CN109312337A - 用于单分子检测的条件性引物延伸 - Google Patents

Abstract

在一些实施方案中，本公开提供了用于单分子检测的方法和组合物。

Description

用于单分子检测的条件性引物延伸

相关申请

本申请依照35U.S.C.§119(e)要求2016年5月27日申请的美国临时申请号62/342,401的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。

联邦资助的研究

本发明在美国国防部海军研究办公室授予的N00014-13-1-0593和N00014-14-1-0610以及国立卫生研究院授予的EB018659和国家科学基金会授予的CCF-1317291下的政府支持下进行。政府在本发明中具有某些权利。

背景

单分子检测方法已变为用于分析由复杂生物系统中的组分集合掩盖的单个分子的有力工具。这些方法可用于在疾病早期阶段期间检测与许多疾病相关的疾病生物标志物，其中治疗具有改善预后和存活率的最大潜力。尽管能够检测单一分子具有重要意义，但这样做仍然是一个挑战，特别是以高通量和多重测定形式。

概述

在一些实施方案中，本文提供了用于从生物样品鉴定和定量靶分析物(例如蛋白质)的方法、组合物和试剂盒，其具有检测单一分子(例如，蛋白质或核酸)的灵敏度水平。本公开的方法使用结合和非结合部分之间的相互作用次数的差异，以仅当两个核酸探针识别相同的靶标时生成可扩增的核酸分子(图1)。

可以例如使用核酸探针对检测单一靶蛋白质(参见例如，图2)。第一核酸探针与识别靶蛋白质上的第一表位的第一抗体缀合。第一核酸探针包含(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域‘UMI’(独特分子标识符)连接的5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’，其中3'条形码亚结构域‘UMI‘通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和(ii)3'未配对的引物-结合结构域‘a’，其中对应于从3'条形码亚结构域(UMI)缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域(UMI)和5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2‘之间，且其中5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2‘包含终止聚合的5'分子。第二核酸探针与识别靶蛋白质上的第二表位的第二抗体缀合。第二核酸探针包含与3'引物结构域(‘a*’，其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1‘。

本公开的方法利用链置换机制来仅当两个核酸条形码化探针共定位于其靶标上时生成可扩增的核酸分子(参见例如，图3)。“链置换”是指当邻近单一互补核酸链(或链的片段)时具有相同序列的两个核酸链对于该互补链经历相对快速(例如，时间尺度<1s)竞争的机制，假定通过“随机-行走”机制从互补体中彼此‘置换’(参见，例如，Yurke等人,Nature406:605-608,2000；和Zhang等人Nature Chemistry 3:103-113,2011，其各自通过引用并入本文)。

当核酸探针对共定位于其靶标上时，第一探针中的结构域’a‘结合第二探针中的结构域’a*’。在dATP、dTTP和dCTP存在的情况下，链置换聚合酶沿着链延伸，直至其到达由黑点表示的“终止”分子。该延伸导致新形成的UMI结构域附加至引物结构域’a*’。探针保持与其靶标结合，这允许附加至引物结构域’a*’的新形成的UMI结构域与第一探针的UMI结构域竞争结合其互补结构域。引物结构域’a*’中新形成的UMI结构域置换第一探针的UMI结构域，并且在dGTP存在的情况下，链置换聚合酶沿着引物结构域‘a*’延伸。该延伸将第二引物结合结构域‘PCR引物2‘附加至引物结构域“a*”。所得核酸提供可扩增的记录物，其用于检测靶蛋白质的存在。

在靶蛋白质不存在的情况下，该核酸探针对不能生成可扩增的核酸分子(参见例如，图4)。靶蛋白质未结合的核酸探针对将在溶液中彼此随机相遇，其允许第一探针中的引物结构域‘a’结合第二探针中的引物结构域‘a*’。链置换聚合酶沿着链延伸，其将新形成的UMI结构域附加至引物结构域‘a*’。该探针对分离并在共同靶蛋白质不存在的情况下保持分离。这种分离防止新形成的引物结构域‘a*’的UMI结构域结合第一探针并置换第一探针的UMI结构域，且因此第二引物-结合结构域‘PCR引物2’不能附加至引物结构域‘a*’。不能扩增所得核酸，且也未检测到靶蛋白质。

还可以例如使用核酸探针对(其经配置成使得不需要‘UMI’序列)检测单一靶蛋白质(参见例如，图28、29和35)；而是可以在该对的单一探针上使用两个或更多个(例如，两个、三个、四个或更多个)立足结构域和两个或更多个(例如，两个、三个、四个或更多个)终止分子，以实现条件性引物延伸。例如，第一核酸探针(例如，与抗体连接)可以包含彼此结合的两条或更多条(例如，两条、三条、四条或更多条)核酸链，并且每条链包括3’未配对立足结构域和终止分子(参见例如，图28)。第二核酸探针(例如，与另一种抗体连接)可以包含能够结合第一核酸探针的3’立足结构域之一的3'未配对引物-结合结构域。通过引物结合、延伸和链置换机制，生成抗体相互作用的记录物。

附图简述

图1显示本公开的方法的实例。

图2显示核酸探针对的实例。

图3显示在靶标存在的情况下本公开的方法的实例。

图4显示在靶标不存在的情况下本公开的方法的实例。

图5显示清除探针的实例。

图6显示使用qPCR或凝胶电泳的靶标检测的实例。

图7显示检测单一靶分子或多种靶分子的实例。产物序列中编码的UMI用于数字计数靶分子的数目。

图8显示多靶标检测的实例。

图9显示通过单一测序反应组合和分析的不同样品的实例。

图10显示本公开的核酸探针对的一个实例。

图11显示本公开的核酸探针对的一个实例。

图12显示本公开的核酸探针对的一个实例。

图13显示本公开的核酸探针对的一个实例。

图14显示链置换介导的引物延伸特异性的实例。正确编码的引物可以有效地延伸。

图15显示发夹探针上的顺序引物延伸反应的实例。

图16显示来自条形码(UMI)拷贝过程的数据。条件性引物交换(CPE)发夹的“C-终止子”(“C-stopper”)能够在拷贝延伸引物上的条形码后有效地停止聚合酶。

图17显示表明UMI的有效性的数据。当不与CPE发夹共定位时(以及在与原始发夹解离后)，用UMI印记的延伸引物仅生成低产量的可见完整记录物(背景记录物)。

图18显示进一步表明UMI的有效性的数据。当不与CPE发夹共定位时(以及在与原始发夹解离后)，用固定条形码而不是UMI印记的延伸引物生成高产量的完整记录物。

图19显示表明使用UMI来证实共定位事件的数据。当经由生物素-链霉抗生物素蛋白连接与CPE发夹共定位时(和从发夹解离后)，用UMI印记的延伸引物生成高产量的完整记录物。

图20显示来自通过单分子成像表征解离动力学的实验的数据。UMI-印迹的延伸引物能够相对快速地从CPE发夹解离，甚至用较长长度的UMI也是如此。

图21显示在UMI印迹阶段后使用清除链来破坏剩余的未延伸的延伸引物的示意图。当使用相对低浓度的探针时，高浓度的清除链能够缩短UMI印迹所需的孵育时间。

图22显示表明在清除链存在的情况下抑制背景记录物生成的数据。在链霉抗生物素蛋白不存在的情况下，在1小时CPE反应后未观察到完整记录物。然而，在链霉抗生物素蛋白存在的情况下，从UMI印迹的延伸引物延伸完整记录物。

图23显示表明在具有各种条形码长度的CPE探针存在的情况下抑制背景记录物生成的数据。在链霉抗生物素蛋白靶标不存在的情况下，对于测试的任何条形码长度没有观察到完整记录物。

图24显示来自实验的数据，所述实验比较使用邻近延伸测定法观察到的背景水平与本公开的条件性引物延伸(CPE)反应。使用邻近延伸反应观察到显著的背景记录物水平，但使用CPE反应没有观察到。

图25显示表明延伸引物和CPE发夹浓度对完整记录物的PCR扩增的可忽略影响的数据(使用具有18nt条形码长度的CPE探针)。

图26显示表明在含有CPE反应的所有组分(包括10pM延伸引物、10pM CPE发夹和100nM清除剂)的混合物中的完整记录物扩增的数据。令人惊讶地，当PCR混合物中存在CPE反应的所有组分时，检测到少于30个拷贝的完整记录物。

图27显示表明CPE反应的灵敏度的数据。使用生物素标记的CPE探针检测链霉抗生物素蛋白(SA)，并且生成的背景信号(0拷贝SA)非常低。检测到约16个拷贝的链霉抗生物素蛋白。

图28显示使用具有两个立足结构域和两个终止分子的探针的连续邻近延伸和加速解离(SPEED)反应的一个实例。

图29显示使用具有三个立足结构域和三个终止分子的探针的连续邻近延伸和加速解离(SPEED)反应的另一个实例。

图30显示表明使用SPEED反应来检测链霉抗生物素蛋白(SA)的数据。探针用生物素标记。

图31显示表明使用不同长度和序列组成的探针使用SPEED反应的额外数据。

图32显示表明SPEED反应(通过qPCR)的灵敏度的数据。该反应能够检测低至～120拷贝的链霉抗生物素蛋白。

图33是说明“翻转的”PCR引物结合结构域设计消除PCR扩增期间生成的背景信号的示意图。当需要高浓度的探针来加强亲和探针和靶标之间的结合时，具有C-终止子的SPEED探针在PCR扩增期间不引入背景，因为生成的延伸序列不能被PCR引物扩增。

图34A-34B显示表明甚至在高探针浓度下SPEED也有效地进行的数据。图34A显示，当使用范围1pM至1nM内的探针浓度时，在25个PCR循环后没有可观察到的完整记录物被扩增。图34B显示qPCR数据，其表明SPEED反应也可用于检测约1200拷贝的链霉抗生物素蛋白，甚至当使用1nM生物素标记的SPEED探针时。显示来自两次重复实验的数据。

图35显示四种不同SPEED探针配置的示意图，每种配置都产生相同的报告序列。

描述

如本文提供的方法、组合物和试剂盒使得能够以单分子灵敏度检测来自生物样品的靶分析物。该方法仅当两个核酸探针识别特定目标靶标时才生成可扩增的核酸分子(图1)。

核酸探针可以与检测分子(例如，抗体)缀合用于单分子蛋白质检测(图2)。经由生成可扩增的核酸分子的单分子蛋白质检测显示于例如图3中。在靶蛋白质不存在的情况下，不能生成可扩增的核酸分子，如例如图4中所示。

图3提供了使用图2中描述的条形码探针对检测靶蛋白质的方法的实例。每种探针与识别相同靶蛋白质的不同表位的不同抗体结合。当两种抗体与靶蛋白质结合时，生成含有引物结合位点的核酸记录物/扩增模板，其反映该特异性相互作用。如图3中所示，例如，将核酸探针对在包含链置换聚合酶的反应缓冲液中在链置换聚合酶有活性的温度下孵育。在反应的最初步骤中，反应缓冲液包括缺乏特定dNTP的dNTP的混合物，所述dNTP对应于从第一核酸探针的3'条形码亚结构域‘UMI’的核苷酸的互补物-在该实例中，为dGTP。如果存在靶蛋白质，则探针(包括结合的抗体)将结合靶蛋白质上的各自表位。第二探针的3’未配对引物结构域‘a*’结合第一探针的3'引物-结合结构域'a'，且聚合酶沿着3'条形码亚结构域延伸引物结构域的3'末端，直至其到达'C-终止'分子(黑点)，由此复制‘UMI’序列并置换原始‘UMI’序列。因为原始‘UMI’序列和新形成的拷贝是相同的，它们竞争结合3'条形码亚结构域的互补序列-称为链置换的机制。原始‘UMI’序列与3'条形码亚结构域的互补序列的结合导致新形成的‘UMI’拷贝的置换和两个探针的解离。

在随后的步骤中，将dGTP(从初始反应缺乏的核苷三磷酸)添加至反应缓冲液中。现在，当新形成的'UMI'拷贝(与原始'UMI'相同)竞争胜过原始'UMI'序列以结合5'配对结构域的3'条形码亚结构域中的其互补序列时，聚合酶可以继续延伸通过第一探针的'C-终止'分子(因为反应缓冲液现在包括互补的dGTP)，置换原始'UMI'，并拷贝5'引物-结合结构域'PCR引物2')。当与原始'PCR引物2'连接的原始'UMI'竞争胜过与'PCR引物2'连接的'UMI'的新形成的拷贝以结合5'配对结构域上的其互补序列时，置换新形成的拷贝。该新形成的拷贝(第二探针的延伸)现在可以充当扩增(例如PCR)的模板，所述扩增(例如PCR)使用与5'未配对的引物-结合结构域'PCR引物1'相同的引物和与第一探针'PCR引物2'的5'引物-结合结构域的新形成的拷贝互补。

图4描绘不包括靶蛋白质的反应缓冲液中探针之间的反应机制的实例。在初始反应中，在dGTP不存在的情况下，以与上述相同的方式将第一探针的'UMI'拷贝至第二探针上。无论抗体是否与靶蛋白质结合，都会发生该反应。然而，在随后的反应(其中存在dGTP)中，生成的核酸记录物将不含引物-结合位点'PCR引物2'用于扩增反应。相反，当含有复制的‘UMI’序列的探针结合包含不同UMI序列的另一探针时，不会发生链置换，因为没有竞争性结合。第二探针的引物结构域‘a*’有效地“粘附”至另一探针的互补结构域‘a’。因此，子序列扩增反应不会扩增任何物质，表明靶蛋白质不存在于反应缓冲液中。

探针

本公开提供了核酸探针对，其通常用于检测目标靶分子(例如，蛋白质或核酸)。设计核酸探针以通过核苷酸碱基配对以预定方式彼此相互作用，使得当共定位于靶蛋白质上时，它们的相互作用生成可扩增的核酸记录物以反映两个特定探针确实共定位。同样地，当两个探针相互作用且它们不共定位于靶蛋白质上时，它们的相互作用生成不可扩增的核酸记录物。如果两个探针对都结合相同的靶分子(例如，相同靶蛋白质的不同表位)，则探针被认为是相同对的一部分。如果该对的一个探针结合不同于该对的另一探针结合的靶蛋白质的靶蛋白质，则探针被认为是不同对的一部分。

图2提供了本公开的核酸探针对的一个实例。第一核酸探针(右图)包含(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域‘UMI’连接的5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’，其中3'条形码亚结构域通过缺乏A、T、C或G之一(例如，G)的核苷酸序列(例如，A、C、T)和核苷酸的互补序列(例如，A、G、T)之间的碱基配对形成，和(ii)3’未配对的引物-结合结构域‘a’。对应于从3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的核苷酸(例如，'C-终止子')可以位于3'条形码亚结构域‘UMI’和5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’之间。5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’可以包含终止聚合的5'分子‘终止子’。第二核酸探针(左图)包含与3'引物结构域‘a*’(其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1’。

特定对的核酸探针之一在其3'末端包括引物。“引物”是充当核酸合成的起点的核酸。聚合酶将核苷酸添加至引物中以生成新的核酸链。设计本公开的引物和引物结构域以与引物-结合结构域互补并结合引物-结合结构域。因此，引物长度和组成(例如，核苷酸组成)至少部分地取决于引物-结合结构域的长度和组成。在一些实施方案中，引物或引物结构域具有4至40个核苷酸的长度。例如，引物或引物结构域可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物或引物结构域可以具有4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35或4至40个核苷酸的长度。

“结构域”是指核苷酸或核苷酸碱基对的离散、连续的序列，其取决于结构域是否分别是未配对的(未与互补核苷酸结合的核苷酸的连续段)或配对的(与互补核苷酸结合的核苷酸碱基对-核苷酸的连续段)。在一些实施方案中，为了定义分子内(在相同分子种类内)和分子间(在两个分开的分子种类之间)互补性的目的，将结构域描述为具有多个亚结构域。如果一个结构域含有与另一个结构域的核苷酸碱基配对(通过Watson-Crick核苷酸碱基配对杂交/结合)、使得两个结构域形成配对(双链)或部分配对的分子种类/结构的核苷酸，则一个结构域(或一个亚结构域)与另一个结构域(或另一个亚结构域)“互补”。在一些实施方案中，尽管提供了完全互补性，但互补结构域不需要完全(100％)互补以形成配对的结构。因此，与特定结构域“互补”的引物结合该结构域，例如，持续足以在聚合酶存在的情况下引发聚合的时间。应当理解，“结构域a”、“结构域b”、“结构域c”等是指具有彼此不同的核苷酸序列的结构域。因此，“结构域a”具有不同于“结构域b”的核苷酸序列的核苷酸序列。还应当理解，“结构域a”和“结构域a*”是指具有彼此互补(部分或完全互补)、使得两个结构域能够与彼此杂交(结合)的核苷酸序列的结构域。

核酸的“引物结构域”是作为引物发挥功能的核苷酸序列。引物结构域具有互补的分子间或分子内引物-结合结构域。因此，核酸的“引物-结合结构域”是互补引物结合的核苷酸的序列。引物-结合结构域通常是未配对的结构域，尽管，应当理解，在一些情况下，引物-结合结构域可以包括与配对的亚结构域相邻的未配对的亚结构域。例如，参考图2，从核酸链伸出的暴露的未配对结构域“a”被认为是引物-结合结构域。在一些实施方案中，引物-结合结构域具有4至40个核苷酸(或核苷酸碱基对，或核苷酸和核苷酸碱基对的组合，这取决于引物-结合结构域的未配对和/或配对性质)的长度。例如，引物-结合结构域可以具有4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸(和/或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，引物-结合结构域可以具有4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、4至35或4至40个核苷酸(和/或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，引物-结合结构域长于40个核苷酸。例如，引物-结合结构域可以具有4至100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，引物-结合结构域具有4至90、4至80、4至70、4至60或4至50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，设计引物-结合结构域以适应多于一种(例如，2或3种不同)引物的结合。

如果结构域或其它离散的核苷酸序列彼此邻接(没有将两个结构域分开的核苷酸)，或如果它们在彼此的50个核苷酸(例如，1-50、1-40、1-30、1-20、1-10、1-5)内，则认为它们与彼此“相邻”。也就是说，在一些实施方案中，如果两个结构域彼此分开1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸，则可以认为两个结构域是相邻的。

核苷酸结构域和亚结构域在相对于彼此的3'和/或5'位置方面或相对于探针的整个长度来描述。例如，参考图2，作为实例，左侧显示的发夹结构包括5'配对结构域和3'未配对结构域。3'未配对结构域被标记为'a'，且5'配对结构域包括末端环结构、'PCR引物2'亚结构域和'UMI'亚结构域以及3'未配对结构域'a'。在整个5'配对结构域的背景下，'PCR引物2'亚结构域被认为是5'引物-结合结构域，且'UMI'亚结构域被认为是3'条形码结构域('PCR引物2'结构域位于'UMI'条形码结构域的5'侧)。类似地，右侧的单链核酸结构包括5'未配对引物结合结构域和3'未配对引物结构域。

在一些实施方案中，探针形成发夹结构，其是一段连续核苷酸，其通过分子内碱基配对折叠以形成侧接未配对线性结构域和未配对环结构域的配对结构域，如例如图2(左图)中所示。尽管图中描绘了通常含有环结构域的“发夹”引物，但应当理解，任何发夹引物可以被包括3'未配对结构域(以充当引物)和相邻的5'配对结构域的任何核酸双链体取代。

探针的“未配对结构域”是指不与核苷酸的互补序列结合的核苷酸的序列。例如，单链核酸被认为是“未配对的”核酸。核酸探针对的探针之一通常包括3'未配对引物结构域，其与该对的另一探针的引物-结合结构域互补(并结合)。3'未配对引物结构域(或引物-结合结构域)的长度可以变化。在一些实施方案中，3'未配对引物结构域具有5-40个核苷酸的长度。例如，3'未配对引物结构域(或引物-结合结构域)可以具有2-35、2-30、2-25、2-20、2-15、2-10、5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-40、20-35、20-30、20-25、25-40、25-35、25-30、30-40、30-35或35-40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，3'未配对引物结构域(或引物-结合结构域)具有5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，3'未配对引物结构域(或引物-结合结构域)具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，3'未配对引物结构域(或引物-结合结构域)长于40个核苷酸，或短于5个核苷酸。

探针的“配对结构域”是指与核苷酸的互补序列结合(例如，Watson-Crick核碱基配对)的核苷酸的序列。例如，双链核酸被认为是“配对的”核酸。探针的配对结构域通常位于3'未配对引物-结合结构域的5'侧(并且在一些实施方案中，与之直接相邻)。发夹探针的配对结构域通过单链核酸的分子内碱基配对(同一分子内的核苷酸之间的碱基配对)形成。配对结构域的长度可以不同。在一些实施方案中，配对结构域(或配对结构域内的亚结构域)具有5-40个核苷酸的长度。例如，配对结构域(或配对结构域内的亚结构域)可以具有5-35、5-30、5-25、5-20、5-15、5-10、10-40、10-35、10-30、10-25、10-20、10-15、15-40、15-35、15-30、15-25、15-20、20-40、20-35、20-30、20-25、25-40、25-35、25-30、30-40、30-35或35-40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，配对结构域(或配对结构域内的亚结构域)具有5、10、15、20、25、30、35或40个核苷酸的长度。在一些实施方案中，配对结构域(或配对结构域内的亚结构域)具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的长度。在一些实施方案中，配对结构域(或配对结构域内的亚结构域)长于40个核苷酸，或短于5个核苷酸。

在一些实施方案中，5'配对结构域具有亚结构域(例如，两个亚结构域)，如例如图2中所描绘(参见，例如，其中亚结构域‘PCR引物2’与亚结构域“UMI”相邻并位于亚结构域“UMI”的5'侧)。在一些实施方案中，探针可以含有两个或更多个彼此相同(具有相同的核苷酸序列)的5'配对结构域。例如，图11-13中描绘的核酸探针包括第一亚结构域“UMI”和第二亚结构域“UMI”。

发夹探针的“环结构域”是指在5'配对结构域的末端(邻近)处形成环状结构的未配对结构域。也就是说，环结构域连接核酸的互补结构域以形成5'配对结构域。环结构域的长度可以不同。在一些实施方案中，环结构域具有3至50个核苷酸的长度。例如，环结构域可以具有3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的长度。在一些实施方案中，环结构域具有3-10、3-15、32-10、3-25、3-30、3-35、3-40、3-35、3-40、3-45、3-50、4-10、4-15、4-10、4-25、4-30、4-35、4-40、4-35、4-40、4-45或4-50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，环结构域长于50个核苷酸。

“条形码”结构域或亚结构域是独特地标识特定分子的核苷酸序列。条形码在本领域中也可称为“独特分子标识符”(UMI)。UMI将独特序列与核酸分子缔合，并且可用于独特地标识扩增的核酸分子。条形码结构域通常含有仅含有四个核苷酸中的三个的核苷酸序列。例如，条形码域或亚结构域可以包括(a)仅As、Ts和Cs，(b)仅As、Ts和Gs，(c)仅Gs、Ts和Cs，或(d)仅As、Gs和Cs。因此，条形码结构域或亚结构域可以缺乏(可以不包括)A、T、C或G之一。条形码结构域或亚结构域的长度可以不同。在一些实施方案中，条形码结构域或亚结构域具有3至50或3至200个核苷酸的长度。例如，条形码结构域或亚结构域可以具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，条形码结构域或亚结构域具有3-10、3-15、32-10、3-25、3-30、3-35、3-40、3-35、3-40、3-45、3-50、4-10、4-15、4-10、4-25、4-30、4-35、4-40、4-35、4-40、4-45或4-50个核苷酸的长度。在一些实施方案中，条形码结构域或亚结构域长于50个核苷酸。在一些实施方案中，条形码结构域或亚结构域具有5-10、5-20、5-30、5-40、5-50、5-60、5-70、5-80、5-90或5-100个核苷酸的长度。

如果该结构域仅与该靶标缔合并且可用于仅标识靶分子群体中的该靶分子(包括具有其自身独特的探针的其它靶标)，则核酸探针可以具有被认为对靶标“独特”或“特异性”的结构域。在一些实施方案中，核酸探针包含独特的引物-结合结构域。在一些实施方案中，核酸探针包含独特的条形码亚结构域。

本公开的核酸探针对的探针之一通常包括至少一个终止聚合的分子或修饰(在图2-6、8和10-15中表示为黑点)。终止聚合的分子或修饰(称为“终止子”)通常位于配对结构域的5'末端处，将配对结构域与末端环结构域分离。在这种配置中，终止子能够防止链置换聚合酶延伸通过环结构域。在一些实施方案中，终止聚合的分子是一个或多个天然核苷酸。在一些实施方案中，终止子可以包含一个或多个A、T、C或G核苷酸。例如，图2中第一核酸探针的3'条形码亚结构域中的“C-终止子”包含至少一个C核苷酸，其可以在dGTP不存在的情况下在反应缓冲液中终止聚合。在一些实施方案中，终止子是至少一个C核苷酸。在一些实施方案中，终止子是至少一个G核苷酸。在一些实施方案中，终止子是至少一个A核苷酸。在一些实施方案中，终止子是至少一个T核苷酸。

在一些实施方案中，终止聚合的分子是单个或配对的非天然核苷酸序列，诸如异-dG和异-dC(IDT)，其分别是胞嘧啶和鸟嘌呤的化学变体。异-dC将与异-dG碱基配对(氢键键合)，但不与dG碱基配对。类似地，异-dG将与异-dC碱基配对但不与dC碱基配对。通过在发夹的相对侧上配对并入这些核苷酸，在终止位置，聚合酶将被停止，因为其在溶液中没有互补核苷酸在该位置添加。

在一些实施方案中，RNA碱基和/或甲基化RNA碱基可用作发夹引物内的终止序列。例如，2'-o-甲基化RNA可用作终止聚合的分子。

在一些实施方案中，终止聚合的分子是合成的非DNA接头，例如三乙二醇间隔子，诸如Int Spacer 9(iSp9)或Spacer 18(Integrated DNA Technologies(IDT))。应当理解，可以如本文所提供使用终止聚合酶聚合的任何非天然接头。此类分子和修饰的其它非限制性实例包括三碳键(/iSpC3/)(IDT)、ACRYDITE^TM(IDT)、腺苷酸化、叠氮化物、地高辛(NHS酯)、胆固醇基-TEG(IDT)、I-LINKER^TM(IDT)和3-氰基乙烯基咔唑(CNVK)及其变体。通常，但不总是，短接头(例如，iSp9)导致更快的反应时间。

包括终止聚合的分子或修饰经常在发夹引物的未配对结构域中产生“凸起”，因为所述分子或修饰不配对。因此，在一些实施方案中，与所述分子或修饰相对的发夹引物被设计为包括单个核苷酸(例如，胸腺嘧啶)，至少两个相同核苷酸(例如，胸腺嘧啶二聚体(TT)或三聚体(TTT))，或非自然修饰。

在一些实施方案中，通过将反应中的dNTP浓度(例如，从200μM)降低至100μM、10μM、1μM或更低来改进“终止”分子或修饰的性能效率。

在一些实施方案中(例如，在靶分子存在的情况下)，本公开的靶标检测反应的最终产物是可扩增的(可以通过例如PCR扩增)核酸记录物，其包括至少一个侧接引物结合结构域的条形码、一个从核酸探针对的探针之一附加的引物-结合结构域和另一个从该对的另一个探针附加的引物-结合结构域。此类可扩增的核酸记录物的实例描绘于图8中。

本公开的核酸可以包含DNA、RNA或DNA和RNA的组合。所述核酸可以是单链、双链或部分双链的(含有至少一个单链结构域和至少一个双链结构域)。

图10提供了本公开的核酸探针对的另一个实例。第一核酸探针包含(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域‘UMI’连接的5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’。3'条形码亚结构域‘UMI‘通过缺乏A、T、C或G之一(例如，G)的核苷酸序列(例如，A、C、T)和核苷酸的互补序列(例如，A、G、T)之间的碱基配对形成，和(ii)3’未配对的引物-结合结构域‘a’。对应于从3'条形码亚结构域(‘C-终止子’)缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域(‘UMI’)和5'引物-结合亚结构域‘a’之间。第二核酸探针包含与3'引物结构域‘a*’(其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1’。

图11提供了本公开的核酸探针对的又另一个实例。第一核酸探针包含(i)5'配对结构域，其包含通过独特核苷酸序列和互补核苷酸序列之间的碱基配对形成的条形码‘UMI’，和终止聚合的5'分子‘终止子’，和(ii)3’未配对的引物-结合结构域，其包含中心引物-结合亚结构域‘PCR引物2’，其侧接5'引物-结合亚结构域‘a’，和条形码亚结构域‘UMI’，其缺乏A、T、C或G之一(其中(i)的UMI和(ii)的UMI共享相同的核苷酸序列)。终止聚合的分子‘终止子’位于3'未配对结构域的5'引物-结合亚结构域‘a’和中心引物-结合亚结构域‘PCR引物2’之间。第二核酸探针包含与3'引物结构域‘a*’(其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域的5'引物-结合亚结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1’。

图12提供了本公开的核酸探针对的又另一个实例。第一核酸探针，其包含(i)5'配对结构域，其包含通过独特核苷酸序列和互补核苷酸序列之间的碱基配对形成的条形码‘UMI’，和终止聚合的5'分子(黑点)，(ii)中心未配对引物-结合结构域‘a’，和(iii)3'配对结构域，其包含通过在缺乏A、T、C或G之一的核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的5'配对亚结构域‘PCR引物2’和3'配对条形码亚结构域‘UMI’(其中(i)的UMI和(iii)的UMI共享相同的核苷酸序列)和终止聚合的5'分子(黑点)。第二核酸探针包含与3'引物结构域‘a*’(其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域的5'引物-结合亚结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1’。

图13提供了本公开的核酸探针对的另一个实例。第一核酸探针包含(i)包含通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码‘UMI’的5'配对结构域，其中5'配对结构域‘UMI’侧接终止聚合的5'分子(黑点)和3'未配对引物结构域‘a’，(ii)中心未配对结构域，和(iii)3'配对结构域，其包含通过在独特核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的3'配对条形码亚结构域‘UMI’(其中(i)的UMI和(iii)的UMI共享相同的核苷酸序列)和5'配对亚结构域‘PCR引物2’。第二核酸探针包含与3'引物结构域‘a*’(其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域的5'引物-结合亚结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1’。

各种核酸清除探针可用于公开的方法中以延伸核酸探针而不附加PCR引物-结合结构域。核酸清除探针的实例显示于图5中。在一些实施方案中，清除探针是包含5’未配对结构域(“z”结构域)和3’未配对引物-结合结构域(“a”结构域)的核酸序列，例如，参见图5中的清除探针-1。在一些实施方案中，清除探针是包含5’配对结构域(“z”结构域)、3’未配对(立足)引物-结合结构域(“a”结构域)和“终止”分子的核酸发夹，例如，参见图5中的清除探针-2。在一些实施方案中，清除探针是包含5’配对条形码结构域(“UMI”结构域)、3’未配对(立足)引物-结合结构域(“a”结构域)和“终止”分子的核酸发夹，例如，参见图5中的清除探针-3。

在一些实施方案中，本文提供了核酸探针对。此类核酸探针对旨在彼此组合使用以检测靶标。在一些实施方案中，本文提供了多个核酸探针。“多个”包含至少两个核酸探针。在一些实施方案中，所述多个包含2至2百万个核酸探针(例如，独特的探针)。例如，多个可以包含100、500、1000、5000、10000、100000、1000000或更多个核酸探针。本公开不限定于这方面。

如本文提供的核酸探针可以与可检测分子(例如，发射可检测信号(诸如荧光或化学发光信号)的分子)连接(用其标记)。在一些实施方案中，所述标记物是荧光团。与荧光团或其它荧光/化学发光分子连接的引物简称为“荧光引物”。本文可使用的荧光团的实例包括但不限于羟基香豆素、甲氧基香豆素、Alexa fluor、氨基香豆素、Cy2、FAM、Alexa fluor405、Alexa fluor 488、Fluorescein FITC、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、HEX、Cy3、TRITC、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-藻红蛋白(PE)、罗丹明Red-X、Tamara、Cy3.5581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、德克萨斯红、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、别藻蓝蛋白、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7和Cy7.5。本公开涵盖发射可检测信号的其它荧光团和分子。

探针对的额外实例显示于图28、29和35中。

靶标-结合分子

本公开的核酸探针通常通过靶标-结合分子结合靶标。在一些实施方案中，靶标-结合分子附接至探针的5'末端(例如，引物-结合区域远端的末端)。在一些实施方案中，靶标-结合分子与以发夹形式排列的探针的单链环区域连接(参见，例如，图2)。

如本文提供的探针可以与特异性结合靶标的分子(例如，结合蛋白质的分子，诸如抗体，参见图2)连接(用其标记)。结合分子可以是，但不限于，基于氨基酸或基于核酸的。基于氨基酸的结合分子的实例是抗体和抗原-结合抗体片段。抗体和片段可以是单克隆抗体。基于核酸的结合分子的实例是适体。

用于如本文提供使用的靶标结合分子的实例包括但不限于生物素、抗体、适体、纳米体、核酸、药物(例如，小分子药物)和原子(例如Li)。考虑其它靶标结合分子。在一些实施方案中，靶标结合分子可以通过杂交或“点击化学”附接至探针。参见，例如，Kolb H.C.,等人Angewandte Chemie International Edition 2001,40(11):2004–2021；和EvansR.A.Australian Journal of Chemistry,2007,60(6):384–395。

如本文所用，“抗体”包括全长抗体及其任何抗原结合片段(例如，“抗原结合部分”)或单链。术语“抗体”包括但不限于包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。抗体可以是多克隆或单克隆的；异种(xenogeneic)、同种异体(allogeneic)、或同基因的(syngeneic)；或其修饰形式(例如，人源化的、嵌合的)。

如本文所用，抗体的“抗原结合部分”是指抗体的保留特异性结合抗原的能力的一个或多个片段。抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段行使。涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VH、VL、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含通过二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段，(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature 341:544 546,1989)；以及(vi)分离的互补性决定区(CDR)，或(vii)可任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VH和VL由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头接合，所述合成接头能够使其制成其中VH和VL区配对以形成单价分子的单蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等人Science 242:423 426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883,1988)。此类单链抗体也涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。使用本领域技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并且以与完整抗体相同的方式针对所述片段筛选效用。

如本文所用，“核酸适体”是指可以形成能够特异性结合蛋白质或其它细胞靶标的二级和三级结构的小RNA或DNA分子(参见，例如，NiX,等人Curr Med Chem.18(27):4206–4214,2011)。

在一些实施方案中，可能优选用结合靶蛋白质上不同表位的分子标记核酸探针对。例如，第一探针可以与特异性结合靶蛋白质上的第一表位的分子缀合，且第二探针可以与特异性结合靶蛋白质上的第二表位的分子缀合。

靶标

事实上，可以使用公开的方法检测任何目标靶标，条件是存在合适的结合分子。本公开中包括的描绘检测蛋白质靶标的实例用于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。

靶标的实例包括但不限于蛋白质，糖(例如多糖)，脂质，核酸(例如DNA，RNA，微RNA)和小分子。靶标可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，靶标是RNA干扰分子，诸如短干扰RNA(siRNA)或微RNA(microRNA)。在一些实施方案中，靶标是反义分子，例如DNA反义合成寡核苷酸(ASO)。

在一些实施方案中，分子靶标是生物分子。如本文所用，“生物分子”是由生物体产生的任何分子，包括大分子诸如蛋白质，多糖，脂质和核酸(例如，DNA和RNA如mRNA)，以及小分子诸如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。分子靶标，特别是生物分子的实例包括但不限于DNA，RNA，cDNA或经历反转录的RNA的DNA产物，A23187(卡西霉素，钙离子载体)，阿维菌素，松香酸，乙酸，乙酰胆碱，肌动蛋白，放线菌素D，腺苷，二磷酸腺苷(ADP)，单磷酸腺苷(AMP)，三磷酸腺苷(ATP)，腺苷酸环化酶，核糖醇，肾上腺素(Adrenaline)，肾上腺素(epinephrine)，促肾上腺皮质激素(ACTH)，水母发光蛋白，黄曲霉毒素，琼脂，Alamethicin，丙氨酸，白蛋白，醛固酮，阿仑膦酮，α-淀粉蛋白，尿囊素，烯丙菊酯，α-阿马丁，氨基酸，淀粉酶，合成代谢类固醇，茴香脑，血管紧张素原，异新霉素，抗利尿激素(ADH)，阿拉伯糖，精氨酸，子囊霉素，抗坏血酸(维生素C)，天冬酰胺，天冬氨酸，不对称二甲基精氨酸，心钠素(ANP)，生长素，抗生物素蛋白，印苦楝子素A-C35H44O16，细菌素，白藜芦醇，比丘核苷，胆红素，生物聚合物，生物素(维生素H)，布雷菲德菌素A，油菜素内酯，布鲁宁，尸胺，咖啡因，钙化醇(维生素D)，降钙素，钙调蛋白，钙调蛋白，钙网蛋白，樟脑-(C10H16O)，大麻酚，辣椒素，碳水化合物，碳水化合物，肉碱，卡拉胶，酪蛋白，胱天蛋白酶，纤维素酶，纤维素-(C6H10O5)，变蓝菌素，西曲溴铵(西三溴铵)-C19H42BrN，白屈菜赤碱，色霉素A3，Chaparonin，壳多糖，α-氯洛糖，叶绿素，缩胆囊素(CCK)，胆固醇，胆碱，硫酸软骨素，肉桂醛，柠檬醛，柠檬酸，橘霉素(Citrinin)，香茅醛，香茅醇，瓜氨酸，钴胺素(维生素B12)，辅酶，辅酶Q，秋水仙碱，胶原蛋白，Coniine，皮质类固醇，皮质酮，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)，皮质醇，肌酸，肌酸激酶，结晶蛋白，α-环糊精，环糊精糖基转移酶，环杷明(Cyclopamine)，环钛酸，半胱氨酸，胱氨酸，胞苷(Cytidine)，松胞菌素，松胞菌素E，细胞色素，细胞色素C，细胞色素C氧化酶，细胞色素C过氧化物酶，细胞因子，胞嘧啶-C4H5N3O，脱氧胆酸，DON(脱氧新戊酚)，脱氧呋喃核糖，脱氧核糖，脱氧核糖核酸(DNA)，葡聚糖，糊精，DNA，多巴胺，酶，麻黄素，肾上腺素-C9H13NO3，芥酸-CH3(CH2)7CH＝CH(CH2)11COOH，赤藓糖醇，促红细胞生成素(EPO)，雌二醇，丁子香酚，脂肪酸，纤维蛋白，纤连蛋白，叶酸(维生素M)，促卵泡激素(FSH)，甲醛，甲酸，Formnoci，果糖，Fumonisin B1，Gamma球蛋白，半乳糖，γ-球蛋白，γ-氨基丁酸，γ-丁内酯，γ-羟基丁酸(GHB)，胃泌素，明胶，香叶醇，球蛋白，胰高血糖素，葡萄糖胺，葡萄糖-C6H12O6，葡萄糖氧化酶，谷蛋白，谷氨酸，谷氨酰胺，谷胱甘肽，谷蛋白，甘油(甘油)，甘氨酸，糖原，乙醇酸，糖蛋白(例如糖蛋白酶如前列腺特异性抗原(PSA))，促性腺激素(GnRH)，粒酶，绿色荧光蛋白，生长激素，生长激素释放激素(GHRH)，GTP酶，鸟嘌呤，鸟苷，三磷酸鸟苷(+GTP)，海珠蛋白，苏木精，血红素，血红蛋白，血蓝蛋白，血红蛋白，血红蛋白，硫酸肝素，高密度脂蛋白，HDL，组胺，组氨酸，组蛋白，组蛋白甲基转移酶，HLA抗原，同型半胱氨酸，激素，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，人生长激素，透明质酸盐，透明质酸酶，过氧化氢，5-羟甲基胞嘧啶，羟脯氨酸，5-羟基色胺，靛蓝染料，吲哚，肌苷，肌醇，胰岛素，胰岛素样生长因子，整合膜蛋白，整合酶，整合素，蛋白质，干扰素，菊糖，离子霉素，紫罗酮，异亮氨酸，铁硫簇，K252a，K252b，KT5720，KT5823，角蛋白，激酶，乳糖酶，乳酸，乳糖，羊毛脂，月桂酸，瘦素，轻肌蛋白B，亮氨酸，木质素，柠檬烯，芳樟醇，亚油酸，亚麻酸，脂肪酶，脂质，脂质锚定蛋白，脂酰胺，脂蛋白，低密度脂蛋白，LDL，促黄体激素(LH)，番茄红素，赖氨酸，溶菌酶，苹果酸，麦芽糖，褪黑素，膜蛋白，金属蛋白，金属硫蛋白，甲硫氨酸，含羞草素，光神霉素A，丝裂霉素C，单体，霉酚酸，肌红蛋白，肌球蛋白，天然酚，核酸，赭曲霉毒素A，雌激素，寡肽，寡核苷酸，地衣酚，阿立新，鸟氨酸，草酸，氧化酶，催产素，p53，PABA，紫杉醇，棕榈酸，泛酸(维生素B5)，甲状旁腺激素(PTH)，副蛋白质，豹毒素，欧苷菊，棒曲霉素，蕈青霉素，青霉酸，青霉素，青霉震颤素A，肽酶，胃蛋白酶，肽，表霉素，外周膜蛋白，Perosamine，苯乙胺，苯丙氨酸，肌磷酸，磷酸酶，磷脂，苯丙氨酸，植酸，植物激素，多肽，多酚，多糖，卟啉，朊病毒，孕酮，催乳素(PRL)，脯氨酸，丙酸，鱼精蛋白，蛋白酶，蛋白质，类蛋白，腐胺，除虫菊酯，吡哆素或吡哆胺(维生素B6)，吡咯赖斯，丙酮酸，喹诺酮，萝沙星，棉子糖，肾素，视黄醇，视黄醇(维生素A)，视紫红质(视紫色)，核黄素(维生素B2)，呋喃核糖，核糖，核酶，蓖麻毒素，RNA-核糖核酸，RuBisCO，黄樟脑，水杨醛，水杨酸，Salvinorin-A-C23H28O8，皂苷，秘密蛋白，硒代半胱氨酸，硒代甲硫氨酸，硒蛋白，丝氨酸，丝氨酸激酶，血清素，粪臭素，信号识别颗粒，生长抑素，山梨酸，角鲨烯，星形孢菌素，硬脂酸，白藜芦醇，甾醇，士的宁，蔗糖(糖)，糖(一般的)，超氧化物，τ蛋白，T2毒素，丹宁酸，鞣酸，酒石酸，牛磺酸，河豚毒素，竹竿蛋白，拓扑异构酶，酪氨酸激酶，牛磺酸，睾酮，四氢大麻酚(THC)，河豚毒素，毒胡萝卜素，Thaumatin，硫胺素(维生素B1)-C12H17ClN4OS·HCl，苏氨酸，血小板生成素，胸腺嘧啶，胸腺嘧啶，Triacsin C，促甲状腺激素(TSH)，促甲状腺激素释放激素(TRH)，甲状腺素(T4)，生育酚(维生素E)，拓扑异构酶，三碘甲状腺原氨酸(T3)，跨膜受体，曲古抑菌素A，营养激素，胰蛋白酶，色氨酸，微管蛋白，突触蛋白，酪氨酸，泛素，尿嘧啶，尿素，尿素酶，尿酸-C5H4N4O3，尿苷，缬氨酸，瓦林霉素，Vanabin，加压素，疣孢菌素，维生素(一般的)，维生素A(视黄醇)，维生素B，维生素B1(硫胺素)，维生素B2(核黄素)，维生素B3(尼克酸或烟酸)，维生素B4(腺嘌呤)，维生素B5(泛酸)，维生素B6(吡哆醇或吡哆胺)，维生素B12(钴胺素)，维生素C(抗坏血酸)，维生素D(促钙醇)，维生素E(生育酚)，维生素F，维生素H(生物素)，维生素K(萘醌)，维生素M(叶酸)，渥曼青霉素和木糖。

在一些实施方案中，分子靶标是蛋白质靶标，诸如，例如细胞环境的蛋白质(例如细胞内蛋白或膜蛋白)。蛋白质的实例包括但不限于纤维蛋白诸如细胞骨架蛋白(例如肌动蛋白，arp2/3，冠状蛋白，肌营养不良蛋白，FtsZ，角蛋白，肌球蛋白，伴肌动蛋白，血影蛋白，tau，肌联蛋白，原肌球蛋白，微管蛋白和胶原)和细胞外基质蛋白质(例如，胶原蛋白，弹性蛋白，f-脊椎动物，皮卡丘林和纤连蛋白)；球蛋白诸如血浆蛋白(诸如血清淀粉样蛋白P成分和血清白蛋白)，凝血因子(诸如补体蛋白，C1抑制剂和C3转化酶，因子VIII，因子XIII，纤维蛋白，蛋白C，蛋白S，蛋白Z，蛋白Z相关蛋白酶抑制剂，凝血酶，血管性血友病因子)和急性期蛋白诸如C反应蛋白；血红素蛋白；细胞粘附蛋白(例如钙粘蛋白，室芬灵，整联蛋白，Ncam和选择蛋白)；跨膜转运蛋白(例如CFTR，血型糖蛋白D和爬行酶)例如离子通道(例如，配体门控离子通道，如烟碱乙酰胆碱受体和GABAa受体，以及电压门控离子通道如钾，钙和钠通道)，同向运输/反向运输蛋白(如葡萄糖转运蛋白)；激素和生长因子(例如表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，血管内皮生长因子(VEGF)，肽激素诸如胰岛素，胰岛素样生长因子和催产素，和类固醇激素如雄激素，雌激素和孕激素)；受体如跨膜受体(例如G蛋白偶联受体，视紫红质)和细胞内受体(如雌激素受体)；DNA结合蛋白(例如组蛋白，原蛋白，CI蛋白)；转录调节物(例如，c-myc，FOXP2，FOXP3，MyoD和P53)；免疫系统蛋白(例如，免疫球蛋白，主要组织相容性抗原和T细胞受体)；营养储存/转运蛋白(例如铁蛋白)；伴侣蛋白；和酶。

本公开的探针、系统、方法和试剂盒可用于检测单一靶分子或多种靶分子。例如，可以例如在单一反应中检测至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或100种不同的靶分子。

有利地，本公开的探针、系统、方法和/或试剂盒可用于检测反应中存在的具有低拷贝数的靶分子。例如，可以使用如本文提供的探针、系统、方法和/或试剂盒检测10-100(例如，10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100)的拷贝数。

反应条件

本公开的靶标检测反应可以作为“一锅合成”反应进行，其中核酸探针对在单个容器中进行连续和/或同时反应(例如，退火、链置换、延伸等)。此类反应可以包括靶分子、核酸探针对、聚合酶和核苷酸三磷酸。通常，反应的所有组分都在反应缓冲液中提供。

在一些实施方案中，所述聚合酶是DNA聚合酶(DNAP)，诸如具有DNA链置换活性的DNA聚合酶(链置换聚合酶)。“链置换”描述置换合成期间遇到的下游DNA的能力。可以如本文提供的那样使用的具有DNA链置换活性的聚合酶的实例包括但不限于phi29DNA聚合酶(例如，NEB#M0269)，Bst DNA聚合酶，大片段(例如，NEB#M0275)或Bsu DNA聚合酶，大片段(例如，NEB#M0330)。可以使用具有链置换活性的其它聚合酶。在一些实施方案中，所述聚合酶是RNA聚合酶。

在一些实施方案中，所述聚合酶是phi29DNA聚合酶。在此类实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如，50mM Tris-HCl,10mM MgCl2,10mM(NH4)2SO4,4mM DTT)，其补充有纯化的牛血清白蛋白(BSA)，pH 7.5，在30℃下孵育。

在一些实施方案中，所述聚合酶是Bst DNA聚合酶，大片段。在此类实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如，20mM Tris-HCl,10mM(NH4)2SO4,10mM KCl,2mMMgSO4,0.1％X-100),pH 8.8，在65℃下孵育。

在一些实施方案中，所述聚合酶是Bsu DNA聚合酶。在此类实施方案中，反应条件可以如下：1X反应缓冲液(例如，50mM NaCl,10mM Tris-HCl,10mM MgCl2,1mM DTT),pH7.9，在37℃下孵育。

靶标检测反应系统中靶序列、引物和dNTP的浓度可以根据例如特定应用(例如，指数扩增、实时监测等)和该特定应用所需的动力学而变化。

靶标检测反应中引物的浓度可以是例如10pM至1000pM。在一些实施方案中，反应中的探针浓度为10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、10-80、10-90、10-100、10-125、10-150、10-200、25-50、25-75、25-100、25-150、25-200、50-75、50-100、50-150或50-200pM。在一些实施方案中，反应中的探针浓度为100-200、100-300、100-400、100-500、100-600、100-70、100-800、100-900或100-1000pM。在一些实施方案中，反应中的探针浓度为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200pM。在一些实施方案中，反应中的探针浓度为100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000pM。反应中探针的浓度可以小于10pM或大于1000pM。

靶标检测反应中核苷酸三磷酸(例如，dNTP或rNTP)的浓度可以是，例如，2-1000μM。在一些实施方案中，靶标检测反应中的dNTP或rNTP浓度为2-10μM、2-15μM、2-20μM、2-25μM、2-30μM、2-35μM、2-40μM、2-45μM、2-50μM、2-55μM、2-60μM、2-65μM、2-70μM、2-75μM、2-80μM、2-85μM、2-90μM、2-95μM、2-100μM、2-110μM、2-120μM、2-130μM、2-140μM、2-150μM、2-160μM、2-170μM、2-180μM、2-190μM、2-200μM、2-250μM、2-300μM、2-350μM、2-400μM、2-450μM、2-500μM、2-600μM、2-700μM、2-800μM、2-900μM或2-1000μM。例如，靶标检测反应中的dNTP或rNTP浓度可以是2μM、5μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、50μM、55μM、60μM、65μM、70μM、75μM、80μM、85μM、90μM、95μM、100μM、105μM、110μM、115μM、120μM、125μM、130μM、135μM、140μM、145μM、150μM、155μM、160μM、165μM、170μM、175μM、180μM、185μM、190μM、195μM或200μM。在一些实施方案中，扩增反应中的dNTP或rNTP浓度为10-20μM、10-30μM、10-40μM、10-50μM、10-60μM、10-70μM、10-80μM、10-90μM或10-100μM。

例如，可以通过改变温度、时间、缓冲液/盐条件和脱氧核糖核苷酸三磷酸(dNTP)浓度来控制靶标检测反应的动力学。与大多数酶一样，聚合酶对许多缓冲条件敏感，包括离子强度、pH和存在的金属离子的类型(例如，钠离子vs.镁离子)。因此，“链置换聚合酶有活性(和进行扩增反应)的温度”可以在例如4℃至65℃之间变化(例如，4℃、25℃、37℃、42℃或65℃)。在一些实施方案中，链置换聚合酶有活性的温度为4-25℃、4-30℃、4-35℃、4-40℃、4-45℃、4-50℃、4-55℃、4-60℃、10-25℃、10-30℃、10-35℃、10-40℃、10-45℃、10-50℃、10-55℃、10-60℃、25-30℃、25-35℃、25-40℃、25-45℃、25-50℃、25-55℃、25-60℃、25-65℃、35-40℃、35-45℃、35-50℃、35-55℃、35-60℃或35-65℃。在一些实施方案中，链置换聚合酶有活性的温度是室温，而在其它实施方案中，扩增反应在37℃下进行。

靶标检测反应可以进行(孵育)1分钟(min)至1小时(hr)或更长时间。在一些实施方案中，靶标检测反应进行1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、1hr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr、7hr、8hr、9hr、10hr、11hr、12hr、18hr或24hr。

在一些实施方案中，使用核苷酸三磷酸变体。例如，热启动/清洁扩增dNTP、硫代磷酸酯dNTP或荧光dNTP。可以使用核苷酸三磷酸变体。

可用于靶标检测反应的反应缓冲液包括但不限于“Thermo-Pol Buffer”(NewEngland Biolabs)，磷酸盐缓冲盐水(有或没有Mg或Na补充)，任何商业或实验室制备的细胞培养基，补充有足以进行DNA杂交和聚合酶操作的阳离子盐的水和任何pH-缓冲溶液。在一些实施方案中，反应缓冲液可以具有0.25-15mM Mg和/或50-250mM Na的盐浓度。

检测

通过可扩增的核酸分子(也称为核酸记录物或简称为“记录物”)的存在来检测单一分子。在一些实施方案中，记录物是双链的。在一些实施方案中，记录物是单链的。记录物的长度可以不同。例如，条形码化记录物可以具有30至500个核苷酸(或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，条形码化记录物具有30至100、30至200、30至300、30至400、50至100、50至200、50至300、50至400或50至500个核苷酸(或核苷酸碱基对)的长度。在一些实施方案中，条形码化记录物具有80至100个核苷酸(或核苷酸碱基对)或90个核苷酸(或核苷酸碱基对)的长度。

在一些实施方案中，通过凝胶电泳的直接观察或通过PCR的扩增和定量来“解码”条形码化记录物(参见例如，图6)。高通量测序也由本公开涵盖，并且可用于检测可扩增核酸分子的数目(参见，例如，图7和图9)。在一些实施方案中，引物-结合结构域和PCR-引物-结合结构域具有不同的序列，并且可用于以多重测定形式检测多种不同的靶标(参见例如，图8)。

系统和试剂盒

本文还提供了靶标检测系统和试剂盒。靶标检测系统或试剂盒可以包含至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100种)本公开的核酸探针对。在一些实施方案中，靶标检测系统或试剂盒进一步包含与第一核酸探针的5'引物-结合亚结构域互补的引物，和与第二核酸探针的5'引物-结合结构域具有至少95％同一性(或相同)的引物。

在一些实施方案中，靶标检测系统或试剂盒进一步包含链置换聚合酶。

在一些实施方案中，靶标检测系统或试剂盒进一步包含核酸清除探针，其包含与第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'引物-结合结构域。清除探针可以包含，例如，与第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'未配对结构域。

在一些实施方案中，靶标检测系统或试剂盒进一步包含至少一种(例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50或100种)靶分子(例如，蛋白质)。

额外实施方案

本公开的额外实施方案由以下编号的段落表示。

1.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域连接的5'引物-结合亚结构域，其中3'条形码亚结构域通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和

(ii)3'未配对的引物-结合结构域，

其中对应于从3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域和5'引物-结合亚结构域之间，且其中5'引物-结合亚结构域包含终止聚合的5'分子；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域互补。参见，例如，图2。在一些情况下，所述第二核酸探针不包括条形码结构域。

2.段落1的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶蛋白质上的第一表位的分子缀合，且第二探针与特异性结合靶蛋白质上的第二表位的分子缀合。在一些实施方案中，可以检测多种靶分子，因此，所述第一探针可以与特异性结合第一靶分子的亲和分子缀合，且第二探针可以与特异性结合第二靶分子的亲和分子缀合。

3.段落2的核酸探针对，其中所述分子是抗体或适体。

4.靶标检测系统，其包含段落1-3中任一项的核酸探针对。

5.段落4的靶标检测系统，其进一步包含

与所述第一核酸探针的5'引物-结合亚结构域互补的引物；和

与所述第二核酸探针的5'引物-结合结构域具有至少95％同一性(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％同一性)的引物。

6.段落4或5的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

7.段落4-6中任一项的靶标检测系统，其进一步包含核酸清除探针，其包含与第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'引物-结合结构域。

8.段落7的靶标检测系统，其中所述清除探针包含与所述第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'未配对结构域。

9.段落4-8中任一项的靶标检测系统，其进一步包含至少一种靶分子。

10.检测至少一种(例如，多种，例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种)靶分子的方法，其包括：

在所述链置换聚合酶有活性的温度下，在包含链置换聚合酶和任选至少一种靶分子的反应缓冲液中孵育

(a)段落1-3中任一项的核酸探针对，和

(b)缺乏dATP、dTTP、dCTP或dGTP之一的dNTP的混合物，其中缺乏的dNTP对应于从所述第一核酸探针的3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的互补序列；

任选地向所述反应缓冲液中添加核酸清除探针，和在所述链置换聚合酶有活性的温度下孵育所述反应缓冲液；且然后

在dATP、dTTP、dCTP和dGTP存在的情况下在链置换聚合酶有活性的温度下孵育所述反应缓冲液，由此产生所述核酸探针对之间相互作用的记录物。

11.段落10的方法，其进一步包括使用与所述第一核酸探针的5'引物-结合亚结构域互补的引物和与所述第二核酸探针的5'引物-结合结构域具有至少95％同一性(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％同一性)的引物进行所述记录物的核酸扩增反应，任选地其中所述扩增反应在所述核酸探针对存在的情况下进行。

12.多个段落1-3中任一项的核酸探针对，其中至少一个(例如，至少2、3、4、5或更多个)引物结合结构域是独特的，其中每个引物-结合结构域是独特的，或其中不同的条形码亚结构域序列以多个存在。

13.段落12的多个核酸探针对，其中所述多个核酸探针对包含至少10对核酸条形码探针。

14.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域连接的5'引物-结合亚结构域，其中所述3'条形码亚结构域通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和

(ii)3'未配对的引物-结合结构域，其中对应于从3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域和5'引物-结合亚结构域之间；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域互补。

15.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选地靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)段落14的核酸探针对，和

(b)缺乏dATP、dTTP、dCTP或dGTP之一的dNTP的混合物，其中缺乏的dNTP对应于从所述第一核酸探针的3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的互补序列；且然后

在从(b)的dNTP的混合物缺乏的dNTP存在的情况下在链置换聚合酶有活性的温度下孵育所述反应缓冲液，由此产生所述核酸探针对之间相互作用的记录物。

16.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，和终止聚合的5'分子，和

(ii)3’未配对引物-结合结构域，其包含侧接5'引物-结合亚结构域的中心引物-结合亚结构域和与(i)的核苷酸的条形码序列相同的条形码亚结构域，其中终止聚合的分子位于3'未配对结构域的5'引物-结合亚结构域和中心引物-结合亚结构域之间；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域的5'引物-结合亚结构域互补。

17.检测靶分子的方法，其包括：

在所述链置换聚合酶有活性的温度下，在包含链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)段落16的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

18.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，和终止聚合的5'分子，和

(ii)中心未配对引物-结合结构域，和

(iii)3'配对结构域，其包含通过在与(i)的核苷酸的条形码序列相同的核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的5'配对亚结构域和3'配对条形码亚结构域，和终止聚合的5'分子；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的中心未配对引物-结合结构域互补。

19.检测靶分子的方法，其包括：

在所述链置换聚合酶有活性的温度下，在包含链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)段落18的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

20.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，其中所述5'配对结构域侧接终止聚合的5'分子和3'未配对引物结构域，

(ii)中心未配对结构域，和

(iii)3'配对结构域，其包含通过在与(i)的核苷酸的条形码序列相同的核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的3'配对条形码亚结构域，和5'配对亚结构域；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的中心未配对引物-结合结构域互补。

21.检测靶分子的方法，其包括：

在所述链置换聚合酶有活性的温度下，在包含链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)段落20的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

22.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，且

其中立足结构域b和立足结构域a是未配对的，结构域c与结构域c*互补和结合，且结构域b*与结构域b互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图28。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

23.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其包含结构域b*，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c、立足结构域b、终止分子和立足结构域a，

其中立足结构域a、立足结构域b和结构域c是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图35(1)。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

24.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

终止分子、结构域b和立足结构域a，且

其中立足结构域b、结构域c和结构域a是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图35(2)。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

25.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，

其中立足结构域b和立足结构域a是未配对的，结构域c与结构域c*互补和结合，且结构域b*与结构域b互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图35(3)。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

26.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含结构域c*、终止分子、结构域c和立足结构域b，

其中立足结构域b是未配对的，且结构域c与结构域c*互补和结合，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含结构域b*、终止分子、结构域b和立足结构域a，

其中立足结构域a是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图35(4)。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

27.段落22-26中任一项的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶分子上的第一区域的亲和分子缀合，且所述第二探针与特异性结合靶分子上的第二区域的亲和分子缀合。

28.段落27的核酸探针对，其中所述靶分子是蛋白质。

29.段落28的核酸探针对，其中所述亲和分子是抗体。

30.段落28的核酸探针对，其中所述亲和分子是适体。

31.靶标检测系统，其包含段落22-30中任一项的核酸探针对。

32.段落31的靶标检测系统，其进一步包含

与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％(例如，至少96、97、98、99或100％)同一性的引物；和

与结构域d*具有至少95％(例如，至少96、97、98、99或100％)同一性的引物。

33.段落31或32的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

34.段落31-33中任一项的靶标检测系统，其进一步包含靶分子。

35.检测靶分子的方法，其包括：

在反应缓冲液中在所述链置换聚合酶有活性的温度下孵育段落22-30中任一项的核酸探针对、链置换聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和靶分子，以产生所述核酸探针对之间的相互作用的记录物。

36.段落35的方法，其进一步包括使用与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％(例如，至少96、97、98、99或100％)同一性的引物和与结构域d*具有95％(例如，至少96、97、98、99或100％)同一性的引物进行记录物的核酸扩增反应。

37.多个段落22-30中任一项的核酸探针对，其中每个引物-结合结构域是独特的。

38.段落37的多个核酸探针对，其包含至少10对核酸条形码探针。

39.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含结构域b*、终止分子、结构域e和立足结构域b，

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，和

(iii)第三核酸链，其以5'至3'方向包含结构域e*、终止分子、结构域c和立足结构域e，且

其中立足结构域b、立足结构域a和立足结构域e是未配对的，结构域e与结构域e*互补和结合，结构域b与结构域b*互补和结合，且结构域c与结构域c*互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。参见，例如，图29。在一些实施方案中，结构域d与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

40.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含5'结构域、终止分子、3'结构域和立足结构域，和

(ii)至少一条额外核酸链，其以5'至3'方向包含5'结构域、终止分子、3'结构域和立足结构域，

其中每个立足结构域是未配对的，且所述第一核酸探针的每个5'结构域与所述第一核酸探针的单个3'结构域互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含5'结构域和3'结构域的核酸链，

其中所述第二核酸探针的3'结构域与所述第一核酸探针的第一核酸链的立足结构域互补。参见，例如，图29。在一些实施方案中，所述第二核酸探针的5'结构域与用于生成记录物用于测序的PCR引物之一具有至少95％(例如，至少96％、97％、98％、99％或100％)同一性(参见，例如，图32)。

41.段落40的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶分子上的第一区域的亲和分子缀合，且所述第二探针与特异性结合靶分子上的第二区域的亲和分子缀合。

42.靶标检测系统，其包含段落40或41的核酸探针对。

43.段落42的靶标检测系统，其进一步包含

与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物；和

与结构域d*具有至少95％同一性的引物。

44.段落42或43的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

45.段落42或43的靶标检测系统，其进一步包含靶蛋白质。

46.检测靶分子的方法，其包括：

在反应缓冲液中在链置换聚合酶有活性的温度下孵育段落40或41的核酸探针对、所述链置换聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和靶分子，以产生所述核酸探针对之间的相互作用的记录物。

47.段落46的方法，其进一步包括使用与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物和与结构域d*具有95％同一性的引物进行记录物的核酸扩增反应。

48.多个段落40或41的核酸探针对，其中每个引物-结合结构域是独特的，或其中所述多个核酸探针对包含不同的引物结合结构域。

49.段落48的多个核酸探针对，其包含至少10对核酸条形码探针。

50.前述权利要求中任一项的对、系统或方法，其中所述分子是抗体，任选地其中所述抗体是单克隆抗体。

51.前述权利要求中任一项的对、系统或方法，其中所述分子是抗体，任选地其中所述抗体是多克隆抗体。

52.前述权利要求中任一项的对、系统或方法，其中所述分子是适体。

53.前述权利要求中任一项的对、系统或方法，其中所述抗体或适体对其结合配偶体(例如，抗原)具有50nM或更小(例如，50nM、10nM、1nM、500pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM或更小)的亲和力(K_D)。

54.前述权利要求中任一项的对、系统或方法，其中所述抗体或适体对其结合配偶体(例如，抗原)具有5nM或更大(例如，5nM、10nM、100nM、500nM、1uM或更大)、例如5nM至1uM、5nM至500nM、5nM至100nM、10nM至100nM或10nM至1uM的亲和力(K_D)。

55.试剂盒，其包含段落1-3、14-16、18、20、22-30和39-41中任一项的核酸探针对，或权利要求4-9和32-34中任一项的靶标检测系统。

实施例

实施例1.引物延伸是特异性的。

本实施例表明在条件性引物延伸(CPE)方法中使用的引物被特异性延伸以附加结构域，例如引物-结合结构域。如图14中所示，与核酸碱基配对的引物(箭头)被聚合酶延伸以附加结构域，而错配引物不能被延伸。将引物荧光标记用于通过凝胶电泳检测。

左侧的示意图显示靶引物的生成。为了检查引物延伸的特异性，将具有不同碱基对突变的引物的延伸与“正确的”(靶)引物进行比较。在将50nM cHairpin和50nM引物(P1*、P1*-Mut1、P1*-Mut2或P1*-Mut3)在37℃下孵育10分钟后进行凝胶电泳。如图14中所示，只有正确编码的引物才能被有效地延伸。分支迁移结构域中的单一碱基错配显著降低了引物延伸率。

实施例2.引物延伸附加多个结构域。

本实施例表明条件性引物延伸方法中使用的引物被延伸以附加多个结构域。如图15中所示，与核酸碱基配对的引物被延伸以附加引物-结合结构域(“1*”结构域)。附加的结构域与核酸碱基配对并延伸以附加第二引物-结合结构域。该反应与以下重复：第一引物-结合结构域(“1*”结构域)和第二引物-结合结构域的碱基配对，由此将发夹附加至引物上。将引物荧光标记用于通过凝胶电泳检测。

实施例3.条形码(UMI)拷贝过程。

本实施例表明条形码(UMI)拷贝过程。将20nM CPE发夹与10nM延伸引物(extPrimer)在25℃下在dATP、dTTP和dCTP存在的情况下孵育，孵育时间如图16中所示。如图中所示，在拷贝延伸引物上的条形码后，CPE发夹的“C-终止子”有效地终止了聚合酶。

为了探索UMI的有效性，将20nM具有UMI的CPE发夹在20℃下与10nM延伸引物孵育1小时，然后在37℃下在dATP、dTTP、dCTP和聚合酶存在的情况下孵育30分钟。然后，将dGTP添加至混合物中，并将混合物在20℃下孵育图17中所示的时间。凝胶电泳显示，当用UMI印迹的延伸引物不与CPE发夹共定位时，它们在从原始发夹解离后生成很少完整记录物至没有生成完整记录物。

作为对照实验，将20nM具有UMI或固定条形码的CPE发夹在20℃下与10nM延伸引物孵育1小时，然后在37℃下在dATP、dTTP、dCTP和聚合酶存在的情况下孵育30分钟。然后，将dGTP添加至混合物中，并将混合物在20℃下孵育30分钟。如图18中所示，当用固定条形码印迹的延伸引物未与CPE发夹共定位时，存在高产量的完整记录物。发现这与用UMI印迹的延伸引物(其在从CPE发夹解离后未显示完整记录物)相反。

为了进一步检查共定位，将20nM生物素标记的用UMI印迹的CPE发夹与或不与10nM链霉抗生物素蛋白在20℃下孵育1小时，然后在dATP、dTTP、dCTP和聚合酶存在的情况下在37℃下孵育30分钟。然后，将dGTP添加至混合物中，并将混合物在20℃下孵育30分钟。如图19中所示，当用UMI印迹的延伸引物与CPE发夹共定位时，在解离后产生高产量的完整记录物。

然后表征解离动力学。如图20中所示，单分子成像用于检查UMI条形码印迹的延伸引物。测试三种具有不同UMI条形码长度的延伸引物，并且发现UMI印迹的延伸引物从CPE发夹快速地解离。

实施例4.背景反应抑制。

为了研究清除剂辅助的CPE反应中的背景反应抑制，将10nM生物素标记的用随机条形码印迹的CPE发夹和10nM延伸引物在有或没有5nM链霉抗生物素蛋白的情况下在25℃下孵育指定时间。如图22中所示，在链霉抗生物素蛋白不存在的情况下，经1小时的反应时间没有生成可观察到的完整记录物。当链霉抗生物素蛋白存在时，从UMI-印迹的延伸引物延伸完整记录物。

接下来，使用上述方案检查不同条形码长度的影响。如图23中所示，当不存在靶链霉抗生物素蛋白时，没有从所有测试的CPE探针生成可观察到的完整记录物。

此外，将CPE过程中的背景信号与另一种邻近方法进行比较。如图24中所示，与使用相同探针浓度和类似探针结合强度的CPE相比，在传统的邻近延伸反应中发生显著的背景反应。在没有链霉抗生物素蛋白的情况下，CPE显示可忽略的背景反应。

接下来检查延伸引物和CPE发夹对完整记录物的扩增的影响。使用具有18个核苷酸(nt)条形码的CPE探针，显示不同浓度的CPE发夹或延伸引物导致特异性扩增的完整记录物；CPE发夹和延伸引物的影响是可忽略的(图25)。

接下来，检查PCR反应中的CPE反应的所有组分的影响。将含有10pM CPE发夹(具有18nt条形码)、dATP、dTTP、dCTP和聚合酶的混合物在20℃下孵育30分钟。添加延伸引物(10pM)，并将所得混合物在20℃下孵育30分钟，然后在85℃下孵育30分钟(以使聚合酶失活)。然后测量扩增。如图26中所示，当PCR混合物中存在CPE反应的所有组分时，容易检测到少于30个拷贝的完整记录物。

还使用链霉抗生物素蛋白检测用生物素标记的包含18nt条形码的CPE探针检查背景信号。如图27中所示，生成的背景信号(0拷贝链霉抗生物素蛋白)非常低，因为检测到约16个链霉抗生物素蛋白拷贝。图27中的两个条表示两个重复。

实施例5.连续邻近延伸和加速解离(SPEED)。

连续邻近延伸和加速解离(SPEED)的实例显示于图28和29中。图28显示双延伸(DE)版本，而图29显示三重延伸(TE)版本。延伸数目是指探针上的立足点的数目。根据以下公式，随着立足数目增加，理论检测限值(LOD)也增加：

其中α＝噪声/背景信号，C_L(AB)＝当抗体A和B结合相同的靶蛋白质时的局部浓度，[A]₀，[B]₀＝抗体A和B的初始浓度，K_D(A)，K_D(B)＝抗体A和B的K_D值，且其中“2”的指数([A]₀ ²和C_L(AB) ²涉及3的立足点数(对于“n”的立足点数，上述方程中的指数将是“n-1”)。

使用生物素标记的SPEED探针和链霉抗生物素蛋白作为靶标来探究SPEED(DE)反应机制。将10nM生物素标记的探针和10nM生物素标记的引物在37℃下在链霉抗生物素蛋白存在(5nM)或不存在的情况下孵育图30中所示的时间。当反应中存在链霉抗生物素蛋白时，在凝胶上观察到两个延伸步骤，如图30中所示。凝胶数据的定量显示当第二延伸产物是反应信号时，信号-背景比急剧增加。

使用上述相同的方案检查SPEED(DE)探针的两个立足点的不同长度和序列的影响。如图31中所示，当链霉抗生物素不存在时，没有生成来自第一和第二延伸的可观察的产物。相反，存在高产率的第二延伸产物，其在链霉抗生物素蛋白存在的情况下快速生成。还显示SPEED反应在室温(RM)条件下表现良好。其它反应在37℃下孵育。

然后使用qPCR来检查用低浓度探针的反应的灵敏度。将50pM生物素标记的SPEED探针在37℃下与链霉抗生物素蛋白、生物素标记的引物和PCR引物一起孵育。如图32中所示，该反应能够容易地检测到约120个拷贝的链霉抗生物素蛋白。

然后通过比较SPEED探针系统与传统的PEA探针系统来检查从PCR扩增过程消除可能的背景信号的能力。如图33中所描绘，当需要高浓度的探针来加强亲和探针和靶标之间的结合时，由于立足结构域的互补性，PEA探针将在PCR扩增期间引入背景信号。相反，配备有C-终止子的SPEED探针在PCR扩增过程期间不引入背景信号，因为生成的延伸序列不匹配PCR引物序列，且因此不能通过PCR引物扩增。

在图34A-34B中进一步检查使用高浓度的SPEED探针降低的背景噪声。如图34A中所示，凝胶数据表明在1pM至1nM的探针浓度范围内的25个PCR循环后没有可观察到的完整记录物扩增，而图34B显示qPCR数据，其表明当应用1nM生物素标记的SPEED探针时，SPEED反应仍能够检测低至约1200个拷贝的链霉抗生物素蛋白。SPEED反应在37℃下孵育。显示两次重复的数据。

SPEED探针可以包含许多不同的设计。经设计以产生相同报告序列的探针的一些实例在图35中给出。小图1显示SPEED探针的同一链上的两个立足点，且第二延伸结构域“c”呈单链形式。小图2显示SPEED探针的不同链上的两个立足点，且第二延伸结构域“c”呈单链形式。小图3显示消除SPEED探针的终止子之间的空间的实例。小图4显示第一和第二延伸结构域“b””c”可以与在相同亲和分子上缀合的两个探针分开。

关于每个被引用的主题，本文中公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用并入本文，其在一些情况下可涵盖该文献的整体。

如在本说明书和权利要求中使用的不定冠词“一(a)”和“一(an)”，除非明确地指出相反，否则应理解为“至少一”。

还应当理解，除非明确地指出相反，否则在本文请求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不一定限于记载所述方法的步骤或动作的顺序。

在权利要求书中以及上述说明书中，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由…构成”(“composed of”)等将被理解为是开放式的，即意味着包括但不限于此。只有过渡性短语“由...组成”和“基本上由...组成”分别是“美国专利局专利审查程序手册”第2111.03节中所规定的封闭或半封闭的过渡性短语。

Claims (51)

1.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域连接的5'引物-结合亚结构域，其中3'条形码亚结构域通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和

(ii)3'未配对引物-结合结构域，

其中对应于从3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域和5'引物-结合亚结构域之间，且其中5'引物-结合亚结构域包含终止聚合的5'分子；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域互补。

2.权利要求1的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶蛋白质上的第一表位的分子缀合，且第二探针与特异性结合靶蛋白质上的第二表位的分子缀合。

3.权利要求2的核酸探针对，其中所述分子是抗体和/或适体。

4.靶标检测系统，其包含权利要求1的核酸探针对。

5.权利要求4的靶标检测系统，其进一步包含

与所述第一核酸探针的5'引物-结合亚结构域互补的引物；和

与所述第二核酸探针的5'引物-结合结构域互补的引物。

6.权利要求4的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

7.权利要求4的靶标检测系统，其进一步包含核酸清除探针，其包含与第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'引物-结合结构域。

8.权利要求7的靶标检测系统，其中所述清除探针包含与所述第二核酸探针的3'引物结构域互补的3'未配对结构域。

9.权利要求4的靶标检测系统，其进一步包含靶蛋白质。

10.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)权利要求1的核酸探针对，和

(b)缺乏dATP、dTTP、dCTP或dGTP之一的dNTP的混合物，其中缺乏的dNTP对应于从所述第一核酸探针的3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的互补序列；且然后

在dATP、dTTP、dCTP和dGTP存在的情况下在链置换聚合酶有活性的温度下孵育所述反应缓冲液，由此产生所述核酸探针对之间相互作用的记录物。

11.权利要求10的方法，其进一步包括使用与所述第一核酸探针的5'引物-结合亚结构域互补的引物和与所述第二核酸探针的5'引物-结合结构域互补的引物进行所述记录物的核酸扩增反应。

12.多个权利要求1的核酸探针对，其中每个引物-结合结构域是独特的。

13.权利要求12的多个核酸探针对，其中所述多个核酸探针对包含至少10对核酸条形码探针。

14.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域连接的5'引物-结合亚结构域，其中所述3'条形码亚结构域通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和

(ii)3'未配对的引物-结合结构域，其中对应于从3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域和5'引物-结合亚结构域之间；且

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域互补。

15.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)权利要求14的核酸探针对，和

(b)缺乏dATP、dTTP、dCTP或dGTP之一的dNTP的混合物，其中缺乏的dNTP对应于从所述第一核酸探针的3'条形码亚结构域缺乏的核苷酸的互补序列；且然后

在从(b)的dNTP的混合物缺乏的dNTP存在的情况下在链置换聚合酶有活性的温度下孵育所述反应缓冲液，由此产生所述核酸探针对之间相互作用的记录物。

16.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，和终止聚合的5'分子，和

(ii)3’未配对引物-结合结构域，其包含侧接5'引物-结合亚结构域的中心引物-结合亚结构域和与(i)的核苷酸的条形码序列相同的条形码亚结构域，其中终止聚合的分子位于3'未配对结构域的5'引物-结合亚结构域和中心引物-结合亚结构域之间；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域的5'引物-结合亚结构域互补。

17.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)权利要求16的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

18.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，和终止聚合的5'分子，和

(ii)中心未配对引物-结合结构域，和

(iii)3'配对结构域，其包含通过在与(i)的核苷酸的条形码序列相同的核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的5'配对亚结构域和3'配对条形码亚结构域，和终止聚合的5'分子；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的中心未配对引物-结合结构域互补。

19.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)权利要求18的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

20.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)5'配对结构域，其包含通过核苷酸的条形码序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的条形码，其中所述5'配对结构域侧接终止聚合的5'分子和3'未配对引物结构域，

(ii)中心未配对结构域，和

(iii)3'配对结构域，其包含通过在与(i)的核苷酸的条形码序列相同的核苷酸序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成的3'配对条形码亚结构域，和5'配对亚结构域；和

(b)第二核酸探针，其包含与3'引物结构域连接的5'引物-结合结构域，所述3'引物结构域与所述第一核酸探针的中心未配对引物-结合结构域互补。

21.检测靶分子的方法，其包括：

在链置换聚合酶有活性的温度下，在包含所述链置换聚合酶和任选靶蛋白质的反应缓冲液中孵育

(a)权利要求20的核酸探针对，和

(b)包含dATP、dTTP、dCTP或dGTP的dNTP的混合物。

22.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，且

其中立足结构域b和立足结构域a是未配对的，结构域c与结构域c*互补和结合，且结构域b*与结构域b互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

23.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其包含结构域b*，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c、立足结构域b、终止分子和立足结构域a，

其中立足结构域a、立足结构域b和结构域c是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

24.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

终止分子、结构域b和立足结构域a，且

其中立足结构域b、结构域c和结构域a是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

25.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域b*、终止分子、结构域c和立足结构域b，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含

结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，

其中立足结构域b和立足结构域a是未配对的，结构域c与结构域c*互补和结合，且结构域b*与结构域b互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

26.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含结构域c*、终止分子、结构域c和立足结构域b，

其中立足结构域b是未配对的，且结构域c与结构域c*互补和结合，和

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含结构域b*、终止分子、结构域b和立足结构域a，且其中立足结构域a是未配对的，且结构域b与结构域b*互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

27.权利要求22的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶分子上的第一区域的亲和分子缀合，且所述第二探针与特异性结合靶分子上的第二区域的亲和分子缀合。

28.权利要求27的核酸探针对，其中所述靶分子是蛋白质。

29.权利要求28的核酸探针对，其中所述亲和分子是抗体。

30.权利要求28的核酸探针对，其中所述亲和分子是适体。

31.靶标检测系统，其包含权利要求22的核酸探针对。

32.权利要求31的靶标检测系统，其进一步包含

与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物；和

与结构域d*具有至少95％同一性的引物。

33.权利要求31的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

34.权利要求31的靶标检测系统，其进一步包含靶蛋白质。

35.检测靶分子的方法，其包括：

在反应缓冲液中在链置换聚合酶有活性的温度下孵育权利要求22的核酸探针对、链置换聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和靶分子，以产生所述核酸探针对之间的相互作用的记录物。

36.权利要求35的方法，其进一步包括使用与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物和与结构域d*具有95％同一性的引物进行记录物的核酸扩增反应。

37.多个权利要求22的核酸探针对，其中每个引物-结合结构域是独特的。

38.权利要求37的多个核酸探针对，其包含至少10对核酸条形码探针。

39.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含结构域b*、终止分子、结构域e和立足结构域b，

(ii)第二核酸链，其以5'至3'方向包含结构域c*、终止分子、结构域b和立足结构域a，和

(iii)第三核酸链，其以5'至3'方向包含结构域e*、终止分子、结构域c和立足结构域e，且

其中立足结构域b、立足结构域a和立足结构域e是未配对的，结构域e与结构域e*互补和结合，结构域b与结构域b*互补和结合，且结构域c与结构域c*互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含结构域d*和结构域a*的核酸链，

其中结构域a*与所述第一核酸探针的立足结构域a互补。

40.核酸探针对，其包含：

(a)第一核酸探针，其包含

(i)第一核酸链，其以5'至3'方向包含5'结构域、终止分子、3'结构域和立足结构域，和

(ii)至少一条额外核酸链，其以5'至3'方向包含5'结构域、终止分子、3'结构域和立足结构域，

其中每个立足结构域是未配对的，且所述第一核酸探针的每个5'结构域与所述第一核酸探针的单个3'结构域互补和结合；和

(b)第二核酸探针，其包含以5'至3'方向包含5'结构域和3'结构域的核酸链，

其中所述第二核酸探针的3'结构域与所述第一核酸探针的第一核酸链的立足结构域互补。

41.权利要求40的核酸探针对，其中所述第一探针与特异性结合靶分子上的第一区域的亲和分子缀合，且所述第二探针与特异性结合靶分子上的第二区域的亲和分子缀合。

42.靶标检测系统，其包含权利要求40或41的核酸探针对。

43.权利要求42的靶标检测系统，其进一步包含

与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物；和

与结构域d*具有至少95％同一性的引物。

44.权利要求42的靶标检测系统，其进一步包含链置换聚合酶。

45.权利要求42的靶标检测系统，其进一步包含靶蛋白质。

46.检测靶分子的方法，其包括：

在反应缓冲液中在链置换聚合酶有活性的温度下孵育权利要求40的核酸探针对、链置换聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和靶分子，以产生所述核酸探针对之间的相互作用的记录物。

47.权利要求46的方法，其进一步包括使用与结构域c*互补和/或与结构域c具有至少95％同一性的引物和与结构域d*具有95％同一性的引物进行记录物的核酸扩增反应。

48.多个权利要求40的核酸探针对，其中每个引物-结合结构域是独特的。

49.权利要求48的多个核酸探针对，其包含至少10对核酸条形码探针。

50.试剂盒，其包含权利要求1的核酸探针对。

51.试剂盒，其包含权利要求4的靶标检测系统。