CN113383070A - 用于分化天然杀伤细胞的培养基和方法 - Google Patents
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Abstract
公开了用于将NK祖细胞分化成NK细胞的培养基和方法。NK分化培养基包含嘧啶并吲哚化合物诸如UM171或UM729。
Description
技术领域
本公开内容涉及细胞培养，且更具体地涉及免疫样细胞或免疫系统细胞的培养。具体地，本公开内容涉及免疫样细胞或免疫系统细胞的分化。
背景
由于它们能够分泌促炎性细胞因子和裂解病毒感染的细胞或肿瘤细胞，天然杀伤(NK)细胞是在针对感染和恶性肿瘤的免疫中具有重要作用的淋巴细胞。基于NK细胞的癌症免疫疗法是一个不断发展的领域。同种异体的单倍同一性NK细胞针对白血病细胞具有反应性，而不会引起移植物抗宿主病(GVHD)。“现成的”嵌合抗原受体(CAR)工程改造的NK细胞可能提供自体CAR T细胞的期望替代品。
由于NK细胞的肿瘤杀伤特性，人们有兴趣开发以足以满足临床需求的量生产功能性NK细胞的方法，诸如在免疫疗法应用中。外周血(PB)或脐带血(CB)NK细胞的扩增是生产这些应用所需的足够数量的NK细胞的常用方法，但由于依赖于饲养细胞，这些方法是困难的，并且可能导致NK细胞耗尽。来自造血干细胞和祖细胞(HSPC)的NK细胞的体外分化和扩增将提供潜在大得多的NK细胞来源。由于基质细胞共培养要求和低扩增，从HSPC体外生成NK细胞面临类似的障碍。此外，扩增的NK细胞应保留其细胞毒性特性。
因此，需要在无基质培养系统中从HSPC产生和扩增NK细胞、同时保持NK细胞的细胞毒性功能的稳健方法。
发明内容
本公开内容涉及用于分化NK祖细胞以获得分化的NK细胞的培养基和方法。
在本公开内容的一个方面，提供了NK细胞分化培养基。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基包含嘧啶并吲哚化合物。在一个实施方案中，所述嘧啶并吲哚化合物是UM171或UM729。在另一个实施方案中，所述嘧啶并吲哚化合物的浓度是在10nM和3μM之间。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基中UM171的浓度是约100nM。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基中UM729的浓度是约1μM。
在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基进一步包含基础培养基。所述基础培养基可以包括盐、缓冲剂、脂质、氨基酸、痕量元素、某些蛋白等。
在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充以下中的一种或全部：一种或多种细胞因子；一种或多种生长因子；或其它蛋白。所述一种或多种细胞因子可以是SCF、FLT3L、IL-15、IL-2、IL-7、IL-3、IL-12和IL-21。在一个实施方案中，所述一种或多种细胞因子可以是SCF或FLT3L和IL-15。在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充SCF、FLT3L、IL-15、IL-2、IL-7、IL-3、IL-12和IL-21中的每一种。
在一个实施方案中，没有给所述NK细胞分化培养基补充芳烃受体拮抗剂。在另一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基没有通过与基质细胞或基质细胞替代物接触进行调理。
在另一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基是无血清的。
在另一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基使NK细胞祖细胞分化。所述NK细胞祖细胞优选地分离自或源自原代样品或源自多能干细胞，诸如诱导的多能干细胞。
在本公开内容的另一个方面提供了用于分化NK细胞的方法。一种示例性的方法可以包括，提供培养的NK细胞祖细胞群体，和在足以产生NK细胞的体积、浓度和持续时间使所述培养的NK细胞祖细胞群体与如上所述的NK细胞分化培养基接触。
在一个实施方案中，使NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触约1周。在一个实施方案中，与嘧啶并吲哚化合物接触至少1周。在一个实施方案中，与嘧啶并吲哚化合物接触超过1周。在一个实施方案中，与嘧啶并吲哚化合物接触约2周。在一个实施方案中，与嘧啶并吲哚化合物接触超过2周。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体对于表型标志物而言是同质的或对于表型标志物而言是异质的。在一个实施方案中，所述表型标志物是CD7。在另一个实施方案中，所述表型标志物是CD5。
在另一个实施方案中，所述NK细胞在接触步骤期间频率增加。
在另一个实施方案中，所述NK细胞在接触步骤期间数目增加。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体在接触步骤期间频率或数目增加或降低。
在另一个实施方案中，所述提供和接触步骤不是在有基质细胞或基质细胞替代物存在下进行。
在另一个实施方案中，所述提供和接触步骤不是在有芳烃受体拮抗剂存在下进行。
在另一个实施方案中，所述NK细胞表达CD56。
在另一个实施方案中，所述NK细胞是细胞毒性的。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体源自原代样品。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体分离自原代样品。在一个实施方案中，所述原代样品是脐带血样品、骨髓样品或外周血样品。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体分化自多能干细胞。
从下述详细描述会明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
为了更好地理解本文描述的各个实施方案，并且为了更清楚地显示这些各个实施方案可以如何实施，将通过示例的方式参考附图，所述附图显示了至少一个实施例实施方案，并且现在描述。附图无意限制本文描述的教导的范围。
图1显示了嘧啶并吲哚化合物对CD56+ NK细胞从NK细胞祖细胞的分化的影响。(A)在有一系列UM171浓度存在下使培养的NK细胞祖细胞分化14天以后CD56+ NK细胞的频率。在100nM，NK细胞的频率与缺乏UM171的培养物相比显著增加(配对t检验:p＝0.013)。(B)在有一系列UM729浓度存在下使培养的NK细胞祖细胞分化14天以后CD56+ NK细胞的频率。在1μM，CD56+ NK细胞的频率与缺乏UM729的培养物相比显著增加(配对t检验:p＝0.017)。也显示了在有100nM UM171存在下培养物的结果。
图2显示了嘧啶并吲哚化合物对CD56+ NK细胞从NK细胞祖细胞的分化的影响。(A)在有一系列UM171浓度存在下使培养的NK细胞祖细胞分化14天以后每个输入细胞(即第0天细胞)的CD56+ NK细胞的产量。(B)在有一系列UM729浓度存在下使培养的NK细胞祖细胞分化14天以后每个输入细胞(即第0天细胞)的CD56+ NK细胞的产量。在1μM，CD56+ NK细胞的产量与缺乏UM729的培养物相比显著增加(配对t检验:p＝0.032)。也显示了在有100nM UM171存在下培养物的结果。
图3显示了嘧啶并吲哚化合物的存在或不存在对CD56+ NK细胞从NK细胞祖细胞的分化的影响。(A)将在图1(A)和图2(A)中100nM数据点的结果针对缺乏UM171化合物的标准(“STD”)培养物归一化。n＝15，在非归一化数据上的配对t检验：对于频率，p＝0.0001，和对于产量，p＝0.052(即图2(A)数据点相对于STD)。(B)将在图1(B)和图2(B)中1μM数据点的结果针对缺乏UM729化合物的STD培养物归一化。n＝20，在非归一化数据上的配对t检验：对于频率，p<0.0001，和对于产量，p＝0.006。
图4显示了在分化的CD56+ NK细胞的表面上的天然细胞毒性受体的表达。关于(A)NKp46、(B)NKp44和(C)NKp30的表达，通过流式细胞计量术来分析细胞。
图5显示了分化的CD56+ NK细胞对与更成熟的NK细胞有关的表型标志物的表达。关于(A)NKG2D、(B)CD16、(C)CD94、(D)KIR和(E)细胞内IFNγ的表达，通过流式细胞计量术来分析细胞。(E)中的直方图显示了用PMA/离子霉素刺激的门控CD56+ NK细胞(黑色空直方图)和未刺激的CD56+ NK细胞(实心灰色直方图)的重叠。
图6显示，分化的CD56+ NK细胞不表达T细胞标志物。(A)在有UM171存在下培养的第一供体的NK细胞祖细胞不表达CD3。(B)在有UM171存在下培养的第二供体的NK细胞祖细胞不表达CD3。(C)在有UM729存在下培养的第二供体的NK细胞祖细胞不表达CD3。
图7显示，分化的CD56+ NK细胞是细胞毒性的。以5:1的效应细胞与靶细胞之比，分别作为阳性和阴性对照，将外周血(PB)NK细胞和单核细胞也与钙黄绿素AM标记的K562细胞一起共培养。将结果表示为K562细胞的％特异性裂解：[(测试释放-自发释放)x 100]/(最大释放-自发释放)。显示了平均值±SD(CB CD34+-衍生的NK细胞:n＝18,PBNK细胞和单核细胞:n＝7)。
图8显示，嘧啶并吲哚化合物特异性地影响NK细胞祖细胞且不影响CD34+ HSPC。在第0天将脐带血衍生的CD34+ HSPC细胞铺板，并在不同时间将UM171加入NK分化培养物：第0-14天(±)；第14-28天(-/+)；或第0-28天(+/+)。还建立了没有UM171的培养物：第0-28天(-/-)。在(A)CD56+ NK细胞的频率和(B)每个输入细胞(即第0天细胞)的CD56+ NK细胞的产量的方面，评估UM171添加对NK细胞分化的影响。
图9显示，嘧啶并吲哚化合物抑制CD34+ HSPC向NK细胞祖细胞的分化。在有或没有UM171存在下培养以后，在NK细胞分化培养的第14天分析CD7+CD5+细胞。在(A)CD7+CD5+ NK细胞祖细胞的频率和(B)每个输入细胞的CD7+CD5+ NK祖细胞的产量的方面，评估UM171添加对CD34+细胞向NK细胞祖细胞的分化的影响。
图10显示了培养14天后从CD34+ HSPC分化的中间细胞群体的表型。(A)通过流式细胞计量术分析细胞的CD56表达。(B)关于NK细胞祖细胞标志物CD7和CD5的表达的存在或不存在，通过流式细胞计量术分析CD56-细胞。
图11显示，嘧啶并吲哚化合物促进CD7+CD5+和CD7+CD5-NK细胞祖细胞向NK细胞的分化。通过流式细胞计量术分选图10(B)中的每个细胞群体-CD7+CD5+、CD7+CD5-、CD7-CD5-，并在存在(正方形数据点)或不存在(圆形数据点)UM729的情况下在NK细胞分化培养基中培养。在(A)CD56+ NK细胞的频率和(B)每个输入祖细胞(即分选的第14天细胞)的CD56+ NK细胞的产量的方面，评估UM729添加对NK细胞的分化的影响。水平条是三个供体的平均值；每个供体用不同的阴影符号表示。
图12显示，使用芳烃受体(AhR)拮抗剂没有重现嘧啶并吲哚化合物对NK细胞的分化的影响。在存在或不存在5μM CH223191的情况下培养NK细胞祖细胞。在(A)CD56+ NK细胞的频率和(B)每个输入细胞(即第0天细胞)的CD56+ NK细胞的产量的方面，评估CH223191添加对NK细胞分化的影响。
图13显示，嘧啶并吲哚化合物优先影响NK细胞祖细胞的CD34-子集。将分选的第14天的NK细胞祖细胞群体在存在(灰色条)或不存在(白色条)UM729的情况下铺板并培养14天。在(A)CD56+ NK细胞的频率和(B)每个输入祖细胞的CD56+ NK细胞的产量的方面，评估UM729添加对NK细胞的分化的影响。每个点代表单个脐带血供体。
图14显示，源自四种PSC系1C、M001、H1和F016的NK细胞祖细胞群体对嘧啶并吲哚化合物有应答。将分化为NK细胞祖细胞群体的PSC-衍生的CD34+细胞在不存在(-)或存在(+)UM729的情况下铺板并培养14天。在(A)CD56+ PSC-衍生的NK细胞的频率和(B)每个输入CD34+细胞的CD56+ PSC-衍生的NK细胞的产量的方面，评估UM729添加对PSC-衍生的NK细胞的分化的影响。每个点代表单个生物重复。
图15显示，嘧啶并吲哚化合物对NK细胞祖细胞群体从PSC-衍生的CD34+细胞的分化具有负面效应。将源自四种PSC系1C、M001、H1和F016的CD34+细胞在不存在(-)或存在(+)UM729的情况下铺板并培养14天。在(A)CD5+CD7+ PSC-衍生的NK细胞祖细胞的频率和(B)每个输入细胞的CD5+CD7+ PSC-衍生的NK细胞祖细胞的产量的方面，评估UM729添加对PSC-衍生的CD34+细胞向PSC-衍生的NK细胞祖细胞群体的分化的影响。每个点代表单个生物重复。
具体实施方式
本公开内容涉及用于分化NK祖细胞的培养基和方法，并涉及用于获得分化的NK细胞的方法。
在本文中使用时，“造血干细胞和祖细胞”或“HSPC”是指能够自我更新和/或分化为造血谱系的更特化细胞的造血谱系细胞。HSPC可以获得自骨髓(BM)、脐带血(CB)、胚胎到成年外周血(PB)、胸腺、外周淋巴结、胃肠道、扁桃体、妊娠子宫、肝脏或具有HSPC的局部群体的任何其它组织。HSPC也可以从多能干细胞诸如诱导的多能干细胞、胚胎干细胞、原初干细胞、扩展的干细胞等分化。人HSPC的标志是跨膜磷酸糖蛋白CD34的表达，因而HSPC可以被称作CD34+细胞。人HSPC由CD45和CD34的共表达定义，并且可以进一步由标志物诸如CD38、CD43、CD45RO、CD45RA、CD10、CD49f、CD59、CD90、CD109、CD117、CD133、CD166、HLA-DR、CD201和整联蛋白-α3的组合定义，所述标志物可用于区分HSPC子集。HSPC可能缺乏标志物诸如血型糖蛋白A、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20和CD56的表达，或仅具有其低表达；这样的标志物可能是成熟血细胞的特征。
在本文中使用时，“天然杀伤细胞”或“NK细胞”是指可源自HSPC的造血谱系的淋巴细胞类型。更具体地，NK细胞可能源自多淋巴样祖细胞(MLP)或共同淋巴样祖细胞(CLP)。NK细胞的典型特征是：缺乏T和B细胞-特异性的标志物；CD56和CD16(低亲和力Fcγ受体3A，在NK细胞子集上表达)的表达；以及它们的效应子功能。更具体地，NK细胞的效应子功能可以包括细胞毒性和/或IFNγ的产生。NK细胞的特征还可以在于被称为杀伤性免疫球蛋白-样受体(KIR)的激活性和抑制性受体的表达。NK细胞可能表达的其它激活受体包括NKG2D和天然细胞毒性受体(NCR)，包括NKp30、NKp44和NKp46。HSPC向NK细胞的分化通常通过中间祖细胞(诸如NK细胞祖细胞)发生，但也可能将HSPC(或CD34+细胞)直接分化为NK细胞。
在本文中使用时，“天然杀伤细胞祖细胞”或“NK细胞祖细胞”是指比HSPC更特化但能够进一步分化为NK细胞的细胞类型。NK细胞祖细胞可以是HSPC的直接后代，或可以进一步从HSPC除去。此外，NK细胞祖细胞可以直接分化为NK细胞或可以在成为NK细胞之前经历一个或多个进一步的分化步骤。NK细胞祖细胞的一个实例是表型标志物CD7和CD5阳性的细胞。在另一个实例中，NK细胞祖细胞可能对CD7呈阳性但对CD5呈阴性。其它可由NK细胞祖细胞表达的表型标志物包括CD10、CD45RA、CD34、CD38、CD161、CD122、CD117和/或整联蛋白α4β7。CD34可能会或可能不会在NK祖细胞上表达。在本文中，除非明确说明，否则NK细胞祖细胞群体可以指能够分化为NK细胞的同质细胞群体或异质细胞群体。
在本文中使用时，“嘧啶并吲哚化合物”是指可用于从NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的一类化合物。在一个实施方案中，所述嘧啶并吲哚化合物可以是嘧啶并[4,5-b]吲哚。在一个具体实施方案中，所述嘧啶并吲哚化合物可以是UM171，如可以由式C25H27N9(X HBr[XH2O]表示的，或否则被称作(1r,4r)-N1-(2-苄基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)环己烷-1,4-二胺。在不同的具体实施方案中，所述嘧啶并吲哚化合物可以是UM729，如可以由式C20H25N5O2·X HCl[X H2O]表示的，或否则被称作4-((3-(哌啶-1-基)丙基)氨基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯。UM171和UM729公开在美国专利号9,409,906中，且UM729可商购得自STEMCELL Technologies。
培养基
本公开内容的培养基包括可用于将HSPC分化为NK细胞、或可用于将NK细胞祖细胞群体分化为NK细胞的任何培养基。这样的NK细胞分化可以指HSPC向NK细胞的分化，这可以包括在它们之间衍生出一个或多个NK细胞祖细胞群体。或者，NK细胞分化可以将NK细胞祖细胞群体直接地或间接地分化为NK细胞。
本公开内容的培养基可以含有血清或可以是无血清的。在一个实施方案中，本公开内容的培养基是无血清的。如果培养基不含血清，则可能必需在这样的培养基中包括血清替代补充剂，诸如BIT 9500血清替代物(STEMCELL Technologies,目录号09500)或其它商购可得的血清替代溶液。可替换地，培养或分化本公开内容的任何细胞所需的通常存在于血清中的组分可以以可接受的浓度单独添加到培养基中。
本公开内容的培养基将包括基础培养基，其被配制为适合培养本公开内容的细胞(例如HSPC、NK细胞祖细胞、NK细胞)。所述基础培养基可以是支持培养造血谱系细胞的任何基础培养基。作为非限制性实例，所述基础培养基可以是StemSpanTM SFEM(STEMCELLTechnologies,目录号09650),StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09655),StemSpanTM-ACF(STEMCELL Technologies,目录号09855),StemSpanTM H3000(STEMCELL Technologies,目录号09850)，或任何其它适合此目的的商购可得的基础培养基。用于配制这样的基础培养基的常见组分可以包括盐、缓冲剂、脂质、氨基酸、痕量元素、某些蛋白等。
本公开内容的NK细胞分化培养基还可以包括一种或多种嘧啶并吲哚化合物。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基仅包括一种嘧啶并吲哚化合物。嘧啶并吲哚化合物的实例包括UM171或UM729。NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度将取决于其性质。例如，一些嘧啶并吲哚化合物可以比其它更有效。例如，据报道UM171的效力大约是UM729的10倍。因此，为了观察对从NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的相同效果，可能必需包含比UM171高约10倍浓度的UM729。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在1nM和10μM之间。在一个更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在5nM和5μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在10nM和3μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在30nM和2μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在50nM和1μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在75nM和500nM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在90nM和150nM之间。
在其中所述嘧啶并吲哚化合物是UM171的实施方案中，它在NK细胞分化培养基中的浓度可以是在约10nM和1000nM之间，或在约20nM和500nM之间，或在约50nM和200nM之间。在一个具体实施方案中，UM171在NK细胞分化培养基中的浓度是约100nM。
在其中所述嘧啶并吲哚化合物是UM729的实施方案中，它在NK细胞分化培养基中的浓度可以是在约50nM和10μM之间，或在约100nM和5μM之间，或在约250nM和2.50μM之间。在一个具体实施方案中，UM729在NK细胞分化培养基中的浓度是约1μM。
为了培养本公开内容的细胞(例如HSPC、NK细胞祖细胞、NK细胞)，可能需要进一步补充本公开内容的NK细胞分化培养基。加入基础培养基中的补充剂可能随要培养的特定细胞类型而变化。一般而言，潜在补充剂的非穷举列表包括一种或多种细胞因子、一种或多种生长因子或其它蛋白。
具体地，可以在NK细胞分化培养基中包括SCF、FLT3L、IL-3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21。在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充了FLT3L、SCF、IL-3、IL-15、IL-2、IL7、IL-12和IL-21中的每一种。在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充了FLT3L、SCF、IL-3、IL-2、IL-15、IL-7、IL-12和IL-21中的一种或多种。在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充了FLT3L、SCF、IL-15和IL-7中的一种或多种。在一个实施方案中，给所述NK细胞分化培养基补充了FLT3L或SCF，和IL-15。在包括SCF、FLT3L、IL-3、IL-7、IL-2、IL-15、IL-12和IL-21中的一种或多种的NK细胞分化培养基的实施方案中，这样的细胞因子可以以在约1-1000ng/mL、或约1-100ng/mL、或约5-50ng/mL之间的浓度存在，且IL-2可以以约50-1500IU/mL存在。
在一些实施方案中，可以不包括SCF、FLT3L、IL-3、IL-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21中的任意一种或多种，但是，NK细胞分化培养基的效率可能受损。在一个实施方案中，为了使用NK细胞分化培养基从NK细胞祖细胞群体分化NK细胞，需要在NK细胞分化培养基中包含IL-15。
此外，本公开内容的NK细胞分化培养基可以与额外的补充剂协同作用。例如，一方面，基质细胞可以与本公开内容的细胞培养基一起使用。基质细胞的非穷举性实例包括胚胎肝细胞系EL08.1D2、AFT024细胞、OP9细胞或M2-10B4细胞。另一方面，无基质培养方案可以与本公开内容的细胞培养基一起使用。无基质培养系统可以利用预先由基质细胞调理的培养基，或者这样的系统可以利用基质细胞替代物。基质细胞替代物可包含一种或多种确定的组分，其向培养的细胞提供适当信号或附着位点。可以将这样的组分包括在施加于培养容器的内培养表面的涂层中或悬浮在细胞培养基中的固体表面上，诸如在颗粒、珠子、微载体等上。这样的组分的非穷举性实例可以包括纤连蛋白涂层(无论是全长还是其片段)、VCAM-1(一种固定化的Notch配体)、或涂层诸如StemSpanTM Lymphoid DifferentiationCoating Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09925)。或者，基质细胞替代物可以在细胞培养基中以可溶形式提供这样的组分，诸如通过补充或作为先前由基质细胞调理的培养基。
虽然HSPC向NK细胞祖细胞的分化可能需要包含基质细胞或基质细胞替代物，但基质细胞或基质细胞替代物对于NK细胞祖细胞向NK细胞的分化可能是不必要的。在一个优选的实施方案中，NK细胞分化培养基(即用于将NK细胞祖细胞分化为NK细胞的培养基)没有通过与基质细胞或基质细胞替代物接触进行调理。因此，这样的NK细胞分化培养基不必与基质细胞或基质细胞替代物接触或不与基质细胞或基质细胞替代物接触。
据报道，除嘧啶并吲哚化合物以外的化合物在各种类型的造血细胞培养物中发挥作用。例如，在NK细胞分化培养基中可以包含芳烃受体拮抗剂类中的化合物。芳烃受体拮抗剂的一些实例包括StemRegenin 1(SR1)(STEMCELL Technologies,目录号72342)或CH223191(STEMCELL Technologies,目录号72732)。在其中在NK细胞分化培养基中包含CH223191的实施方案中，所述化合物可以以范围在约100nM和10μM之间、或在约500nM和8μM之间、或在约1μM和6μM之间的浓度存在。在一个具体实施方案中，CH223191的浓度是约5μM。
在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基不包括芳烃受体拮抗剂。
因此，在本公开内容的一个方面，提供了NK细胞分化培养基。NK细胞分化培养基可以用于从HSPC或NK细胞祖细胞群体分化NK细胞。NK细胞分化培养基可以包含基础培养基(如上所述)和嘧啶并吲哚化合物(如上所述)。在一个实施方案中，所述基础培养基是StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09655)，且所述嘧啶并吲哚化合物是UM171或UM729。这样的NK细胞分化培养基是无血清的，同时进一步包含SCF、FLT3L、IL-15、IL-2、IL-3IL-7、IL-12和IL-21中的一种或多种。
在获得大量分化的NK细胞很重要的情况下，可能期望的是，在将HSPC分化为NK细胞祖细胞和NK细胞之前，首先培养和扩增HSPC。
可以通过本领域已知的任何已知方法扩增HSPC。在一个实施方案中，根据生产商的方案，使用补充了StemSpanTM CD34+扩增补充剂(STEMCELL Technologies,目录号02691)的StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09655)或StemSpanTM CC100(STEMCELL Technologies,目录号02690)或StemSpanTM CC110(STEMCELL Technologies,目录号02697)，可以将HSPC扩增至显著数目。使用StemSpanTM SFEM II(STEMCELLTechnologies,目录号09655)并补充了扩增补充剂或任何其它适当培养基的HSPC扩增，可以通过向培养基补充嘧啶并吲哚化合物诸如UM171或UM729来进一步增强。
在HSPC扩增方案中的嘧啶并吲哚化合物的浓度将取决于其性质。例如，一些嘧啶并吲哚化合物可以比其它更有效。例如，据报道UM171的效力大约是UM729的10倍。因此，为了使用不同的嘧啶并吲哚化合物观察到相同的效果，可能必需包含比UM171高10倍浓度的UM729。在一个实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在1nM和10μM之间。在一个更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在5nM和5μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在10nM和3μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在30nM和2μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在50nM和1μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在75nM和500nM之间。在一个仍更具体的实施方案中，在HSPC扩增方案中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在90nM和150nM之间。
用于扩增HSPC的培养基可以进一步包含芳烃受体拮抗剂。芳烃受体拮抗剂的一些实例包括StemRegenin 1(SR1)(STEMCELL Technologies,目录号72342)或CH223191(STEMCELL Technologies,目录号72732)。在其中在HSPC扩增培养基中包含CH223191的实施方案中，所述化合物可以以范围在约100nM和10μM之间、或在约500nM和8μM之间、或在约1μM和6μM之间的浓度存在。在一个具体实施方案中，CH223191的浓度是约5μM。
可以将HSPC(无论是否如上所述扩增)在第一培养基中培养以产生暂时的NK细胞祖细胞群体。第一培养基(即NK细胞祖细胞分化培养基)可以基本上如上文对于NK细胞分化培养基所述，并且嘧啶并吲哚化合物的加入是任选的。在这样的一个实施方案中，嘧啶并吲哚化合物可以是UM171或UM729。在一个实施方案中，NK细胞祖细胞培养基不含添加的嘧啶并吲哚化合物。
本公开内容的NK细胞祖细胞分化培养基可以与额外的补充剂协同作用。例如，一方面，基质细胞可以与这种细胞培养基一起使用。基质细胞的非穷举性实例包括胚胎肝细胞系EL08.1D2、AFT024细胞、OP9细胞或M2-10B4细胞。另一方面，无基质培养方案可以与这样的细胞培养基一起使用。无基质培养系统可以利用预先由基质细胞调理的培养基，或者这样的系统可以利用基质细胞替代物。基质细胞替代物可包含一种或多种确定的组分，其向培养的细胞提供适当信号或附着位点。可以将这样的组分包括在施加于培养容器的内培养表面的涂层中或悬浮在细胞培养基中的固体表面上，诸如在颗粒、珠子、微载体等上。这样的组分的非穷举性实例可以包括纤连蛋白涂层(无论是全长还是其片段)、VCAM-1(一种固定化的Notch配体)、或涂层诸如StemSpanTM Lymphoid Differentiation CoatingSupplement(STEMCELL Technologies,目录号09925)。或者，基质细胞替代物可以在细胞培养基中以可溶形式提供这样的组分，诸如通过补充或作为先前由基质细胞调理的培养基。
在一个实施方案中，使NK细胞祖细胞分化培养基与基质细胞接触(或已通过基质细胞的培养物调理)，或包含基质细胞替代物。例如，基质细胞替代物可以是纤连蛋白涂层(无论是全长还是其片段)、VCAM-1(一种固定化的Notch配体)、或涂层诸如StemSpanTMLymphoid Differentiation Coating Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09925)。
因此，在本公开内容的另一个方面，根据前述提供了一种NK细胞祖细胞分化培养基。这样的培养基可用于将HSPC分化为NK细胞祖细胞群体。如此衍生的NK细胞祖细胞可以在NK细胞祖细胞分化培养基中继续培养以获得分化的NK细胞，或者它们可以在上述NK细胞分化培养基中依次培养。
方法
本公开内容的方法包括从NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的那些步骤。本公开内容的方法还可以包括用于将HSPC分化为NK细胞的那些步骤，无论是否通过一种或多种NK细胞祖细胞中间群体。本文公开的用于分化NK细胞的方法优选为体外方法。
本公开内容的方法可以通过提供适当的起始细胞群体开始。如果从HSPC开始，HSPC可以是商业购买的，从血液或组织样品分离的，或衍生(即分化)自多能干细胞，诸如诱导的多能干细胞。无论HSPC的来源如何，可能必需进行一次或多次纯化实验以消除尽可能多的污染细胞。通过任何已知方案，可以清除包含HSPC的样品中的污染细胞。例如，可以对这样的样品进行密度梯度离心或进行阳性和/或阴性细胞选择。一个示例性方案可以包括使用RosetteSepTM试剂(例如RosetteSepTM Cord Blood CD34Pre-Enrichment CocktailSTEMCELL Technologies，目录号15896C)对单核细胞进行常规阴性选择，然后使用适当的EasySepTM试剂(例如EasySepTM人CD34阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies,目录号17896))对CD34+ HSPC进行阳性选择。
根据所需NK细胞的数量，可能期望的是，首先扩增HSPC，然后将其分化为NK细胞(无论是否通过一个或多个NK细胞祖细胞群体)。可以使用任何已知方案来扩增HSPC。扩增HSPC的一个示例性方案可以包括在有适当的基础培养基和StemSpanTM CD34+扩增补充剂(STEMCELL Technologies,目录号02691)或StemSpanTM CC100(STEMCELL Technologies,目录号02690)或StemSpanTM CC110(STEMCELL Technologies,目录号02697)存在下培养HSPC。使用前述方案，适当的基础培养基可以包括StemSpanTM SFEM(STEMCELL Technologies,目录号09650),StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09655),StemSpanTM-ACF(STEMCELL Technologies,目录号09855),StemSpanTM H3000(STEMCELL Technologies,目录号09850)无血清扩增培养基。
无论HSPC是否进行预先扩增，HSPC都可以分化为NK细胞祖细胞群体。NK细胞祖细胞群体可以是同质细胞群体或异质细胞群体。例如，同质的NK细胞祖细胞群体可以通过CD7+CD5+或CD7+CD5-表型表征。并且，异质的NK细胞祖细胞群体可以包括具有CD7+CD5+、CD7+CD5-、CD7-CD5-表型的那些细胞。在一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞(例如CD7+CD5+、CD7+CD5-和/或CD7-CD5-细胞)可以是CD34+或CD34-。
在一些实施方案中，从HSPC衍生NK细胞祖细胞可能不是必需的。在一个实施方案中，可能期望使用本公开内容的培养基将HSPC直接分化为NK细胞。在一个实施方案中，可能期望使用本公开内容的培养基将多能干细胞(包括、但不限于诱导的多能干细胞)直接分化为NK细胞。在一个实施方案中，可能期望使用本公开内容的培养基将对应于特定胚层的细胞转分化为NK细胞。在这些实施方案的一些中，可能必需用额外的因子或细胞因子和/或转录因子(无论是蛋白还是核酸的形式)或这样的转录因子的活化剂进一步补充培养基。
如果将HSPC分化为NK细胞祖细胞群体，这可以通过使HSPC群体与适当的培养基接触来进行。适当的培养基可以是能够将HSPC分化为NK细胞祖细胞群体的任何已知培养基。在一个实施方案中，通过使HSPC与如上所述的NK细胞祖细胞分化培养基接触，将HSPC分化为NK细胞祖细胞群体。在一个不同的实施方案中，NK细胞祖细胞分化培养基可以包含补充了Lymphoid Progenitor Expansion Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09915)的StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09655)。在一个实施方案中，使用StemSpanTM Lymphoid Differentiation Coating Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09925)或可用于将HSPC分化为NK细胞祖细胞群体的任何其它已知涂层，可以培养与NK细胞祖细胞分化培养基接触的HSPC。
在另一个方面，本公开内容的方法可以通过提供NK细胞祖细胞群体开始，诸如可以从HSPC或诱导的多能干细胞分化或衍生，例如，使用如上所述的NK细胞祖细胞分化培养基，或可以基于区别表型标志物(例如CD7和/或CD5±CD34)从原代样品(例如脐带血、外周血、骨髓、胸腺、子宫、肝、肠或次级淋巴组织)直接分离。在一个实施方案中，NK细胞祖细胞群体可以是衍生的(即分化的)，在这种情况下，这样的NK细胞祖细胞群体源自原代样品或多能干细胞，诸如诱导的多能干细胞或ES细胞。在一个实施方案中，NK细胞祖细胞群体可以从原代样品分离。细胞分离方案是本领域已知的，并且可以包括阳性或阴性细胞选择，或两者。作为非限制性实例，谱系阳性细胞可以被耗尽(诸如使用RosetteSepTM人造血祖细胞富集混合液,STEMCELL Technologies,目录号15066)，并且可以通过选择表达以下标志物中的一种或多种的细胞来分离NK细胞祖细胞：CD34、CD38、CD45RA、CD10、CD7和CD5。因而，在一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体表达CD7。在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体可以表达CD7和CD5两者。在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体可以仅表达CD7且不表达CD5。在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体可以表达或不表达CD34。
在另一个实施方案中，所述NK细胞祖细胞群体可以从多能干细胞(PSC)分化。PSC-衍生的NK细胞祖细胞的分化可能需要一种或多种中间细胞群体(诸如PSC-衍生的CD34+HSPC)的分化。
将NK细胞祖细胞群体分化为NK细胞，可以通过在足以产生NK细胞的浓度和持续时间将培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触来进行。可以将嘧啶并吲哚化合物包含在支持NK细胞祖细胞群体的任何培养基中。在一个实施方案中，根据本公开内容，将嘧啶并吲哚化合物包含在NK细胞分化培养基中。
如上所述，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度将取决于其性质。例如，一些嘧啶并吲哚化合物可以比其它更有效。例如，据报道UM171的效力大约是UM729的10倍。因此，为了观察对从NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的相同效果，可能必需包含比UM171高约10倍浓度的UM729。在一个实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在1nM和10μM之间。在一个更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在5nM和5μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在10nM和3μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在30nM和2μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在50nM和1μM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在75nM和500nM之间。在一个仍更具体的实施方案中，所述NK细胞分化培养基中嘧啶并吲哚化合物的浓度可以是在90nM和150nM之间。
也如上所述，在其中嘧啶并吲哚化合物是UM171的实施方案中，它在NK细胞分化培养基中的浓度可以是在约10nM和1000nM之间，或在约20nM和500nM之间，或在约50nM和200nM之间。在一个具体实施方案中，UM171在NK细胞分化培养基中的浓度是约100nM。
也如上所述，在其中嘧啶并吲哚化合物是UM729的实施方案中，它在NK细胞分化培养基中的浓度可以是在约50nM和10μM之间，或在约100nM和5μM之间，或在约250nM和2.50μM之间。在一个具体实施方案中，UM729在NK细胞分化培养基中的浓度是约1μM。
NK细胞分化培养基的其它潜在实施方案如上所述。
包含嘧啶并吲哚化合物的NK细胞分化培养基可以增加从NK细胞祖细胞群体分化的NK细胞的频率和/或产量。在NK细胞分化过程中，随着NK细胞的频率和产量增加，NK细胞祖细胞的频率和/或产量可以降低。因此，在NK细胞分化培养基中包含嘧啶并吲哚化合物对于提高从培养的NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的效率可能是重要的。嘧啶并吲哚化合物的作用可能对NK细胞祖细胞具有特异性，因为在用于从例如HSPC分化NK细胞祖细胞的培养基(诸如NK细胞祖细胞分化培养基)中包含嘧啶并吲哚化合物可能对由此衍生的NK细胞祖细胞的产量和频率具有总体抑制作用。但是，在用于从培养的NK细胞祖细胞群体分化NK细胞的培养基(诸如NK细胞分化培养基)中包含嘧啶并吲哚化合物可以挽救或补偿在用于从HSPC群体(无论是原代还是从多能干细胞(诸如诱导的多能干细胞或ES细胞)分化而来)分化NK细胞祖细胞的培养基(诸如NK细胞祖细胞分化培养基)中已经包含的嘧啶并吲哚化合物的抑制作用。
如果通过提供NK细胞祖细胞群体并将这样的培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触以产生NK细胞来分化NK细胞，则提供和接触步骤可以在基质细胞或基质细胞替代物存在或不存在的情况下进行。在一个实施方案中，在没有基质细胞或基质细胞替代物存在下使NK细胞祖细胞群体分化为NK细胞。
此外，如果通过提供NK细胞祖细胞群体并将这样的培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触以产生NK细胞来分化NK细胞，则提供和接触步骤可以在存在或不存在芳烃受体激动剂诸如StemRegenin 1(SR1)(STEMCELL Technologies,目录号72342)或CH223191(STEMCELL Technologies,目录号72732)的情况下进行。在一个实施方案中，在没有芳烃受体拮抗剂存在下使NK细胞祖细胞群体分化为NK细胞。
使培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触可以持续足以从NK细胞祖细胞群体产生NK细胞的任何时间量。认识到基础培养基(或基础培养基或补充的基础培养基的其它组分)中的嘧啶并吲哚化合物可能随着时间的推移而耗尽，因此可能必需定期更换培养基，诸如每天、每隔一天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每七天或以更低频率，或以不同的频率，诸如每1-2天、每2-3天或每3-4天，诸如此类。进行的培养基更换的次数可能与分化NK细胞的方法的持续时间直接相关。在一个实施方案中，从NK细胞祖细胞分化NK细胞的方法的持续时间(即，使NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触的持续时间)为约1周。在另一个实施方案中，用于从NK细胞祖细胞分化NK细胞的方法的持续时间为至少1周。在另一个实施方案中，用于从NK细胞祖细胞分化NK细胞的方法的持续时间超过1周。在另一个实施方案中，用于从NK细胞祖细胞分化NK细胞的方法的持续时间为约2周。在另一个实施方案中，用于从NK细胞祖细胞分化NK细胞的方法的持续时间超过2周。
通过将培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触，NK细胞的频率可能增加。NK细胞频率的增加意味着与较早的时间点相比，在一个时间点的NK细胞的比例相对于培养物中所有细胞的比例增加。例如，如果将CD56的表达用作分化的NK细胞的代表，则根据下式确定在任何给定时间的NK细胞的频率：CD56+细胞的数目/(CD56+细胞的数目+CD56-细胞的数目)。
此外，通过将培养的NK细胞祖细胞群体与嘧啶并吲哚化合物接触，NK细胞的数量(即产量)可能增加。NK细胞数量的增加意味着与较早的时间点相比，在一个时间点的NK细胞的数量增加。例如，如果CD56的表达被用作分化的NK细胞的代表，则通过计数CD56+细胞的数量来确定在任何给定时间的NK细胞数量。
根据本文中公开的方法分化的NK细胞可以表达表型标志物CD56。例如，约40％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。或者，约50％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。或者，约60％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。或者，约70％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。或者，超过70％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。或者，超过80％的本公开内容的分化的NK细胞可以是CD56+。在一个具体实施方案中，>70％的本公开内容的分化的NK细胞是CD56+。
根据本文中公开的方法分化的NK细胞也可以表达天然的细胞毒性标志物，诸如NKp30和/或NKp44和/或NKp46。因此，本公开内容的分化的NK细胞可以是细胞毒性的。在标准的细胞毒性测定中，本公开内容的分化的NK细胞可以表现出对靶细胞的细胞毒性。在一个具体实施方案中，所述靶细胞可以是K562细胞系，且本公开内容的分化的NK细胞可以达到与从成人供体的外周血分离的NK细胞相当的杀伤能力。例如，从成人供体的外周血分离的NK细胞可以达到约90％、或约80％、或约70％、或约60％、或约50％、或约40％、或约30％的特异性裂解百分比。在一个具体实施方案中，本公开内容的分化的NK细胞和从成人供体的外周血分离的NK细胞各自达到约70％的杀伤能力。在一些实施方案中，可能期望在进行杀伤测定之前首先激活分化的NK细胞。熟练的技术人员会理解如何激活NK细胞，这可以包括将NK细胞暴露于IL-2或IL-15足够的时间量。
根据本文中公开的方法分化的NK细胞还可以表达与成熟NK细胞相关的其它标志物，诸如NKG2D和/或CD16和/或CD94和/或KIR。
根据本文中公开的方法分化的NK细胞也可以在适当的刺激(诸如用PMA/离子霉素刺激)后产生IFNγ。在用布雷菲德菌素A处理后，可以检测细胞内IFNγ。在一个实施方案中，约30％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约40％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约50％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约60％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约70％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约80％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，约90％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。在另一个实施方案中，超过90％的本公开内容的分化的NK细胞已经被适当刺激以产生细胞内IFNγ。
重要的是，大部分根据本文中公开的方法分化的NK细胞不表达与T细胞谱系相关的某些标志物。在一个实施方案中，小于5％的本公开内容的分化的NK细胞表达CD3。在另一个实施方案中，小于4％的本公开内容的分化的NK细胞表达CD3。在另一个实施方案中，小于3％的本公开内容的分化的NK细胞表达CD3。在另一个实施方案中，小于2％的本公开内容的分化的NK细胞表达CD3。在另一个实施方案中，小于1％的本公开内容的分化的NK细胞表达CD3。在本公开内容的分化的NK细胞中CD3表达的缺失或基本上缺失表明它们不是T细胞或NKT细胞。
通过实施上述方法，可能获得大量体外分化的NK细胞。这样的体外分化的NK细胞可用于下游细胞疗法应用中。在使用这样的体外分化的NK细胞之前，可能期望使这样的NK细胞转基因，例如通过基因编辑技术。如果希望产生转基因的NK细胞，因此可能期望在使用本公开内容的培养基和方法将NK细胞祖细胞群体分化为NK细胞之前克隆扩增转基因的HSPC或转基因的NK细胞祖细胞。
下述非限制性实施例说明本公开内容。
实施例
实施例1：细胞的制备和培养
人CB样品获得自Bloodworks NW(西雅图，华盛顿州)，并使用EasySepTM人脐带血CD34阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies,目录号17896)分离CD34+细胞。以这种方式获得的CD34+细胞的纯度通常高于90％。
将24孔板的孔用StemSpanTM Lymphoid Differentiation Coating Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09925)包被，并每孔铺板5000个CD34+细胞。将CD34+细胞在补充有Lymphoid Progenitor Expansion Supplement(STEMCELL Technologies,目录号09915)的StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09605,09655)中培养长达14天，每3-4天更换一次培养基。
培养14天后，收获CD34+细胞-衍生的NK细胞祖细胞。在未包被的组织培养24孔板的每孔中铺板50,000个NK细胞祖细胞。将铺板的NK细胞祖细胞在补充有NK细胞分化补充剂(STEMCELL Technologies,目录号09950)的NK细胞分化培养基(即StemSpanTM SFEM II(STEMCELL Technologies,目录号09605,09655)中培养长达2周，并每3-4天更换一次培养基培养另外2周。在第14-28天，将UM729或UM171添加到补充的NK细胞分化培养基中。在第28天收获细胞用于分析或下游应用。
对收获的细胞进行染色，并通过流式细胞计量术测量NK细胞谱系标志物CD56的表达。通过光散射概况和7-AAD或DRAQ7染色，排除死细胞。图1和图2中在条件“0”(绘制在x轴上)的结果表明CD56+ NK细胞的频率和产量，所述CD56+ NK细胞来自按照上述方案但在没有UM171或UM729存在下的实验。使用NucleoCounter NC250获得细胞计数。通过将所得细胞数目除以最初接种的细胞数目来计算产量。通过将总产量乘以细胞频率来获得特定细胞类型的产量。
实施例2：嘧啶并吲哚化合物对NK细胞分化的影响
如实施例1中所述培养细胞，例外是，在有或没有UM171或UM729存在下在NK细胞分化培养基中培养NK细胞祖细胞至多两周(即培养第14-28天)。
在一系列浓度下测试UM171和UM729的影响：UM171的浓度为0nM、50nM、100nM、150nM和200nM；且UM729的浓度为0μM、0.25μM、0.5μM、1μM和2μM。这些实验的结果总结在图1和图2中。
CD56+ NK细胞的频率似乎在UM171浓度为100nM(图1A)和UM729浓度为1μM(图1B)时最高。CD56+ NK细胞的产量也似乎在UM171浓度为100nM(图2A)和UM729浓度为1μM(图2A)时最高。基于这些结果，选择100nm的UM171浓度和1μM的UM729浓度用于进一步实验。
因此，将UM171或UM729添加到NK细胞祖细胞的分化培养物中会在这些分子的递增浓度下增加CD56+ NK细胞的频率：直到100nM的UM171和1μM的UM729。总体而言，与不包括嘧啶并吲哚化合物的培养条件相比，在包括100nM UM171(图3A)或1μM UM729(图3B)的培养条件下，NK细胞的平均频率和产量平均增加约30％和2倍。
实施例3：在分化的NK细胞上的天然细胞毒性受体的表达
在有1μM UM729存在下如实施例1和2中所述分化CD56+ NK细胞，并在第28天通过流式细胞计量术分析已知NK细胞标志物的表达。将细胞在4℃用针对指定NK细胞标志物的荧光缀合抗体染色15分钟。使用FcR封闭剂和5％人或大鼠血清封闭非特异性结合。通过光散射概况和7-AAD或DRAQ7染色，排除死细胞。通过流式细胞计量术分析制备的样品。
结果显示：大约70％的分析的细胞共表达CD56和NKp46(图4A)；大约80％的分析的细胞共表达CD56和NKp44(图4B)；和大约80％的分析的细胞共表达CD56和NKp30(图4C)。
实施例4：在分化的NK细胞上与更成熟的NK细胞相关的标志物的表达
在有1μM UM729存在下如在实施例1和2中所述分化CD56+ NK细胞，并在第28天通过流式细胞计量术分析已知NK细胞标志物的表达。基本上如实施例3中所述，针对本实施例中所述的标志物对细胞进行染色。使用抗体180704和HP-MA4的两个克隆的组合对KIR分子进行染色，因为每个克隆识别KIR分子的不同子集。通过光散射概况和7-AAD或DRAQ7染色排除死细胞。
结果显示：大约50％的分析的细胞共表达CD56和NKG2D(图5A)；大约17％的分析的细胞共表达CD56和CD16(图5b)；大约18％的分析的细胞共表达CD56和CD94(图5c)；和大约10％的分析的细胞共表达CD56和KIR(图5d)。
还测量了分化的CD56+ NK细胞的IFNγ产生。对于IFNγ细胞内染色，将分化的CD56+ NK细胞用PMA/离子霉素刺激2小时。加入布雷菲德菌素A并将细胞再温育2小时。收获细胞并针对CD56进行染色，然后将Zombie NIR生存力染料固定，渗透化处理，并针对细胞内IFNγ染色。图5E中的结果显示，大约58％的分化的CD56+ NK细胞在刺激后表达细胞内IFNγ。
实施例5：在分化的细胞上缺乏T细胞标志物的表达
在有嘧啶并吲哚化合物存在下如在实施例1和2中所述分化CD56+ NK细胞，并在第28天通过流式细胞计量术分析T细胞标志物的表达。基本上如实施例3中所述对所分析的细胞进行CD3染色。通过光散射概况和7-AAD或DRAQ7染色排除死细胞。
在有100nM UM171存在下培养的、从第一供体的脐带血样品分化的细胞中几乎不存在CD3的表达(图6A)。类似地，在有100nM UM171(图6B)或1μM UM729(图6C)存在下培养的、从第二供体的脐带血样品分化的细胞中几乎不存在CD3的表达。
这些结果提示，分化的CD56+细胞不是T细胞或NKT细胞。
实施例6:分化的CD56+ NK细胞是细胞毒性的
在有1μM UM729存在下如在实施例1和2中所述分化CD56+ NK细胞，并在第28天分析它们对K562靶细胞的细胞毒性。
关于细胞毒性测定，将体外产生的CD56+ NK细胞与钙黄绿素AM标记的K562细胞一起以5:1的效应细胞(NK细胞)与靶细胞(K562细胞)之比共培养4小时，并关于荧光钙黄绿素从杀死的靶细胞的释放来分析上清液。
以与上述相同的比率，将使用EasySepTM(STEMCELL Technologies,分别目录号17955和19359)分离的外周血(PB)NK细胞和单核细胞(分别作为阳性和阴性对照)也与标记的K562细胞一起共培养。在实施例2的培养基中过夜培养PB NK细胞，不同的是它不包括嘧啶并吲哚化合物，而将PB单核细胞在仅StemSpanTMSFEM II中培养过夜。
为了检测钙黄绿素的自发释放，设置了仅包含钙黄绿素AM-标记的K562靶细胞的对照孔。将标记的K562细胞用1％TritonTMX-100处理以测量最大释放。温育后，将平板以500x g离心5分钟，并将100μL上清液转移至黑色平板，并使用
微量培养板读数器(激发485nm/发射530nm)进行分析。将结果表示为特异性裂解百分比:[(测试释放-自发释放)x100]/(最大释放-自发释放)。
图7显示，如本文所述分化的NK细胞能够杀死K562靶细胞，并且它们的杀伤能力类似于从成人供体的外周血分离的NK细胞的杀伤能力。
实施例7:嘧啶并吲哚化合物的作用对NK细胞祖细胞具有特异性
如实施例1中所述分离和培养CD34+ CB细胞。与在实施例1和2中一样，在第0-14天和第14-28天培养物中使用不同的培养基，但是给第0-14天培养基进一步补充100nM UM171以研究其对CD34+ HSPC向NK细胞的分化的影响。
在这些实验中，在不同时间点将UM171添加到培养物中：第0-14天(±)；第14-28天(-/+)；或第0-28天(+/+)。还建立了不含UM171的培养物(-/-)。在第28天分析细胞的CD56表达(图8)，或在第14天分析细胞的CD7和CD5表达(图9)。
与在这些天缺乏UM171的培养物(-/-)相比，在第14-28天之间暴露于UM171的培养物(-/+)经历了NK细胞频率和产量的增加，并且与在第0-14天缺乏UM171的培养物(-/-)相比，在第0-14天之间暴露于UM171的培养物(+/-)导致降低的CD56+细胞频率和产量(图8A和8B)。(+/+)条件指示，在第14-28天UM171的包含可以补偿该化合物对第0-14天培养物的影响。
图9A和9B显示了在进一步补充有UM171的第0-14天培养基中培养CD34+ HSPC的结果。在第14天，与在第0-14天期间未补充UM171的培养物相比，观察到CD7+CD5+ NK细胞祖细胞的频率和产量的明显降低(图9A和9B)。
总之，这些数据证实，UM171不会促进(并且可能实际上抑制)从CD34+ HSPC产生NK细胞祖细胞(图8和9)，但确实促进了NK细胞祖细胞向NK细胞的分化(图8)。
实施例8:表征NK细胞祖细胞的表型
如在实施例1中所述分离和培养CD34+ CB细胞直至第14天时间点。基本上如实施例3中所述，用针对标志物CD5、CD7和CD56的抗体对源自培养14天后的CB CD34+ HSPC的NK细胞祖细胞进行染色。对CD56-细胞进行门控，并使用BD FACSAria Fusion荧光激活细胞分选仪对CD7+CD5-、CD7+CD5+、CD5-CD7-细胞进行分选。
培养两周后，从CB CD34+细胞分化的大部分细胞是CD56-(图10A)，且这些细胞包含基本上由CD7+CD5-、CD7+CD5+和CD7-CD5-细胞组成的异质群体。
为了研究嘧啶并吲哚化合物靶向第14天NK细胞祖细胞群体中的哪个子集，将CD7+CD5-、CD7+CD5+和CD7-CD5-分选的群体分别在没有或有UM729的NK细胞分化培养基中培养另外14天。
结果显示，与缺乏UM729的培养条件相比，CD7+CD5+和CD7+CD5-细胞对UM729有应答，并以更高的频率(图11A)和产量(图11B)分化为NK细胞。在存在或不存在UM729的情况下，CD7-CD5-细胞不会扩增和分化为NK细胞。与在有UM729存在下的CD7+CD5-细胞相比，CD7+CD5+细胞产生了更高的NK细胞频率和产量，且因此该群体似乎是响应于UM729而分化为CD56+ NK细胞的主要NK细胞祖细胞群体(图11)。
实施例9:芳烃受体拮抗剂负面影响NK细胞的分化
据报道，除嘧啶并吲哚化合物以外的化合物，诸如芳烃受体(AhR)拮抗剂，扩增培养的HSPC。因此，还测试了AhR拮抗剂对NK细胞祖细胞的分化的影响。
如实施例1中所述分离和培养CD34+ CB细胞直至第14天时间点。基本上如实施例1中所述，将第14天NK细胞祖细胞在NK细胞分化培养基中进一步培养，不同的是不存在添加的嘧啶并吲哚化合物，但存在或不存在5μM CH223191。
数据显示，CH223191向NK细胞祖细胞的分化培养物中的添加导致降低的CD56+ NK细胞频率(图12A)和产量(图12B)。这表明，观察到的对NK细胞祖细胞向NK细胞的分化的影响是对嘧啶并吲哚化合物特异性的，而不是对AhR拮抗剂特异性的。
实施例10:CD34
+
细胞NK祖细胞对嘧啶并吲哚化合物没有应答
如实施例1中所述分离和培养CD34+ CB细胞直至第14天时间点。基本上如实施例3中所述，用针对标志物CD5、CD7、CD34和CD56的抗体对源自培养14天后的CB CD34+ HSPC的NK细胞祖细胞进行染色。对CD56-细胞进行门控，并使用BD FACSAria Fusion荧光激活的细胞分选仪对CD34+CD7+CD5-和CD34+CD7+CD5+和CD34-CD7+CD5-和CD34-CD7+CD5+进行分选。CD7-细胞被分选为阴性对照。
为了研究嘧啶并吲哚化合物靶向第14天NK细胞祖细胞群体的哪个子集，将CD34+CD7+CD5-和CD34+CD7+CD5+和CD34-CD7+CD5-和CD34-CD7+CD5+分选的群体各自在含或不含UM729的NK细胞分化培养基中培养另外14天。
结果显示，与缺乏UM729的培养条件相比，仅CD34-CD7+CD5-和CD34-CD7+CD5+细胞对UM729有应答并以更高的频率(图13A)和产量(图13B)分化为NK细胞。因此，更不成熟的CD34+ NK祖细胞子集似乎对UM729的作用没有应答。
实施例11：嘧啶并吲哚化合物对从PSC分化为NK细胞的影响
将三种诱导的多能干细胞(iPSC)系WLS-1C、STiPSC M001和StiPS F016以及一种胚胎干细胞(ESC)系H1维持在mTeSRTM1中。收获PSC并使用accutase将其解离成单细胞悬浮液，并使用37μm可逆过滤器(STEMCELL Technologies)过滤。
将PSC的单细胞悬浮液接种到AggreWell板(STEMCELL Technologies)中以形成500-细胞聚集体。将接种的细胞在中胚层分化培养基和10μM Y027632(STEMCELLTechnologies)中培养。培养3天后(即在第3天)，更换培养基以诱导造血谱系分化。培养7天后(即在第10天)，收获聚集体并使用胶原酶II和含胰蛋白酶的溶液解离。
使用EasySepTM人CD34阳性选择试剂盒II(STEMCELL Technologies,目录号17856)富集解离细胞中的CD34+细胞。为了将CD34+细胞分化为NK细胞祖细胞，在，将富集的CD34+细胞在补充有StemSpanTM Lymphoid Progenitor Expansion Supplement(STEMCELLTechnologies)的StemSpanTM SFEM II medium(STEMCELL Technologies)中以5x104个细胞/mL铺板至用StemSpanTM Lymphoid Differentiation Coating Material(STEMCELLTechnologies)包被的平板上，并培养14天。每3-4天进行半培养基更换。
培养14天后，在有或没有UM729存在下，将NK细胞祖细胞群体在NK细胞分化培养基中以1x105个细胞/mL重新铺板到未包被的平板上，并培养另外14天。
基本上如实施例3中所述对细胞进行CD56染色，并分析CD56+细胞的频率和每5x104个输入PSC-衍生的CD34+细胞的CD56+细胞产量。与在没有UM729存在下培养这样的细胞相比，在有UM729存在下培养PSC-衍生的NK细胞祖细胞群体后，CD56+细胞的频率(图14A)和产量(图14B)均增加。因此，在培养PSC-衍生的NK细胞祖细胞的第24-38天期间UM729的存在增加了CD56+细胞的频率和产量。
实施例12：嘧啶并吲哚化合物抑制PSC-衍生的CD34+细胞向NK细胞祖细胞的分化
如实施例11中所述产生PSC-衍生的CD34+细胞。除了评估1μM UM729的存在或不存在对NK细胞祖细胞群体的分化的影响之外，如在实施例11中所述培养PSC-衍生的CD34+细胞。
基本上如实施例3中所述对细胞进行CD5和CD7染色，并分析CD5+CD7+细胞的频率和每5x104个输入PSC-衍生的CD34+细胞的CD5+CD7+细胞的产量。与在没有UM729存在下培养这样的细胞相比，在有UM729存在下培养PSC-衍生的CD34+细胞后，CD5+CD7+细胞的频率(图15A)和产量(图15B)都降低。因此，在培养PSC-衍生的CD34+细胞的第10-24天期间UM729的存在会降低CD5+CD7+ NK祖细胞的频率和产量。
虽然已经参考目前被视作优选的实施例描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于所公开的实施例。相反，本发明意图涵盖在所附权利要求的精神和范围内包括的各种修改和等效布置。
所有出版物、专利和专利申请通过引用整体并入本文，达到如同明确地且单独地指出每篇单独的出版物、专利或专利申请通过引用整体并入的程度。
Claims (29)
1.一种NK细胞分化培养基，其包含嘧啶并吲哚化合物。
2.根据权利要求1所述的NK细胞分化培养基，其中所述嘧啶并吲哚化合物是UM171或UM729。
3.根据权利要求1或2所述的NK细胞分化培养基，所述NK细胞分化培养基进一步包含基础培养基。
4.根据权利要求3所述的NK细胞分化培养基，所述NK细胞分化培养基进一步包含SCF、FLT3L、IL-2、IL-3、IL-15或IL-7中的一种或多种。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞分化培养基没有通过与基质细胞或基质细胞替代物接触进行调理。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞分化培养基不包括芳烃受体拮抗剂。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞分化培养基是无血清的。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞分化培养基使NK细胞祖细胞分化。
9.根据权利要求8所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞祖细胞分离自或源自原代样品。
10.根据权利要求8或9所述的NK细胞分化培养基，其中所述NK细胞祖细胞源自多能干细胞。
11.根据权利要求10所述的NK细胞分化培养基，其中所述多能干细胞是诱导的多能干细胞。
12.一种用于分化NK细胞的方法，所述方法包括：
提供NK细胞祖细胞群体；和
在足以产生NK细胞的浓度和持续时间使培养的NK细胞祖细胞群体与权利要求1-11中的任一项的培养基接触。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述NK细胞祖细胞群体对于表型标志物而言是同质的或对于表型标志物而言是异质的。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述表型标志物是CD7。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述表型标志物是CD5。
16.根据权利要求12-15中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞在接触步骤期间频率增加。
17.根据权利要求12-16中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞在接触步骤期间数目增加。
18.根据权利要求12-17中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞祖细胞群体在接触步骤期间频率或数目增加或降低。
19.根据权利要求12-18中的任一项所述的方法，其中所述提供和接触步骤不是在有基质细胞或基质细胞替代物存在下进行。
20.根据权利要求12-19中的任一项所述的方法，其中所述提供和接触步骤不是在有芳烃受体拮抗剂存在下进行。
21.根据权利要求12-20中的任一项所述的方法，其中所述嘧啶并吲哚化合物的浓度是在10nM和3μM之间。
22.根据权利要求12-21中的任一项所述的方法，其中所述时间是至少1周。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述时间是约2周。
24.根据权利要求12-23中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞表达CD56。
25.根据权利要求12-24中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞是细胞毒性的。
26.根据权利要求12-25中的任一项所述的方法，其中所述NK细胞祖细胞群体源自原代样品。
27.根据权利要求12-25中的任一项所述的方法，其中所述细胞群体分离自原代样品。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述原代样品是脐带血样品、骨髓样品或外周血样品。
29.根据权利要求12-25中的任一项所述的方法，其中所述细胞群体分化自多能干细胞。
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