CN113384600A - 一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用，属于降血糖技术领域。本发明将植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301混合后灭活，在高脂饲料联合多次小剂量的链脲佐菌素诱导下的2型糖尿病模型中，本发明的灭活菌组对于2型糖尿病的改善程度能够达到活菌组水平，可以降低2型糖尿病模型小鼠的摄食量与饮水量并且一定程度增加其体重，能够有效降低血糖，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。而且，灭活菌明显降低2型糖尿病小鼠的脂肪蓄积，一定程度上改善糖尿病引起的肾功能障碍，可应用于制备治疗和/或预防糖尿病产品中。

Description

一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中 的应用

技术领域

本发明属于降血糖技术领域，尤其涉及一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用。

背景技术

随着经济发展和膳食的丰富，糖尿病(DM)已经成为危害人类健康的第三大非传染性疾病。根据国际糖尿病联盟所提供的全球糖尿病概览(第九版)的最新数据，截至2019年，全球约有4.63亿成年人患有糖尿病，其中中国的成年糖尿病患者数量为1.164亿。

糖尿病是由于体内胰岛素绝对或相对不足，或外周组织对胰岛素的敏感度降低而导致体内脂质和糖代谢紊乱的慢性疾病，根据其发病病因和机理可以将其分为1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、妊娠糖尿病(GDM)和其他特定类型的糖尿病。1型糖尿病主要的机制是在多种因素致使自身免疫系统出现异常，导致机体内产生一定量的胰岛β细胞特异性抗体，从而对胰岛β细胞进行破坏，导致胰岛素的绝对缺乏，且患者年龄均较小多为青少年和儿童；2型糖尿病是一种持续性高血糖疾病，其主要特征与发病原因是在体内胰岛素分泌水平正常的情况下，机体对胰岛素的敏感性降低，进而产生胰岛素抵抗效应，导致胰岛素生成水平降低，或体内胰岛β细胞功能性缺陷，胰岛素分泌不足，无法有效降低机体血糖值。2型糖尿病常与代谢综合征 (MS)相关，中老年人年龄段的发病风险较高，且在糖尿病中2型糖尿病患者人数达到了90％以上。

现阶段治疗糖尿病的方法主要有：饮食疗法、运动疗法、手术疗法和药物疗法。治疗的中心思想是减少糖的摄入以及通过各种方法以提升胰岛β细胞的活性。但目前常用的治疗方法都存在着一定弊端，如胰岛素治疗可能会引发糖尿病并发症以及耐药性和过敏，而双胍类药物会对肝肾功能造成一定损伤。

乳酸菌与人体健康有着非常密切的关系，具有抑制病原菌、改善胃肠道功能等作用。目前关于乳酸菌的益生效应的主要解释是：当乳酸菌菌体为活菌时，通过胃酸的屏障到达肠道并在肠道繁殖，随后发挥其功能特性。肠道菌群与糖尿病的发生发展密切相关：(1)有害菌的增加、益生菌的减少会导致肠道菌群失调，肠道免疫功能下降，使得糖尿病易感；(2)肠道菌群代谢产物破坏胰岛细胞引发糖尿病；(3) 革兰氏阴性菌大量增加并分泌大量内毒素，内毒素入血增加引起高血糖，长期处于高血糖的状态会导致机体产生胰岛素抵抗。应用乳酸菌等肠道益生菌以实现糖尿病的预防和治疗已经成为当前的热点研究问题，但是将乳酸菌应用于糖尿病的防治也存在一定复杂性，主要来源于益生菌研究中存在的应答率不一致，活菌难以完整发挥作用等问题，将乳酸菌产品应用于糖尿病防治也具有一定的局限性，在如何改善产品口感风味、提高产品效果、延长产品货架期以及产品储存方面仍面临巨大挑战。乳酸菌是一类益生菌，包含有很多菌株，不同的菌株在功效上不尽相同。而且益生菌制剂一般使用活菌制剂，活菌制剂生产工艺比较复杂，成本较高。而灭活的乳酸菌制剂由于其不具有生物活性，所以其降糖功效不如活菌制剂。探寻一种与活菌制剂具有相当降糖功效的灭活乳酸菌剂，是本领域亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有显著降糖功效的灭活乳酸菌剂，能够有效降低血糖，增加葡萄糖耐受能力，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，明显降低脂肪蓄积，改善糖尿病相关的肾功能障碍。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用，所述乳酸菌复合物包括植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301。

优选的，所述产品包括食品和药品。

优选的，所述糖尿病为2型糖尿病。

优选的，所述植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301的体积比为1：0.1-10。

优选的，所述乳酸菌复合物的菌悬液浓度为1×10⁸-1×10⁹个/mL。

优选的，所述灭活乳酸菌复合物减少脂肪蓄积。

优选的，所述灭活乳酸菌复合物增加葡萄糖耐受能力。

优选的，所述灭活乳酸菌复合物提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。

优选的，所述灭活乳酸菌复合物改善糖尿病相关的肾功能障碍。

本发明的有益效果：

本发明将植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301混合后灭活，在降低血糖方面，能够达到与活菌组相当的效果，而且能够明显降低血糖，提升机体糖耐受力，明显改善机体胰岛素抵抗，能够缓解脂肪蓄积和肾脏功能，可应用于2型糖尿病的治疗和预防中，为开发安全有效且生产储存容易的具有缓解2型糖尿病的益生菌相关产品提供了理论参考。

附图说明

图1为小鼠体重的变化，其中N.control：正常对照组；Model：模型组；P.control：阳性对照组；Lp&Lb：活菌组；ILp&ILb：灭活菌组；*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01 表示与正常对照组相比较；

图2为小鼠血糖水平的变化，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；▽▽p<0.01 表示治疗前后组内相互比较；

图3为小鼠糖耐受性及AUC葡萄糖，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；

图4为小鼠糖化血红蛋白，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；

图5为小鼠血清胰岛素及胰岛素抵抗指数，*p<0.05，**p<0.01 表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；

图6为小鼠胰岛素敏感性及AUC胰岛素，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；

图7为不同组别小鼠胰高血糖素样肽-1，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较；#p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较；

图8为小鼠尿素氮，*p<0.05，**p<0.01表示与模型组相比较； #p<0.05，##p<0.01表示与正常对照组相比较。

具体实施方式

本发明提供了一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用，所述乳酸菌复合物包括植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301。

本发明对于植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM 1301的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可，在本发明具体实施例中，植物乳杆菌CICC 24202购买于中国科学院微生物所菌种保藏中心，短乳杆菌YM 1301购买于昆明微生物所菌种保藏中心。在本发明中，所述糖尿病优选的为2型糖尿病，所述产品优选为包括食品和药品。

本发明对于灭活乳酸菌复合物的灭活方式没有特殊限定，采用本领域常规灭活方式均可，在本发明具体实施例中，灭活的方法为高压蒸汽灭菌，其具体参数优选为120-130℃、20-30min，更优选为 121-125℃、23-26min。在本发明中，灭活乳酸菌复合物的体积比优选为植物乳杆菌CICC 24202：短乳杆菌YM 1301为1：0.1-10，更优选为1：1-5。应用本发明所述乳酸菌复合物时，乳酸菌复合物的菌悬液浓度优选为1×10⁸-1×10⁹个/mL，更优选为2×10⁸-9×10⁸个/mL。

在治疗和/或预防糖尿病产品中添加本发明所述灭活乳酸菌复合物后，所述灭活乳酸菌复合物优选的通过减少脂肪蓄积、增加葡萄糖耐受能力、提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗、改善糖尿病相关的肾脏功能障碍等途径发挥抗糖尿病的作用。

在本发明所述应用中，当所述产品为药物时，该药物中优选的还包括药学上可接受的辅料。本发明对所述辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用本领域的常规药学辅料即可。当所述产品为食品时，该食品中优选的还包括食品上可接受的原料和辅料。本发明对所述原料和辅料的来源及种类并没有特殊限定，利用食品领域的常规原料和辅料即可。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在本发明实施例中，对数据的统计处理为：使用SPSS 20.0和GraphPad Prism 6软件统计处理数据，以平均值±标准误(Mean±SEM)方式表示。组间显著性差异的分析采用t检验，p<0.05表示统计学差异显著，p<0.01则表示统计学差异极显著。

实施例1

灭活乳酸菌复合物的制备

将MRS固体培养基(MRS肉汤培养基和琼脂均购于北京奥博星生物技术有限责任公司)于121℃灭菌25min，斜面放置冷却至室温，在超净工作台中无菌操作划线，接入保存于甘油中的植物乳杆菌 CICC 24202(Lp)和短乳杆菌YM 1301Lp(Lb)菌液，并于培养箱中37℃恒温培养24-48h，重复活化2-3次。将分装于锥形瓶中的MRS 液体培养基(250mL锥形瓶装液量为50mL)于115℃下灭菌20min，冷却至30-40℃后挑取斜面培养基上生长良好的菌落，接种到MRS 液体培养基中进行培养。

液体培养基培养18h后，将Lp和Lb按照体积比1:1比例混匀，对其进行计数，用无菌生理盐水调节至10⁸CFU/mL，即为口服活菌制剂，根据小鼠灌胃剂量，分装于无菌无酶冻存管中，置液氮灌备用；

按照同样方法将两种菌混匀计数并调整体积后，将菌液装于锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌，121℃灭菌25min，即为口服死菌制剂，根据小鼠灌胃剂量，分装于EP管中，置于4℃备用。

实施例2

动物实验

雄性昆明小鼠50只，体重18g±2g，饲养于洁净级动物房，保持室内恒温24±1℃，相对湿度50％-70％，进行12h昼夜循环模拟光照，标准实验饲料和自由饮水，适应性饲养一周后开始实验。将小鼠随机分成2组：正常对照组(N.control)和造模组，正常对照组(10只)给予普通饲料，造模组(40只)给予高脂饲料(High Fat Diet， HFD)喂养。第2周开始运用高脂饲料喂养4周后，除正常对照组外，造模组给予多次小剂量链脲佐菌素(STZ，购于美国Sigma公司，70 mg/kg，腹腔注射)诱导2型糖尿病(T2DM)小鼠模型发生，(STZ 溶于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH＝4.4，配制成浓度为1％的溶液，现配现用。正常对照组注射相应体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)。每次注射STZ 72h后用血糖仪测定空腹血糖，空腹血糖≥11.1 mmol/L的小鼠认为是成功造摸的的T2DM模型小鼠。

将造模成功的小鼠随机分成4组：模型组(Model)、阳性药组 (Positive Control，P.control)、活菌组(Lp&Lb)、灭活菌组(ILp&ILb)。第6周开始每组小鼠灌胃，正常对照组(N.control)，给予普通饲料，正常饮食饮水，每日灌胃同等体积的生理盐水；模型组：给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃同等体积的生理盐水；阳性药组：给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃盐酸二甲双胍150mg/kg，用生理盐水配成混悬液；活菌组：给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃实施例1所述活菌制剂0.2ml；灭活菌组：给予高脂饲料，正常饮食饮水，每日灌胃实施例1所述灭活菌制剂0.2ml。试验期间定时记录小鼠体重变化及饮水摄食量，连续给药4周后检测与糖尿病相关生理生化指标。

2型糖尿病的病症主要体现在三多一少，即饮食多、饮水多、排尿多和体重减少。上述动物实验给药前后小鼠体重变化结果如图1所示，给药前正常对照组组小鼠体重较其余模型四组体重略高，数据具有极显著差异(p<0.01)，经过4周给药治疗，模型组小鼠体重仍下降趋势，其余四组小鼠体重均略有增加。而且，在治疗期间，模型组小鼠行为上表现日常较不活跃，反应较慢，蜷卧拱背，毛发略有发汗且皮毛松软；而其他给药组小鼠上述症状均有所减轻，小鼠较为活跃，毛发光滑，无明显皮毛发汗现象。

实施例3

2型糖尿病模型小鼠的空腹血糖≥11.0mmol/L即为造模成功。相关研究表明，喂食高脂饲料会使小鼠肥胖、高胰岛素血症和胰岛素抵抗，而不是明显的高血糖或者糖尿病，注射STZ后会直接导致胰腺β细胞被破坏，导致胰岛素缺乏而不是胰岛素抵抗的后果，所以可通过高脂饮食诱导胰岛素抵抗后,再注射低剂量STZ损伤胰岛功能，引起血糖升高，可模拟2型糖尿病的发病过程。

将实施例2造模成功后的小鼠随机分为4个组，分别为模型组、阳性药组、活菌组和灭活菌组，其处理方式同实施例2。测量其空腹血糖作为治疗初试血糖值，即给药前血糖值。药物治疗4周后，测量其空腹血糖值作为治疗后血糖值，即给药4周后血糖值。测定方法为：小鼠分别于给药前和给药4周结束后，禁食不禁水12h，用三诺稳定血糖仪(购买于三诺生物传感股份有限公司)测其尾静脉血空腹血糖值。结果统计如图2所示。

由图2可以看出，给药前血糖值除N.control组外，其余四组均达到11.0mmol/L，以此可以判断2型糖尿病造模成功。治疗4周后，Model组小鼠的空腹血糖较治疗前有所上升，而其余各治疗组的小鼠空腹血糖均有明显下降。与Model组相比，差异均有极显著性 (p<0.01)。与Lp&Lb组相比较，相同剂量下ILp&Ilb组的空腹血糖较高，但差异无显著意义(p>0.05)。比较各治疗组治疗前后空腹血糖值的变化，可以发现：治疗组包括ILp&ILb组给药4周后空腹血糖值明显低于治疗前的空腹血糖值，差异均有极显著意义(p<0.01)，而Model组4周后的空腹血糖值高于给药前。

根据空腹血糖值的变化结果，可以看出，二甲双胍作为阳性药对 2型糖尿病的降糖效果最佳，灭活菌的降糖效果虽低于活菌，但其与给药前血糖值相比显著性降低，因此，灭活菌具有降低2型糖尿病小鼠血糖的作用。

实施例4

血糖通过胰岛素和胰高血糖素二者互作介导，葡萄糖耐受力的下降是因为机体代谢糖类物质的能力减弱，说明糖代谢紊乱，而这种紊乱会加剧2型糖尿病的症状，所以监测机体的糖耐受能力是判断和诊断机体是否患有2型糖尿病的一个重要手段。一般情况下，正常小鼠在一次性摄入大量葡萄糖后，血糖会短时间出现小幅度上升，大约在2小时后恢复到正常血糖水平，这种属于健康的糖耐受状态，而2 型糖尿病模型小鼠在一次性大量摄入葡萄糖后，血糖会出现急剧上升，并且2小时内无法恢复到正常水平，会保持在较高水平。

选取实施例2五组组别的小鼠，给药治疗4周后进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)。试验前禁食不禁水12h，以2g/kg的剂量灌胃葡萄糖。血糖采血点为空腹、糖负荷后30min、60min和120min，以三诺稳定血糖仪测定尾静脉血血糖值，各个时间点的血糖值记为 G0、G30、G60、G120，根据检测结果绘制葡萄糖耐量曲线图，并计算曲线下面积(AUC)。计算公式为： AUC(mmol/L)＝(1/2×G0+G30+G60+1/2×G120)/2。各组结果与其曲线下面积(AUC)如图3所示。各组小鼠在灌胃给予葡萄糖30min后，血糖水平均快速上升，但N.control组血糖值明显低于其他组，在2h 后所有组小鼠的血糖值均有所下降，但Model组的血糖值处于较高水平，N.control组血糖值已恢复在正常水平，治疗组血糖值恢复到正常组和模型组之间的水平，说明Model组的葡萄糖耐受能力明显降低，这也是符合2型糖尿病糖耐量降低的典型特征，而治疗组小鼠，包括灭活菌组的糖耐受力明显高于Model组，说明药物的治疗效果显著。三个治疗组，分别是P.control组、Lp&Lb组和ILp&ILb组的AUC值均比模型组显著降低，说明其对2型糖尿病小鼠的糖耐量具有显著改善作用。因此，灭活菌能够使小鼠葡萄糖耐受能力增加。

实施例5

糖化血红蛋白(GHb)是成人血红蛋白的一部分，由血红蛋白和葡萄糖经非酶促反应形成，其与血糖浓度、高血糖持续时间成正比，所以GHb能够提供有关近期平均血糖的重要信息，它可以用来作为长期监测血糖水平的一个重要指标，也是糖尿病诊断和监控的重要指标。

选取实施例2五组组别的小鼠，给药治疗4周后使用小鼠GHb ELISA检测试剂盒(购于上海酶远生物科技有限公司)检测小鼠血清糖化血红蛋白(GHb)，按试剂盒说明书操作。结果如图4所示，Model 组糖化血红蛋白的含量与N.control组相比有极显著差异性，P.control 组含量最低，ILp&ILb组和Lp&Lb组略高于P.control组，且与Model 组有极显著差异。说明ILp&ILb(灭活菌组)能够调控降低2型糖尿病的血糖并长期控制血糖。

实施例6

高脂饮食会引起胰岛素抵抗，无论动物或人短期或长期进食高脂膳食均可导致胰岛素抵抗，在胰岛素抵抗状态期间，由于胰岛素作用不良，最初会促使胰岛素分泌增加，以减少血糖水平的增加。胰岛素抵抗是指胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。2型糖尿病的主要病因就是胰岛素抵抗。胰岛素抵抗指数又称为稳态模型的胰岛素抵抗指数，英文缩写HOMA-IR，是由国外学者创建的数学模型。胰岛素抵抗指数等于空腹血糖乘以空腹胰岛素比22.5，值大于2.69时，判断有胰岛素抵抗，所以胰岛素抵抗的正常值小于2.69。

选取实施例2五组组别的小鼠，给药治疗4周后进行小鼠血清胰岛素(INS)水平及胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)检测，具体检测方法为：小鼠禁食12h后，测量空腹血糖，眼眶静脉丛取血，离心取血清，分装后于-20℃保存备用；胰岛素含量使用小鼠胰岛素(INS) ELISA检测试剂盒(购于上海酶远生物科技有限公司)，按试剂盒说明书操作。计算胰岛素抵抗指数：HOMA-IR＝空腹血糖(FPG)×空腹胰岛素(FINS)/22.5。结果如图5所示。

从图5-a中，可以看出Model组的血清胰岛素水平最高，高达 6.90mU/L，较N.control组有极显著差异，较P.control组有显著性差异，Lp&Lb组和ILp&ILb组血清胰岛素含量分别为5.49mU/L和5.38 mU/L，与Model组有极显著差异。综合小鼠血糖水平，Model组小鼠血清胰岛素水平较高但血糖水平并不正常，此结果说明Model组小鼠胰岛素敏感性较低，患有胰岛素抵抗，是典型的2型糖尿病模型；而治疗组小鼠的胰岛素抵抗有明显改善。图5-b中是胰岛素抵抗指数结果记录，Model组数值达到5.49，明显大于2.69，判断其有胰岛素抵抗；ILp&ILb组是三个治疗组中数值最高，其比值是1.82，小于 2.69，结果得出ILp&ILb组和其他治疗组均属于正常值。综合各项结果说明，ILp&ILb(灭活菌)可以提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，以此来提高2型糖尿病模型的机体对于胰岛素促进葡萄糖代谢的效率，防止机体代偿性的分泌过多胰岛素，从而控制血糖。

实施例7

胰岛素耐量检测是一种检测机体对胰岛素敏感度的试验，正常情况下，注射一定量胰岛素后15～30min，其血糖浓度比空腹时下降50％；在60～90min内应恢复到空腹血糖水平。而在患有2型糖尿病的机体中，因胰岛素抵抗，其生产胰岛素的能力并未减弱，但其调节血糖平衡时，对胰岛素敏感性降低，从而无法降低血糖。对于2型糖尿病模型小鼠来说，在注射胰岛素后，血糖值比空腹时无下降或下降很少，甚至下降迟缓。

选取实施例2五组组别的小鼠，小鼠给药治疗4周后处死，处死前3天进行胰岛素耐量试验(ITT)。试验前禁食2h，测定0min尾静脉血血糖值并立即腹腔注射0.75IU/kg(超短效)胰岛素，注射后 30min、60min、120min分别测定尾静脉血血糖值，各个时间点的血糖值记为G0、G30、G60、G120，根据检测结果绘制胰岛素耐量曲线图，并计算曲线下面积(AUC)。计算公式为: AUC(mmol/L)＝(1/2×G0+G30+G60+1/2×G120)/2。各组结果与其曲线下面积(AUC)如图6所示。

由图6可以看出，各组小鼠在注射胰岛素30min后，血糖值均有所下降，但Model组下降幅度最小，平均血糖值由16mmol/L下降到 14mmol/L，其余组下降幅度明显大于Model组；1h后，Model组血糖值仍在缓慢下降，三个治疗组的血糖值也呈下降趋势，而N.control组已在上升阶段；2h后N.control组血糖值已恢复到正常水平，三个治疗组的血糖值也有所上升，近似起始血糖值，而Model组血糖值并未回升。此结果说明，Model组小鼠表现出了明显的胰岛素抵抗现象，即注射完胰岛素之后，其血糖值并没有明显的下降趋势，而治疗组的胰岛素抵抗现象减弱，注射完胰岛素后会有血糖迅速下降的趋势，并且能够恢复到正常水平。就AUC值而言，Model组极显著高于其他组，其中ILp&ILb组低于Lp&Lb组但高于P.control组。综合来看， ILp&ILb组能够改善糖尿病的胰岛素不敏感性，从而来控制血糖。

实施例8

胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是一种肠肽类激素，由回肠内分泌细胞分泌的一种脑肠肽，通过缓解胃排空和葡萄糖依赖性抑制胰高血糖素分泌而发挥调控葡萄糖稳态的作用，大量研究表明GLP-1可抑制胃排空，减少肠道蠕动，故有助于控制摄食，减轻体重，降低T2DM 患者的空腹血糖，并对T2DM的并发症也有较好的改善作用。选取实施例2五组组别的小鼠，给药4周后使用小鼠胰高血糖素样肽1 (GLP-1)ELISA检测试剂盒(购于上海酶远生物科技有限公司)进行小鼠胰高血糖素样肽1(GLP-1)测定，根据试剂盒说明书操作。

血清GLP-1水平检测结果如图7所示，Model组小鼠血清中 GLP-1水平显著低于N.control组，这与已有文献结果一致，即T2DM 患者血清中GLP-1水平降低；P.control组、Lp&Lb组、ILp&ILb组血清中的GLP-1水平较Model组均有明显升高，说明其能够有效地促进肠道L细胞分泌GLP-1。

实施例9

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病并发症之一，为糖尿病微血管病变导致的肾小球硬化，又称糖尿病肾小球硬化症，其根本致病因是糖尿病机体葡萄糖代谢紊乱引发的高血糖导致的肾小球结构损伤。肾功能参数用来衡量肾功能的变化情况，血尿素氮是衡量肾脏功能的核心指标。

尿素氮(BUN)即为“血尿素氮”，血浆中除蛋白质以外的一种含氮化合物，它从肾小球滤过而排出体外。在肾功能不全失代偿时， BUN将升高。所以临床将其作为判断肾小球滤过功能的指标。尿素氮与肌酐同时测定更有意义，如二者同时升高，说明肾脏有严重损害。选取实施例2五组组别的小鼠，给药4周后使用小鼠尿素氮(BUN) ELISA检测试剂盒进行小鼠尿素氮(BUN)测定，根据试剂盒说明书操作。

BUN结果如图8所示，Model组小鼠与N.control组小鼠相比BUN 水平极显著性升高，其余三个给药治疗组与Model组相比BUN水平均不同程度降低且有极显著差异性；其中，ILp&ILb组BUN值最低为3.37mmol/L，而Model组BUN含量为4.61mmol/L。

根据以上结果可知，本发明将植物乳杆菌CICC 24202(Lp)和短乳杆菌YM 1301Lp(Lb)混合后灭活，在高脂饲料联合多次小剂量的链脲佐菌素(STZ)诱导下的2型糖尿病模型中评价阳性药组(盐酸二甲双胍)、活菌组(Lp&Lb)和灭活菌组(ILp&ILb)的降糖效果。试验结果表明，阳性药组在各方面均具有明显的治疗作用，而灭活菌组的改善程度能够达到活菌组水平。灭活菌可以降低2型糖尿病模型小鼠的摄食量与饮水量并且一定程度增加其体重，能够有效降低血糖，增加葡萄糖耐受能力，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，灭活菌明显降低2型糖尿病小鼠的脂肪蓄积，一定程度上改善肾功能，对肠道菌群及糖尿病并发症有正向调节作用，这为研发具有缓解2型糖尿病效果且安全性高、生产保存容易、质量稳定性高等优点的益生菌相关产品提供了可靠的理论实验基础。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种灭活乳酸菌复合物在制备治疗和/或预防糖尿病产品中的应用，其特征在于，所述乳酸菌复合物包括植物乳杆菌CICC 24202和短乳杆菌YM1301。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括食品和药品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病为2型糖尿病。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物乳杆菌CICC24202和短乳杆菌YM1301的体积比为1：0.1-10。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述乳酸菌复合物的菌悬液浓度为1×10⁸-1×10⁹个/mL。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌复合物减少脂肪蓄积。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌复合物增加葡萄糖耐受能力。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌复合物提高胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述灭活乳酸菌复合物改善糖尿病相关的肾功能障碍。

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