在制备促血管生成和/或抗血栓作用药物中的应用。

5.根据如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述所述美沙达唑类化合物是命名为美沙达唑A₁的化合物1；或是命名为美沙达唑A₂的化合物2；或是命名为美沙达唑B₂的化合物3。

6.一种含美沙达唑类化合物的促血管生成药物，其特征在于：所述药物含有治疗有效量的美沙达唑类化合物和药学上可接受的载体。

7.一种含美沙达唑类化合物的抗血栓作用药物，其特征在于：所述药物含有治疗有效量的美沙达唑类化合物和药学上可接受的载体。

8.一种含美沙达唑类化合物的促血管生成药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是治疗有效量的美沙达唑类化合物与治疗有效量的丹红注射液、丹参素钠中的一种或其任意组合制备的促血管生成药物组合物。

9.一种含美沙达唑类化合物的抗血栓作用药物组合物，其特征在于：所述药物组合物是治疗有效量的美沙达唑类化合物与治疗有效量的阿司匹林、氯吡格雷、丹参多酚酸、盐酸地尔硫卓、血栓通、血塞通中的一种或其任意组合制备的抗血栓作用药物组合物。

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