CN105452480A - 经由剪刀状结构的dna扩增(dasl) - Google Patents

Abstract

提供了通过具有链置换活性的聚合酶扩增目标核酸的方法和系统，其使用两种或更多种茎环状引物，每种茎环状引物具有3’末端部分和5’末端部分，所述3’末端部分包括与目标核酸的目标同源性位点互补的序列，所述5’末端部分具有包括茎序列，环序列和与所述茎序列反向互补的序列的序列，所述5’末端部分能够形成茎环。这种方法和系统可以用于通过具有链置换活性的聚合酶等温地扩增目标核酸。

Description

经由剪刀状结构的DNA扩增(DASL)

技术领域

本发明涉及核酸扩增。更具体地，本发明涉及使用新颖的引物和扩增设计来扩增核酸的方法和系统。

背景技术

核酸扩增通常用于研究、鉴证、医学(包括诊断)和农业。其中最著名的扩增方法是聚合酶链式反应(PCR)，这是一种目标扩增方法(参见美国专利号4683195、4683202和4800159)。PCR反应通常利用两种引物和DNA聚合酶，所述两种引物结合到目标核苷酸序列的5’末端和3’末端，所述DNA聚合酶通过使用三磷酸脱氧核苷(dNTPs)增加碱基来延伸所结合的引物以产生双链产物。通过提高和降低反应混合物的温度，将DNA产物的两条链分离并作为下一轮引物结合和延伸的模板，并重复该过程。PCR需要热循环仪器以升高和降低温度，因此在一些快速和现场测试设置中受限。

在过去的几年里已经开发了等温环境中的目标扩增方法。一种是链置换扩增(SDA)。SDA结合了限制性内切酶使目标DNA的未修饰的链产生切口的能力以及外切酶缺陷的DNA聚合酶延伸切口处的3’末端并置换下游DNA链的作用。置换链充当互补链反应的模板，反之亦然，从而导致目标DNA的扩增(参见美国专利号5455166和5470723)。在原始设计的SDA中，首先通过限制酶切割DNA，以便产生具有确定的5’和3’末端的可扩增目标片段，但限制酶切割位点的要求限制了可能的目标DNA序列的选择(参见例如，Walkeret.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:392-396(1992))。通过加入位于待扩增的区域的侧翼的保险杠(bumper)引物来进一步发展SDA(Walker等人，见上(1992)，美国5916779)。SDA技术已主要用于传染病例如衣原体和淋病的临床诊断。然而，SDA在迅速扩增序列方面效率低下。

另一种等温扩增系统，转录介导的扩增(TMA)，使用RNA聚合酶的功能以从在引物区域中设计的启动子制备RNA，以及使用逆转录酶的功能以从RNA模板产生DNA。通过引入第三酶活性，RNaseH，以在不进行热变性步骤的情况下从cDNA除去RNA而进一步发展了RNA扩增技术。因此，已经消除了热循环步骤，产生命名为自持序列复制(3SR)的等温扩增方法(参见，例如，Guatellietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1874-1878(1990))。然而，TMA和3SR的起始物限于RNA分子，并且不能是DNA。

第三种等温目标扩增方法，滚环扩增(RCA)，生成在改编自体内滚环DNA复制的体外DNA扩增中使用的序列的多个拷贝(参见FireandXu,Proc.Natl.Acad.Sci.USA92:4641-4645(1995)；Lui,etal.,J.Am.Chem.Soc.118:1587-1594(1996)；Lizardi,etal.,NatureGenetics19:225-232(1998)，美国专利号5714320和6235502)。DNA聚合酶延伸环状模板上的引物，产生所述模板的互补序列的串联连接的拷贝(参见KornbergandBaker,DNAReplication,W.H.FreemanandCompany,NewYork(2nded.(1992))。最近，RCA在命名为多重置换扩增(MDA)的技术中得到了进一步的发展，其产生全基因组扩增的更一致表现(参见Deanet.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA99:5261-5266(2002))。然而，这些方法使用不方便，因为需要产生环状模板作为程序的一部分。

另一种等温扩增系统，环介导的等温扩增(LAMP)，使用寡核苷酸引物作为延伸起源，在每条引物的5’端部分具有与用此引物延伸的区域的序列反向互补的核苷酸序列(NotomiT,etal.,2000.NucleicAcidsResearch28:E63；和美国专利号6,410,278)。扩增进行45分钟到1个小时并产生阶梯模式的各种产物。然而，向模板的正向和反向延伸多个目标区域的引物的需求使得引物的设计变得困难。LAMP使用折回引物，其包括在所述引物结合至目标序列之后折回的在5’末端的尾部区域。具体地，在折回引物与目标序列结合后，折回引物的5’末端尾部将“折回”并结合到目标上存在的核苷酸序列，从而在折回引物的3’末端结合到目标并延伸之后形成环。互补链将形成具有互补序列的另一个环。两个环都至少约80至90个碱基对长。此外，折回引物构建体通常必须含有目标序列的至少80个碱基对，但不包括引物的5’侧部分，和通常必须含有目标序列的至少200个碱基对，包括引物的5’侧部分。扩增相对大的产物限制反应产率并延长反应时间。

另一种等温扩增系统是智能扩增过程2(SMAP2)，其利用LAMP中描述的折回引物，折叠引物，两个外引物和增效引物(boosterprimer)。实例在Mitanietal,NatureMethods,Vol.4No.3:257-262(2007)和Kimuraetal,BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications383(2009):455-459中描述。折叠引物包括5’末端的回文序列，其导致3至15个碱基对长的小发夹结构的形成，所述结构的发夹环部分为3-7个碱基长。

用于核酸扩增技术的潜在用途不断增长。例如，大多数的核酸测定法利用扩增反应，包括许多基因分型测定法。环境和食品污染物的检测对尤其需要核酸扩增方法的诊断测试的灵敏度和分析能力提出要求。因此，希望相对于现有技术改进扩增方法。例如，所希望的改进将包括在等温反应环境中发生的核酸扩增方法，包括引物和其它起始物的方便设计，并且能够快速扩增相对较小的核酸序列。

发明内容

本发明提供了使用两种或更多种茎环状引物特异且高效地指数地扩增目标核酸的方法，系统和试剂盒，每种所述茎环状引物具有3’-末端部分和5’末端部分，所述3’-末端部分包括与目标同源性位点互补的序列，所述5’末端部分包括茎环，在目标的两条链中并且以使得引物的3’末端指向彼此以扩增预期的目标的方式选择所述茎环状引物。这样的方法，系统和试剂盒可用于利用具有链置换活性的聚合酶等温扩增目标核酸。

本发明的方法和系统可以发生在等温反应环境中，因此，不需要使用和消费用于升高或降低温度的热循环仪器或任何其他设备或技术。本发明所使用的材料，包括茎环状引物，相对容易和方便的获得和/或设计。另外，本发明可仅使用单一类型的聚合酶。设计本发明的方法和系统以扩增广泛的目标核酸序列，包括相对较小的核酸序列，其扩增通常导致较高的反应产率和较短的反应时间。

在一个方面，本发明提供了扩增核酸的方法，其包括：

(a)提供第一模板，所述第一模板具有：(i)3’茎环，所述3’茎环由位于3’末端的第一区和彼此退火形成第一茎的第一互补区，和连接所述位于3’末端的第一区和所述第一互补区的第一环区形成；(ii)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第二区和彼此退火形成第二茎的第二互补区，和连接所述位于5’末端的第二区和所述第二互补区的第二环区形成；和(iii)连接所述3’末端茎环和所述5’末端茎环的单链目标序列，所述目标序列具有在目标序列的3’末端处的第一同源性位点，在目标序列的5’末端处的第二同源性位点，任选地，在第一同源性位点和第二同源性位点之间的连接区；

(b)提供两种或更多种茎环状引物，具有链置换活性的聚合酶和反应缓冲液；其中，第一茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第三区和彼此退火形成第三茎的第三互补区，和连接所述位于5’末端的第三区和所述第三互补区的第三环区形成；和(ii)与第一同源性位点互补的在3’末端处的核苷酸序列；并且其中第二茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第四区和彼此退火形成第四茎的第四互补区，和连接所述位于5’末端的第四区和所述第四互补区的第四环区形成；和(ii)与互补于第二同源性位点的序列互补的在3’末端处的核苷酸序列；

(c)使第一茎环状引物与第一模板上的第一同源性位点退火结合；

(d)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第一模板延伸第一茎环状引物以形成第二模板，所述第二模板具有：(ⅰ)与第一同源性位点互补的第三同源性位点；和(ii)与第二同源性位点互补的第四同源性位点；

(e)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第一模板的3’末端，从而从第一模板移置第二模板；

(f)使第二茎环状引物与第二模板上的第四同源性位点退火结合；

(g)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第二模板延伸第二茎环状引物以形成第三模板；

(h)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第二模板的3’末端，从而从第二模板移置第三模板；和

(ⅰ)使用第三模板作为步骤(c)中的第一模板重复步骤(c)至(h)，从而扩增所述核酸。

在另一个方面，本发明提供了一种用于扩增核酸的系统，其包括：

(a)第一模板，所述第一模板具有：(i)3’茎环，所述3’茎环由位于3’末端的第一区和彼此退火形成第一茎的第一互补区，和连接所述位于3’末端的第一区和所述第一互补区的第一环区形成；(ii)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第二区和彼此退火形成第二茎的第二互补区，和连接所述位于5’末端的第二区和所述第二互补区的第二环区形成；和(iii)连接所述3’末端茎环和所述5’末端茎环的单链目标序列，所述目标序列具有在目标序列的3’末端处的第一同源性位点，在目标序列的5’末端处的第二同源性位点，任选地，在第一同源性位点和第二同源性位点之间的连接区；

(b)两种或更多种茎环状引物，具有链置换活性的聚合酶和反应缓冲液；其中，第一茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第三区和彼此退火形成第三茎的第三互补区，和连接所述位于5’末端的第三区和所述第三互补区的第三环区形成；和(ii)与第一同源性位点互补的在3’末端处的核苷酸序列；并且其中第二茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第四区和彼此退火形成第四茎的第四互补区，和连接所述位于5’末端的第四区和所述第四互补区的第四环区形成；和(ii)与互补于第二同源性位点的序列互补的在3’末端处的核苷酸序列。

优选地，所述方法在等温的反应环境中发生。

优选地，所述方法还包括：

(i)提供置换引物，其中所述置换引物具有与一个或多个所述同源性位点的上游或下游核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使置换引物与所述同源性位点之一的上游或下游互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸置换引物，从而使所述模板中的两种彼此置换。

优选地，所述方法还包括：

(i)提供环状引物，其中所述环状引物具有与其中一种所述模板上的所述茎环的其中一个所述环区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使环状引物与其中一种所述模板上的所述茎环的其中一个所述环区上的互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸环状引物，从而有助于所述模板中的两种彼此置换。

优选地，所述方法还包括：

(i)提供增效引物，其中所述增效引物具有与所述连接区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使增效引物与所述连接区上的互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸增效引物，从而有助于所述模板中的两种彼此置换。

优选地，所述系统工作在等温反应环境中运作。

优选地，所述系统还包括置换引物，其中所述置换引物具有与一种或多种所述同源性位点的上游或下游核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，所述系统还包括环状引物，其中所述环状引物具有与第一模板上的所述茎环的其中一个所述环区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，所述系统还包括增效引物，其中所述增效引物具有与所述连接区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

优选地，具有链置换活性的所述聚合酶是BstDNA聚合酶大片段。

优选地，所述反应缓冲液包含甜菜碱。

优选地，所述单链目标序列的长度为70个碱基对或更短。

优选地，所述单链目标序列的长度为50个碱基对或更短。

优选地，第一模板的所述3’末端茎环和所述5’末端茎环具有相同的核苷酸序列。

优选地，提供所述第一模板的所述步骤(a)包括：

(a1)提供双链核酸目标，所述双链核酸目标包括与第二链互补的第一链，所述第二链具有与第三和第四同源性位点的序列相同的序列；

(a2)使第二茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第二链上的第四同源性位点相同；

(a3)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第二链延伸第二茎环引物以形成第三链，所述第三链具有与第一和第二同源性位点的序列相同的序列，从而替换第一链；

(a4)使第一茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第三链上的第一同源性位点相同；

(a5)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第三链延伸第一茎环引物以形成第四链，所述第四链具有与第三和第四同源性位点的序列相同的序列，从而置换第二链；

(a6)使第二茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第四链上的第四同源性位点相同；

(a7)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第四链延伸第二茎环引物以形成第五链，所述第五链具有与第一和第二同源性位点的序列相同的序列，从而形成具有第三、第四和第五链的三链复合体；

(a8)使所述三链复合体可逆地解离成：(i)第三链；和(ii)包含第四和第五链的双链复合体，其中双链复合体的一端具有在第四链上的3’末端茎环和在第五链上的5’末端茎环；

(a9)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第四链的3’末端，从而置换第五链，其中第五链用作步骤(a)中的第一模板。

优选地，所述第三环区和所述第四环区中的每一个的长度是10至30个碱基对。

优选地，所述第三茎和所述第四茎中的每一个的长度是4至25个碱基对。

优选地，第一茎环状引物和第二茎环状引物的所述5’末端茎环具有60摄氏度至80摄氏度的熔解温度。

优选，所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘧啶碱基，更优选至少75％。

优选，所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘌呤碱基，更优选至少75％。

优选地，所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚腺嘌呤碱基，更优选至少75％。

优选地，所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚胸苷碱基，更优选至少75％。

在一个替代实施方案中，第一茎环状引物的第三互补区和第三环区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

在一个替代实施方案中，第一茎环状引物的第三互补区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

在一个替代实施方案中，第二茎环状引物的第四互补区和第四环区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。

在一个替代实施方案中，第一茎环状引物的第四互补区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。

本发明提供了指数地和快速地扩增核酸目标的方法和系统。相对于已知的核酸延伸的反应方法，已经将本发明开发为低成本的方法，其可以使用单一的酶并涉及简单的引物设计。本发明提供了延伸和扩增短核酸的方法，其快速和有效，即在短时间内产生高水平的扩增的核酸。

附图说明

由于结合附图的以下描述，进一步的方面和优点将变得显而易见，其中：

图1示出根据本发明的一个优选实施方案的核酸扩增路径；

图2示出图1的步骤B，C，D和E，包括用于模板和茎环状引物的优选DNA序列的实例；

图3示出根据本发明的优选实施方案的单链目标DNA模板的产生；

图4示出置换引物在本发明的优选实施方案中的使用；

图5示出根据其中使用两个单链DNA模板的本发明的优选实施方案的核酸扩增路径；

图6示出根据本发明的另一优选实施方案的核酸扩增路径；

图7示出环状引物在本发明的优选实施方案中的使用；

图8示出增效引物在本发明的优选实施方案中的使用；

图9示出本发明的优选实施方案，其中目标序列包括人凝血酶原基因片段A(SEQIDNO：1)以及显示了模板和引物之间的序列比对；

图10显示图9的优选DNA扩增的凝胶电泳结果；

图11显示图9的优选DNA扩增的DNA测序结果；

图12示出本发明的优选实施方案，其中目标序列包括人凝血酶原基因片段B(SEQIDNO：9)以及显示了模板和引物之间的序列比对；

图13显示图12的优选DNA扩增的DNA测序结果；

图14示出本发明的另一优选实施方案，其中目标序列包括人凝血酶原基因片段B(SEQIDNO：9)以及显示了模板和引物之间的序列比对；

图15显示图14的优选DNA扩增的凝胶电泳结果；

图16示出本发明的又一优选实施方案，其中目标序列包括人凝血酶原基因片段B(SEQIDNO：9)以及显示了模板和引物之间的序列比对；

图17显示图16的优选DNA扩增的凝胶电泳结果；

图18示出本发明的另一优选实施方案，其中目标序列包含人亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)片段(SEQIDNO：21)以及显示了模板和引物之间的序列比对；

图19显示图18的优选DNA扩增的凝胶电泳结果；

图20显示了图18的优选DNA扩增的DNA测序结果；以及

图21显示本发明的另一优选DNA扩增的DNA测序结果，其中，目标序列包含人凝血酶原基因片段B(SEQIDNO：9)。

在所有附图和描述中，类似的部分用相同的参考数字表示。

具体实施方式

现在将关于优选的实施方案描述本发明的方法和系统。在本文中可将本发明的方法称为经由剪刀状结构的DNA扩增(DASL)。参考了涉及本发明的优选实施方案的图1至21。

定义

为方便起见，在此定义在说明书，实施例和所附的权利要求中使用的某些术语。所述定义为整个说明书提供，除非专门提供例外的定义。

术语“核酸”指的是双链或单链DNA、RNA分子或DNA/RNA杂合体。这些分子可以如在活细胞中所发现的具有切口或是完整的。所述双链或单链核酸分子可以是线性的或环形的。该双连单位可以具有平端或具有单链尾巴，例如，具有由限制性内切酶产生的粘性末端。

术语“目标核酸、目标DNA、目标区域或目标”是指待选择性扩增的核酸的整体或一部分。也可以将所述目标核酸称为意图扩增的片段或序列。待扩增的目标核酸的大小可以在例如约30bp至10000bp的范围内，或大到约100kb，或者甚至大到整个人类基因组。所述目标核酸可以是纯的，具有一种类型的DNA或RNA，或可替代地可以是不同类型和不同长度的核酸的混合物。所述目标核酸可以是生物的或延长的，纯的或与其他生物和细胞物质，诸如蛋白质、脂质和碳水化合物混合。目标DNA可以从各种来源分离，包括环境，食品，农业，发酵，生物流体，如血液、血浆、血清、乳汁、脑脊液、痰、唾液、粪便，肺吸出物，粘膜组织或组织样品或细胞或皮肤的拭样，或各种表面如医疗器械或门把手的拭样。核酸样品可从细胞或病毒获得，并且可以包括以下的任何：染色体DNA，包括线粒体DNA的染色体外DNA，质粒DNA，重组DNA，DNA片段，信使RNA，转运RNA，核糖体RNA，双链RNA，微小RNA(miRNA)和小干扰RNA(siRNA)或在细胞或病毒中出现的其他RNA。

术语“模板”指的是目标，或含有为了DNA延伸而与引物和酶结合的目标的核酸的一部分或全部。模板充当DNA延伸或复制的参考拷贝。当与“目标”对照使用时术语“模板”表示从原始目标修饰的或基于原始目标延伸的核酸，而“目标”表示最初或在DASL开始之前在样品中发现的DNA。模板DNA可以包括在DASL反应期间或之前引入的非目标序列。例如，可以将(多个)外部添加的茎环序列或(多个)二聚、三聚或多聚序列添加到目标中以获得模板。

术语“链”是指双链DNA分子的链之一或RNA或单链DNA分子的唯一链。对于每一条链，可以存在互补链。

当两条DNA链具有互补序列时，将该两条链说成是互补的。一条链是另一条链的“互补链”。一条链和其互补链基于DNA碱基配对或Watson-Crick原理杂合，换言之，A，C，G和T(或U)碱基分别与T，G，C和A碱基非共价配对。

术语“正向链”和“反向链”是指具体结构中的双链DNA的两条相互互补的链。当将两条链垂直于彼此堆叠起来时，如一些附图中所示，通常设想顶链为正向链或将所述顶链写成其5’末端位于左侧且其3’末端位于右侧。同时，通常设想底链为反向链或将所述底链写成其3’末端位于左侧且其5’末端位于右侧，除非另外提及。在本说明书中，“反向链”的含义是相对于“正向链”的，反之亦然。这些术语用于清楚和方便地描述本发明及其优选的实施方案。

术语“链型”是指假设该DNA链是正向或反向。例如，如果两个DNA分子都携带正向链序列，则将它们说成具有相同的链型。

术语“5’末端”和“3’末端”各指位于DNA分子(包括目标，模板或引物)的左边界或右边界的区域。更具体地，来自单链的任一末端的50至200个核苷酸，或至少5个核苷酸可以包括在术语“3’末端”和“5’末端”内。“3’末端”是DNA可延伸的一侧，即可以通过聚合酶反应添加脱氧核苷酸碱基的一侧，只要3’末端以允许这样的延伸发生的方式结合到DNA的另一个链或区域。例如，当DNA链的3’末端形成茎环结构时，所述3’末端结合相同链的区域。这样的末端被称为“3’可延伸末端”。在存在合适的条件的情况下，例如在包含合适的聚合酶，dNTP和缓冲液的情况下，3’末端可以通过在聚合反应中加入核苷酸进行延伸。作为另一个实例，当引物的3’末端结合到模板时，3’末端是可延伸的。“5’末端”是“3’末端”的相反末端，并且是不可延伸的。

单链或双链DNA的“5’末端”或“3’末端”可包括茎环结构。此外，DNA的一些末端可包含两个并排的茎环，也被称为剪刀状结构，用于导致茎环的两条DNA链中的每一条的一个环。

每条单链DNA具有5’末端和3’末端。一些DNA分子可以具有单链区域和双链区，以及这样的DNA可以被称为杂合DNA。

关于目标或模板DNA的两个不同区域的相对位置，相对于另一区域更接近5’末端的区域是上游。相反，相对于另一区域更接近3’末端的区域是下游。

当在序列背景中使用时术语“相同”意味着与另一序列同源。这并不一定意味着该序列必须相同。也就是说，如果两个DNA与第三DNA互补并且可以结合第三DNA，则可以将DNA的序列说成与另一个同源。本领域的那些技术人员知道，为了结合引物到其互补序列，可以容忍一些错配/插入/缺失。一般来说，在两个同源序列之间，优选至少80％的同源性，以及更优选至少90％的同源性。

目标的同源性位点是这样的区域，该区域的序列可以用作位于DASL引物的3’部分的所述DASL引物的目标结合序列。例如，可以通过使用第一同源性位点的序列设计正向DASL引物以及通过使用第二同源性位点的反向互补来设计反向DASL引物。

互补序列是指在一定条件下能够结合另一序列以提供充当互补链的延伸的起源的3’末端的序列，使用另一序列作为模板。本领域的那些技术人员知道，为了结合引物到其互补序列，可以容忍序列中的一些错配/插入/缺失。一般来说，在引物和模板之间，优选至少80％的同源性或互补性，以及更优选至少90％的同源性或互补性。同源性和互补性可以根据已知的算法如BLAST法确定(Altschul,S.F.,Gish,W.,Miller,W.,Myers,E.W.&Lipman,D.J.(1990)"Basiclocalalignmentsearchtool"J.Mol.Biol.215:403-410)。

术语“引物”是指单链核酸，通常可替代地称为“寡核苷酸引物”，其能够结合到目标核酸的链，并且提供这样的3’末端，所述3’末端可以成为目标核酸的聚合酶依赖性DNA复制/延伸的起源。引物通常是化学合成的。引物的主链不一定限于经由磷酸二酯键的主链，虽然这是最常见的链接类型。例如，它可以由作为主链的具有代替O的S的硫代磷酸酯衍生物或基于肽键的肽核酸组成。碱基可以是能够互补碱基配对的那些。具有5个天然存在的碱基，即，A，C，T，G和U，但是碱基可以是模拟的或修饰的碱基，例如溴脱氧尿苷，其中所述修饰不妨碍引物结合核酸或引物伸长或双链分子变性。

所使用的术语“正向引物”和“反向引物”是指分别结合到模板的反向和正向链的引物。

术语“配对的引物”是指两个或更多个引物，其包括a)结合模板DNA的反向链的正向引物，和b)结合模板的正向链的反向引物，以这样的方式：两个配对的引物的3’末端彼此面对并可通过结合其中一个配对引物到另一个配对引物的延伸产物来发生扩增反应，反之亦然。当存在三个或更多个包括一对配对引物的引物时，将该组引物称为配对引物。

根据本发明的各引物可以在5’末端具有“茎环”和在3’末端具有目标结合部分。茎环也称为茎环区域或茎环结构，指的是在彼此反向互补并通过连接区连接，并且可以相互结合以形成双链结构“茎”的两个区域之间形成的结构。作为形成茎的结果，剩下第三区域为单链，从而导致环区域。将如这里所提到的通过引物引入的茎环结合到延伸的DNA产物中。由于这些DNA充当进一步DNA延伸的模板，因此产生互补链。这些互补链带有新的茎环结构。新的茎环具有与引物上的茎环互补的序列。

术语“熔解”，“解离”，“变性”或“打开”是指将两条互补链的所有或部分分成两条单链，以这样一种方式，引物可以结合到两条链中的一条并且可以通过聚合酶延伸。或者，该术语可意味着分离彼此结合的单个DNA链的两个区域，例如以熔解茎环结构的茎的两个区域。

术语“结合”或“退火”是指在引物只特异性结合其在模板链上的互补序列的条件下接触并杂合引物到单链核酸模板的区域。另外，术语“结合”，“退火”或“关闭”可以指在两条DNA链或DNA的两个区域之间发生结合。结合的特异性可以受到引物或DNA区域的长度，实施结合反应的温度，离子强度，pH值，温度和溶剂和金属离子如镁的影响。

术语“反应”是指涉及引物，目标和模板的事件，包括熔解，结合，延伸，链置换和核酸扩增。所述反应也可以用于指其中发生反应的系统或容器。

术语核酸的“延伸”用于描述引物或模板的3’可延伸末端通过DNA延伸的加长。如果该延伸连续发生显著的一段时期或显著的循环数，则显著量的特定核酸相对于目标核酸累积。将导致累积的该系列反应事件统称为“扩增”。

术语“链置换”是指DNA链从双链DNA或DNA区域的其原始互补链通过前进的新链分离，所述前进的新链正在使用原始互补链作为模板链延伸。一些酶诸如BstDNA聚合酶具有链置换活性，而其他酶如TaqDNA聚合酶不具有显著水平的该活性。

“等温扩增”是指对于整个反应过程在大约相同的孵育温度下发生的扩增。这不包括可在比等温扩增温度高的温度下进行的扩增的引发之前的单个短暂的时期(通常30秒至2分钟，典型地小于15分钟)。等温扩增的反应是指在存在模板的情况下扩增的DNA产物的累积。为了确定反应进行得如何快，可以将从反应开始到结束的时间称为反应时间，所述结束是指扩增产物显著累积或随着时间的推移不再指数增加的情况。可以将相对于所使用的模板的量的扩增的DNA的量称为反应产率。

DASL方法以及它们如何工作

参照图1，其示出了DASL扩增过程的基础，以步骤A开始，提供了单链DNA10，图3和4更详细地描述了所述单链DNA10的产生。单链DNA10的特征在于从其3’末端至5’末端具有第一环L1，第一茎S1，同源性位点1(H1)，连接目标区域12，同源性位点2(H2)，第二茎S2和第二环L2。在该图和随后的附图中，连接到线的圆点表示引物或模板DNA序列的5’末端。

在步骤B中，具有形成第三茎环L1-S1的序列和互补以结合到目标DNA上的H1的3’末端序列的DASL引物P1结合到步骤A中的单链DNA10。

在步骤C中，DASL引物P1的3’末端在包含具有链置换活性的DNA聚合酶，和dNTP和合适的离子和其他缓冲条件的等温反应中延伸。该延伸的产物，DASLDNA14是主要双链DNA，在其5’末端具有两个L1-S1茎环，其中一个S1茎具有可延伸的3’末端，而其他茎具有5’末端(由点表示)。将这种结构称为DASLDNA14，其中将双环称为剪刀状结构，类似于一把剪刀的手柄，并且具有S2区域的另一端，以及L2区域和S2区域，都是双链的，类似于一把剪刀的刀刃。

在步骤D中，通过具有链置换活性的聚合酶在等温反应条件下延伸在步骤C中产生的双环结构的可延伸3’末端。该延伸置换DASLDNA14的顶链，从而产生第二类型的单链DNA16。单链DNA14和单链DNA16在结构上相似，不同的是它们的链型不同。延伸创建了另一种产物，主要双链DNA18，其5’具有闭环，这源于环1(L1)且其3’末端具有特征在于具有全双链区域H2，S2，L2和S2的常规双链结构。

在步骤E中，单链DNA16被第二DASL引物P2结合，所述第二DASL引物P2具有a)5’末端L2-S2茎环和b)与目标DNA上的H2区域互补的3’末端序列。

在步骤F中，在等温反应条件下延伸步骤E中的引物P2，形成第二类型的DASLDNA20，其特点是具有与步骤C中的DASLDNA14相同的特征，在3’末端上的双环上具有可延伸的3’末端，除了DASLDNA14和DASLDNA20的链型不同之外。

在步骤G中，通过具有链置换活性的聚合酶在等温反应条件下延伸DASLDNA20的可延伸3’末端。该延伸置换步骤F中的DASLDNA20的顶链，从而产生单链DNA22的新的分子。该延伸创建了另一种产物，主要双链DNA24，其a)具有闭环3’末端，这源于环2(L2)和b)具有特征为5’末端的H1，S1，L1和S1的常规双链结构。单链DNA22具有与步骤B中的起始结构相同的结构，从而完成完整的扩增循环。持续的循环累积增加量的DNA模板和产物，包括DASLDNA18和24，从而导致扩增。

应当指出的是，步骤B一般应先于步骤C。步骤B在时间顺序上领先步骤C是因为产生单链DNA10或单链DNA16的方式(图3和图4)：将H1或H2区域释放为单链模板，并因此可供DASL引物结合并延伸，其在形成可延伸3’S1或S2末端之前。然而，这两个步骤可以不仅仅是相继的。换言之，在步骤B中的链延伸完成之前，可延伸末端的3’末端可以在步骤C中开始其延伸。

为了更详细地说明图1中的步骤B，C，D和E中的DNA，尤其是双茎环(“剪刀状结构”)结构和3’末端延伸，这样的结构和延伸的实例具有图2中的特定序列。实施例1(图9)中的模板和DASL引物用作特定序列。顶图显示第一DASL引物P1结合到单链DNA10。在3’末端延伸DASL引物P1之后，在由箭头上面的字母“a”标记的3’可延伸末端处，形成DASLDNA14，在底图中显示。另一个箭头下面的字母“b”示出了双环结构的3’可延伸末端，其可在延伸引物引发延伸“a”的相同反应中延伸。在延伸“a”之后，完成延伸“b”，导致在两端具有茎环的单链DNA16。这种DNA可以是由与第一DASL引物P1配对的第二DASL引物P2结合的主体，其末端可以如箭头旁边的字母“c”所标记地延伸。

参照图3，其示出产生单链DNA10的过程(图1的步骤A)，其是DASL扩增过程的主体，在步骤A1中，具有形成L1-S1茎环的序列和与目标DNA上的同源性位点1H1互补的3’末端序列的DASL引物P1结合至目标DNA30的两条链的反向链。

在步骤A2中，在包含DNA聚合酶,例如具有链置换活性的BstDNA聚合酶，和dNTP和合适的离子和其他缓冲液条件的等温反应中延伸引物P1的3’末端，以形成正向模板延伸链32，并置换目标DNA30的正向链。

在步骤A3中，在3’末端具有与同源性位点2H2互补的序列且在其5’末端具有茎环(S2-L2)的反向引物P2结合至步骤A2中的正向链。

在步骤A4中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸在步骤A3中结合的引物P2的3’末端，以在双链DNA内形成模板延伸链34，以及置换目标DNA的正向链。

在步骤A5中，正向引物P1，如在步骤A1中，结合至步骤A4中的双链DNA的反向链。

在步骤A6中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸在步骤A5中结合的引物的3’末端，以形成正向模板延伸链，并在新延伸的模板链和来自步骤A5的两种链之间形成三链复合体36，如图所示。在本发明的等温反应条件下，所述复合体可逆地解离成单链DNA和双链DNA，其具有5’末端上的两个并排茎环，所述环之一具有可延伸的3’末端，3’末端由全部双链的H2，S2，L2和S2区域组成。将该双链DNA称为DASLDNA14。

在步骤A7中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸DASLDNA14的可延伸3’末端，以置换单链DNA，单链DNA16。通过遵循平行步骤A1'至A7'，可以形成另一单链DNA，单链DNA10。这些单链DNA是本发明的扩增方法的主体(参见图5和图6)。

如果步骤A1中的目标DNA30是单链的或与RNA结合的cDNA，则上述过程类似地进行，除了1)步骤A1，或步骤A1'，开始于结合P1或P2DASL引物到具有如上所述的相同茎环和同源性位点结构的反向或正向单链模板；2)步骤A2的延伸不取代任何DNA链；3)所产生的末端产物是两条单链DNA之一，单链DNA10或单链DNA16，而不是目标DNA为双链的情况下的两条。具有单链DNA10模板或单链DNA16模板支撑扩增，如具有两个模板的情况(参见图5)。

参照图4，其示出产生单链DNA10和单链DNA16的另一过程(图1的步骤A)，其由置换引物促进，在步骤A1中，具有能够形成L1-S1茎环的序列和与目标DNA上的H1互补的3’末端序列的DASL引物P1，结合至目标DNA40的两条链的反向链。

在步骤A2中，在包含具有链置换活性的DNA聚合酶，和dNTP和合适的离子和其他缓冲液条件的等温反应中延伸DASL引物P1的3’末端，以形成正向模板延伸链42，并置换目标DNA的正向链。

在步骤A3中，步骤A2中的目标DNA的反向链结合有正向引物D1，其结合步骤A1中的正向引物P1的上游区域；

在步骤A4中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸在步骤A3中结合的引物D1的3’末端，以形成模板延伸链44，以及置换步骤A2中延伸的正向链，所述链是单链。

在步骤A5中，步骤A4中的单链链结合有反向DASL引物P2，其在3’末端具有与目标同源性位点2互补的序列和能在其5’末端形成茎环S2-L2的序列。

在步骤A6中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸在步骤A5中结合的引物P2的3’末端，以形成模板延伸链46。

在步骤A7中，步骤A6中的DNA的正向链结合有反向引物D2，其在步骤A6中结合目标的同源性位点2，H2的下游区域。

在步骤A8中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸在步骤A7中结合的引物D2的3’末端，以形成模板延伸链48，并置换反向链，所述反向链是单链DNA10。该单链DNA10具有来自以上步骤A1和A5的源自正向引物P1的环和源自反向引物P2的另一环。该所述单链DNA10成为本发明的扩增方法的主体(参见例如，图5和6)。

如果步骤A1中的目标DNA是单链的或与RNA结合的cDNA，则上述过程类似地进行，除了1)步骤A1，或步骤A1'，开始于结合P1或P2DASL引物到具有如上所述的相同茎环和同源性位点结构的反向或正向单链模板；2)步骤A2的延伸不取代任何DNA链；3)所产生的末端产物是两条单链DNA之一，单链DNA10或单链DNA16，而不是目标DNA为双链的情况下的两条。具有单链DNA10模板或单链DNA16模板支撑扩增，如具有两个模板的情况(参见图5)。

参照图5，其示出同时扩增单链DNA10和单链DNA16的扩增路径，其开始于步骤A，在5’末端具有能够形成茎环S1-L1的序列和在3’末端具有与目标同源性位点H1互补的序列的引物P1，结合至单链DNA10。

在步骤B中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸所结合的引物P1，以形成模板延伸链50。将双链DNA称为DASLDNA14。DASLDNA14的特征在于在5’末端的双环中的一个处存在3’可延伸末端。

在步骤C中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸步骤B中的DASLDNA14的3’可延伸末端，以形成具有5’末端处的环L1和3’末端处的常规双链末端的双链DNA。该延伸还置换和释放单链DNA，单链DNA16，其类似单链DNA10的镜像，在图5的开始。将该第二DASL单链DNA16供给到一系列步骤A'，B'和C'中，其类似于步骤A，B和C。实际上，扩增路径的这两个分支A-C和A'-C'的产物彼此供给新的模板用于进一步的扩增，从而维持一双链环状扩增过程。

参照图6，其示出扩增单链DNA10和单链DNA16和一些相关的双链产物的另一扩增路径，其起始于步骤A，通过具有链置换活性的聚合酶延伸带有环L1，茎S1，同源性位点1H1，连接区12，同源性位点2H2，茎S2和环L2的单链DNA10的3’可延伸末端，以形成双链DNA60，所述双链DNA60具有在其5’末端上的环L1，接着是S1，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2和茎S2序列，环L2序列和在其3’末端的S2序列。注意，在3’末端的茎和环序列不形成茎环结构，因为所述序列是双链。这种DNA也是图5所示的扩增路径的中间产物。

在步骤B中，来自步骤A的双链DNA60的一条链被引物P2结合，所述引物P2从其5’末端具有能够形成茎环L2-S2的序列和3’末端处的与目标同源性位点2H2互补的序列。

在步骤C中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸引物P2，以形成双链DNA结构62，所述双链DNA结构62具有原始DASLDNA的两个串联连接的单元，即，两组同源性位点H1和H2和茎环，以5’-S2-L2-S2-H2-H1-S1-L1-S1-H1-H2，接着是3’末端处的双S2-L2茎环的形式。需要注意的是，在3’末端，存在双茎环结构，这两个茎环都具有与来自引物P2的环L2相同的环序列。另外，DASLDNA的这两个单元以反方向重复，即，第一单元具有与第二单元的序列反向互补的序列。还值得注意的是，在这两个单元之间的连接位点处，只存在一个环序列，例如为步骤C显示的结构中的一个L1序列。

在步骤D中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸步骤C中的结构62的可延伸3’末端，从而导致两条双链DNA64和66，一条64具有一个单元的DASLDNA或一组H1-H2同源性位点，以及另一条66具有两个单元的DASLDNA序列或两组H1-H2同源性位点，如步骤D所示。

通过使用步骤D中的产物并继续类似于步骤A至D的步骤，可以如双箭头所示地产生具有三个单元或更多单元的DASLDNA结构的DNA产物。

通过遵循步骤A'至D'等，类似于步骤A至D和双箭头，产生额外的DNA产物，其具有与图6中所示的那些类似的结构(类似于镜像)。

参照图7，其示出环状引物促进DASL扩增过程的方法，开始于步骤A，环状引物LP1结合至双链DNA70，其是扩增路径的副产物或中间产物，如图5和6所示的那些。该DNA70是双链的，其具有在5’末端的环L1，接着是茎S1，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2，和在3’末端以茎序列S2，环序列L2和茎序列S2结束。这些茎环序列是两条单独的链之间的双链并因此不形成茎环结构。在步骤B中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸LP1引物以形成双链/单链DNA杂合72，如在步骤C之前所示。该杂合DNA72的特征在于在其3’末端存在由茎S2形成的3’可延伸末端。

在步骤C中，延伸步骤B中的DNA杂合的可延伸3’末端，以形成所示出的双链DNA74和置换单链DNA76。单链DNA76具有从5’末端至3’末端的环L1，茎S1，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2和茎环S2-L2。

在步骤D中，引物P2，反向DASL引物，其具有3’末端处的与同源性位点2互补的序列和在其5’末端的能够形成茎环S2-L2的序列，结合于步骤C中的单链DNA76。

在步骤E中，通过具有链置换活性的聚合酶在3’末端延伸所结合的引物P2，以形成双链DNA78，其具有环L1序列，茎S1序列，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2，接着是3’末端处的两个茎环结构。

在步骤F中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸可延伸的3’末端，以形成所示出的双链DNA80和单链DNA82，其具有在其3’末端的环L1序列，S1序列，目标H1序列，连接区，目标H2序列和5’末端处的茎环S2-L2。

在步骤G中，具有在其5’末端处的能够形成茎环S1-L1的序列和在3’末端处的与目标同源性位点1H1互补的序列的引物P1，在H1同源性位点1处结合到单链DNA82。

在步骤H中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸所结合的引物P1，以形成双链/单链杂合DNA84。从5’末端开始，在一条链上，存在茎环L1-S1，以及具有环L1和茎S1序列的单链DNA，随后是双链H1，连接区和H2序列，随后是茎环S2-L2的3’末端序列。

在步骤I中，引物LP1，具有与步骤A和B中相同的序列，结合至双链/单链杂合84。

在步骤J中，通过具有置换活性的聚合酶延伸所结合的引物LP1，以形成所示出的双链DNA86和单链DNA16分子，其可用于根据扩增路径A和B引发新的扩增循环(图5和图6)。

通过遵循步骤A'到J'以及使用环状引物Lp2，DASL引物P1和P2，类似于步骤A至J，可以生成其它类型的DASL单链DNA，单链DNA10。

因为环状引物转换某些双链DNA为单链DASLDNA，其可以通过图5和6中示出的扩增路径扩增，该反应可以通过这些环状引物加速。

参照图8，其示出增效引物在促进DASL扩增过程中的作用，开始于步骤A，增效引物B结合至图5和图6所示的扩增路径中的双链副产物DNA90。该DNA90具有5’末端处的环L1，茎S1，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2和3’末端处的两个并排茎环S2-L2结构。增效引物B结合到H1和H2同源性位点之间的连接区，以避免竞争与正向DASL引物P1或反向DASL引物P2的目标结合，并避免在增效引物B和两个DASL引物P1和P2两者之一之间形成引物-引物副产物。这些副产物是不希望的，因为它们可能会减慢目标扩增反应。然后通过具有链置换活性的聚合酶延伸所结合的增效引物B，以形成新的延伸链，并且因此如步骤A中所示的新的双链-单链杂合产物92。这种结构具有环L2，在其末端之一处具有可延伸的3’末端。

在步骤B中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸步骤A中的可延伸3’-末端，以形成具有两个接合单元的DASL序列的双链DNA94和双链-单链杂合DNA96。这种杂合DNA96具有在其5’末端处的环L1，接着是茎S1，双链同源性位点1H1，双链连接区，单链同源性位点2H2和在3’末端处的茎-环结构S2-L2。

在步骤C中，具有在其5’末端的茎-环S2-L2和在其3’末端的H2结合序列的引物P2结合至步骤B中的杂合DNA96的单链同源性位点2H2。

在步骤D中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸所结合的引物P2，以形成双链DNA98，其具有在其5’末端处的双链茎序列S1，双链环序列L1，茎序列S1，同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2和在3’末端处的两个并排茎环S2-L2结构。

在步骤E中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸两个并排茎环中的一个的可延伸3’末端，以形成所示出的双链DNA100和双链单链杂合DNA102。该杂合DNA102具有在其3’末端处的环L1，接着是茎S1，双链同源性位点1H1，双链连接区，单链同源性位点2H2和在5’末端处的茎环结构S2-L2。

在步骤F中，具有在其5’末端处的能够形成茎环S1-L1的序列和在3’末端处的与目标同源性位点1H1互补的序列的引物P1，结合于步骤E中的杂合DNA102的双链H1区域。

在步骤G中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸所结合的引物P1，以形成双链-单链DNA杂合104，其在5’末端处以两个并排茎环L1-S1开始，接着是双链同源性位点1H1，连接区，同源性位点2H2，茎序列S2，环序列L2和在3’末端处的茎序列S2。除了双链H1区域，这种杂合DNA104在一个单独的链中还具有单链同源性位点1H1。

在步骤H中，在DNA构象的可逆变换中，带有单链同源性位点的链与双链H1区域的两条链的其中一条结合，以形成可延伸的3’末端，如图所示。

在步骤I中，通过具有链置换活性的聚合酶延伸可延伸的3’末端，以形成所示出的双链DNA106和DASL单链DNA16，即进入扩增路径A和B用于扩增(图5和6)。

通过以结构类似于步骤A中的结构的DNA开始，即，图6所示的扩增路径的另一双链副产物，其具有3’末端处的环L2，茎S2，同源性位点2H2，连接区，同源性位点1H1和5’末端处的2个茎-环S1-L1结构，并遵循与步骤A至I平行的步骤，可以产生另一条单链DNA，单链DNA10(参照图3)。

因为增效引物可在扩增期间从一些相关双链产物产生DASL单链DNA10和单链DNA16，增效引物可加快扩增过程。

引物设计和用途

当根据本发明设计引物时，优选地选择足够的序列长度，即，碱基数量，和组成，即，GC含量，和熔解温度以确保引物与模板的特异的和有效的结合(Kampkeetal.,Bioinformatics17:214-225(2001))。通常，适合在DASL中使用的引物的长度多于10个核苷酸且少于70个核苷酸。引物可具有约50％的GC含量，优选30-70％，更优选40-60％之间。引物的熔解温度由引物的长度和GC含量来确定。优选地，引物的熔解温度Tm接近结合和扩增将发生的温度，从反应温度以下5℃至反应温度以上约15℃，优选为从反应温度以下2℃至反应温度以上约5℃。如果结合和扩增的温度为60℃，为该反应设计的一对引物的熔解温度可以在55℃至70℃的范围内并且更优选58-65℃。此外，引物不应具有非预期的二级结构，如非预期的茎环或发夹和非预期的引物-引物副产物“引物二聚体”。Tm的估计以及对引物序列的二级结构的预测可以由一些软件辅助，诸如Mfold(M.Zuker.Mfoldwebserverfornucleicacidfoldingandhybridizationprediction.NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)。本领域技术人员知道Tm估计应当考虑到反应条件，包括引物浓度，镁浓度，dNTP和盐浓度。关于引物设计的更多信息由Kampkeetal.,Bioinformatics17:214-225(2001)描述。为了为DASL反应选择最好的引物，可以在平行DASL测定法中通过实验测试具有各种序列和熔解温度的一组引物。本文所描述的引物可以通过本领域中公知的合成方法来制备(参见，例如美国专利第6214587号)。引物可以容易地作为定制的寡核苷酸商购得到。

对于DASL引物，如图1中的引物P1，将目标结合部分设计成在DASL反应条件下自身结合到目标链的同源性位点。例如，DASL引物的目标结合部分可具有约60℃，优选53-70℃，更优选57-63℃的Tm。DASL引物优选在3’末端包含至少1-2个出自四种碱基的鸟苷(G)或胞苷(C)碱基以确保引物选择性地结合目标的足够能力。由G和C形成的碱基配对的稳定性比由A和T碱基形成的碱基配对高。在另一方面，优选避免在引物的3’末端具有超过2-3个的G或C碱基，因为这些引物更容易产生错配引物或形成引物二聚体。

优选地，在DASL正向引物所结合的目标同源性位点和DASL反向引物所结合的目标同源性位点之间的序列的距离应选择为尽可能地短，以使全长扩增DNA产物的大小尽可能地小，以便最大限度地减少需要被合成的核苷酸碱基的总数，从而缩短总的扩增时间。例如，用于实施例1中的凝血酶原基因片段A(图9)的单体产物的大小为38bp，不包括构建体的茎-环区域。

DASL引物的茎环部分可以具有以下序列区域，a)5’末端茎序列，b)环序列和c)是茎的反向互补的序列(“r-c茎序列”)。这样的一系列序列区域应确保在等温反应条件下形成茎环结构。可以通过使用核苷酸序列二级结构预测算法来验证该设计。茎的长度可以是3至30个碱基，优选为4至25个碱基，GC含量为至少30％，并且环的长度可以是5-30个碱基。环的长度优选为10-25个碱基，更优选长度为13-20个碱基。为了促进在茎环状引物中形成所设计的茎环结构以便有效和快速的反应，优选的是环的GC含量低，诸如30-50％GC或更低。这有助于促进茎环结构的形成，以及阻止DNA模板的茎环区域，如顶部和底部(正向或反向DNA链)之间的链间碱基配对。还优选，通过将环设计成仅具有嘧啶碱基或仅嘌呤碱基，使该环具有低的形成另外的环内结构的倾向。例如，由于C和A不彼此形成强有力的WatsonCrick碱基配对，可以由C或A碱基形成环。作为另一个实例，多聚A环或多聚C环或多聚T环或多聚G环不提供环内碱基配对。

可以优化环的大小以提高扩增反应的速率。环越小，如环中具有3-7个碱基，环形成得越快-可被称为接合速率(on-rate)的速率。环越大，如超过30个碱基，环形成得越慢。对于最优DASL反应，例如8-30个碱基对，优选10-30个碱基对，更优选13-20个碱基对。可以通过设计具有相同的目标结合序列和具有可变环大小的相同的茎序列的若干引物来确定最佳的环大小。

对于给定的环大小，也可以调整茎长度和序列。一般而言，茎序列越长或茎的GC含量越高，预形成的茎环可被打开得越慢。换句话说，茎序列和碱基组成可能影响打开速率，或断开速率(off-rate)。对于具有最佳断开速率的最优DASL反应，茎应该优选具有4-25个碱基对，或优选4-15个碱基对，或优选4-8个碱基。可以通过设计具有a)相同的目标结合序列，b)相同的环序列和c)可变的茎序列长度和/或碱基组成来确定最佳茎长度和碱基组成。

如上所述，可通过调整茎环中的茎的大小，茎环中的环的大小和茎环中的环的碱基含量优选地设计茎环状引物以便更有效地扩增核酸目标。更具体地，茎环状引物可以假定整体相对短的引物序列长度，以使设计茎环状引物在DASL反应期间有效地迅速结合模板。例如，对于DASL反应有效的茎环状引物可以包括16个碱基环序列，具有6个碱基的茎序列，具有6个碱基的r-c茎序列，具有20个碱基的目标结合序列，具有48个碱基的总引物长度。

在一般情况下，优选的是茎环状引物具有30-75个碱基，更优选40-60个碱基的总长度。为了缩短引物的总长度，所述目标结合区的5’部分可同时充当环和/或r-c茎的一部分。可选地，目标结合区的5’部分可以充当r-c茎的一部分或全部。例如，在该茎环状引物中，所述目标结合区域与环和r-c茎重叠：

在目标结合序列(以大写字母表示)中，“GTA”充当环的一部分且“TGCCCG”充当r-c茎。为了具有所期望的10-30个碱基(在本实施例中是17个碱基)的环大小，在“GTA”之前的14A作为环的其余部分。在环序列之前的茎序列“cgggca”确保茎环结构的形成。注意：加下划线的是茎和r-c茎区域。在一些替代实施方案中，环和/或r-c茎可以重叠到目标结合序列中多达90％的目标结合序列。

r-c茎的序列基本上或完全是茎结构的反向互补的序列。茎环结构可以具有接近反应温度或比反应温度高5-20℃的熔解温度Tm。例如，对于60℃下的反应，茎环的Tm可以是60-80℃，优选65-75℃。为了最大限度地减少茎和r-c茎区中的碱基数，可以使用高的GC含量，高达100％GC含量。换言之，这两个区域中的所有碱基可以是G或C。茎-环结构的的Tm可以通过算法和软件程序来预测，如Mfold(M.Zuker.Mfoldwebserverfornucleicacidfoldingandhybridizationprediction.NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)。这种预测算法不仅可用于预测将在所定义的反应条件(如预期的镁浓度和离子强度)下形成所预期的茎-环，而且还避免或减少另外的二级结构。如果发现任何另外的二级结构，则可以检查茎环结构的新设计，例如，通过改变茎和相应的r-c茎序列，或环序列，以确保形成预期的茎环结构，并且基于热力学参数，如自由能变化或熔解温度，避免另外的二级结构或使另外的二级结构不稳定。例如，另外的结构应该具有大幅低于预期茎环结构的Tm值的Tm值。检查核酸的二级结构的方法是本领域技术人员所公知的，例如Mfold(M.Zuker.Mfoldwebserverfornucleicacidfoldingandhybridizationprediction.NucleicAcidsRes.31(13),3406-3415,2003)。

默认情况下，正向和反向DASL引物可具有彼此不同的环结构，不同的茎，或以其它方式不同的茎环结构。可替代地，正向和反向DASL引物可以共享相同的茎环序列并由此共享结构。换句话说，如正向DASL引物的L1-S1，以及反向DASL引物的L2-S2，可以具有相同的序列。

使用上述引物设计考虑，应该将置换引物，如图4中的D1和D2引物，设计成确保它们在DASL反应条件下结合到目标。应该将正向置换引物设计成正向DASL引物的正上游，优选上游1-100个碱基对，更优选上游1-50个碱基对。应该将反向置换引物设计成反向DASL引物的正下游，优选下游1-100个碱基对，更优选下游1-50个碱基对。置换引物的Tm可能接近反应温度。例如，对于在60℃下的DASL反应，置换引物的Tm值可以是大约60℃，优选53-70℃，更优选57-63℃。

可以将环状引物，如图7中的Lp1和Lp2引物，设计成结合DASL产物的一部分或整个环区。关于“一部分”，其是指环区的序列中的至少5个碱基。在3’末端，所述环状引物可以采用DASL引物的环序列的一部分或整个序列。所述环状引物可以在其5’末端包含针对茎区的序列。另外，其他结构，例如茎环，可连接到引物的5’末端。所述环状引物可以具有接近反应温度的Tm。例如，对于60℃下的DASL反应，环状引物的Tm可以是大约60℃，优选53-70℃，更优选57-63℃。可以将环状引物序列选择为使得链型(strandedness)与DASL引物的环序列相同。换句话说，环状引物序列可以衍生自DASL引物的环序列，而不是反向互补序列。这是为了避免环状引物结合至DASL引物导致引物之间的延伸反应而无目标DNA的参与。

提供了指数地和选择性地扩增核酸目标的方法，其中用于模板的两个DASL引物的茎环的部分或全部共享相同的序列并且在DASL扩增反应中使用具有共享的序列的单个环状引物。

可以将增效引物，如图8中的引物B，设计成结合在目标DNA的同源性位点1和同源性位点2之间连接的连接区的一部分或全部(参见例如图3，图4和图8)。关于“一部分”，是指连接区的序列中的至少5个碱基。所述连接区的长度优选为3-50个碱基对。此区域的长度优选足够长，以允许增效引物的设计，以及足够短以扩增尽可能短的产物。在实施例1中，将5个碱基对的一段延伸作为连接区，允许不含茎环(包括茎环的107bp)的单体产物的35个碱基对被扩增。相比于长产物，短的产物可以更快速地扩增。为了扩增相对短的产物，在增效引物的5’末端，所述引物的序列可与同源性位点1或同源性位点2重叠，这取决于增效引物的取向。每当一个增效引物(booster)与其他引物，如DASL引物或另一个增效引物重叠时，这种重叠是在具有相同链型的引物的序列之间。例如，正向DASL引物的3’末端和正向增效引物的5’末端可以彼此重叠。例如，注意实施例1中的实验，其中增效引物与正向DASL引物重叠以尽量减小单体产物的尺寸。优选的是增效引物的3’末端不与DASL引物的3’末端重叠。如果引物的3’末端重叠，则在目标DNA不参与的情况下的引物之间的延伸和反应可干扰目标DNA的扩增。此外，当增效引物与DASL引物的同源性结合序列重叠时，优选这种重叠仅仅是局部的，也就是只对于DASL引物的少于50％的同源性位点，和50％的增效引物的模板结合序列，以避免/最小化DASL引物和增效引物之间的与模板结合的竞争。

可以使用多个增效引物，如两个或更多的增效引物。例如，可以使用多个不重叠的增效引物，其中个体引物结合正向或反向模板链。例如，增效引物1和2都结合到正向模板链，或反向模板链。可选择地，增效引物1可以结合到正向链且增效引物2可结合到反向链，或反之亦然。在后一种情况下，增效引物可以彼此头对头(3’末端对3’末端)或者尾对尾(5’末端对5’末端)的面对。当使用重叠的增效引物时，优选的是，重叠介于一个引物的5’末端和另一个引物的3’末端之间，或引物的5’末端之间。应避免增效引物的3’-末端之间的重叠以避免/最小化引物-引物反应和模板依赖性扩增反应之间的竞争。

也可以优选地仅使用一对DASL引物，一个用于正向且另一个用于反向，围绕待扩增的目标区域，如实施例6中。

除了DASL引物，可以包括来自以下的引物类型的列表的至少一种类型的引物以增加DASL反应的速率和/或增加产物的产率，反应的特异性和/或灵敏度：a)置换引物，b)增效引物和/或c)环状引物。优选地，来自该列表的至少两种类型的引物包括有DASL反应中的DASL引物。例如，DASL反应包括正向和反向DASL引物，置换引物和增效引物，在适当的缓冲液和其他温度条件中，在具有置换活性的聚合酶的存在下。可替代地，DASL反应包括正向和反向DASL引物，置换引物和环状引物，在适当的缓冲液和其他温度条件中，在具有置换活性的聚合酶的存在下。在一个优选的实施方案中，DASL反应包括所有三种类型的附加引物：正向和反向DASL引物，正向和反向置换引物，增效引物和环状引物，在适当的缓冲液和其他温度条件中，在具有置换活性的聚合酶的存在下，如在实施例1至5中。

可以优化DASL反应中的引物的浓度以确保DASL反应迅速和有效地进行。例如，在使用多种类型的引物的情况下，两种DASL引物具有最高浓度，随后是中间浓度的增效引物和环状引物，以及具有最低浓度的置换引物以引导反应朝向DASL反应的优化的速率并最小化背景反应。优选地，每个增效引物和环状引物具有0.3-0.7×的DASL引物浓度且每个置换引物具有0.05至0.2×的DASL引物的浓度。例如，DASL引物可各自具有大约2μM的浓度，(多个)增效引物和(多个)环状引物的每种可以具有约1μM的浓度，并且每种置换引物可以具有约0.2μM的浓度。作为另一实例，所述DASL引物可以各自具有约1μM的浓度，(多个)增效引物和(多个)环状引物的每种可以是大约0.6μM，并且每种置换引物可以是大约0.15μM的浓度。此外，DNA延伸反应，包括DASL等温扩增反应的速率，可通过改变整体引物浓度调节。在某些条件下，增加DASL引物的引物浓度从2μM至3μM，可导致反应速率的增加。然而，由于引物-引物二聚体或其它的副产物，太高的整体引物浓度可导致降低的特异性。可以在一系列平行的DASL反应中测试引物的最佳浓度，其中改变整体和/或个体引物的浓度并对所得的产物分析产率，反应时间及期望产物的存在，例如通过琼脂糖凝胶电泳，参见实施例1～6。

优选地，可以在单个DASL反应容器中利用多组DASL引物以便同时扩增多个扩增子，将这种扩增反应称为多重扩增反应。术语“扩增子”在这里用来指待扩增的目标或目标区域。本领域技术人员知道，可以为期望的结果优化多重扩增反应，所述期望的结果例如，相似水平的扩增用于多重反应中的所有扩增子。或者，也可以实现一些扩增子的优先扩增，例如，小的扩增子。可以改变反应条件，如每个扩增子的引物浓度，反应时间，pH值，镁浓度，酶浓度以获得期望的多重扩增结果。可以在一个DASL反应容器中扩增两个扩增子。通常将这样的反应称为2重(2-plex)。也可以复用超过2个的扩增子。例如，在3重反应中，可在同一试管中扩增病毒的三个不同的区域。作为使用DASL的多重扩增的另一实例，在基因分型测定法中，可以扩增4个或更多的或甚至10个或更多的扩增子以便在不同的序列位点处询问所述序列。通常在单核苷酸多态性(SNP)分析和检测病原体中使用复用(Jessingetal.,J.Clin.Microbiol.41:4095-4100(2003))。在优化多重DASL方法中，可以首先优化引物浓度。优选地，对于特定的引物类型，例如，DASL引物，环状引物，增效引物或侧翼置换引物，在多重DASL反应中的引物的总浓度保持与用于优化的单一扩增子反应的那些接近。此外，多个扩增子扩增可以共享(多个)环状引物。例如，用于目标1，2和3的DASL引物可以共享相同的环序列，从而单一的环状引物可以用于同时扩增目标1，2和3的整个多重反应。

聚合酶

基于聚合酶在所需的温度范围内的DNA聚合和链置换活性将所述聚合酶选择用于DASL。有可能具有两种单独的酶，一种如聚合酶和一种提供链置换活性。在一个优选的实施方案中，一种酶具有两种活性。例如，BstDNA聚合酶大片段可用于同时提供聚合酶和链置换活性。

可从缺乏5’至3’外切酶活性和可任选地缺乏3’-5’外切酶活性的一组聚合酶中选择具有链置换活性的DNA聚合酶。

合适的DNA聚合酶的实例包括BstDNA聚合酶的大片段和Bst2.0DNA聚合酶的大片段(NewEnglandBiolabs公司，贝弗利，麻萨诸塞州)，大肠杆菌DNA聚合酶I的外切酶缺陷型Klenow片段(NewEnglandBiolabs公司，贝弗利，麻萨诸塞州)，外切核酸酶缺陷型T7DNA聚合酶(测序酶；USB，克利夫兰，俄亥俄州)，大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(NewEnglandBiolabs公司，贝弗利，麻萨诸塞州)，KlenTaqDNA聚合酶(AB肽，圣路易斯，密苏里州)，T5DNA聚合酶(美国专利第5716819号)和PolIIIDNA聚合酶(美国专利第6555349号)，Bca(外切-)DNA聚合酶，Vent(外切-)DNA聚合酶(无外切酶活性的VentDNA聚合酶)，DeepVentDNA聚合酶，DeepVent(外切-)DNA聚合酶(无外切酶活性的DeepVentDNA聚合酶)，Φ29噬菌体DNA聚合酶，MS-2噬菌体DNA聚合酶，Z-TaqDNA聚合酶(TakaraShuzo)，KODDNA聚合酶(TOYOBO)。优选地，具有链置换活性的DNA聚合酶，如BstDNA聚合酶大片段，大肠杆菌DNA聚合酶I的外切酶缺陷型Klenow片段和测序酶，用于DASL扩增。优选BstDNA聚合酶，Bca(外切-)DNA聚合酶和类似的酶，因为它们各自都同时具有聚合和链置换活性并且在55-70℃之间的高温下具有一定程度的热稳定性和高催化活性。对于Bst2.0DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs，伊普斯威奇，MA，USA)，例如，可以使用60-69℃的温度。此外，可使用这些酶的各种突变体，只要它们具有适当的序列依赖性互补链延伸活性和链置换活性。这些突变体包括截短的酶或突变酶，所述截短的酶仅包含具有催化活性的结构，所述突变酶的催化活性，稳定性或热稳定性已经由氨基酸突变改性。

结合引物到核酸模板并进行DNA延伸

结合引物到核酸模板的条件已很好地描述并且被本领域技术人员公知，如在“分子克隆和实验室手册”第二版中描述。Sambrook，Rich和Maniatis，ColdSpringHarbor出版(2003)。在用于酶促延伸本发明的DNA的方法中，包括一系列步骤的反应在缓冲液中进行，所述缓冲液给予适当的pH，引物结合以及保持酶的催化活性所需的盐浓度，酶的保存剂，此外如果需要的话，Tm调节剂等。可以使用在中性至弱碱性pH值范围内如pH值从6.5-10具有缓冲作用的缓冲液。根据所使用的DNA聚合酶的类型调节pH。要添加以保持酶活性并改变多核苷酸的Tm的盐的实例包括KCl，NaCl，MgCl₂，MgSO₄，(NH₄)₂SO₄等。酶保存剂包括牛血清白蛋白和糖。优选地，使用为具有链置换活性的聚合酶优化的缓冲液。例如，来自酶Bst2.0DNA聚合酶(大片段)的供应商的缓冲液(NewEnglandBiolabs，伊普斯威奇，MA，USA)，也就是20mMTris-HCl，10mM((NH₄)₂SO₄，50mMKCl，2mMMgSO₄，pH8.8)，或等效缓冲液，可用于进行DASL反应。

相比于已经是双链DNA形式的链，引物更容易地结合到单链核酸。在聚合酶链式反应中，当双链DNA用作模板时，在引物结合之前该DNA需要通过变性转化为单链。在使用双链DNA模板的互补链延伸的DASL反应中，可以通过Tm调节剂诸如甜菜碱和其他缓冲和反应条件使双链DNA去稳。这样的去稳足以允许引物瞬时结合于模板以及在引物结合时即刻发生引物延伸，而无需完全转换双链结构为单链。

可以使用产生初始单链模板的初始高温变性步骤以加速DASL反应。例如，提供了根据本发明的优选实施方案的指数地和选择性地扩增核酸目标的方法，其中在70℃或更高，优选90-100℃下预先加热所述目标DNA30秒或更长的时间，在存在或不存在引物的情况下，在加入具有链置换活性的聚合酶和反应缓冲液之前。在DASL反应的开始，预变性模板预期增加结合有引物的模板的比例。

可替代地，可以增加任选的碱变性步骤以在反应的开始变性模板。这样的碱性条件可以通过增加氢氧化钠至5-20mM创建。在本发明的一个方面中，使用低浓度的碱，例如2-10mM，这样的低浓度的碱可方便地在碱变性之后通过在DASL反应中加入的反应缓冲液中和，例如，在上述引用的在Bst2.0DNA聚合酶(大片段)缓冲液中的20mM的Tris。以这种方式，可以变性之后立即发生DASL反应。无论是在热变性或碱变性中，所有必需的引物，例如，DASL引物，置换引物，环状引物和/或增效引物可以被包括在与模板相同的混合物中并在同一时间变性。以这种方式，随着混合物冷却或中和，引物可以在DASL反应之前立即结合单链模板。由于酶和dNTP可能是热和碱不稳定的，温度变性应排除这些反应组分。

熔解温度(Tm)调节剂降低模板DNA的Tm，包括模板和中间产物的链之间的链与链关联的Tm。这些Tm调节剂包括甜菜碱(N，N，N-三甲基甘氨酸)，脯氨酸，二甲基亚砜(DMSO)，甲酰胺和三甲胺N-氧化物。同样，丙二醇是适于根据本发明的反应的另一种分子拥挤试剂(Zhangetal.,BioTechniques,Vol.47,pp.775–779(2009))。当使用Tm调节剂时，可以在相对窄的温度范围内调节上述引物的结合，如20℃范围。此外，甜菜碱和四烷基铵盐由于它们的熔点和稳定化作用有效地促进链置换的效率的提高。在本发明的优选实施方案中，向反应溶液中加入约0.2～3.0M，优选约0.5至1.5M的浓度的甜菜碱可望提高DNA的扩增。通过排除水和创建与溶质聚阳离子的静电相互作用，已经将聚乙二醇(PEG)用于创建人造分子拥挤条件(Miyoshi,etal.,Biochemistry41:15017-15024(2002))。当将PEG(7.5％)加入到DNA连接反应中时，反应时间缩短为5分钟(快速连接试剂盒，NewEnglandBiolabs公司(贝弗利，麻州))。也已经将PEG加入到解旋酶解旋试验中以提高反应的效率(Dong,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:14456-14461(1996))。PEG或其他分子拥挤试剂也可以增加DASL反应中的酶和核酸的有效浓度，从而缩短反应时间和降低反应所需的酶浓度。

基于引物与模板关联的Tm和聚合酶可接受的温度范围可以容易地选择酶反应的合适的温度条件，例如，58-70℃是适合基于BstDNA聚合酶的酶的范围。可以调节Tm调节剂的量以增加或减少引物结合模板的有效Tm。本领域技术人员可以容易地选择合适的反应温度，取决于引物核苷酸序列，Tm和Tm调节剂的量和具有链置换活性的可兼容聚合酶。也可以通过改变反应混合物的温度和使用琼脂糖凝胶电泳比较扩增产物来在一系列平行测定中通过实验确定给定的一组引物的最佳温度和反应条件。

也可以考虑所提及的用于结合引物到模板的相同条件以确保模板DNA内的延伸，如模板内3’末端延伸(例如，参见图1的步骤D)或模板到模板相互作用或状态之间的模板转换(例如，参见步骤A6，图3)，和链置换。

适合根据本发明的方法的模板DNA可以在各种方法中制备，例如，它们可通过使用适当的DNA分离方法从组织，血液和其他生物流体或培养的细胞中分离出来。例如在ManiatisT，FritschEF，SambrookJ(1982)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约州中充分描述了这些方法。用于DNA分离的方法和试剂盒也广泛地市售。在根据本发明的DASL方法中使用之前，可以不需要从样本如组织、血液和其他生物流体中存在的污染物分离DNA。模板DNA也可以合成(化学)制备。

扩增反应的体积标度可以是纳升至数毫升。在利用超低量执行筛选测定的一些方法中，可以将纳升标度的溶液转移到小的反应容器中，如96，384，1536孔微孔板中的孔。可以通过吸取和混合纳升的聚合酶、反应缓冲液，引物和其他试剂和样品或这些试剂和样品一起的混合物到反应容器中设置DASL反应。可以将这种反应孵育至所需的反应温度范围内，例如，30-70℃，为了通过采样一个大体积的样品来增加灵敏度，反应的体积可以从实施例1-6中的那些按比例放大至数百微升至几毫升。优选的是相对于实施例1-6中的或说明书中讨论的那些保持试剂的浓度。本领域的技术人员可以很容易地优化试剂的浓度和采用这些大体积的反应的条件。

RNA检测

在扩增前，通过使用适当的逆转录酶和合适的引物或引物的混合物可以将RNA转化成单链cDNA。得到cDNA后，可以使用上文描述的方法扩增它们，因为包括单链DNA10和单链DNA16的产生的DASL方法，对双链和单链目标DNA或DNA-RNA杂合双链DNA起作用。在后一种情况下，只有杂合的DNA链将充当DASL扩增的模板。各种逆转录酶是容易商购的。用于cDNA延伸的引物可以是目标特异性引物或随机序列引物，或具有聚A碱基的引物。当购买逆转录酶时，供应商广泛地提供在逆转录中使用的这些引物和方法，或以其他方式广泛地描述，例如在这样的参考文献中-ManiatisT,FritschEF,SambrookJ(1982)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约州。

可从各种生物来源分离信使RNA，通常缩写为mRNA，以及包含mRNA的总RNA。可以用各种方法制备适合根据本发明的方法的模板RNA，例如，可通过使用适当的DNA分离方法从组织，血液和其他生物流体或细胞系中分离它们。在例如ManiatisT，FritschEF，SambrookJ(1982)分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室，冷泉港，纽约中充分描述了这些方法。用于RNA分离的方法和试剂盒也可广泛地商购。在根据本发明的DASL方法中使用之前，含有模板RNA的样本如组织、血液和其他生物流体可能不需要从这样的来源分离。

适合使用的逆转录酶包括用于逆转录酶的任何可商购的酶，如M-MuLV，禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶。当逆转录酶不耐热时，可以首先在低温下孵育该反应，例如37至42℃或类似的温度，用于逆转录，随后高温孵育以便通过DASL等温扩增，例如在63℃。在两种不同的缓冲系统用于RT-DASL时，一种用于RT而另一种用于扩增步骤，在寡-dT引物或与目标RNA序列互补的序列特异性引物或随机引物的存在下，通过逆转录酶延伸第一链cDNA。在本发明的一个方面中，两阶段方法中的RT缓冲液和组成是50mMTris-HCl，pH8.3，75mMKCl，3mMMgCl2，10mMDTT,AMV，50mMTris乙酸盐，pH8.4，75mM醋酸钾，8mM醋酸镁，10mMDTT，dNTPs和目标RNA。然后将来自逆转录反应的cDNA拷贝的等分试样转移到第二种反应缓冲液并随后在DASL反应中在聚合酶的存在下扩增。

可以通过两个连续的反应，逆转录和DASLDNA扩增反应来扩增RNA。使用对于逆转录和DASL反应共同的缓冲液在共同的反应容器中发生这两个反应。在加入样品和包括RNA、逆转录引物和逆转录酶，以及DASL引物和具有置换活性的聚合酶的所有试剂之后，首先在大约37℃的低温下为逆转录纳入反应容器，随后是在约60℃的高温下的DASL反应。这种组合的单管反应的好处是节省时间并为操作者提供方便。

通过使用热稳定的逆转录酶(美国5322770)，如(SuperScript^TM，ThermoScript^TM(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州)，或转录子(罗氏，巴塞尔，瑞士)逆转录酶或具有逆转录酶活性的聚合酶如Tth聚合酶ThermoScript^TM(Invitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州))，可以在单一的反应温度下进一步进行逆转录和DASL反应。在这样的系统中，使用逆转录酶和DNA聚合酶和共同的缓冲系统并在整合的孵育步骤中同时从RNA目标生成和扩增cDNA拷贝。第一链cDNA首先通过逆转录酶延伸。来自逆转录反应的RNA-DNA双链体部分地由反应系统解开。在本发明的一个方面中，在RNA/cDNA双链体的全长解开后，单链RNA进入下一轮逆转录反应，从而产生更多的第一链cDNA。cDNA在DASL反应中进行扩增。此过程重复自身来实现源自RNA目标序列的DNA的指数扩增。

检测扩增核酸

包括引物结合和DNA延伸的DASL反应通常发生几分钟到一个小时。为了缩短反应的持续时间并提高反应产率，可通过实验检查各种条件，包括反应温度，引物浓度，DASL引物，置换引物、增效引物和/或环状引物的浓度比，镁浓度，dNTP浓度，酶浓度，模板浓度等。优选地，该反应可以进行到高水平的DNA产物，或平台水平，超出该水平，反应的进一步孵育不显著增加产物的数量。尽管如此，对于检测扩增产物的一些方法，如使用例如EvaGreen或SYBRGreen的荧光染料监测扩增的DNA的荧光，反应只需要积累足够数量以超过实时PCR机器的荧光检测器的检测阈值，如Cq或Ct(循环阈值或时间阈值)。

可通过各种方法检测扩增的核酸产物。优选地，荧光嵌入剂如溴化乙锭，其通过与双链DNA反应发出荧光，用于检测扩增的DNA。溴化乙锭可以用于染色所完成的反应的溶液。阳性扩增反应可以引起与阴性反应不同的溴化乙锭荧光。当核酸以高水平存在于扩增产物中时，溴化乙锭染色可用于目视检查或在紫外透射仪的辅助下检查。PicoGreen^TM(Tomlinsonetal.,ApplEnvironMicrobiol73:4040-4047(2007))，SYBRGreenI(Iwamotoetal.,JClinMicrobiol41:2616-2622(2003))，EvaGreen(Qiaoetal.BiotechnolLett,29:1939-1946(2007))，GelRed(Nakaoetal.BMCMicrobiology10:296(2010))可用于代替溴化乙锭以直接染色所完成的扩增反应的溶液。或者，浊度可用于检测扩增的核酸的存在(Morietal.,BiochemBiophysResCommun289:150-154(2001))。该溶液染色之后，提倡应用目视检查，如医疗点诊断，因为它需要很少的时间来获得定性结果，在试验样品中的核酸的扩增之后。羟基萘酚蓝也可以用于染色和检测扩增的DNA。染料，例如羟基萘酚蓝，也可以在DASL反应之前加入，因为染料在适当的浓度范围内(例如约120μM)不抑制等温扩增反应。

在一个优选的实施方案中，诸如SybrGreen或EvaGreen的荧光染料可以包括在反应中并且通过凭借荧光计或实时PCR机器的检测器监测随着DASL反应积累扩增的DNA而产生的荧光来实时监测反应，在约20℃-75℃的温度范围内，例如在60℃-65℃的范围内。

还可以通过凝胶电泳，接着是凝胶的溴化乙锭或Safe或GelRed染色以可视化扩增的DNA的条带来分析扩增的核酸(参见实施例1-6)。

为了协助检测，可以将引物和/或从引物衍生的产物结合到固相。例如，引物的一部分可以标记有结合的配体，例如生物素。该标签随后使所得到的DNA产物通过结合伴侣如固定化的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白间接地固定化，所述抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可例如通过磁珠或固体表面固定。因此，扩增产物的固定化可促进其从溶液相分离，例如从酶，缓冲液和未反应的引物和目标DNA分离。分离的产物可以通过核酸特异性指示剂或者通过与标记探针结合来检测。也可通过用限制性酶消化产物来回收目标核酸片段，所述限制性酶的特异性识别序列可以构建在引物中。或者，附着到引物的标记可以是信号部分，例如荧光标签，放射性同位素或另一信号提供物。这样的标签的实例包括荧光标签，如羧基荧光素的胺反应性荧光素酯-GlenResearch，斯特林，弗吉尼亚州。这样的引物优选是增效引物，环状引物或DASL引物。例如，引物可具有在5’末端处的标签序列，其非互补于(多个)目标核苷酸序列。这种标签序列可以与例如侧流分析设备的侧向流动膜中的检测探针结合。使用探针来检测扩增的DNA的这些方法是本领域的技术人员公知的(如美国专利US8445291)。

这里所公开的方法可用于检测样品中的病原体，基因型和其它目标的存在或不存在。当在样品中具有目标时，使用根据本发明的方法，扩增可以发生。可以使用各种检测方法检测这种扩增，其中一些在此讨论。是否进行这样的检测的结果，换言之，阳性或阴性，指示目标是否存在或不存在于样品中。因此，根据本发明的扩增方法可用于制备诊断方法和试剂盒。

还提供了一种在现场使用的紧凑的便携式装置，如在医疗点卫生保健机构中，使用侧流试纸条装置来检测扩增的核酸。在核酸扩增之后，将扩增的DNA施加到这样的装置的样品区域。随着扩增的DNA与探针和捕捉试剂相互作用，所捕获的信号线可以形成以指示扩增的DNA的存在。本领域的技术人员一直容易获得检测扩增的DNA的各种方法，例如，使用侧向流动膜(例如在美国专利7799554的侧向流动装置中)。

上述材料，如具有链置换活性的聚合酶和引物，反应缓冲液，以及其他材料可以以任何合适的组合包装在一起，伴随着执行优选的方法的指令，作为用于实施所公开的方法或帮助所公开的方法的实施的试剂盒。如果给定试剂盒中的试剂盒组分被设计和适合与所公开的方法一起使用，它是有用的。例如公开的是用于在DASL反应中扩增目标核酸的试剂盒，所述试剂盒包含用于扩增和检测目标核酸的一种或多种试剂组合物和一种或多种组分或试剂。例如，所述试剂盒可包括一种或多种试剂组合物和一种或多种寡核苷酸探针，一种或多种荧光染料或组合。试剂盒的另一种形式可以包括多个试剂组合物。试剂盒也可以含有，例如，dNTP核苷酸，缓冲液，具有链置换活性的聚合酶，Tm调节剂，镁或组合。

因为DASL方法快速，灵敏和稳健而不需要热循环仪，需要核酸扩增的各种产业应用是可能的。例如，这样的应用包括人类疾病，如感染性疾病和癌症的诊断，或基因分型的方法以帮助优化患者治疗性处理，以及在食品监督和安全测试中检测食品中的病原体，其中通常需要对所选定的食品样品测试病原体诸如沙门氏菌，李斯特菌和大肠杆菌。在这样的应用中，可以使用根据本发明的方法来扩增和检测用于疾病和病原体的任何核酸标志。扩增方法可用于开发实验室中的诊断方法或程序或可选地诊断和测试试剂盒，其可被构建用于实验室或医疗点或需要快速测试或诊断的实验室外的现场位置。

为了帮助理解本发明提供了下面的实施例并且不解释为限制本发明。

实施例

实施例1：扩增和表征凝血酶原产物A

用于凝血酶原产物A的模板和引物的序列在图9和下面的表1中示出：

人凝血酶原基因产物A引物的列表

所使用的引物浓度：各自为0.2μM的FII-NF1和FII-NR1(置换引物)，1μMFII-Nbooster(增效引物)，均为2μM的PIA-FII-F2'和PIA-FII-NR2，1μM的PIA-LP2和1μM的PIA-LP7(环状引物)。

用于反应的模板是水，或来自人肿瘤细胞系MCF7的10ng人类基因组DNA，或100ng的同一人类基因组DNA。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH42SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs，贝弗利，马萨诸塞州)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma-Aldrich)，3.5mM的总Mg2+浓度和8UBstDNA聚合酶(大片段)/25μl反应。在加入所有的试剂和DNA之后，在60℃下孵育反应35或50分钟。

对所完成的反应实施1.2％琼脂糖凝胶电泳。结果示于图10中。MW是FermentasGeneRuler^TM1kbladder(ThermoScientific，渥太华，加拿大安大略省)。反应1和4是水空白。反应2和5具有10ng的人类基因组DNA作为模板。反应3和6具有100ng人类基因组DNA作为模板。对于反应1-3孵育条件为在60℃下35分钟，而对于反应4-6为在60℃下50分钟。在图10中，请注意，在泳道1中，将出现在泳道的底部的单一条带指定为游离的未反应的引物。如图10所示，在35分钟，10ng和100ng的人类基因组两者都支持凝血酶原产物A的扩增。此外，100ng人类基因组DNA(反应3和6)相比于10ng人类基因组DNA(反应2,5)产生更多的DNA产物。另外，较长的反应时间产生更多的DNA产物(相对于泳道3和4的泳道5和6)。空白反应显示没有(反应1)或很少(反应4)的反应产物。值得注意的是，反应4产物似乎是在产物的大小和产物的尺寸的模式方面不同于反应2,3和4和5的产物。对于反应5和6，所观察到的产物在约60，100，200个碱基对(bp)和更高的尺寸的范围内。增效引物FII-Nbooster和其中一个DASL引物PIA-FII-NR2预期产生62bp产物。预期的单体为107bp(图9)。根据图6的其中一个二聚最终产物预计约为206bp。这些预测的产物尺寸与在琼脂糖凝胶上观察到的条带尺寸严格匹配。

使用PIA-FII-NR2(SEQIDNO：3)引物作为测序引物对反应5进行测序。结果示于图11中。

所观察到的序列如下：

GCACTGGGAGCATTGAGGCTCCTCGACGGTCGACTGCGCACGTGGCCC对于相同的区域，用于与观察到的序列比较的预期序列是：

GCACTGGGAGCATTGAGGCTCCTCGACGGTCGACTGCGCACGTGGCCCGTCGAGGAG(斜体：PIA-f2'茎环)

所观察到的序列与该构建体所期望的序列匹配。因此，在本实验中扩增出正确的产物。

估计实施例1中的扩增的倍数

我们估计发生在实施例1中的扩增的倍数。大约或最多100ng的人类基因组DNA在反应中使用。这相当于可用于该反应的DNA模板的30303个拷贝(参见用于估计的下表A)。

当考虑所有的产物，包括二聚物，三聚物，四聚物等时，获得了大约或至少100ng的约100bp大小的产物。以单体等效数量估计二聚物，三聚物，四聚物，多聚物。这相当于被扩增的DNA的9.1×10¹¹个拷贝(参见用于估计的下表A)。

因此，在实施例1的反应中存在大约3000万倍扩增(扩增之后的DNA的拷贝除以扩增之前的DNA的拷贝)。

表A

实施例2：扩增和表征凝血酶原产物B

用于凝血酶原产物B的模板和引物的序列在图12和下面的表2中示出：

人凝血酶原基因产物B引物的列表

所使用的引物浓度：各自为0.4μM的FII-F1和FII-R1(置换引物)，各自为1μM的FII-Nbooster和FII-F1’(增效引物)，均为2μM的PIA-FII-F2和PIA-FII-NR2，和1μM的PIA-LP2(环状引物)。

用于反应的模板是水或100ng人类基因组DNA。DNA和引物混合物在94℃下加热1分钟并且在将酶和缓冲液加入到反应管中之前在冰上冷却。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma)，3.5mM的Mg2+浓度和8UBstDNA聚合酶(大片段)/25μl反应。在60℃下孵育反应50分钟。利用100ng人类基因组DNA的反应显示期望的扩增产物而利用水的反应不显示(未示出数据)。

稀释利用人类基因组DNA的反应并使用测序引物FII-SEQ(SEQIDNO：28)测序。测序结果示于图13中。

预期序列是：

TGGTTCCCAAAAAAGTGACTCTCAGCGAGCCTCAATGCTCCCAGTGCTATTCATGGGCAGCTCTCTCGACGGTCGACTGCGCACGTGGCCC。

所观察到的序列(图13)与预期序列匹配，除了字符串CCC(预期序列的碱基6-8)被机器自动读为CC。色谱结果的人工读取显示字符串CCC，基于相邻碱基峰的间距，表明观察到的和预期的序列之间是100％匹配(图13)。这证实扩增产物的正确序列。

实施例3：使用各种引物组合扩增凝血酶原产物C

用于模板和引物的序列如图14和下面的表3所示：

人凝血酶原基因产物C引物的列表

所使用的引物浓度：各自为0.2μM的FII-F1和FII-R1(置换引物)，1μM的FII-Nbooster(增效引物)，均为2μM的PIA-FII-F2’和PIA-FII-NR2，和1μMPIA-LP-V2(环状引物)。引物的不同组合如下文所示地在单独的反应中使用：“完全”-所有的引物存在；“-置换引物”，“-增效”，-“PIA引物”，“-环状引物”表示所有的引物都存在除了(多个)命名的引物，未将其加入到相应的反应中。

用于反应的模板是如所指出的水(空白，“-”)或25ng人类基因组DNA(“+”，来自人类肿瘤细胞系，MCF7)。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma)，3.5mM的Mg2+浓度和8UBstDNA聚合酶(大片段)/25μl反应。在加入所有的试剂和DNA之后，在60℃下孵育反应40或50分钟。

进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。结果示于图15中。注意，在标记有“-”的泳道中，将出现在各泳道的底部的单一条带指定为游离的未反应引物。MW是100-1000bpDNA标记(BioBasic，Markham，安大略省，加拿大)。标记有“-”和“+”的反应为水或25ng的人类基因组DNA作为模板。

结果(图15)表明，在60℃下持续40分钟，在“完全”反应中存在所有的引物的情况下，反应是最有效的，证实所有的引物可用于促进特异的和有效的反应。在不存在环状引物的情况下，在60℃下在50分钟反应进行至产生可检测的水平。

实施例4：使用环状引物的不同组合扩增凝血酶原产物

用于凝血酶原产物的模板和引物的序列如图16和下面的表4所示：

几种人凝血酶原基因产物的引物的列表

引物浓度：各自为0.3μM的FII-F1和FII-R1(置换引物)，和1μMPIA-LP2-V2和2μMPIA-LP7(环状引物)，1μMFII-filler-R’(反应1-6)或1μMFII-Nbooster(增效引物)，以及1μMFII-F1’(反应7和8)用作增效引物。各自为2μM的DASL引物如下使用：PIAFIIF2’和FII-R2-Nu(反应1至4)，PIA-FII-F2，FII-NR2(反应5和6)，PIA-FII-F2–Nu和PIA-FII-NR2(反应7和8)。对于反应1-2，也加入1μMPIA-LP-Nu1作为环状引物用于引物FII-R2-Nu中的环，而对于反应3-4和7-8也加入1μMPIA-LP-Nu2作为额外的环状引物用于引物FII-R2-Nu和FII-F2–Nu中的环。

用于反应的模板是水(反应(“-”，1，3，5和7)或100ng人类基因组DNA(“+”，反应2，4，6和8)。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma)，3.5mM的Mg2+浓度和6UBst2.0DNA聚合酶(大片段，NewEnglandBiolabs)/25μl反应。在63℃下35或45分钟。

进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。MW是100-1000bpDNA标记(BioBasic，Markham，安大略省，加拿大)。如上所述地标记载入的反应。结果示于图17中。注意，在泳道1,3,5和7中，将出现在各泳道的底部的单一条带指定为游离的未反应引物。

结果(图17)表明，虽然共同的茎环结构和环状引物可为DASL反应中的正向和反向链共享(反应5和6)，然而两个不同的茎环结构和两种不同的环状引物(反应1，2，3，4，7和8)也可以用于DASL反应中的正向和反向链以支持成功的扩增。

实施例5：亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)产物的扩增

用于亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)产物的模板和引物的序列如图18和下面的表5所示：

引物浓度：各自为0.4μM的677-F1和677--R1(置换引物)，各自为1μM的677-booster1和677-booster4(增效引物)，各自为2μM的PIA-677-F2和PIA-677-R2’，以及1μMPIA-LP2(环状引物)。用于反应的模板是水或100ng人类基因组DNA。引物-模板混合物在94℃下预加热1分钟并在冰上冷却，在加入聚合酶和缓冲液mastermix之前(参见下面)。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma-Aldrich)，3.5mM的Mg2+浓度和8UBst2.0DNA聚合酶(大片段，NewEnglandBiolabs)/25μl反应。在60℃下孵育反应50分钟。

进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。MW是100-1000bpDNAMarker(BioBasic，Markham，安大略省，加拿大)。标记DNA尺寸标准的尺寸。未示出MW泳道。标记反应。反应1和2分别为水或20ng的人类基因组DNA作为模板。结果(图19)表明，产物以模板依赖性方式扩增-具有模板的反应2表明产物呈有规律地增加的多条带图案，而当模板在反应中不存在时，没有产物扩增出(水作为模板，反应1)。注意，在泳道1中，将在泳道的底部出现的单一条带指定为游离的未反应的引物。

用引物“677-booster1”(SEQIDNO：24)对具有人类基因组DNA作为模板的反应#2进行测序。结果示于图20中。

预期序列(用于与观察到的序列的相同区域比较)如下：CCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGCTCGACGGTCGACTGCGCACGTGGCCCGTCGAG

(下划线部分为PIA-677-R2’的茎环)。

利用手动读取从自动序列读取所观察到的序列，序列的开头是：

CCGATTTCATCATCACGCAGCTTTTCTTTGAGCTCGACGGTCGACTGCGCACGTGGCCCGTCGAG

除了呈现为主要的色谱峰的正确的序列外，存在呈现为小峰的其它序列的背景。这是预料之中的，因为反应产物是在凝胶电泳图案(图18)上观察到的各种物质的混合物。总体而言，所观察到的序列与预期的序列匹配，证实反应2中的扩增产物具有正确的序列。

实施例6：扩增凝血酶原产物的扩增产物

用于凝血酶原产物的模板与图12中示出的凝血酶原产物B相同，(SEQIDNO：9)。正向DASL引物是PIA-FII-F2-Nu(SEQIDNO：15)且反向DASL引物是PIA-FII-NR2(SEQIDNO：3)。未使用其他的引物。

引物浓度：各自为2μM的PIA-FII-F2-Nu和PIA-FII-NR2。用于反应的模板是水或19ul反应中的100ng人类基因组DNA。引物-模板混合物在94℃下预加热2分钟并在冰上冷却，在加入酶和缓冲液mastermix之前(参见下面)。

酶和缓冲液条件为：1X等温扩增缓冲液(20mMTris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mMKCl，2mMMgSO4，pH8.825℃(NewEnglandBiolabs)，1.4mMdNTPs，0.8M甜菜碱(Sigma-Aldrich)，3.5mM的Mg2+浓度和4UBst2.0DNA聚合酶(大片段，NewEnglandBiolabs)/25μl反应。在60℃下孵育反应50分钟。

用引物FII-filler-R’B(SEQIDNO：29)对具有人类基因组DNA作为模板的反应进行测序。结果示于图21中。

预期序列(用于与观察到的序列的相同区域比较)如下：

TAGAAACACAAAAATAATTCTTTCACGGGATTGGTTCCAGGGGGGGCGTCACCAGGCCGTAGCTCCCCCCC

利用手动读取从自动序列读取观察到的序列，序列的开头是：TAGAAACACAAAAATAATTCTTTCACGGGATTGGTTCCAGGGGGGGCGTCACCAGGCCGTAGCTCCCCCCC。

除了呈现为主要的色谱峰的正确的序列外，还存在呈现为小峰的其它序列的背景。这是预料之中的，因为用于测序的产物预计是各种尺寸单体和多聚体的混合物。总体而言，所观察到的序列与预期的序列匹配，证实扩增产物具有正确的预期序列。

权利要求的范围不应受所述实施例中陈述的优选的实施方案限制，而是应给予与说明书作为一个整体一致的最广泛的解释。

Claims (51)

1.一种扩增核酸的方法，其包括：

(a)提供第一模板，所述第一模板具有：(i)3’茎环，所述3’茎环由位于3’末端的第一区和彼此退火形成第一茎的第一互补区，和连接所述位于3’末端的第一区和所述第一互补区的第一环区形成；(ii)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第二区和彼此退火形成第二茎的第二互补区，和连接所述位于5’末端的第二区和所述第二互补区的第二环区形成；和(iii)连接3’末端茎环和所述5’末端茎环的单链目标序列，所述目标序列具有在目标序列的3’末端处的第一同源性位点，在目标序列的5’末端处的第二同源性位点，和任选地，在第一同源性位点和第二同源性位点之间的连接区；

(b)提供两种或更多种茎环状引物，具有链置换活性的聚合酶和反应缓冲液；其中，第一茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第三区和彼此退火形成第三茎的第三互补区，和连接所述位于5’末端的第三区和所述第三互补区的第三环区形成；和(ii)与第一同源性位点互补的在3’末端处的核苷酸序列；并且其中第二茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第四区和彼此退火形成第四茎的第四互补区，和连接所述位于5’末端的第四区和所述第四互补区的第四环区形成；和(ii)与互补于第二同源性位点的序列互补的在3’末端处的核苷酸序列；

(c)使第一茎环状引物与第一模板上的第一同源性位点退火结合；

(d)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第一模板延伸第一茎环状引物以形成第二模板，所述第二模板具有：(ⅰ)与第一同源性位点互补的第三同源性位点；和(ii)与第二同源性位点互补的第四同源性位点；

(e)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第一模板的3’末端，从而从第一模板移置第二模板；

(f)使第二茎环状引物与第二模板上的第四同源性位点退火结合；

(g)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第二模板延伸第二茎环状引物以形成第三模板；

(h)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第二模板的3’末端，从而从第二模板移置第三模板；和

(ⅰ)使用第三模板作为步骤(c)中的第一模板重复步骤(c)至(h)，从而扩增所述核酸。

2.根据权利要求1的方法，其中所述方法在等温的反应环境中发生。

3.根据权利要求1或2的方法，其还包括：

(i)提供置换引物，其中所述置换引物具有与一个或多个所述同源性位点的上游或下游核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使置换引物与所述同源性位点之一的上游或下游互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸置换引物，从而使所述模板中的两种彼此置换。

4.根据权利要求1至3中的任一项的方法，其还包括：

(i)提供环状引物，其中所述环状引物具有与所述模板之一上的所述茎环的所述环区之一上的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使环状引物与所述模板之一上的所述茎环的所述环区之一上的互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸环状引物，从而有助于所述模板中的两种彼此置换。

5.根据权利要求1至4中的任一项的方法，其还包括：

(i)提供增效引物，其中所述增效引物具有与所述连接区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(ⅱ)使增效引物与所述连接区上的互补区退火结合；和

(ⅲ)通过具有链置换活性的聚合酶延伸增效引物，从而有助于所述模板中的两种彼此置换。

6.根据权利要求1至5中的任一项的方法，其中具有链置换活性的所述聚合酶是BstDNA聚合酶大片段。

7.根据权利要求1至6中的任一项的方法，其中所述反应缓冲液包含甜菜碱。

8.根据权利要求1至7中的任一项的方法，其中所述单链目标序列的长度为70个碱基对或更短。

9.根据权利要求1至8中的任一项的方法，其中所述单链目标序列的长度为50个碱基对或更短。

10.根据权利要求1至9中的任一项的方法，其中第一模板的所述3’末端茎环和所述5’末端茎环具有相同的核苷酸序列。

11.根据权利要求1至10中的任一项的方法，其中提供所述第一模板的所述步骤(a)包括：

(a1)提供双链核酸目标，所述双链核酸目标包括与第二链互补的第一链，所述第二链具有与第三和第四同源性位点的序列相同的序列；

(a2)使第二茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第二链上的第四同源性位点相同；

(a3)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第二链延伸第二茎环状引物以形成第三链，所述第三链具有与第一和第二同源性位点的序列相同的序列，从而替换第一链；

(a4)使第一茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第三链上的第一同源性位点相同；

(a5)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第三链延伸第一茎环状引物以形成第四链，所述第四链具有与第三和第四同源性位点的序列相同的序列，从而替换第二链；

(a6)使第二茎环状引物与这样的序列退火结合，所述序列与第四链上的第四同源性位点相同；

(a7)通过具有链置换活性的聚合酶沿着第四链延伸第二茎环状引物以形成第五链，所述第五链具有与第一和第二同源性位点的序列相同的序列，从而形成具有第三、第四和第五链的三链复合体；

(a8)使所述三链复合体可逆地解离成：(i)第三链；和(ii)包含第四和第五链的双链复合体，其中双链复合体的一端具有在第四链上的3’末端茎环和在第五链上的5’末端茎环；

(a9)通过具有链置换活性的聚合酶延伸第四链的3’末端，从而置换第五链，其中第五链用作步骤(a)中的第一模板。

12.根据权利要求1至11中的任一项的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个的长度是10至30个碱基对。

13.根据权利要求1至12中的任一项的方法，其中所述第三茎和所述第四茎中的每一个的长度是4至25个碱基对。

14.根据权利要求1至13中的任一项的方法，其中第一茎环状引物和第二茎环状引物的所述5’末端茎环具有60摄氏度至80摄氏度的熔解温度。

15.根据权利要求1至14中的任一项的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘧啶碱基。

16.根据权利要求15的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的嘧啶碱基。

17.根据权利要求1至14中的任一项的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘌呤碱基。

18.根据权利要求17的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的嘌呤碱基。

19.根据权利要求1至14中的任一项的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚腺嘌呤碱基。

20.根据权利要求19的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的聚腺嘌呤碱基。

21.根据权利要求1至14中的任一项的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚胸苷碱基。

22.根据权利要求21的方法，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的聚胸苷碱基。

23.根据权利要求1至22的任一项的方法，其中第一茎环状引物的第三互补区和第三环区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

24.根据权利要求1至22的任一项的方法，其中第一茎环状引物的第三互补区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

25.根据权利要求1至24的任一项的方法，其中第二茎环状引物的第四互补区和第四环区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。

26.根据权利要求1至24的任一项的方法，其中第一茎环状引物的第四互补区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。

27.一种用于扩增核酸的系统，其包括：

(a)第一模板，所述第一模板具有：(i)3’茎环，所述3’茎环由位于3’末端的第一区和彼此退火形成第一茎的第一互补区，和连接所述位于3’末端的第一区和所述第一互补区的第一环区形成；(ii)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第二区和彼此退火形成第二茎的第二互补区，和连接所述位于5’末端的第二区和所述第二互补区的第二环区形成；和(iii)连接所述3’末端茎环和所述5’末端茎环的单链目标序列，所述目标序列具有在目标序列的3’末端处的第一同源性位点，在目标序列的5’末端处的第二同源性位点，和任选地，在第一同源性位点和第二同源性位点之间的连接区；和

(b)两种或更多种茎环状引物，具有链置换活性的聚合酶和反应缓冲液；其中，第一茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第三区和彼此退火形成第三茎的第三互补区，和连接所述位于5’末端的第三区和所述第三互补区的第三环区形成；和(ii)与第一同源性位点互补的在3’末端处的核苷酸序列；并且其中第二茎环状引物具有：(ⅰ)5’末端茎环，所述5’末端茎环由位于5’末端的第四区和彼此退火形成第四茎的第四互补区，和连接所述位于5’末端的第四区和所述第四互补区的第四环区形成；和(ii)与互补于第二同源性位点的序列互补的在3’末端处的核苷酸序列。

28.根据权利要求27的系统，其中所述系统在等温的反应环境中运作。

29.根据权利要求27或28的系统，还包括置换引物，其中所述置换引物具有与一个或多个所述同源性位点的上游或下游核苷酸序列互补的核苷酸序列。

30.根据权利要求27至29的任一项的系统，还包括环状引物，其中所述环状引物具有与第一模板上的所述茎环的所述环区之一上的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

31.根据权利要求27至30的任一项的系统，还包括增效引物，其中所述增效引物具有与所述连接区上的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

32.根据权利要求27至31的任一项的系统，其中具有链置换活性的所述聚合酶是BstDNA聚合酶大片段。

33.根据权利要求27至32中的任一项的系统，其中所述反应缓冲液包含甜菜碱。

34.根据权利要求27至33中的任一项的系统，其中所述单链目标序列的长度为70个碱基对或更短。

35.根据权利要求27至34中的任一项的系统，其中所述单链目标序列的长度为50个碱基对或更短。

36.根据权利要求27至35中的任一项的系统，其中第一模板的所述3’末端茎环和所述5’末端茎环具有相同的核苷酸序列。

37.根据权利要求27至36中的任一项的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个的长度是10至30个碱基对。

38.根据权利要求27至37中的任一项的系统，其中所述第三茎和所述第四茎中的每一个的长度是4至25个碱基对。

39.根据权利要求27至38中的任一项的系统，其中第一茎环状引物和第二茎环状引物的所述5’末端茎环具有60摄氏度至80摄氏度的熔解温度。

40.根据权利要求27至39中的任一项的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘧啶碱基。

41.根据权利要求40的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的嘧啶碱基。

42.根据权利要求27至39中的任一项的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的嘌呤碱基。

43.根据权利要求42的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的嘌呤碱基。

44.根据权利要求27至39中的任一项的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚腺嘌呤碱基。

45.根据权利要求44的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的聚腺嘌呤碱基。

46.根据权利要求27至39中的任一项的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少60％的聚胸苷碱基。

47.根据权利要求46的系统，其中所述第三环区和所述第四环区中的每一个包括至少75％的聚胸苷碱基。

48.根据权利要求27至47的任一项的系统，其中第一茎环状引物的第三互补区和第三环区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

49.根据权利要求27至47的任一项的系统，其中第一茎环状引物的第三互补区与互补于第一同源性位点的在3’末端处的核苷酸序列重叠。

50.根据权利要求27至49的任一项的系统，其中第二茎环状引物的第四互补区和第四环区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。

51.根据权利要求27至49的任一项的系统，其中第一茎环状引物的第四互补区与在3’末端处的这样的核苷酸序列重叠，所述核苷酸序列与互补于第二同源性位点的序列互补。