CN113388602A - 一种肌肽水解酶固定化的方法及其应用 - Google Patents
一种肌肽水解酶固定化的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及肌肽水解酶与含肌肽水解酶的重组细胞的固定化技术。在肌肽水解酶酶液或含肌肽水解酶的重组细胞悬浮液中加入絮凝剂，生成絮凝颗粒(酶或细胞聚集体)，并与海藻酸钠溶液混合，得到海藻酸钠‑酶混合液，然后加入有机溶剂以及表面活性剂，形成反相悬浮体系，在该体系中加入氯化钙，海藻酸钠‑酶混合液凝胶化生成微米～毫米级凝胶颗粒，进而使用戊二醛进行交联得到稳定的凝胶固定化催化剂。本发明所述固定化生物催化剂具有高的活性和稳定性，易于重复使用，有很好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种肌肽水解酶的固定化方法，以及固定化肌肽水解酶在催化L-组氨酸和β-丙氨酸逆水解缩合制备L-肌肽的应用。
背景技术
L-肌肽是由β-丙氨酸的羧基与L-组氨酸的氨基缩合得到的一种天然二肽化合物，具有抗氧化、抗衰老、预防溃疡等重要的生理、药理功能，在医药、保健及食品领域具有非常广泛的应用。
目前已有很多L-肌肽化学法合成的报道，但化学法合成工艺路线普遍存在合成路线冗长，包括繁琐的保护、去保护步骤，涉及使用大量有害、甚至剧毒试剂，废物排放多、污染大等严重问题。与化学合成法相比，酶法合成路线可以直接使用β-丙氨酸与L-组氨酸作为底物，反应得到L-肌肽，无需对原料进行保护和去保护，不使用有害试剂，绿色环保，有望取代传统的化学法合成工艺。
在先前工作中，通过广泛筛选，成功获得了来源于粘质沙雷氏菌的高活性肌肽水解酶SmPepD(CN 109468303 A)，并对其进行了进化改造(CN 112266908 A)；它可以催化β-丙氨酸与L-组氨酸的逆水解(缩合)反应，一步合成获得L-肌肽；当使用游离酶作为催化剂，在机械搅拌反应釜中催化反应时，时空产率达到62g/L/d(Catal.Sci.Technol.2019,9,5971–5978)。
在酶法合成工艺的工业化应用中，高稳定性生物催化剂的重复使用对于工艺过程的稳定化、连续化操作而言是非常重要的。在先前的报道中，通过膜截留反应器进行肌肽水解酶的截留回收和重复使用，即采用截留分子量为10kD的超滤膜，将酶蛋白截留在反应器中，持续回收并重复使用，进行连续或半连续反应96h后，产物浓度未见显著下降。尽管该方法可以实现肌肽水解酶的重复使用，但膜反应器在长期运行中存在膜孔通道被蛋白质堵塞，操作压力持续升高，需要间歇对膜进行清洗，难以长期稳定操作等问题。在先前工作中，尝试使用多种来源的环氧树脂、氨基树脂进行SmPepD的共价键合固定化，获得的固定化酶具有很高的活力上载，但使用这种方法制备的固定化酶催化剂，酶蛋白容易脱落损失，固定化酶的重复使用性能非常差。因此，有必要开发高效的肌肽水解酶固定化技术，制备稳定、易于重复使用的固定化肌肽水解酶催化剂。
发明内容
针对肌肽水解酶共价键合固定化方法存在的问题，本发明采用海藻酸钠包埋的技术，对肌肽水解酶或含肌肽水解酶的细胞进行包埋固定化。传统海藻酸钙包埋固定化技术仅适用于细胞的固定化，不适用于空间尺寸较小的蛋白固定化，得到的产物为毫米级尺寸的颗粒，传质阻力较大、机械强度差，而且放大制备困难。本发明对肌肽水解酶或含肌肽水解酶的细胞进行絮凝沉淀，得到酶或细胞的聚集体；与海藻酸钠溶液混合后，在表面活性剂存在下分散于有机溶剂中；然后加入氯化钙进行凝胶化，获得微米～毫米级固定化凝胶颗粒，传质阻力小。通过蛋白质絮凝，生成尺寸较大的聚集体，使本方法不仅适用于细胞固定化，也适用于酶蛋白的固定化。获得的固定化催化剂颗粒加入戊二醛交联，可以得到高机械强度、高稳定性的固定化催化剂。
本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种肌肽水解酶固定化的方法，包括如下步骤：
(1)将肌肽水解酶或含有肌肽水解酶的细胞加入到pH 6～9的Tris-HCl缓冲液中，得到酶溶液或细胞悬浮液，然后加入絮凝剂，使酶蛋白或细胞絮凝，得到酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液；
(2)将步骤(1)的悬浮液与预先制备的海藻酸钠溶液混合，得到海藻酸钠-酶混合液，然后加入有机溶剂和表面活性剂，充分混合形成反相悬浮体系；
(3)在步骤(2)的反相悬浮体系中加入氯化钙，海藻酸钠-酶混合液凝胶化，得到含有微米～毫米级凝胶颗粒的混合液；
(4)在步骤(3)得到的含有微米～毫米级凝胶颗粒的混合液中加入戊二醛，使生成的凝胶颗粒进一步交联；
(5)分离步骤(4)得到的凝胶颗粒，充分洗涤，得到海藻酸钙包埋固定化肌肽水解酶催化剂。
优选的，步骤(1)中，可以将酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液离心沉降，收集酶或细胞聚集体，重新悬浮于适量缓冲液中，再次得到酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液。
优选的，步骤(1)中，所述絮凝剂为聚乙烯亚胺、聚丙烯酸钠或聚丙烯酰胺中任意一种；肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞与絮凝剂的质量比为1:10～10:1。
优选的，步骤(2)中，混合液中海藻酸钠的浓度为0.5％～2.0％(w/v)，所述有机溶剂是环己烷、异辛烷或甲苯中任意一种，有机溶剂与海藻酸钠-酶混和液的体积比为100:1～1:1。
优选的，步骤(2)中，所述表面活性剂为吐温80、吐温60、吐温40、司盘80、司盘-60或曲通X-100中任意一种，表面活性剂与海藻酸钠-酶混和液的质量体积比为0.5％～5％。
根据本发明的第二个方面，本发明制备的海藻酸钠包埋固定化肌肽水解酶催化剂，用于催化β-丙氨酸和L-组氨酸缩合，生成L-肌肽。固定化酶重复使用20次，仍然保留了比较高的活性。
本发明具有如下有益效果：
本发明将酶或细胞的絮凝沉淀与海藻酸钙包埋的方法结合，进行肌肽水解酶的固定化，解决了肌肽水解酶难以固定化重复使用的问题。制备过程条件温和，催化剂活力损失小；通过对酶或细胞的絮凝沉淀进行离心、重新悬浮，可以有效提高催化剂上载量；制备得到微米～毫米级尺寸的凝胶颗粒，传质阻力小；通过戊二醛交联可以进一步提高催化剂的稳定性，最终得到的固定化肌肽水解酶催化剂具有活性高、易于重复使用、机械强度高等优点。
附图说明
图1为固定化酶催化合成L-肌肽重复反应的转化率曲线。
具体实施方式
实施例1
本发明所用的肌肽水解酶是参考公开专利CN 112266908 A中实施例2方法制备的肌肽水解酶，所用的重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞是相应静息细胞冷冻干燥制备的冻干细胞。具体的，将重组大肠杆菌pET28a-SmPepDM13/E.coli BL21接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC1 10g/L，pH 7.0)中，37℃振荡培养过夜，按1％(v/v)的接种量转接到装有600mL LB培养基的2L三角烧瓶中，置于37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD600达到1.2时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG作为诱导剂，16℃诱导24h后，将培养液离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤两次，得到静息细胞。静息细胞冷冻干燥，得到重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞；将所得的静息细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液(100mM，pH 8.0)中，使用高压匀浆破碎，破碎液冷冻干燥，即得到肌肽水解酶冻干酶粉。大肠杆菌整细胞活力为89U/g干细胞，冻干酶粉活力为78U/g冻干酶粉。
酶活力测定方法：反应体系0.2ml，含Tris-HCl缓冲液(50mM，pH 8.0)，1.9Mβ-丙氨酸，100mM L-肌肽和适量酶粉或冻干细胞，30℃条件下，1000rpm振荡反应20min；取10μl反应液，加入990μl高氯酸(pH1.0)充分混合，振荡5min，12000×g高速离心3min，膜过滤除蛋白，滤液进行液相色谱分析。每分钟催化水解1μmol L-肌肽水解需要的酶量，定义为1个酶活力单位(U)。
实施例2
(1)将0.1g实施例1所述肌肽水解酶冻干酶粉溶解于5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，加入5mL平均分子量为10000的聚乙烯亚胺的水溶液(2w/v％,pH 8.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(2)将5mL海藻酸钠水溶液(1％,w/v)加入到(1)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(3)将(2)的混合液加入到100mL环己烷中，加入50mg吐温80，500rpm机械搅拌，缓慢加入1mL的CaCl2溶液(10％,w/v)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(4)在(3)的混合物中加入40μL戊二醛溶液(50％,w/v)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用100mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶，比活力为0.29U/g固定化酶。
实施例3
(1)将0.1g实施例1所述肌肽水解酶冻干酶粉溶解于5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 9.0)中，加入5mL平均分子量为1200万的聚丙烯酸钠的水溶液(2w/v％,pH 9.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(2)将5mL海藻酸钠水溶液(1w/v％)加入(1)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(3)将(2)的混合液加入到100mL甲苯中，加入100mg吐温60，500rpm机械搅拌，缓慢加入1mL的CaCl2溶液(10％,w/v)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(4)在(3)的混合物中加入40μL戊二醛溶液(50％,w/v)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用100mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 9.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶，比活力为0.23U/g固定化酶。
实施例4
(1)将0.5g实施例1所述肌肽水解酶冻干酶粉溶解于15mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，加入25mL平均分子量为800万的阳离子聚丙烯酰胺的水溶液(0.2％,w/v,pH 8.0)，涡旋混合，生成浑浊的絮凝沉淀；
(2)将(1)的絮凝沉淀离心，弃去上清液，然后将絮凝沉淀重新悬浮于10mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中；
(3)将10mL海藻酸钠水溶液(4w/v％,)加入(2)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(4)将(3)的混合液加入到1000mL异辛烷中，加入1g曲通X-100，500rpm机械搅拌，缓慢加入1mL的CaCl2溶液(10w/v％,)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(5)在(4)的混合物中加入80μL戊二醛溶液(50w/v％,)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用100mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶，比活力为0.68U/g固定化酶。
实施例5
(1)将1g实施例1所述肌肽水解酶冻干酶粉溶解于25mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，加入100mL平均分子量为10000的聚乙烯亚胺的水溶液(1w/v％,pH 8.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(2)将(1)的絮凝沉淀离心，弃去上清液，然后将絮凝沉淀重新悬浮于25mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中；
(3)将25mL海藻酸钠水溶液(2w/v％)加入(2)的絮凝悬浮液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(4)将(3)的混合液加入到100mL异辛烷中，加入0.5g曲通X-100，500rpm机械搅拌，缓慢加入1mL的CaCl2溶液(20％w/v)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(5)在(4)的混合物中加入0.2mL戊二醛溶液(50w/v％,)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用500mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶，显微镜观察尺径约为200微米～500微米，比活力为0.92U/g固定化酶。
实施例6
(1)将1g实施例1所述重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞加到50mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 6.0)中，充分搅拌悬浮；
(2)在步骤(1)的悬浮液中加入50mL平均分子量为10000的聚乙烯亚胺的水溶液(2w/v％pH 6.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(3)将100mL海藻酸钠水溶液(2w/v％)加入(2)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(4)将(3)的混合液加入到200mL异辛烷中，加入2g吐温40，500rpm机械搅拌，缓慢加入20mL的CaCl2溶液(10w/v％)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(5)在(4)的混合物中加入0.8mL戊二醛溶液(50w/v％)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用500mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 6.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶整细胞，比活力为0.32U/g固定化整细胞。
实施例7
(1)将0.5g实施例1所述重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞加到25mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，充分搅拌悬浮；
(2)在步骤(1)的悬浮液中加入25mL平均分子量为10000的聚乙烯亚胺的水溶液(2w/v％,pH 8.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(3)将50mL海藻酸钠水溶液(2w/v％)加入(2)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(4)将(3)的混合液加入到100mL异辛烷中，加入1g司盘60，500rpm机械搅拌，缓慢加入10mL的CaCl2溶液(10w/v％)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(5)在(4)的混合物中加入0.8mL戊二醛溶液(50w/v％)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用500mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶整细胞，比活力为0.23U/g固定化整细胞。
实施例8
(1)将0.5g实施例1所述重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞加到25mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，充分搅拌悬浮；
(2)在步骤(1)的悬浮液中加入25mL平均分子量为10000的聚乙烯亚胺的水溶液(2w/v％,pH 8.0)，涡旋混合，生成混浊的絮凝沉淀；
(3)将50mL海藻酸钠水溶液(2w/v％)加入(2)的絮凝沉淀液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(4)将(3)的混合液加入到100mL异辛烷中，加入1g司盘80，400rpm机械搅拌，缓慢加入10mL的CaCl2溶液(10w/v％)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(5)在(4)的混合物中加入0.8mL戊二醛溶液(50w/v％)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用500mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶整细胞，显微镜观察尺径约为0.5毫米～0.8毫米，比活力为0.37U/g固定化整细胞。
实施例9
称取10g如实施例5所述固定化酶加到250mL三口烧瓶中，加入100mL底物的水溶液(含500g/Lβ-丙氨酸、22g/L组氨酸、12.6mg/L MnCl2)，35℃、200rpm机械搅拌反应12h。反应液抽滤，回收固定化酶返回到三口烧瓶中，加入新鲜底物再次转化，如此重复反应20次，间歇检测反应结束时组氨酸的转化率，结果如图1所示。肌肽水解酶催化的L-肌肽合成反应是一个可逆反应，新鲜制备的固定化酶催化反应的转化率约25％，由于固定化催化剂中残余产物的影响，固定化酶重复使用初期，反应12h时检测的转化率逐渐升高，直至重复使用10次之后，由于活力损失以及固定化酶回收过程中的损失，反应转化率逐渐下降。尽管如此，固定化酶重复使用20次，仍然保留了比较高的活性。
对比例
对比实施例1
(1)将0.1g实施例1所述肌肽水解酶冻干酶粉溶解于5mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，然后与5mL海藻酸钠水溶液(1w/v％)充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(2)将(1)的混合液加入到100mL环己烷中，加入50mg吐温80，500rpm机械搅拌，缓慢加入1mL的CaCl2溶液(10w/v％)，CaCl2溶液加入完毕后，继续搅拌30min；
(3)在(2)的混合物中加入40μL戊二醛溶液(50w/v％)，冰水浴，200rpm机械搅拌2h，抽滤，滤饼用100mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到固定化肌肽水解酶，比活力为0.21U/g固定化酶。
与实施例1相比，该对比实施例中，酶蛋白没有经过絮凝预处理，直接包埋于海藻酸钙凝胶中，由于缺少絮凝剂的保护，固定化酶的酶活收率不高，按实施例9所述方法重复使用3次之后，固定化酶活力几乎完全丧失，可能是由于酶蛋白没有经过絮凝处理，结构小，导致泄露损失。
对比实施例2
(1)将0.5g实施例1所述重组表达肌肽水解酶的大肠杆菌整细胞加到25mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)中，充分搅拌悬浮；加入25mL海藻酸钠水溶液(2w/v％)加入(1)的悬浮液中，充分搅拌混合，得到混合液，静置2h，充分除去气泡；
(2)通过蠕动泵，将(1)的混合液逐滴加入500mL的CaCl2溶液(1w/v％)中，滴加完毕后，冰水浴，继续搅拌30min；
(3)抽滤，分离制备的固定化细胞，用200mL Tris-HCl缓冲液(100mM,pH 8.0)洗涤，重复3次，得到直径约2-4毫米的固定化肌肽水解酶小珠，比活力为0.23U/g固定化细胞。
(4)称取10g(3)的固定化细胞加到100mL三口烧瓶中，加入20mL底物的水溶液(含500g/Lβ-丙氨酸、22g/L组氨酸、12.6mg/LMnCl2)，35℃、200rpm摇床振摇反应12h，观察到固定化酶小珠逐渐破碎，无法重复使用。
该对比实施例中，按传统方法进行细胞的凝胶固定化，与实施例8相比，使用传统方法制备的固定化酶，直径为毫米级，尺寸较大，传质阻力大，比活力低；由于底物氨基酸会与钙离子螯合，导致钙离子流失，在没有加入戊二醛进一步交联的情况下，固定化酶小珠机械强度非常差，很快破碎，无法重复使用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种肌肽水解酶或含有肌肽水解酶细胞的固定化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将肌肽水解酶或含有肌肽水解酶的细胞加入到pH 6～9的Tris-HCl缓冲液中，得到酶溶液或细胞悬浮液，然后加入絮凝剂，使酶蛋白或细胞絮凝，得到酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液；
(2)将步骤(1)的悬浮液与预先制备的海藻酸钠溶液混合，得到海藻酸钠-酶混合液，然后加入有机溶剂和表面活性剂，充分混合形成反相悬浮体系；
(3)在步骤(2)的反相悬浮体系中加入氯化钙，海藻酸钠-酶混合液凝胶化，得到含有微米～毫米级凝胶颗粒的混合液；
(4)在步骤(3)得到的含有微米～毫米级凝胶颗粒的混合液中加入戊二醛，使生成的凝胶颗粒进一步交联；
(5)分离步骤(4)得到的凝胶颗粒，充分洗涤，得到海藻酸钙包埋固定化肌肽水解酶催化剂。
2.如权利要求1所述的肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，将酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液离心沉降，收集酶或细胞聚集体，重新悬浮于适量缓冲液中，再次得到酶或细胞聚集体颗粒的悬浮液。
3.如权利要求1所述的肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞的固定化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述絮凝剂为聚乙烯亚胺、聚丙烯酸钠或聚丙烯酰胺中任意一种；肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞与絮凝剂的质量比为1:10～10:1。
4.如权利要求1所述的肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞的固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，混合液中海藻酸钠的浓度为0.5w/v％～2.0w/v％，所述有机溶剂是环己烷、异辛烷或甲苯中任意一种，有机溶剂与海藻酸钠-酶混和液的体积比为100:1～1:1。
5.如权利要求1所述的肌肽水解酶或含肌肽水解酶细胞的固定化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述表面活性剂为吐温80、吐温60、吐温40、司盘80、司盘-60或曲通X-100中任意一种，表面活性剂与海藻酸钠-酶混和液的质量体积比为0.5％～5％。
6.如权利要求1所述的方法制备的海藻酸钙包埋固定化肌肽水解酶催化剂的应用，其特征在于，催化β-丙氨酸和L-组氨酸缩合，生成L-肌肽。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：取权利要求1所述方法制备得到的海藻酸钙包埋固定化肌肽水解酶加到反应器中，加入β-丙氨酸、L-组氨酸和MnCl2的水溶液中，机械搅拌反应。
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