CN113398900A - 一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下：步骤1，将左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与功能单体、乙腈混合，超声处理，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，对第一混合物进行氮气吹扫，进行聚合反应，离心分离得到产物；步骤2，用甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到针对黄曲霉毒素的分子印迹材料。本发明的制备方法得到的分子印迹材料具有易制备、性质稳定、成本低、效率高和对黄曲霉毒素特异性识别能力的优点，有利于推广应用于对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测，提高对中药、食品的食用安全保障。

Description

一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及高分子材料技术领域，特别是涉及一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料及其制备方法和应用。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉和寄生曲霉等某些菌株产生的一类化学结构相似的二呋喃香豆素代谢产物。在发霉的农作物如玉米、花生、小麦、大米、大豆都有这种物质。目前已经分离出30多种黄曲霉毒素，其中B1、B2、 G1、G2及两种代谢产物M1和M2比较常见。其中黄曲霉毒素B1于1993 年被国际癌症研究机构(IARC)列为第一类致癌物质。其诱导肝细胞癌的毒性是氰化钾的10倍，是二甲基亚硝胺的75倍。通过对各种食品和动物饲料的污染，黄曲霉毒素可能会给人类带来严重的健康问题。因此黄曲霉毒素对食品的污染问题日益受到人们的关注。
如何从复杂的食品样品中快速、准确、有效的分离黄曲霉毒素已成为食品安全检测的重要问题。针对黄曲霉毒素的检测有几种广泛使用的方法，包括薄层色谱法(TLC)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、高效液相色谱、高效液相色谱-质谱法(LC-MS)、电化学传感器。但往往在检测前需要富集目标物质，同时要排除杂质的干扰，防止杂质存在对检测的灵敏度造成影响。最常用的方法是对样本采用免疫亲和柱预处理，这一过程包括药物提取、离心、过滤和免疫亲和柱层析法。过程操作复杂，且免疫亲和柱不稳定，价格相对昂贵，且吸附性能易受有机溶剂、pH值和温度的影响，基本是一次性使用，极大地限制了对黄曲霉毒素检测的普及。
分子印迹技术为黄曲霉毒素的快速提取和检测提供了新的途径，通过该技术制备的分子印迹材料(MIP)，因制备简单，且耐高温、酸碱并可重复使用，从而大大降低了使用成本。将其运用于固相萃取柱中则可取代免疫亲和柱，也可作为识别原件用于可在线检测、重复使用的生物传感器。由于黄曲霉毒素毒性大，且价格昂贵，本身用作模板分子会导致实验成本高，并给操作人员带来潜在的危险，所以在实际制备中通需要使用与其结构类似物作为虚拟模板来合成印迹聚合物，以达到降低对实验人员的伤害，同时也避免了模板分子的渗漏。现有技术常用的黄曲霉毒素的虚拟模板为5，7-二甲氧基香豆素，但是以5，7-二甲氧基香豆素作为虚拟模板制备得到的分子印迹材料对黄曲霉毒素的吸附效率较低。因此需要开发廉价的虚拟模板分子替代毒性大、昂贵的黄曲霉毒素，并制备得到对黄曲霉毒素吸附效果较好地分子印迹材料，应用于对食品中黄曲霉毒素进行检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料及其制备方法和应用。
根据本发明的一个方面，提供了一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与功能单体、乙腈混合，超声处理，加入交联剂和引发剂，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1：6：30，得到第一混合物，对第一混合物进行氮气吹扫，在一定温度下进行聚合反应，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素的分子印迹材料，洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。
本发明的有益效果：本发明以左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子，采用本体聚合法，将左旋氧氟沙星环合酯与功能单体两者充分混合发挥作用，再加入交联剂和引发剂引发聚合，最后去除未反应单体和左旋氧氟沙星环合酯，制备得到分子印迹材料，制备过程中左旋氧氟沙星环合酯与功能单体、交联剂的摩尔比直接影响到分子印迹材料对黄曲霉毒素的特异性及吸附能力，本发明中以左旋氧氟沙星环合酯与功能单体、交联剂的摩尔比为1：6：30的比例制备得到的分子印迹材料对黄曲霉毒素B1具有较好地特异性吸附效果，因此本发明的用左旋氧氟沙星环合酯替代黄曲霉毒素B1作为模板分子制备的黄曲霉毒素分子印迹材料及其制备方法，解决了黄曲霉毒素作为模板分子价格昂贵、毒性大、实验成本高、对操作人员不安全、易造成模板分子渗漏、除去困难等问题，制备得到的分子印迹材料具有易制备、性质稳定、成本低、效率高和对黄曲霉毒素特异性识别能力的优点，有利于推广应用于对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测，提高对中药、食品的食用安全保障。
在一些实施方式中，一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与功能单体、30-50ml乙腈混合，超声处理10-20min，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1：6：30，对第一混合物进行氮气吹扫10-20min，在一定温度下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物，功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺或2-已烯基吡啶中的一种，引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈中的一种；
步骤2，用20-40ml甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素的分子印迹材料，洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。本制备方法中，左旋氧氟沙星环合酯与功能单体、交联剂的摩尔比优选为1：6：30，在此比例条件下，制备得到的分子印迹材料，对黄曲霉毒素B1的特异性吸附效果最好，吸附量最高。
在一些实施方式中，功能单体为甲基丙烯酸，交联剂为乙二醇二甲醇丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。甲基丙烯酸的分子内除具有一个碳碳双键外，还具有一个羧基，可以和模板分子左旋氧氟沙星环合酯结构中的羰基发生氢键作用；乙二醇二甲醇丙烯酸酯的分子内具有两个乙烯基团，在聚合反应中可以形成三维网状结构，从而使聚合物在去除模板分子后形成的空腔形状固定，实现对黄曲霉毒素的特异性吸附。
在一些实施方式中，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。该洗涤剂可以很好地除去产物中的模板分子左旋氧氟沙星环合酯。
在一些实施方式中，制备得到的黄曲霉毒素的分子印迹材料用于对中药、食品中的黄曲霉毒素含量进行测定。制备得到的黄曲霉毒素的分子印迹材料对黄曲霉毒素具有较高的特异性吸附效果，可以将其应用于对中药、食品中的黄曲霉毒素含量进行测定，提高对中药、食品的食用安全保障。
在一些实施方式中，中药包括药材及中药制剂。黄曲霉毒素的分子印迹材料可以对药材及中药制剂中的黄曲霉毒素含量进行测定。
在一些实施方式中，利用黄曲霉毒素的分子印迹材料测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法，包括以下：
步骤a，分子印迹-固相萃取柱制备：
取洁净空的SPE小柱，底部放入聚四氟乙烯垫片，加入黄曲霉毒素的分子印迹材料作为填料，使其在柱内均匀分布，在填料顶部再压入聚四氟乙烯垫片，用来固定填料，得到分子印迹-固相萃取柱；
步骤b，待测样液制备：
将待测样品粉碎、过筛，取待测样品粉末15g，置于均质瓶中，加入第一提取剂75ml，超声振荡提取30分钟，使用定性滤纸过滤，收集滤液，量取滤液15ml，置于50ml容量瓶中，加入2.5mL水，再加入体积分数60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得到样品提取液，样品提取液中甲醇与水的体积比为3:2，第一提取剂中甲醇与水的体积比为7:3；
将分子印迹-固相萃取柱连接到固相萃取装置，向柱内加入活化剂，浸泡冲洗小柱，活化填料；填料活化后，取一定量样品提取液使其以1.0ml/min 的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱剂分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到待测样液；
步骤c，对照品梯度待测溶液制备：
量取1.0μg/ml黄曲霉毒素B1标准品溶液适量，用70％甲醇溶液稀释，得到含黄曲霉毒素B1浓度为0.12～10.0ng/ml的对照品梯度溶液；
分别取各浓度的对照品梯度溶液3.0ml，以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱液分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30 秒，收集洗脱液，得到对照品梯度待测溶液；
步骤d，进行高效液相色谱-串联质谱法检测：
吸取上述对照品梯度待测溶液各5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以黄曲霉毒素B1含量浓度为横坐标，绘制标准曲线；另吸取上述待测样液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算得到样品提取液中相当于黄曲霉毒素B1的浓度，然后计算得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。将黄曲霉毒素的分子印迹材料作为固相萃取柱填料使用，利用分子印迹材料对黄曲霉毒素的特异性吸附作用，吸附萃取待测样品中含有的黄曲霉毒素，对待测样品中含有的黄曲霉毒素进行有效提取，保证了检测结果的准确性，并且具有制备简单、耐高温、耐酸碱、可重复使用，大大降低了成本，取代免疫亲和柱的优点，同时解决了现有检测方法中操作过程复杂、免疫亲和柱不稳定、价格昂贵、吸附性能受有机溶剂、pH值和温度影响等问题。
在一些实施方式中，步骤d中液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相：A相：10mmol/L醋酸铵溶液；B相：甲醇，柱温：25℃，流速：0.3ml/min，梯度洗脱，梯度洗脱方式如表1所示：
表1
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～4.5 65→15 35→85
4.5～6 15→0 85→100
6～6.5 0→65 100→35
6.5～10 65 35
在一些实施方式中，步骤d中质谱检测条件为：电喷雾离子源，采集模式为正离子模式，目标物相应的保留时间、监测离子对及电压参数如表2 所示：
表2
Figure BDA0003162778870000051
在一些实施方式中，步骤b中活化剂为甲醇，洗脱剂为甲醇，步骤c 中对照品梯度浓度溶液中黄曲霉毒素B1的浓度依次为：0.12ng/ml、 0.25ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml。
附图说明
图1为本发明的一种实施方式的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法的以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的黄曲霉毒素的分子印迹材料的红外谱图。
图2为本发明的一种实施方式的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法的空白分子印迹材料的红外谱图。
图3为本发明的一种实施方式的在不同吸附溶剂条件下三种不同的分子印迹材料对黄曲霉毒素B1的吸附量柱状图。
图4为本发明的一种实施方式的利用黄曲霉毒素的分子印迹材料测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法的黄曲霉毒素B1的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例中黄曲霉毒素B1标准品选择青岛普瑞邦生物工程有限公司供应的黄曲霉毒素B1标准品，醋酸铵选择安耐吉化学有限公司供应的分析纯醋酸铵，甲醇选择安耐吉化学有限公司供应的分析纯甲醇，乙酸安耐吉化学有限公司供应的分析纯乙酸，甲基丙烯酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯甲基丙烯酸，乙二醇二甲醇丙烯酸酯选择供应上海阿拉丁生化科技股份有限公司的乙二醇二甲醇丙烯酸酯，偶氮二异丁腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯偶氮二异丁腈，偶氮二异戊腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的98％的偶氮二异戊腈，丙烯酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯丙烯酰胺，乙腈选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯乙腈；3，5-二甲氧基苯酚选择国药集团化学试剂有限公司供应的98％3，5-二甲氧基苯酚，丙炔酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的98％丙炔酸乙酯，四氟硼酸银选择国药集团化学试剂有限公司供应的 99％四氟硼酸银；
5，7-二甲氧基香豆素由3，5-二甲氧基苯酚与丙炔酸乙酯在四氟硼酸银的催化下经环化反应制备得到，反应式如下：
Figure BDA0003162778870000061
以下实施例2-6均采用本实施例1中的试剂。
实施例2
本发明的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与1.2mmol甲基丙烯酸、40ml乙腈混合，超声处理15min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中左旋氧氟沙星环合酯：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：8：30，对第一混合物进行氮气吹扫15min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用30ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素分子印迹材料，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。对制备得到黄曲霉毒素分子印迹材料进行傅里叶变换红外光谱仪分析，得到该黄曲霉毒素的分子印迹材料的红外谱图，见说明书附图1。通过比较说明书附图1与附图2，可以直接看出，该以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子制备得到的黄曲霉毒素的分子印迹材料在 2900-3000之间出现明显振动峰，在1700-1800之间出现强信号峰，表明有左旋氧氟沙星环合酯与甲基丙烯酸以氢键作用聚合后，将左旋氧氟沙星环合酯洗脱后使得聚合物产生孔洞，裸露在外面的官能团个数增加，使羰基和烷烃的吸收振动峰增强。
步骤1和步骤2的反应过程如下：
Figure BDA0003162778870000071
本实施例的制备方法以左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子，采用本体聚合法，将左旋氧氟沙星环合酯与功能单体甲基丙烯酸两者充分混合发挥作用，再加入交联剂乙二醇二甲醇丙烯酸酯和引发剂偶氮二异丁腈引发聚合反应，最后去除未反应的功能单体甲基丙烯酸和左旋氧氟沙星环合酯，制备得到分子印迹材料，制备过程中左旋氧氟沙星环合酯与甲基丙烯酸、乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比直接影响到分子印迹材料对黄曲霉毒素的特异性及吸附能力，本实施例中以左旋氧氟沙星环合酯与功能单体、交联剂的摩尔比为1： 6：30的比例制备得到的分子印迹材料对黄曲霉毒素B1具有较好地特异性吸附效果。聚合反应中甲基丙烯酸的分子内除具有一个碳碳双键外，还具有一个羧基，可以和模板分子左旋氧氟沙星环合酯的羰基发生氢键作用，乙二醇二甲基丙烯酸酯的分子内具有两个乙烯基团，在聚合反应中可以形成三维网状结构，从而使分子印迹材料在去除左旋氧氟沙星环合酯后形成的空腔形状稳定，便于对黄曲霉毒素进行吸附。
实施例3
本发明的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与1.2mmol甲基丙烯酸、30ml乙腈混合，超声处理10min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中左旋氧氟沙星环合酯：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：6：30，对第一混合物进行氮气吹扫10min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用20ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素的分子印迹材料，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。
实施例4
本发明的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下：
步骤1，将0.2mmol左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与1.4mmol甲基丙烯酸、50ml乙腈混合，超声处理20min，然后加入6mmol乙二醇二甲醇丙烯酸酯和0.072mmol偶氮二异丁腈，得到第一混合物，其中左旋氧氟沙星环合酯：甲基丙烯酸：乙二醇二甲醇丙烯酸酯的摩尔比为1：6：30，对第一混合物进行氮气吹扫20min，在65℃温度条件下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用40ml甲醇洗涤产物，除去未反应的甲基丙烯酸，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素的分子印迹材料，洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。
实施例5
不同模板分子的分子印迹材料的合成制备及对黄曲霉毒素B1的吸附性能测试：
本实施例中以5，7-二甲氧基香豆素、左旋氧氟沙星环合酯分别作为模板分子，以不加入模板分子为空白对照，采用实施例2中的制备方法，制备得到以5，7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹材料1、以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的分子印迹材料2、空白分子印迹材料。对制备得到的空白分子印迹材料进行傅里叶变换红外光谱仪分析，得到该空白分子印迹材料的红外谱图，见说明书附图2。
利用甲醇将黄曲霉毒素B1配置成浓度梯度为100、75、50、25、12.5ppm 的标样溶液，通过高效液相色谱仪-荧光检测仪绘制黄曲霉毒素B1标准浓度曲线，得到标准曲线y＝0.016462x+2.23839，R2＝0.989571。
使用甲醇作为吸附溶液1、甲醇与水的体积比为3：2的混合溶液作为吸附溶液2，分别配制浓度为20ppm的黄曲霉毒素B1溶液，向20ppm黄曲霉毒素B1溶液中对应加入20mg分子印迹材料1、分子印迹材料2和空白分子印迹材料，吸附1小时后，用高效液相色谱仪-荧光检测仪测定吸附后黄曲霉毒素B1溶液中黄曲霉毒素B1的浓度，根据吸附前后浓度的变化，计算得到分子印迹材料1、分子印迹材料2和空白分子印迹材料对黄曲霉毒素B1的吸附量Q，见表3及说明书附图3，计算公式如下：
Q＝(C1-C2)V/M
Q：吸附量，ug/mg
C1：吸附前浓度，ug/mL
C2：吸附后浓度，ug/mL
M：聚合物质量，mg
表3不同模板分子制备的分子印迹材料在不同吸附溶剂条件下对黄曲霉毒素B1的吸附量
Figure BDA0003162778870000091
从表3及说明书附图3可以直接得出，对于同样的分子印迹材料，吸附溶剂的配比会影响分子印迹材料对黄曲霉毒素B1的吸附效果。在吸附溶液 2的吸附条件下，以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的分子印迹材料2对于 20ppm的黄曲霉毒素B1溶液中的黄曲霉毒素B1的吸附量为0.484μg/mg，高于在吸附溶液1甲醇条件下的吸附量。以5，7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹材料1和空白分子印迹材料在甲醇为吸附溶液下的吸附量也均小于吸附溶液2条件下的吸附量，因此，本发明的应用中采用甲醇与水的体积比为3:2作为吸附溶剂，以提高以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的分子印迹材料对黄曲霉毒素的吸附效果，保证后续检测的准确性。
根据表3和说明书附图3可以直接得出，在相同吸附溶剂2条件下，以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的分子印迹材料2对于20ppm的黄曲霉毒素溶液中的黄曲霉毒素B1的吸附量为0.484μg/mg，比以5，7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹材料2的吸附量提高了21.61％，比空白分子印迹材料的吸附量提高了20.10％，说明以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的分子印迹材料2对黄曲霉毒素B1的吸附性能，高于以5，7-二甲氧基香豆素为模板分子的分子印迹材料1和空白分子印迹材料对黄曲霉毒素B1的吸附性能。
实施例6
利用实施例2中制备得到的以左旋氧氟沙星环合酯为模板分子的黄曲霉毒素的分子印迹材料测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法，包括以下：
步骤a，分子印迹-固相萃取柱制备：
取洁净空的SPE小柱，底部放入聚四氟乙烯垫片，加入0.1g黄曲霉毒素的分子印迹材料作为填料，使其在柱内均匀分布，在填料顶部再压入聚四氟乙烯垫片，用来固定填料，得到分子印迹-固相萃取柱；
步骤b，待测样液制备：
将待测样品粉碎、过二号筛，称取待测样品粉末15g，置于均质瓶中，加入第一提取剂75ml，超声振荡提取30分钟，使用定性滤纸过滤，收集滤液，量取滤液15ml，置于50ml容量瓶中，加入2.5mL水，再加入体积分数 60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得到样品提取液，样品提取液中甲醇与水的体积比为3:2，第一提取剂中甲醇与水的体积比为7：3，待测样品为中药药材、中药制剂或食品中的一种；
将分子印迹-固相萃取柱连接到固相萃取装置，向柱内加入3.0ml甲醇，浸泡冲洗小柱，活化填料；填料活化后，取3.0ml样品提取液使其以1.0ml/min 的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml甲醇分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到待测样液；
步骤c，对照品梯度待测溶液制备：
量取1.0μg/ml黄曲霉毒素B1标准品溶液适量，用70％甲醇溶液稀释，得到含黄曲霉毒素B1浓度为0.12ng/ml、0.25ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、 5.0ng/ml、10.0ng/ml的对照品梯度溶液；
分别取各浓度的对照品梯度溶液3.0ml，以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱液分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30 秒，收集洗脱液，得到对照品梯度待测溶液；
步骤d，进行高效液相色谱-串联质谱法检测：
液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相：A相：10mmol/L醋酸铵溶液；B相：甲醇，柱温：25℃，流速： 0.3ml/min，梯度洗脱，梯度洗脱方式如表4所示：
表4
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～4.5 65→15 35→85
4.5～6 15→0 85→100
6～6.5 0→65 100→35
6.5～10 65 35
质谱检测条件为：电喷雾离子源，采集模式为正离子模式，目标物相应的保留时间、监测离子对及电压参数如表5所示：
表5
Figure BDA0003162778870000101
吸取上述对照品梯度待测溶液各5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以黄曲霉毒素B1含量浓度为横坐标，绘制标准曲线见说明书附图4，得到标准曲线方程为：
y＝10814.336790x-183.813198，R2＝0.9983；另吸取上述待测样液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算得到样品提取液中相当于黄曲霉毒素B1的浓度，然后计算得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。
本实施例的检测方法对中药、食品中黄曲霉毒素的检测限为0.50μg/kg，对中药、食品中黄曲霉毒素含量的检测准确性高，对黄曲霉毒素进行特异性吸附，对待测样品中的黄曲霉毒素进行有效提取，保证了检测结果的准确性，并且具有制备简单、耐高温、耐酸碱、可重复使用，大大降低了成本，取代免疫亲和柱的优点，同时解决了现有检测方法中操作过程复杂、免疫亲和柱不稳定、价格昂贵、吸附性能受有机溶剂、pH值和温度影响等问题。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与功能单体、乙腈混合，超声处理，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔质量为1:6～8:30，对第一混合物进行氮气吹扫，在一定温度下进行聚合反应，反应结束后，离心分离得到产物；
步骤2，用甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素分子印迹材料，所述洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。
2.根据权利要求1所述的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将左旋氧氟沙星环合酯作为模板分子与功能单体、30-50ml乙腈混合，超声处理10-20min，加入交联剂和引发剂，得到第一混合物，其中模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:8:30，对第一混合物进行氮气吹扫10-20min，在一定温度下进行聚合反应24小时，反应结束后，离心分离得到产物，所述功能单体为甲基丙烯酸、丙烯酰胺或2-已烯基吡啶中的一种，所述引发剂为偶氮二异丁腈或偶氮二异戊腈中的一种；
步骤2，用20-40ml甲醇洗涤产物，除去未反应的功能单体，然后用洗涤剂除去左旋氧氟沙星环合酯，得到黄曲霉毒素分子印迹材料，所述洗涤剂为甲醇与乙酸的混合溶液。
3.根据权利要求2所述的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述功能单体为甲基丙烯酸，所述交联剂为乙二醇二甲醇丙烯酸酯，所述引发剂为偶氮二异丁腈。
4.根据权利要求2所述的一种针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的制备方法，其特征在于，所述洗涤剂中甲醇与乙酸的体积比为8：2。
5.根据权利要求1-4中任一权利要求所述的制备方法制备的黄曲霉毒素的分子印迹材料的应用，其特征在于，所述针对黄曲霉毒素的分子印迹材料用于对中药、食品中的黄曲霉毒素含量进行测定。
6.根据权利要求5所述的针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的应用，其特征在于，所述中药包括药材及中药制剂。
7.根据权利要求5所述的针对黄曲霉毒素的分子印迹材料的应用，其特征在于，所述利用黄曲霉毒素分子印迹材料测定中药、食品中的黄曲霉毒素含量的检测方法，包括以下：
步骤a，分子印迹-固相萃取柱制备：
取洁净空的SPE小柱，底部放入聚四氟乙烯垫片，加入所述黄曲霉毒素分子印迹材料作为填料，使其在柱内均匀分布，在填料顶部再压入聚四氟乙烯垫片，用来固定填料，得到分子印迹-固相萃取柱；
步骤b，待测样液制备：
将待测样品粉碎、过筛，取待测样品粉末15g，置于均质瓶中，加入第一提取剂75ml，超声振荡提取30分钟，使用定性滤纸过滤，收集滤液，量取滤液15ml，置于50ml容量瓶中，加入2.5mL水，再加入体积分数60％甲醇溶液定容至刻度，摇匀，得到样品提取液，所述样品提取液中甲醇与水的体积比为3:2，所述第一提取剂中甲醇与水的体积比为7:3；
将分子印迹-固相萃取柱连接到固相萃取装置，向柱内加入活化剂，浸泡冲洗小柱，活化填料；填料活化后，取一定量样品提取液使其以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱剂分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到待测样液；
步骤c，对照品梯度待测溶液制备：
量取1.0μg/ml黄曲霉毒素B1标准品溶液适量，用70％甲醇溶液稀释，得到含黄曲霉毒素B1浓度为0.12～10.0ng/ml的对照品梯度溶液；
分别取各浓度的对照品梯度溶液3.0ml，以1.0ml/min的速度缓慢通过分子印迹-固相萃取柱，并使空气通过柱体，加入适量水淋洗柱体，并使空气通过柱体，再加入1.0ml洗脱液分三次进行洗脱，每次洗脱时需要孵育30秒，收集洗脱液，得到对照品梯度待测溶液；
步骤d，进行高效液相色谱-串联质谱法检测：
吸取上述对照品梯度待测溶液各5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以黄曲霉毒素B1含量浓度为横坐标，绘制标准曲线；另吸取上述待测样液5μl，注入高效液相色谱-串联质谱仪，测定峰面积，根据标准曲线计算得到样品提取液中相当于黄曲霉毒素B1的浓度，然后计算得到待测样品中黄曲霉毒素的含量。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤d中液相色谱条件为：色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，流动相：A相：10mmol/L醋酸铵溶液；B相：甲醇，柱温：25℃，流速：0.3ml/min，梯度洗脱，所述梯度洗脱方式如表1所示：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～4.5 65→15 35→85 4.5～6 15→0 85→100 6～6.5 0→65 100→35 6.5～10 65 35
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤d中质谱检测条件为：电喷雾离子源，采集模式为正离子模式，目标物相应的保留时间、监测离子对及电压参数如表2所示：
Figure FDA0003162778860000031
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤b中活化剂为甲醇，所述洗脱剂为甲醇，所述步骤c中对照品梯度浓度溶液中黄曲霉毒素B1的浓度依次为：0.12ng/ml、0.25ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml。
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