CN113402447A - 一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物，所述sEH抑制剂具有式I所示的结构。本发明提供的sEH抑制剂可以稳定具有广泛生理活性的内源性物质环氧脂肪酸，对人重组sEH具有很强的抑制作用，能够通过调节多种促炎性细胞因子的生成、减轻内质网应激、预防或逆转内皮功能紊乱、稳定线粒体功能多种作用机制来显著缓解神经病理性疼痛，还可以有效避免靶点相关的不良反应。而且，本发明提供的sEH抑制剂结构中不含游离的羧基，可以避免口服给药导致的胃肠道刺激等不良反应，不良反应小，生物利用度高，镇痛效果优异且给药剂量小。

Description

一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

可溶性环氧化物水解酶(sEH)在哺乳动物组织中广泛存在，尤其是肝脏、肾脏、肺、肠道和血管中的表达较高。sEH抑制剂可以稳定具有广泛生理活性的内源性物质环氧脂肪酸(EETs)，EETs是一类具有强大生物活性的内生性脂质环氧化合物，作为内皮衍生的超级化因子的主要成分，具有抗炎、镇痛、抗凋亡、抗纤维化、抗缺血的作用，同时显示出对心、肺、肾和大脑等器官的保护作用。因而，sEH抑制剂受到广泛关注。

目前，sEH抑制剂的中心药效基团包括但酰胺、氨基甲酸酯和脲。sEH抑制剂在靶标酶上的滞留时间(t_1/2)是影响体内功效的最重要参数之一，具有长滞留时间的抑制剂对靶标酶的作用时间长，在体内转化的功效长。然而，上述sEH抑制剂的滞留时间短，体内功效不佳。

发明内容

本发明的目的在于提供一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物及其制备方法和应用，本发明提供的sEH抑制剂在体内滞留时间长，含sEH抑制剂的药物对于sET介导的疾病的治疗效果优异。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物，所述sEH抑制剂具有式Ⅰ所示结构：

所述药学上可接受的组合物中的组合物包括氘代物和水合物中的一种或几种。

本发明提供了上述技术方案所述sEH抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述化合物Ⅱ、氯代试剂、催化剂和可溶化合物Ⅱ溶剂混合后进行氯代反应，得到酰氯中间体；将所述酰氯中间体、氨溶液、冰和可溶酰氯中间体溶液混合，进行酰化反应，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂；

优选的，所述化合物Ⅱ、氯代试剂和氨溶液中的氨的摩尔比为1：1.05～2：5～20。

优选的，所述氯代反应的温度为0～80℃，时间为0.5～6h；

所述酰化反应的温度为-10～0℃，时间为2～10h。

优选的，所述化合物Ⅱ的制备方法包括以下步骤：

(1)将化合物1、(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和可溶化合物1溶剂混合后进行酰化反应，得到化合物2；

(2)将所述化合物2、金属还原剂、酸性试剂和可溶化合物2溶剂混合后进行还原反应，得到化合物3；

(3)将所述化合物3、固体光气、有机碱和可溶化合物3溶剂混合后进行亲核取代-消除反应得到异氰酸酯中间体溶液；将所述异氰酸酯中间体溶液、美金刚和可溶美金刚溶剂混合后进行亲核取代反应，得到化合物4；

(4)将所述化合物4进行水解，得到化合物Ⅱ；

优选的，步骤(1)中，所述化合物1和(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的摩尔比为1：1～1.5；所述酰化反应的温度为0～40℃，时间为0.1～6h；

步骤(2)中，所述金属还原剂包括铁和/或锌；所述化合物2和金属还原剂的摩尔比为1：3.3～5；所述还原反应的温度为50～100℃，时间为0.1～6h；

步骤(3)中，所述化合物3、固体光气和美金刚的摩尔比为1：0.34～1：1～1.5；所述亲核取代-消除反应的温度为-10～30℃，时间为0.5～4h；所述亲核取代反应的温度为-10～30℃，时间为0.5～4h。

本发明提供了上述技术方案所述的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物或上述技术方案所述制备方法制备的sEH抑制剂在制备治疗sEH介导疾病的药物中的应用。

优选的，所述sEH介导疾病包括疼痛、炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病或肾病。

优选的，所述疼痛包括神经性疼痛、炎性疼痛或癌性疼痛；

所述炎症包括脓毒症、神经炎症、炎症性肠病、慢性消化性溃疡或关节炎；

所述心血管疾病包括高血压、心肌病、中风或动脉粥样硬化；

所述神经退行性疾病包括帕金森综合征、阿尔兹海默病、亨廷顿病或肌萎缩性侧索硬化症；

所述代谢性疾病包括糖尿病或痛风。

本发明提供了一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物，所述sEH抑制剂具有式I所示的结构，化学名称为(S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酰胺。阿片类阵痛药物不仅可以与外周神经阿片受体相结合，又可以与位于人体内脊髓背角胶状质(第二层)感觉神经元内的阿片受体相结合，同时还可以抑制P物质的释放，从而有效阻止疼痛的感觉传入大脑内；阿片类物质还可以作用于人体的大脑和脑干等组织当中的疼痛中枢系统，从而发挥较强的下行性疼痛抑制作用。非甾体抗炎药主要是通过抑制环氧化酶，减少炎性介质前列腺素的生成，产生抗炎、镇痛、解热的作用。离子通道在痛觉产生和疼痛处理中起着关键性作用，是调节神经病理性疼痛的主要靶点，抗癫痫药主要作用于离子通道，降低神经元兴奋性，增加膜稳定性进而调节神经元的过度放电，从而降低痛感。而本发明提供的sEH抑制剂可以稳定具有广泛生理活性的内源性物质环氧脂肪酸(EETs)，对人重组sEH具有很强的抑制作用，能够通过调节多种促炎性细胞因子的生成、减轻内质网应激、预防或逆转内皮功能紊乱、稳定线粒体功能多种作用机制来显著缓解神经病理性疼痛，作用机制与阿片类镇痛药、非甾体抗炎药、抗癫痫药等完全不同；本发明提供的sEH抑制剂可以有效避免靶点相关的不良反应。而且，本发明提供的sEH抑制剂结构中不含游离的羧基，可以避免口服给药导致的胃肠道刺激等不良反应；而且，本发明提供的具有式I所示的sEH抑制结构中含有氟原子可以提高化合物的代谢稳定性；此外，美金刚结构中的3,5-二甲基可以增强与sEH的结合，代谢稳定性优于金刚烷结构，综上分析式I所示的结构在体内滞留时间较长。

如实施例结果所示，本发明提供的sEH抑制剂对重组人源sEH的半数抑制浓度为纳摩尔水平；在人和大鼠肝微粒体中的半衰期(t_1/2)分别为174min和120min，体内滞留时间长；在小鼠口服给药6g/kg后没有显示出任何毒性和不良反应；经静脉注射给予SD大鼠10mg/kg的sEH抑制剂7min后，sEH抑制剂的血药浓度达到峰值667631.2ng/L；药时曲线AUC_0-4下的总暴露量为561131.7ng·h/L，半衰期为0.795h；口服给予SD大鼠50mg/kg后，达峰时间为2小时，药时曲线AUC_0-4下的总暴露量884275.33ng·h/L，半衰期为2.228h；sEH抑制剂的绝对生物利用度为31.52％；在大鼠神经病理性疼痛模型中表现出很强的镇痛效果，起效快于加巴喷丁，连续给药后的镇痛效果与优于加巴喷丁，且摩尔给药剂量仅为加巴喷丁的六分之一。说明，本发明提供的sEH抑制剂在体内滞留时间长，体内功效长，含sEH抑制剂的药物对于sEH介导的疾病的治疗效果优异；而且，sEH抑制剂的副作用小，生物利用度高，镇痛效果优异且给药剂量小。

本发明提供的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物的制备方法，本发明提供的制备方法，操作简单，产率高，适宜工业化生产。

附图说明

图1为测试例3中尾静脉注射和灌胃给药后的药时曲线；

图2为测试例4中对照组与给药组小鼠体重比较结果；

图3为测试例5中爪收缩阈值比较结果，其中a为对照组与各给药组爪收缩阈值比较结果，b为给药前对照组与各给药组爪收缩阈值比较结果；

图4为测试例5中模型组与各给药组爪收缩阈值比较结果；

图5为测试例5中最后一次给药后的药物时效曲线。

具体实施方式

本发明提供了一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物，所述sEH抑制剂具有式Ⅰ所示结构：

在本发明中，所述药学上可接受的组合物中的组合物包括氘代物、和水合物中的一种或几种，优选包括药学上可接受的氘代物和药学上可接受的水合物。在本发明中，所述氘代物优选为式I中的氨甲酰基、哌啶环以及3,5-二甲基上的氢原子被取代为氘。在本发明中，所述药学上可接受的水合物优选为1～5水合物。

本发明提供了上述技术方案所述sEH抑制剂的制备方法，包括以下步骤：

将所述化合物Ⅱ、氯代试剂、催化剂和可溶化合物Ⅱ溶剂混合后进行氯代反应，得到酰氯中间体；将所述酰氯中间体、氨溶液、冰和可溶酰氯中间体溶液混合，进行酰化反应，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂；

在本发明中，若无特殊说明，所有的原料组分均为本领域技术人员熟知的市售商品。

在本发明中，所述化合物Ⅱ的制备方法优选包括以下步骤：

(1)将化合物1、(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和可溶化合物1溶剂混合后进行酰化反应，得到化合物2；

(2)将所述化合物2、金属还原剂、酸性试剂和可溶化合物2溶剂混合后进行还原反应，得到化合物3；

(3)将所述化合物3、固体光气、有机碱和可溶化合物3溶剂混合后进行亲核取代-消除反应，得到异氰酸酯中间体溶液；将所述异氰酸酯中间体溶液、美金刚和可溶美金刚溶剂混合后进行亲核取代反应，得到化合物4；

(4)将所述化合物4进行水解，得到化合物Ⅱ；

本发明将化合物1、(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和可溶化合物1溶剂混合后进行酰化反应，得到化合物2((S)-1-(4-硝基-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯)。

在本发明中，所述化合物1(3-氟-4-硝基苯甲酰氯)的制备方法优选包括以下步骤：将3-氟-4-硝基苯甲酸、催化剂、氯代试剂和可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂混合后进行氯代反应，得到化合物1(3-氟-4-硝基苯甲酰氯)。

在本发明中，所述催化剂优选包括路易斯酸和/或路易斯碱；所述路易斯酸优选包括氯化锌、三氯化铝、三氟化硼、三氯化铁和氯化锡中的一种或几种；所述路易斯碱优选包括N,N-二甲基甲酰胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。在本发明中，所述氯代试剂优选包括氯化亚砜、草酰氯、三氯氧磷、三氯化磷和五氯化磷中的一种或几种。在本发明中，所述3-氟-4-硝基苯甲酸、催化剂和氯代试剂的摩尔比优选为1：1.05～3：0.001～0.2，更优选为1：1.1～1.5：0.001～0.1。在本发明中，所述可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、甲苯、四氢呋喃或氯代试剂；所述可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂优选为干燥可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂；本发明对于所述可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂的用量没有特殊限定，能够将3-氟-4-硝基苯甲酸溶解即可；在本发明的实施例中，所述3-氟-4-硝基苯甲酸的物质的量和可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂的0.14mol：200mL。

在本发明中，所述混合的顺序优选为将3-氟-4-硝基苯甲酸、催化剂和部分可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂混合，得到混合溶液；将氯代试剂和剩余可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂混合，得到3-氟-4-硝基苯甲酸溶液；将所述3-氟-4-硝基苯甲酸溶液滴加到所述混合溶液中；本发明对于所述部分可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂的用量没有特殊限定，能够将3-氟-4-硝基苯甲酸溶解即可；在本发明的实施例中，所述3-氟-4-硝基苯甲酸的物质的量和部分可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂体积之比优选为0.14mol：150mL；本发明对于所述剩余可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂用量没有特殊限定，能够将氯代试剂溶解即可；在本发明的实施例中，所述氯代试剂的物质的量和剩余可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂体积之比优选为0.16mol：50mL。本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。

在本发明中，所述氯代反应的温度优选为0～80℃，更优选为30～60℃；所述氯代反应的时间优选为0.1～6h，更优选为1～2h；所述氯代反应过程中，3-氟-4-硝基苯甲酸与氯代试剂反应生成化合物1。

所述氯代反应后，本发明优选还包括将所述氯代反应的体系进行浓缩至恒重，得到化合物1；所述浓缩的方式优选为减压蒸馏。

在本发明中，所述化合物1和(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的摩尔比优选为1：1～1.5，更优选为1：1.2～1.3。在本发明中，所述有机碱优选包括三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。在本发明中，所述化合物1和有机碱的摩尔比优选为1：2～4，更优选为1：2.5～3。在本发明中，所述可溶化合物1溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、甲苯或四氢呋喃；本发明对于所述可溶化合物1溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物1溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物1的物质的量和部分可溶3-氟-4-硝基苯甲酸溶剂体积之比优选为0.14mol：250mL。

在本发明中，所述化合物1、(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和可溶化合物1溶剂混合优选为将化合物1溶解于部分可溶化合物1溶剂中，得到化合物1溶液；将(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和剩余可溶化合物1溶剂混合，得到混合溶液；将所述化合物1溶液滴加到所述混合溶剂中。本发明对于所述部分可溶化合物1溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物1溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物1的物质的量和部分可溶化合物1溶剂体积之比优选为0.14mol：100mL；本发明对于所述剩余可溶化合物1溶剂用量没有特殊限定，能够将(S)-哌啶-3-甲酸乙酯溶解即可；在本发明的实施例中，所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量和剩余可溶化合物1溶剂体积之比优选为0.14mol：50mL。本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。

在本发明中，所述酰化反应的温度优选为0～40℃，更优选为室温；所述酰化反应的时间优选为0.1～6h，更优选为0.5～1h。在本发明中，所述酰化反应过程中发生的反应如下：

所述酰化反应后，本发明优选还包括将所述酰化反应的体系进行固液分离，得到液体组分和固体组分；将所得固体产物洗涤至无色，将固液分离所得液体组分和洗涤所得液体组分后依次进行浓缩、水萃取和有机溶剂萃取，合并有机相后依次进行盐酸溶液洗涤、水洗和饱和食盐水洗，将所得有机相浓缩至恒重，得到化合物2。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压蒸馏。在本发明中，所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量与萃取用水的体积与之比优选为0.14mol：200mL。在本发明中，所述有机溶剂萃取用有机溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、甲苯或四氢呋喃；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～3次；所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量与单次萃取用有机溶剂的体积与之比优选为0.14mol：250mL。在本发明中，所述盐酸溶液的浓度优选为1～6mol/L，跟更优选为1mol/L；所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量与盐酸溶液的体积与之比优选为0.14mol：270mL。在本发明中，所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量与水洗用水的体积与之比优选为0.14mol：200mL。在本发明中，所述(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的物质的量与饱和食盐水的体积与之比优选为0.14mol：200mL。

得到化合物2后，本发明将所述化合物2、金属还原剂、酸性试剂和可溶化合物2溶剂混合后进行还原反应，得到化合物3((S)-1-(4-3-氟氨基苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯)。

在本发明中，所述金属还原剂优选包括铁和/或锌；所述酸性试剂优选包括氯化铵、醋酸和盐酸中的一种或几种；所述盐酸优选以盐酸溶液形式使用；所述盐酸溶液的浓度优选为0.1～6，更优选为0.5～1。在本发明中，所述化合物2、金属还原剂和酸性试剂的摩尔比为1：3.3～5：5～20，更优选为1：4～4.5：10～15。在本发明中，所述可溶化合物2溶剂优选为醇水溶液；所述醇水溶液中的醇优选包括甲醇和/或乙醇，所述醇水溶液中醇和水的体积比优选为1：0.3～2，更优选为1：0.8～1.2。本发明对于所述部分可溶化合物1溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物2溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物2的物质的量和可溶化合物2溶剂体积之比优选为0.14mol：400mL。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。

在本发明中，所述还原反应的温度优选为50～100℃，更优选为60～80℃；所述还原反应时间优选为0.1～6h，更优选为0.25～1h。在本发明中，所述还原反应过程中发生的反应如下：

所述还原反应后，本发明优选还包括将所述还原反应的体系冷却至室温后硅藻土抽滤，得到抽滤液和滤饼，将所述滤饼进行醇洗，得到醇洗液；将所述抽滤液和醇洗液合并后减压浓缩以除去醇；将所得浓缩物依次进行有机溶剂萃取、水洗、饱和食盐水洗、干燥剂干燥、抽滤除去干燥剂、减压浓缩和硅胶柱层析纯化，得到化合物3。在本发明中，所述硅藻土抽滤用的硅藻土的粒度优选为200～300目。在本发明中，所述醇洗用醇优选包括乙醇、甲醇或异丙醇；所述醇洗的方式优选为醇淋洗；所述化合物2的物质的量和醇的体积之比优选为0.14mol：50mL。在本发明中，所述萃取用有机溶剂优选包括乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基异丁酮或正丁醇；所述有机溶剂萃取的次数优选为2～3次；所述化合物2的物质的量和有机溶剂的体积之比优选为0.14mol：200mL。在本发明中，所述化合物2的物质的量和水洗用水的体积之比优选为0.14mol：200mL。在本发明中，所述化合物2的物质的量和饱和食盐水的体积之比优选为0.14mol：200mL。在本发明中所述干燥剂优选包括无水硫酸钠或无水硫酸镁。在本发明中，所述硅胶柱层析纯化过程中，粗产物和上样用硅胶的质量比优选为1：1～3，更优选为1:1.5，粗产物和硅胶柱中装入的硅胶的质量比优选为1：2～10，更优选为1:5；在本发明中，所述硅胶柱层析纯化采用的洗脱剂优选为乙酸乙酯(EA)和石油醚(PE)，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：1～20，更优选为1:5。

得到化合物3后，本发明将所述化合物3、固体光气、有机碱和可溶化合物3溶剂混合后进行亲核取代-消除反应，得到异氰酸酯中间体溶液；将所述异氰酸酯中间体溶液、美金刚和可溶美金刚溶剂混合后进行亲核取代，得到化合物4((S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯)。

得到化合物3后，本发明将所述化合物3、固体光气、有机碱和可溶化合物3溶剂混合后进行亲核取代-消除反应，得到异氰酸酯中间体溶液。在本发明中，所述有机碱优选包括三乙胺、N,N-二异丙基乙胺、吡啶和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。在本发明中，所述化合物3、固体光气、有机碱和美金刚的摩尔比为1：0.34～1：4～10：1～1.5，更优选为1：0.5～0.8：5～8：1.2～1.3。在本发明中，所述可溶化合物3溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、甲苯或四氢呋喃；所述可溶化合物3溶剂优选为干燥溶剂；本发明对于所述可溶化合物3溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物3溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物3的物质的量和可溶化合物3溶剂体积之比优选为0.076mol：800mL。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述混合的顺序优选为将固体光气溶解于第一部分可溶化合物3溶剂中，得到固体光气溶液；将有机碱溶解于第二部分可溶化合物3溶剂中，得到有机碱溶液；将化合物3溶解于剩余可溶化合物3溶剂中，冰盐浴降温至0℃以下后加入固体光气溶液，然后滴加有机碱溶液。在本发明中，所述固体光气的物质的量和第一部分可溶化合物3溶剂体积之比优选为0.038mol：100mL；所述有机碱的物质的量和第二部分可溶化合物3溶剂体积之比优选为0.46mol：100mL；所述化合物3的物质的量和剩余可溶化合物3溶剂体积之比优选为0.076mol：600mL。在本发明中，所述降温后的温度优选为优选为-20～0℃；本发明对于所述冰盐浴中的盐没有特殊限定，冰盐浴的温度能够达到-20℃即可，具体如氯化钠。在本发明中，所述羰基化反应的温度优选为-10～30℃，更优选为-5～0℃；所述亲核取代-消除的时间优选为0.5～4h，更优选为1～3h。

得到异氰酸酯中间体溶液后，本发明将所述异氰酸酯中间体溶液、美金刚和可溶美金刚溶剂混合后进行亲核取代，得到化合物4。在本发明中，所述可溶美金刚溶剂优选包括二氯甲烷、氯仿、丙酮、乙腈、甲苯或四氢呋喃；所述美金刚的物质的量和可溶美金刚溶剂体积之比优选为0.076mol：100mL。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述亲核取代的温度优选为-10～30℃，更优选为-5～0℃；所述亲核取代的时间优选为0.5～4h，更优选为1～3h。在本发明中，所述亲核取代-消除和亲核取代过程中发生的反应如下：

所述成脲反应后，本发明将所述成脲反应体系浓缩至恒重，得到化合物4。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压蒸馏。

得到化合物4后，本发明将所述化合物4进行水解，得到化合物Ⅱ((S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸)。

在本发明中，所述水解优选在无机碱存在条件下进行，所述无机碱优选包括氢氧化物和/或碳酸盐；所述氢氧化物优选包括氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾中的一种或几种；所述碳酸盐优选包括碳酸钾和/或碳酸钠。在本发明中，所述化合物4和无机碱的摩尔比优选为1：3～20，更优选为1：5～10。在本发明中，所述水解用溶剂优选包括有机溶剂/水的混合溶剂；所述混合溶剂中的有机溶剂优选包括甲醇、乙醇、四氢呋喃、丙酮或乙腈；所述混合溶剂中有机溶剂和水的体积比优选为1：0.2～5，更优选为1：1～3；本发明对于所述水解用溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物4溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物4的物质的量和水解用溶剂体积之比优选为0.079mol：400mL。

在本发明中，所述水解反应的温度优选为5～100℃，更优选为20～50℃；所述水解反应的时间优选为0.5～5h，更优选为1～2h。在本发明中，所述水解反应过程中，发生的反应如下：

所述水解反应后，本发明优选包括将所述水解反应的体系浓缩，在所得浓缩物中加入水后冰盐浴降温至0℃以下，酸化后固液分离，将所得固体产物进行水洗后干燥，得到化合物Ⅱ。在本发明中，所述化合物4的物质的量和加入的水的体积之比优选为0.079mol：500mL。在本发明中，所述降温后的温度优选为优选为-20～0℃；本发明对于所述冰盐浴中的盐没有特殊限定，冰盐浴的温度能够达到-20℃即可，具体如氯化钠。在本发明中，所述酸化采用的无机酸优选包括盐酸、硫酸或磷酸；所述酸优选以酸溶剂形式使用；所述酸溶液的浓度优选为0.5～12mol/L，更优选为6mol/L；所述酸化后的pH值优选为1～6，更优选为3。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。在本发明中，所述水洗优选为水淋洗；所述化合物4的物质的量和水洗用水的体积之比优选为0.079mol：100mL。在本发明中，所述干燥的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃；所述干燥的时间优选为1～12h，更优选为4～8h。

得到化合物Ⅱ后，本发明将所述化合物Ⅱ、氯代试剂、催化剂和可溶化合物Ⅱ溶剂混合后进行氯代反应，得到酰氯中间体；将所述酰氯中间体、氨溶液、冰和可溶酰氯中间体溶液混合，进行酰化反应，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂((S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酰胺)。

得到化合物Ⅱ后，本发明将所述化合物Ⅱ、氯代试剂、催化剂和可溶化合物Ⅱ溶剂混合后进行氯代反应，得到酰氯中间体。在本发明中，所述氯代试剂优选包括氯化亚砜、草酰氯、三氯氧磷、三氯化磷和五氯化磷中的一种或几种。在本发明中，所述催化剂优选包括路易斯酸和/或路易斯碱；所述路易斯酸优选包括氯化锌、三氯化铝、三氟化硼、三氯化铁和氯化锡中的一种或几种；所述路易斯碱优选包括N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、吡啶和4-二甲氨基吡啶中的一种或几种。在本发明中，所述化合物Ⅱ、氯代试剂和催化剂的摩尔比优选为1：1.05～2：0.001～0.01，更优选为1：1.2～1.5：0.005～0.008。在本发明中，所述可溶化合物Ⅱ溶剂优选包括优选包括氯代烃类溶剂、杂环类溶剂或腈类溶剂；所述氯代烃类溶剂优选包括二氯甲烷或氯仿；所述杂环类溶剂优选包括四氢呋喃或二氧六环；所述腈类溶剂优选包括乙腈；所述可溶化合物Ⅱ溶剂优选为干燥溶剂；本发明对于所述可溶化合物Ⅱ溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物Ⅱ溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物Ⅱ的物质的量和可溶化合物Ⅱ溶剂的0.075mol：280mL。在本发明中，所述混合的顺序优选为将化合物Ⅱ、催化剂和部分可溶化合物Ⅱ溶剂混合，得到混合溶液；将氯代试剂和剩余可溶化合物Ⅱ溶剂混合，得到化合物Ⅱ溶液；将所述化合物Ⅱ溶液滴加到所述混合溶液中；本发明对于所述部分可溶化合物Ⅱ溶剂的用量没有特殊限定，能够将化合物Ⅱ溶解即可；在本发明的实施例中，所述化合物Ⅱ的物质的量和部分可溶化合物Ⅱ溶剂体积之比优选为0.075mol：250mL；本发明对于所述剩余可溶化合物Ⅱ溶剂用量没有特殊限定，能够将氯代试剂溶解即可；在本发明的实施例中，所述氯代试剂的物质的量和剩余可溶化合物Ⅱ溶剂体积之比优选为0.094mol：50mL。本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可。在本发明中，所述氯代反应的温度优选为0～80℃，更优选为室温；所述氯代反应的时间优选为0.1～6h，更优选为1～2h；所述氯代反应过程中，化合物Ⅱ与氯代试剂反应生成酰氯中间体。所述氯代反应后，本发明优选还包括将所述氯代反应的体系进行浓缩至恒重，得到酰氯中间体；所述浓缩的方式优选为减压蒸馏。

得到酰氯中间体；将所述酰氯中间体、氨溶液、冰和可溶酰氯中间体溶液混合，进行酰化反应，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂。在本发明中，所述氨溶液中溶剂优选包括水、醇类溶剂、醚类溶剂、氯代烃类溶剂、酯类溶剂、杂环类溶剂、腈类溶剂或酮类溶剂；所述醇类溶剂优选包括甲醇或乙醇；所述醚类溶剂优选包括乙醚；所述氯代烃类溶剂优选包括二氯甲烷或氯仿；所述酯类溶剂优选包括乙酸乙酯；所述杂环类溶剂优选包括四氢呋喃或二氧六环；所述腈类溶剂优选包括乙腈；所述酮类溶剂优选包括丙酮；所述氨溶液的质量浓度优选为5～28％，更优选为10～20％。在本发明中，所述化合物Ⅱ和氨溶液中的氨的摩尔比优选为1：5～20，更优选为1：10～15。在本发明中，所述可溶酰氯中间体溶剂优选包括氯代烃类溶剂或杂环类溶剂；所述氯代烃类溶剂优选包括二氯甲烷或氯仿；所述杂环类溶剂优选包括四氢呋喃或二氧六环；所述可溶酰氯中间体溶剂优选为干燥溶剂；本发明对于所述酰氯中间体溶剂用量没有特殊限定，能够将酰氯中间体溶解即可；在本发明的实施例中，所述酰氯中间体的物质的量和可溶酰氯中间体溶剂体积之比优选为0.075mol：200mL。在本发明中，所述混合的方式优选为搅拌混合，本发明对于所述搅拌混合的速度和时间没有特殊限定，能够将原料混合均匀即可；所述混合的顺序优选为将酰氯中间体溶剂于可溶酰氯中间体溶剂中，得到酰氯中间体溶液；将氨溶液和冰在冰浴中降温至0℃后滴加所述酰氯中间体溶液；本发明对于所述滴加的速度没有特殊限定，匀速逐滴加入即可。在本发明中，所述成脲反应的温度优选为-10～0℃，更优选为-5～-2℃；所述成脲反应的时间优选为2～10h，更优选为5～8h。在本发明中，所述氯代反应和成脲反应过程中发生的反应如下：

所述酰化反应后，本发明优选还包括将所述酰化反应的体系分层，将所得有机相浓缩至恒重，在所得浓缩物中加入水进行搅拌，固液分离，将所得固体产物进行干燥，将所得粗产物进行硅胶柱层析纯化，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂。在本发明中，所述浓缩的方式优选为减压蒸馏。在本发明中，所述化合物Ⅱ的物质的量和加入的水的体积之比优选为0.075mol：500mL；本发明对于所述搅拌的速度和时间没有特殊限定，能够均匀分散，液体不飞溅即可。本发明对于所述固液分离的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体如抽滤。在本发明中，所述干燥的温度优选为10～40℃，更优选为20～30℃；所述干燥的时间优选为1～12h，更优选为4～8h。在本发明中，所述硅胶柱层析纯化过程中，粗产物和上样用硅胶的质量比优选为1：1～3，更优选为1:1.5，粗产物和硅胶柱中装入的硅胶的质量比优选为1：2～10，更优选为1:5；所述硅胶柱层析纯化采用的洗脱剂优选为乙酸乙酯(EA)和石油醚(PE)，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1：1～20，更优选为1:5～10。

本发明提供了上述技术方案所述的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物或上述技术方案所述制备方法制备的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物在制备治疗sEH介导疾病的药物中的应用。

在本发明中，所述sEH介导疾病优选包括疼痛、炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病或肾病。在本发明中，所述疼痛包括神经性疼痛、炎性疼痛或癌性疼痛。在本发明中，所述炎症包括脓毒症、神经炎症、炎症性肠病、慢性消化性溃疡或关节炎。在本发明中，所述心血管疾病包括高血压、心肌病、中风或动脉粥样硬化。在本发明中，所述神经退行性疾病包括帕金森综合征、阿尔兹海默病、亨廷顿病或肌萎缩性侧索硬化症。在本发明中，所述代谢性疾病包括糖尿病或痛风。

在本发明中，所述sEH抑制剂的有效剂量优选根据不同的疾病和患者的病症确定，具体优选为10～500mg。

在本发明中，所述sEH抑制剂的制剂的给药频率优选根据治疗方案确定，具体优选包括每周一次、每5天一次、每3天一次、每2天一次、每天一次、每天两次、每天三次、每天四次、每天五次、每小时一次或者任何更高的频率。

在本发明中，所述sEH抑制剂给药方式优选包括口服、注射或输液；所述给药部位优选取决于患者的病状和病症，具体优选包括胃肠外(包括皮下、肌肉、静脉内、关节内和髓内)、腹膜内、透过黏膜、经皮、直肠和局部(包括皮肤、舌下和眼内)。

在本发明中，所述sEH抑制剂的剂型优选包括片剂、胶囊剂、口服酊膏剂、口服丸剂、口服颗粒、口服粉、口服散剂、外用酊、外用膏、外用贴、外用粉剂、外用涂剂、栓剂或注射剂；所述的片剂优选包括肠溶片、包衣片、薄膜衣片、糖衣片、浸膏片、分散片、划痕片、缓释片、缓释包衣片或控释片；所述胶囊剂优选包括硬胶囊、软胶囊(胶丸)、肠溶胶囊、缓释胶囊或控释胶囊；所述口服酊膏剂优选包括口服溶液剂、口服混悬剂、口服乳剂、胶浆剂、口服液、乳液、乳剂、胶体溶液、合剂、酊剂、滴剂或混悬滴剂；所述的口服丸剂优选包括大丸剂、滴丸或蜜丸；所述口服粒、口服粉和口服散剂独立地包括包括颗粒剂、肠溶颗粒剂、干混悬剂、吸入性粉剂、干粉剂、干粉吸入剂、粉末吸入剂、干粉吸剂、散剂、药粉或粉剂；所述粉优选包括、所述的散剂包括、所述的外用酊、外用膏、外用贴和外用粉剂独立地优选包括软膏剂、乳膏剂、霜剂、糊剂、油膏剂、硬膏剂、亲水硬膏剂、乳胶剂、凝胶剂、贴剂、贴膏剂、膜剂、透皮贴剂、滴眼剂、滴眼液、滴耳剂、滴耳液、滴鼻剂、滴鼻液、散剂、粉剂、撒布剂或撒粉；所述外用涂剂和栓剂独立地优选包括栓剂、肛门栓、阴道栓、涂剂、涂膜剂或涂布剂；所述注射剂优选包括注射液、注射用溶液剂、静脉滴注用注射液、注射用混悬液、注射用无菌粉末、静脉注射针剂、水针、注射用乳剂、粉针剂、针剂、无菌粉针或冻干粉针。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)(S)-1-(3-氟-4-硝基苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯(化合物2)的制备

向500mL单口瓶中加入0.14mol 3-氟-4-硝基苯甲酸、150mL干燥的四氢呋喃和0.014mol DMF，得到混合溶剂；将0.16mol氯化亚砜溶解于50mL干燥的四氢呋喃中，得到氯化亚砜溶液；在搅拌条件下将所述氯化亚砜溶液滴加到所述混合溶液中，滴加完毕后升温至60℃氯代反应3h，减压蒸馏除去四氢呋喃和残余的氯化亚砜至恒重，得到3-氟-4-硝基苯酰氯溶解于100mL干燥的四氢呋喃中，得到3-氟-4-硝基苯酰氯溶液。

在搅拌条件下，向500mL三口瓶中加入0.14mol(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、0.41mol三乙胺和150mL干燥的四氢呋喃，冰浴降温至0℃后滴加3-氟-4-硝基苯甲酰氯溶液，滴加完毕后酰化反应10min，抽滤，得到抽滤液和滤饼，将所述滤饼用50mL四氢呋喃洗至无色，将所得滤液和所述抽滤液合并后经减压浓缩除去四氢呋喃，向所得浓缩物中加200mL水搅拌，乙酸乙酯萃取2次，单次萃取用乙酸乙酯体积为250mL，合并有机相后用270mL浓度为1mol/L的盐酸溶液洗，200mL水洗，200mL饱和食盐水洗，将所得有机相减压浓缩至恒重，得到化合物2(棕红色油状物，50.2g)。化合物2的结构表征数据：¹HNMR(400MHz,CDCl₃):δ8.11(t,J＝8.08Hz,1H),7.33-7.31(m,2H),4.52(s,0.5H),4.16(s,2.5H),3.57-3.13(m,3H),2.60-2.46(m,1H),2.10(s,1H),1.81(dd,J＝9.32Hz,4.36Hz,2H),1.60(s,1H),1.26(s,3H).ESI-MS:m/z 325.1[M+H]⁺,347.0[M+Na]⁺。

(2)(S)-1-(4-氨基-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯(化合物3)的制备

向1L单口瓶中加入0.14mol化合物2、0.45mol铁粉、0.68mol氯化铵、200mL乙醇和200mL水，在80℃条件下回流还原反应20min后，将反应液冷却至室温，硅藻土抽滤，得到抽滤液和滤饼，将所述滤饼用50mL乙醇淋洗，将所得滤液与所述抽滤液合并后减压浓缩以除去乙醇，将所得浓缩物用乙酸乙酯萃取2次，单次萃取用乙酸乙酯的体积为200mL，200mL水洗，200mL饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，抽滤除去无水硫酸镁，滤液经减压浓缩至恒重，得到粗品(37.4g)，将所得粗品进行硅胶柱层析纯化，硅胶柱层析纯化过程中，粗产物和上样用硅胶的质量比为1:1.5，粗产物和硅胶柱中装入的硅胶的质量比为1:5；所述硅胶柱层析纯化采用的洗脱剂优选为EA和PE，EA和PE的体积比为1:5，得到化合物3(26.05g，步骤(1)和步骤(2)的总收率65.6％)。化合物3的结构表征数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ7.10(dd,J＝11.28Hz,1.76Hz,1H),δ7.03(dd,J＝8.08Hz,1.4Hz,1H),6.76(t,J＝8.48Hz,1H),4.28(s,0.5H),4.13(q,J＝7.08Hz,2H),4.02(s,0.5H),3.51(s,2H),3.19(t,J＝10.8Hz,1H),3.04(td,J＝12.44Hz,1.96Hz,1H),2.54-2.49(m,1H),2.14-2.08(m,1H),1.80-1.68(m,2H),1.57-1.51(m,1H),1.24(t,J＝7.08Hz,4H)ESI-MS:m/z295.1[M+H]⁺,317.1[M+Na]⁺。

(3)(S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸乙酯(化合物4)的制备

向1L三口瓶中加入0.076mol化合物3和600mL干燥的二氯甲烷，在冰盐浴条件下降温至0℃以下，加入100mL固体光气的二氯甲烷溶液(固体光气量为0.038mol)，滴加100mL三乙胺的二氯甲烷溶液(三乙胺的量为0.46mol)，边滴加边进行亲核取代-消除反应，亲核取代-消除反应时间为3h，反应完毕后向所得异氰酸酯中间体反应液中滴加0.076mol美金刚、0.152mol三乙胺和100mL二氯甲烷的混合溶液，滴加加毕后，成脲反应完全，将反应液蒸干，得到化合物4(粗品39.9g)，化合物4未经纯化直接进行下一步反应。化合物4的结构表征数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.13(s,1H),7.26(s,1H),7.04(s,2H),6.95(s,1H),4.13(s,3H),3.20(s,1H),3.05(s,1H),2.52(s,1H),2.14(s,2H),1.83-1.64(m,9H),1.54-1.36(m,10H),0.85(s,6H).ESI-MS:m/z 500.4[M+H]⁺,522.4[M+Na]⁺。

(4)(S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酸(化合物Ⅱ)的制备

向1L单口瓶中加入0.079mol化合物4(按纯度为100％计算)、0.55mol一水合氢氧化锂、250mL四氢呋喃和150mL水，在50℃条件下反水解应1h，减压浓缩除去四氢呋喃，向所得浓缩物中加入500mL水搅拌，在冰盐浴条件下降温至0℃以下，用浓度为6mol/L的盐酸溶液调节pH值至3进行酸化，将析出的白色固体进行抽滤，将所得滤饼用100mL水淋洗后干燥，得到化合物Ⅱ粗品(35.5g)，粗品未经纯化直接进行下一步反应。化合物Ⅱ的结构表征数据：¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.11(t,J＝7.76Hz,1H),7.73-7.64(m,1H),7.01(t,J＝6.76Hz,2H),4.69(s,0.5H),3.93-3.70(m,1.5H),3.40(s,1H),3.26(s,1H),2.50(s,1H),2.12(s,1H),2.03(s,1H),1.83(s,3H),1.67-1.59(m,4H),1.38-1.26(m,5H),1.18-1.10(m,2H),0.83(s,7H).ESI-MS:m/z472.3[M+H]⁺,494.3[M+Na]⁺。

(5)(S)-1-(4-{3-[(1r,3R,5S,7S)-3,5-二甲基金刚烷-1-基]脲基}-3-氟苯甲酰基)哌啶-3-甲酰胺(具有式I所示结构的sEH抑制剂)的制备

向1L单口瓶中加入0.075mol化合物Ⅱ、250mL干燥的四氢呋喃和7.5mmol DMF，在室温下滴加30mL氯化亚砜的四氢呋喃溶液(氯化亚砜的量为0.094mol)，滴加完毕后在室温下氯代反应3h，反应完毕后减压蒸馏除去四氢呋喃和残余的氯化亚砜，得到酰氯中间体，向所得酰氯中间体中加入200mL干燥的四氢呋喃溶解，得到酰氯中间体溶液。

向500mL三口瓶中加入100mL浓度为25～28wt％的氨水和200g碎冰，在冰浴条件下降温至0℃，滴加上述酰氯中间体溶液，边滴加边进行酰化反应，酰化反应时间为2h，反应完毕后分层，将所得有机相减压浓缩至恒重，向所得浓缩物中加入500mL水搅拌后抽滤，将所得固体产物干燥，得到粗产物，将所得粗产物进行硅胶柱层析纯化，得到具有式I所示结构的sET抑制剂(20g，纯度为98％，步骤(1)～(5)总收率为31％，sEH抑制剂记为GL-B437)；其中，硅胶柱层析纯化过程中，粗产物和上样用硅胶的质量比1:1.5，粗产物和硅胶柱中装入的硅胶的质量比为1:5，洗脱剂为体积比为1:1的EA和PE混合溶剂。具有式I所示结构的sEH抑制剂GL-B437为白色固体，熔点为165～166℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ8.18(t,J＝7.64Hz,1H),7.06(d,J＝7.40Hz,2H),5.62(s,1H),3.93-3.71(m,2H),3.57-3.23(m,2H),2.50(s,1H),2.15(s,1H),1.94(s,1H),1.83(s,2H),1.65(s,5H),1.50(s,1H),1.40-1.26(m,5H),1.20-1.12(m,2H),0.85(s,7H).ESI-MS:m/z 471.3[M+H]⁺,493.3[M+Na]⁺HRMS(ESI)calcd for C₂₆H₃₅FN₄O₃Na[M+Na]⁺:493.2585,found:493.2611.化合物GL-B437的纯度用Shimadzu 2010AHPLC测定，纯度98％(面积归一化法)。色谱柱为WondaSil C18 Superb(5μm,4.6×150mm)，流动相为乙腈/水＝50％/50％，流速1mL/min，柱温30℃，检测波长210nm和230nm，保留时间为7.99min。

测试例1

GL-B437的肝微粒稳定性评价

人和SD大鼠肝微粒体购自瑞德肝病研究所(中国上海)有限公司。

孵育体系由肝微粒体的Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝7.4)、GL-B437的DMSO溶液(74μg/mL)和NADPH溶液组成(1.0mM)，孵育体系总体积为500μL。

人肝微粒体的浓度为0.5mg/mL，SD大鼠肝微粒体的浓度为0.53mg/mL。

向5mLEP管内加入10μL GL-B437的DMSO溶液、440μL肝微粒体的Tris-HCl缓冲液和50μL浓度为1.0mM的NADPH溶液，将所得混合液在37℃下恒温孵育0、10、30、60、120、180min，然后加入500μL冰乙腈终止反应，涡旋1min后取200μL混合液，加入400μL乙酸乙酯，涡旋1min，在3000rpm条件下离心5min，取400μL上清液吹干；用150μL溶剂(乙腈：水体积比＝7:3)复溶，涡旋30s，在3000rpm条件下离心5min，吸取100μL上清液，采用ShimadzuLC-2010A液相进行分析。液相分析条件：色谱柱为WondaSil C18 Superb(5μm,4.6×150mm)，流动相为乙腈/水体积比＝50％/50％，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为210nm和230nm，保留时间为7.99min。L-B437在人肝微粒体中的半衰期为174min，在大鼠肝微粒体中的半衰期为120min。

测试例2

对sEH酶的抑制活性试验

(1)实验仪器和试剂

表1实验仪器和试剂

重组人源可溶性环氧化物水解酶由加利福尼亚大学戴维斯分校Bruce D.Hammock院士赠送，于-80℃冰箱保存，浓度为5mg/mL。

AR-9281的合成：

4-(羟基亚氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(G2)的合成：向250mL单口瓶中加入50.18mmol盐酸羟胺、100.36mmol碳酸钾粉末和80mL乙醇，在室温条件下搅拌1h后滴加50mLG1(25.09mmol)的乙醇溶液，滴毕升温回流2.5h，减压浓缩除去乙醇，加入65mL水后搅拌5min，抽滤，将所得滤饼用冷水洗涤，干燥至恒重，得到G2(白色固体，5.03g，收率为93.67％，熔点为95～96℃)。

4-氨基哌啶-1-羧酸叔丁酯(G3)的合成：向250mL单口瓶中加入9.34mmol G2和80mL正丙醇溶解，98℃回流后分三批加入140.1mmol金属钠，2.5h后TLC检测反应完全，向反应液中加入20mL水淬灭反应，减压浓缩除去大部分溶剂，加入50mL水，二氯甲烷萃取3次，单次萃取用二氯甲烷体积为50mL，合并有机层，50mL水洗1次，50mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到G3(黄色油状液体，1.4g，收率为74.9％)。

4-[(苯氧羰基)氨基]哌啶-1-羧酸叔丁酯(G4)的合成：向100mL三口瓶中加入10.0mmol G3、50.0mmo碳酸钾粉末、1mmol DMAP和30mL二氯甲烷溶解，于0℃下滴加6mL苯氧甲酰氯(15mmol)的二氯甲烷溶液，滴毕移至室温反应2.5h，向反应液中加入50mL水，二氯甲烷萃取2次，单次萃取用二氯甲烷体积为50mL，合并有机层，40mL水洗1次，40mL饱和碳酸钠溶液洗1次，50mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到G4(黄白色固体，3.27g，收率为102.2％)。

叔丁基4-{3-[(3s,5s,7s)-金刚烷-1-基]脲基}哌啶-1-甲酸叔丁酯(G5)的合成：向25mL单口瓶中加入1.9mmol G4、2.09mmol金刚烷胺、5.7mmol碳酸钾粉末、0.19mmol DMAP和15mL干燥THF溶解，75℃回流3.5h，减压浓缩除去THF，加入20mL水搅拌20min，抽滤，滤饼用10mL饱和柠檬酸溶液洗涤2次，干燥，得到G5(白色固体，0.69g，收率为97.18％)。

1-[(3s,5s,7s)-金刚烷-1-基]-3-(哌啶-4-基)脲(G6)的合成：向25mL单口瓶中加入1.83mmol G5、36.58mmol TFA和10mL二氯甲烷室温搅拌反应4h，加入20mL水、二氯甲烷萃取2次，单次萃取用二氯甲烷体积为20mL，合并有机层，20mL水洗1次，20mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到G6(白色固体，0.39g，收率为76.9％)。

1-(1-乙酰基哌啶-4-基)-3-[(3s,5s,7s)-金刚烷-1-基]脲(AR-9281)的合成：向25mL单口瓶中加入1.98mmol G6、5.94mmol碳酸钾粉末和13mL二氯甲烷，于0℃滴加2mL乙酰氯(2.18mmol)的二氯甲烷溶液，滴毕室温反应10h，加入20mL水，二氯甲烷萃取2次，单次萃取用二氯甲烷体积为20mL，合并有机层，20mL水洗1次，20mL饱和碳酸氢钠溶液1次，20mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到0.31g粗产物；粗产物经硅胶柱层析，3g硅胶装柱，0.5g硅胶拌样，EA:PE＝1:10洗脱，得到0.23g洗脱白色固体，用15mL乙腈重结晶得到AR-9281(白色晶体，0.18g，收率为28.5％)。AR-9281的结构表征数据：¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ:5.66(d,J＝7.6Hz,1H),5.41(s,1H),4.09-4.06(m,1H),3.67-3.64(m,1H),3.52-3.31(m,1H),3.10-3.06(m,1H),2.78-2.71(m,1H),1.97(s,6H),1.85-1.84(m,6H),1.78-1.71(m,2H),1.56(s,6H),1.08-1.04(m,1H),1.20-1.16(m,1H).ESI-MS:m/z 342.5[M+Na]⁺.

PHOME的合成：

(E)-4-苯基丁-3-烯酸(P2)的合成：向25mL单口瓶中加入8.3mmol苯乙醛、8.3mmol丙二酸、1.6mmol哌啶和15mL吡啶，氩气保护、100℃条件下搅拌反应12h，减压浓缩除去溶剂，加入20mL水，搅拌下加入氢氧化钠固体调pH值至13，将水层用乙酸乙酯洗3次，单次乙酸乙酯洗用乙酸乙酯体积为20mL，水层用1M盐酸调pH值至2，然后用乙酸乙酯萃取3次，单次萃取用乙酸乙酯体积20mL，合并有机层，20mL水洗1次，20mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到P2(0.7g，浅黄色液体，收率为52.0％)。

2-羟基-2-(6-甲氧基萘-2-基)乙腈(P4)的合成：向100mL三口瓶中加入53.74mmol三甲基氰硅烷、26.87mmol氯化锌和30mL二氯甲烷，于0℃滴加10mL 6-甲氧基-2-萘甲醛(26.87mmol)的二氯甲烷溶液，滴加完毕室温反应4h，安装30wt％NaOH尾气吸收装置，向反应液中加入20mL乙酸乙酯，于0℃下向反应液中缓慢滴加30mL 10wt％盐酸溶液，滴加完毕室温搅拌过夜，分出有机层，水层用乙酸乙酯萃取2次，单次萃取用乙酸乙酯体积为40mL，合并有机层，40mL水洗1次，40mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到3.67g粗产物。粗产物经硅胶柱层析纯化，37g硅胶装柱，7.4g硅胶拌样，梯度洗脱EA:PE:AcOH＝1:100:0.1％→EA:PE:AcOH＝1:10:0.01％，得到P4(3.50g，白色固体，收率为61.4％)。

氰基(6-甲氧基萘-2-基)甲基-(E)-4-苯基丁-3-烯酸酯(P5)的合成：向25mL单口瓶中加入27.70mmol P2、23.09mmol P4、2.31mmol DMAP和30mL二氯甲烷，于0℃滴加20mLEDCI(34.63mmol)的二氯甲烷悬浊液，滴加完毕室温反应8h反应完全，加入40mL水，二氯甲烷萃取2次，单次萃取用二氯甲烷体积为40mL，合并有机层，40mL水洗1次，40mL 1wt％稀硫酸水溶液洗1次，40mL饱和食盐水洗1次，无水硫酸镁干燥，抽滤，滤液经减压浓缩至恒重，得到8.48g黑色油状液体。硅胶柱层析，80g硅胶装柱，11g硅胶拌样，洗脱剂EA:PE＝1:200，得到3.0g黄色液体，经20mL乙醇重结晶，得到P5(2.5g白色固体，熔点为118～120℃)。P5的结构表征数据：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.95(d,J＝1.2Hz,1H),7.82(d,J＝15.2Hz,1H),7.80(d,J＝15.6Hz,1H),7.54(dd,J＝8.5Hz,1.9Hz,1H),7.36-7.28(m,4H),7.25-7.20(m,2H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),6.60(s,1H),6.53(d,J＝15.9Hz,1H),6.29(dt,J＝15.9Hz,7.0Hz,1H),3.94(s,3H),3.38-3.34(m,2H).

氰基(6-甲氧基萘-2-基)甲基-2-(3-苯基环氧乙烷-2-基)乙酸酯(PHOME)的合成：向50mL三口瓶中加入8.4mmol m-CPBA和5mL二氯甲烷，于0℃分三批加入2.8mmol P5，室温反应10h，过滤去反应液中固体，0℃加入2.8mmol m-CBPA，室温反应10h，过滤去反应液中固体，0℃加入2.8mmol m-CBPA，室温反应10h，抽滤去除反应液中固体，将反应液放入冰箱冷冻4h，再次抽滤除去反应液中固体，向10mL反应液中加入30mL石油醚，室温静置1天分出滤液，向滤液中加入10mL石油醚，室温静置5h，再向滤液中加入10mL石油醚，室温静置1天，抽滤，固体用4mL乙醚淋洗，干燥至恒重，得到PHOME(白色固体，10mg)。PHOME的结构表征数据：¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.94(d,J＝1.2Hz,1H),7.81(d,J＝12.5Hz,1H),7.79(d,J＝12.9Hz,1H),7.33-7.30(m,3H),7.25-7.21(m,3H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),6.62(s,1H),3.94(s,3H),3.71(d,J＝1.9Hz,1H),3.37-3.34(m,1H),2.91-2.76(m,2H).ESI-MS:m/z396.0[M+Na]⁺,769.1[2M+Na]⁺.

(2)实验原理

sEH可以水解PHOME底物中环氧环，经分子内环化，释放出氰醇。在碱性条件下，氰醇迅速分解为氰化物离子和6-甲氧基-2-萘醛，后者在激发波长330nm，发射波长465nm处具有强的荧光信号，该信号强弱与sEH的抑制作用强弱成反比。基于以上原理，与对照组相比，计算出不同浓度样品的抑制率。根据抑制率与浓度利用IBM SPSS statistics 20软件化合物的IC₅₀。

(3)试剂与药物的配置

25mM Tris-HCl缓冲液(pH＝7.4，含1％BSA)：取12.5mL的1M Tris-HCl缓冲液，加入5mg BAS，用娃哈哈纯净水稀释并用浓盐酸调pH＝7.4，最后定容至500mL。

PHOME底物溶液：将PHOME溶解于DMSO中，得到浓度为20mM的PHOME溶液，于-80℃冰箱保存；现配现用，使时用Tris-HCl缓冲液稀释至1/3mM的使用浓度。

sEH溶液：取1μL浓度为5mg/mL的sEH加入499μLTris-HCl缓冲液制成10μg/mL的母液，-80℃冰箱保存。使用时用Tris-HCl缓冲液稀释至4μg/mL的使用浓度。

将GL-B437化合物用DMSO溶解为20mM的溶液，-20℃冰箱保存备用；使用前将20mM的高浓度化合物用DMSO梯度稀释，共计五个浓度：100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM。

(4)sEH抑制实验

实验分组：溶剂组、100％活力组(A)、抑制剂组(B)和阳性对照组(C)，具体如表2所示：

表2对sEH酶的抑制活性试验分组情况

(5)实验步骤：

(5.1)向96黑底微孔板中加入148μL/孔Tris-HCl缓冲液，每个化合物设置三个复孔；

(5.2)依次加入待测样品2μL，溶剂组和100％活力组用等体积DMSO代替，阳性对照组加入AR-9281；待测化合物终浓度分别为：1nM、0.5nM、0.25nM、0.125nM、0.0625nM；

(5.3)加入sEH溶液20μL(终浓度400ng/mL)，溶剂组用等体积Tris-HCl缓冲液代替；

(5.4)加入PHOME底物30μL起始反应(终浓度50μM)，于37℃恒温箱孵育10min；

(5.5)酶标仪检测荧光信号数据，激发波长330nm，发射波长465nm。

(6)数据分析

每个样品设置三个复孔，三个复孔的均值为待测化合物的荧光值(F)，抑制率％＝[(AF-BF)/AF]*100％，AF为100％活力组荧光值，BF抑制剂组荧光值。根据抑制率与浓度利用IBM SPSS statistics 20软件计算化合物的IC₅₀。

备注：μM即为μmol/L。

测试结果：GL-B437对重组人源sEH的半数抑制浓度IC₅₀为0.06nM。

测试例3

GL-B437的药代动力学评价

(1)实验动物

8周龄雌性SD大鼠，SPF级，购自安徽中医药大学实验动物中心，动物许可证号为：SCXK(皖)2017-001。大鼠购买后常规饲养，室温22～24℃，日夜照明各12h，适应饲养至少3天后再用于实验。所有动物实验程序已经得到安徽中医药大学伦理委员会批准。

(2)实验仪器和试剂

多管涡旋振荡器：DMT-2500，杭州米欧仪器有限公司。

离心机：G-16C，赛多利斯(sartorius)。

天平：XP-6，梅特勒-托利多仪器(上海)。

液相：VanquishUPLC，Thermo Fisher。

三重四级杆液质联用仪：TSQAltis，Thermo Fisher。

(3)试验方法

静脉注射溶媒：8％无水乙醇+4％吐温80+88％生理盐水(体积分数)。

给药制剂配制方法：称取样品于容器内，移取8％无水乙醇将样品充分溶解，加入4％吐温80，搅拌至澄清透明，加入88％生理盐水，充分搅拌至澄清透明的溶液。

口服给药溶媒：0.5％的CMC-Na混悬液。给药制剂配制方法：精确称量对应的药物置于EP管中，加入定量0.5％CMC-Na水溶液，经超声破碎处理制成混悬液，稳定后放置4℃保存，使用前涡旋混均。

GL-B437组SD大鼠静脉注射给药剂量为10mg/kg；灌胃组给药剂量为50mg/kg。GL-B437：14只SD大鼠，随机分成灌胃组(po)和静脉注射组(iv)，实验前一天禁食12h以上，不禁水。分别将po组和iv组给药前、给药后5min、10min、15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h和24h，经眼眶静脉丛取血0.2mL，置EDTA-K2抗凝离心管中，在4℃、11000rpm条件下离心5min，2h内分离血浆，-70℃保存待测样品。

样品分析：取50μL待测样品，加入50μL内标工作液(他达拉非20.000ng/mL)，涡旋混匀后加入300μL乙腈，涡旋混匀10min，在4℃、4200rpm条件下离心10min，取150μL上清液加入150μL纯水，涡旋混匀，在4℃、4200rpm条件下离心10min，取上清液进样。

(4)数据分析

数据处理均由AB Sciex Multi Quant2.1软件自动计算获得，并采用DAS3.0药代动力学软件，以非房室模型统计分析GL-B437在大鼠体内的主要药动学参数。绝对生物利用度F的计算公式如下：

其中，D_iv表示静脉注射给药剂量，D_po表示口服给药剂量；AUC_iv表示静脉注射给药的药时曲线下面积，AUC_po表示口服给药的药时曲线下面积。

GL-B437非临床药代动力学研究结果表明，经静脉注射给予SD大鼠10mg/kg的GL-B437，5min后，GL-B437的血药浓度达到峰值3342.73ng/L；药时曲线AUC_0-24h(24h内的药时曲线下面积)下的总暴露量为1832.11ng·h/L；半衰期为6.25h。口服给予SD大鼠50mg/kg后，达峰时间为38min，药时曲线AUC_0-24h下的总暴露量2620.520ng·h/L，半衰期为5.179h；GL-B437的绝对生物利用度为28.6％。

图1为尾静脉注射和灌胃给药后的药时曲线，由图1可知，静脉注射给药5min后化合物GL-B437在大鼠体内浓度达到峰值，血药浓度随着时间逐渐降低；灌胃给药38min后化合物GL-B437在大鼠体内浓度达到峰值，血药浓度随着时间逐渐降低。

测试例4

GL-B437的急性毒性实验

(1)实验动物

雄性ICR小鼠，3只。动物均在沈阳药科大学新科研楼612室(小鼠房)饲养，保持环境温度20℃-24℃，湿度50％左右，自由摄食饮水。

(2)试剂、药物及配制

最大灌胃浓度化合物B437混悬液配制：称取化合物GL-B4370.7498g，溶于2.5ml的0.5wt％CMC-Na溶液中，超声破碎制成混悬液。

(3)实验仪器

4℃低温冰箱：海尔电冰柜，SC390；

万分之一天平：梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，GB172311；

微型涡旋混合器：上海精科实业有限公司，H-1；

电磁炉：美的集团；

(4)实验方法

实验动物分组及给药方案：将小鼠分为2组，空白对照组1只、化合物B437组2只。化合物B437组灌胃给药6.0g/kg，给药体积为20ml/kg，空白对照组灌胃等量的蒸馏水。

实验步骤：取3只ICR小鼠，雄性，随机分为化合物B437组及空白组。分别给与可灌服的最大体积(20ml/kg)，最大可灌服浓度的化合物GL-B437混悬液(0.3g/ml)，给药剂量为6.0g/kg，空白组灌服等体积蒸馏水(20ml/kg)。给药当天记录小鼠自主活动、进食、排泄、眼鼻等变化,持续观察14天，每天记录小鼠的体重。

(5)实验结果

急性毒性实验结果显示，给小鼠灌胃6.0g/kg的化合物GL-B437，连续观察14天，未见动物死亡以及肉眼可见的异常反应。说明，GL-B437在小鼠口服给药6g/kg后，没有显示出任何毒性和不良反应。

图2为对照组与给药组小鼠体重比较结果，由图2可知，连续14天的体重监测显示，与对照组相比，化合物GL-B437对小鼠的体重无影响。

测试例5

GL-B437对SNI模型大鼠神经病理性疼痛的镇痛试验

(1)实验动物

SD大鼠体重180～220g，SPF级，雄性，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，动物许可证号：SYXK(鲁)20190003，购买后常规饲养，18～22℃、日温差≤4℃、相对湿度为40～70％，日夜照明各12h，动物自由摄食、饮水，适应饲养至少3天后进行检疫观察，观察动物的活动、饮食等表现，合格的动物用于实验。所有动物实验程序已经得到烟台大学伦理委员会批准。

(2)受试化合物：GL-B437，阳性对照为加巴喷丁和EC-5026。

仪器与试剂：

TouchText SensoryEvaluator：DanMic Global。

SC-15数显恒温水浴锅：宁波新芝生物科技有限公司。

KQ-500DE数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。

AE224C电子天平：上海舜宇恒平科学仪器有限公司。

Centrifuge 5424R台式离心机：艾本德生命科学公司。

ST16型离心机：赛默飞世尔科技公司。

MS-H-Pro磁力搅拌器：大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。

VORTEX-5漩涡混合器：海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

其它：96孔板、手术剪、止血钳、缝合针、医用缝合线(2-0)、医用真丝编织线(4-0结扎神经用)、75％酒精、台灯、牵开器、棉球、注射器

(3)坐骨神经分支选择损伤模型的制备

测试前所有动物禁食8～10h，用marker笔在动物尾部编号做标记。实验前，所有手术器械消毒处理、高压灭菌、烘干，准备好血管结扎线，剪成小段，浸泡于生理盐水或消毒酒精中，室温维持18～22℃。用10％水合氯醛按大鼠体重30～40mg/100g将大鼠深麻后，将一侧(左侧)后肢外侧备皮，沿股骨剪开皮肤，用眼科镊顺肌肉纹理扒开找到分支的坐骨神经分支，结扎并剪断胫神经和腓总神经，保留最细的腓肠神经。神经结扎后用医用真丝编织线对手术部位进行缝合，缝合后在手术外皮擦拭碘酒，对其手术部位注射广谱抗生素青霉素钾。将大鼠分笼放置，室温待其自然清醒。假手术组只暴露神经后缝合，不做其它处理。

(4)实验设计及分组

造模成功后将大鼠按照体重随机分组，分为对照组、模型组、加巴喷丁组、GL-B437组(四个剂量)、EC-5026组和假手术组，假手术组作为阴性对照组，是为了验证模型建立是否成功，不需要参与统计，实验过程中每组实验数据量n≥6只。于诱发性疼痛产生后(造模后3～5天)，每天定时给药一次，连续给药。

(5)给药剂量

药物配置：精确称量对应的药物置于15mL EP管中，加入定量0.5％羧甲基纤维素钠水溶液，经超声破碎处理制成混悬液，稳定后放置4℃保存。给药方式为口服，给药剂量为1mg/kg/d、3mg/kg/d、9mg/kg/d、27mg/kg/d，每12h给药一次，连续给药20天。给药剂量与分组如表3所示：

表3给药剂量与分组

(6)药效学实验

造模后会出现自发性疼痛行为：(1)抓挠：抬起后左或右爪子，以快速移动爪子和爪子来抓取身体各部分；(2)撕咬：用嘴和牙齿刺穿身体左侧或右侧皮肤。

造模完成后给药前1h、给药后2h进行行为学实验测—机械性痛敏测试。给药后第1、2、4、8、16、20天测定机械痛敏状况。选用冯弗雷(VonFrey)纤毛机械刺激针，利用上下法进行触觉测试实验，数据记录用PWT＝(10^[Xf+kδ])/10000进行处理。

本实验采用统计学软件GraphPad Prism 8.0.2进行处理数据，结果以均值±标准差表示。首先采用Levene’s检验法对各组数据方差进行齐性检验，方差齐性(P>0.05)，则采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行统计分析。如果ANOVA有统计学意义(P<0.05)，进一步使用LSD test(参数法)进行组间两两比较分析。如果方差不齐(P<0.05)，则采用Kruskal-Wallis进行非参数检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P≤0.05)，则进一步使用Mann-WhitneyU法进行均数间的两两比较。

图3为爪收缩阈值比较结果，其中a为对照组与各给药组爪收缩阈值比较结果，b为给药前对照组与各给药组爪收缩阈值比较结果。由图3中a可知，与对照组和假手术组相比，模型组大鼠的爪收缩阈值显著降低，具有显著性差异，表明SNI模型制备成功。由图3中b可知，假手术组与对照组相比，假手术组PWT略有下降，但无统计学意义。模型组与空白对照组相比，PWT明显下降，其差异具有统计学意义(^***P<0.001)；与假手术组相比，PWT明显下降，其差异具有统计学意义(^###P<0.001)。给药前各给药组PWT值与对照组相比，各给药组首次给药前的爪收缩阈值显著降低，各组PWT差异具有统计学意义(^***P<0.001)，具有显著性差异，表明各给药组SNI所致的神经病理性疼痛模型制备成功，可以用于镇痛的药效学研究。

图4为模型组与各给药组爪收缩阈值比较结果，由图4可知，SD大鼠SNI神经病理性疼痛的缓解表现为PWT显著升高，给药第1天，GL-B437的3mg/kg/d、9mg/kg/d、27mg/kg/d给药组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(^*P<0.05，^**P<0.01)；连续给药第2天，GL-B437的27mg/kg/d、GP组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(^#P<0.05)；连续给药第4天，GL-B437的9mg/kg/d、27mg/kg/d、加巴喷丁、EC-5026给药组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(^$P<0.05，^$$P<0.01)；连续给药第8天，GL-B437的27mg/kg/d、GP给药组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(^&P<0.05)；连续给药第16天，B437的9mg/kg/d给药组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(@P<0.05)，优于加巴喷丁和EC-5026；连续给药第20天，GL-B437的3mg/kg/d和9mg/kg/d给药组PWT与模型组相比明显升高，具有统计学差异(^▲P<0.05)，显著优于加巴喷丁和EC-5026。

加巴喷丁是电压依赖性钙通道α2δ亚单位的配体，可减少钙离子内流，从而减少兴奋性递质释放和脊髓敏化，对神经性疼痛具有较好的治疗效果。由于动物体内配体数量有限，连续给药易饱和，且容易导致耐受，进而产生药效降低的现象。连续给药20天后，加巴喷丁的镇痛效果显著降低，显著弱于GL-B437组3mg/kg/d和9mg/kg/d的给药组。镇痛试验表明GL-B437对SNI所致的神经病理性疼痛具有显著的镇痛效果，低剂量组显示出明显的剂量依赖性，其中3mg/kg/d和9mg/kg/d的剂量镇痛效果最优，镇痛效果优于加巴喷丁和EC-5026，1mg/kg/d的给药组的镇痛效果较弱。

图5为最后一次给药后的药物时效曲线，由图5可知，在连续给药第20天，GL-B437的3mg/kg/d、9mg/kg/d给药组大鼠于给药后2h表现出明显的镇痛效果，并可持续6h以上，起效速度和镇痛效果均优于加巴喷丁和EC-5026。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物，所述sEH抑制剂具有式Ⅰ所示结构：

所述药学上可接受的组合物中的组合物包括氘代物和水合物中的一种或几种。

2.权利要求1所述sEH抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述化合物Ⅱ、氯代试剂、催化剂和可溶化合物Ⅱ溶剂混合后进行氯代反应，得到酰氯中间体；将所述酰氯中间体、氨溶液、冰和可溶酰氯中间体溶液混合，进行酰化反应，得到具有式I所示结构的sEH抑制剂；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物Ⅱ、氯代试剂和氨溶液中的氨的摩尔比为1：1.05～2：5～20。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述氯代反应的温度为0～80℃，时间为0.5～6h；

所述酰化反应的温度为-10～0℃，时间为2～10h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述化合物Ⅱ的制备方法包括以下步骤：

(1)将化合物1、(S)-哌啶-3-甲酸乙酯、有机碱和可溶化合物1溶剂混合后进行酰化反应，得到化合物2；

(2)将所述化合物2、金属还原剂、酸性试剂和可溶化合物2溶剂混合后进行还原反应，得到化合物3；

(3)将所述化合物3、固体光气、有机碱和可溶化合物3溶剂混合后进行亲核取代-消除反应得到异氰酸酯中间体溶液；将所述异氰酸酯中间体溶液、美金刚和可溶美金刚溶剂混合后进行亲核取代反应，得到化合物4；

(4)将所述化合物4进行水解，得到化合物Ⅱ；

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述化合物1和(S)-哌啶-3-甲酸乙酯的摩尔比为1：1～1.5；所述酰化反应的温度为0～40℃，时间为0.1～6h；

步骤(2)中，所述金属还原剂包括铁和/或锌；所述化合物2和金属还原剂的摩尔比为1：3.3～5；所述还原反应的温度为50～100℃，时间为0.1～6h；

步骤(3)中，所述化合物3、固体光气和美金刚的摩尔比为1：0.34～1：1～1.5；所述亲核取代-消除反应的温度为-10～30℃，时间为0.5～4h；所述亲核取代反应的温度为-10～30℃，时间为0.5～4h。

7.权利要求1所述的sEH抑制剂或其药学上可接受的组合物或权利要求2～6任一项所述制备方法制备的sEH抑制剂在制备治疗sEH介导疾病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述sEH介导疾病包括疼痛、炎症、心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病或肾病。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述疼痛包括神经性疼痛、炎性疼痛或癌性疼痛；

所述炎症包括脓毒症、神经炎症、炎症性肠病、慢性消化性溃疡或关节炎；

所述心血管疾病包括高血压、心肌病、中风或动脉粥样硬化；

所述神经退行性疾病包括帕金森综合征、阿尔兹海默病、亨廷顿病或肌萎缩性侧索硬化症；

所述代谢性疾病包括糖尿病或痛风。

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