CN113368164B - 一种用于抗敏的中药组方发酵物和制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents

一种用于抗敏的中药组方发酵物和制备方法及其在化妆品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于抗敏的中药组方发酵物和制备方法及其在化妆品中的应用，经过多种原料的科学配比以及多次功效实验，最终确定该中药组方，包括，积雪草1～30份、艾叶1～30份、栀子1～30份；中药组方发酵物将酵母菌及中草药有效成分得到较好的融合，具有较高的安全性，较强的抗敏活性及较好的细胞修复及保护能力，可应用于具有抗敏功效的护肤品中。

Description

一种用于抗敏的中药组方发酵物和制备方法及其在化妆品中 的应用
技术领域
本发明属于植物应用以及化妆品领域，具体涉及到一种用于抗敏的中药组方发酵物和制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
敏感性皮肤是一种问题性皮肤，任何肤质中都可能有敏感性肌肤。就如同各种肤质都可能有老化肤质，痘痘肤质等。敏感肌肤的主要特点是皮肤干燥、容易紧绷和发红，受到轻微刺激即可产生瘙痒、脱屑甚至烧灼和刺痛等感觉，严重者可产生不良情绪或精神症状。与正常皮肤相比，敏感皮肤存在屏障功能损伤或神经功能异常的特点，更难于抵御外界刺激物与过敏原的侵袭，容易发生一系列刺激或过敏导致的皮肤炎症反应，然后进一步损害皮肤屏障结构与神经末梢，导致恶性循环。
当人们的皮肤屏障功能在一定程度上受到损伤，敏感皮肤出现的概率越来越大，因此，具有抗敏功效的化妆品日益受到人们的重视。
现有技术中，将多种植物提取液进行复配形成的舒敏复合液，在若干种提取液的复配过程中可能出现各项液体之间混合不充分的问题，且复配中间并没有使用相关的混合介质，导致其复合液不能将各组分的效果较好的结合，不能充分发挥各组分的效果。
因此，针对上述问题，研究开发一款具抗炎、修复、保湿功效的中药组方发酵物，来源安全，发酵工艺绿色，具有较高的安全性和重要意义。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于抗敏的中药组方发酵物。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于抗敏的中药组方发酵物，所述的中草药组方发酵液由包括以下重量分数的中药组分构成：积雪草1～30份、艾叶1～30份、栀子1～30份。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的一种优选方案，其中：所述的中草药组方发酵液由包括以下重量分数的中药组分构成：积雪草5～10份、艾叶5～10份、栀子5～10份。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的一种优选方案，其中：所述中草药组方发酵液，为将中药组合物进行发酵处理后，过滤、破壁、复配得到中药组方发酵物。
本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，包括，
将积雪草、艾叶和栀子原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60～80目，混匀，得到中药组合物，将中药组合物配伍0.2％～0.5％脱脂奶粉、1％～2％蜂蜜、1％-2％葡萄糖，调节pH至6.5～7.0，121℃灭菌20～30min后，制得发酵培养基；
配制106～108cfu/mL的酵母菌菌液；
将酵母菌菌液接种至发酵培养基中，进行发酵得到发酵液，其中，发酵pH值范围为3.0～7.0，发酵温度25～35℃，摇床速度100～250rpm，发酵时间3～4d，酵母菌菌液的接种量为10％～12％；
发酵结束后将所得发酵液纱布过滤，滤液超声破壁后，200nm陶瓷膜过滤，高压灭菌得到中草药组方发酵滤液；
将所制备的中草药组方发酵滤液，加入丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀后，采用过滤膜过滤得到澄清透明的浅黄色具有特征性气味的液体，灭菌得所述抗敏的中药组方发酵物。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述中药组合物，其中，以各原料重量份数计：积雪草1～30份、艾叶1～30份、栀子1～30份。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述配制106～108cfu/mL的酵母菌菌液，包括，
配制YPD培养基：以g/L计，取蛋白胨20、酵母粉10和葡萄糖20，加纯水1.0L比例混合，控制体系pH 6.5，121℃、20min灭菌制得YPD液体培养基；
将酵母菌接种在灭菌后的YPD培养基中，于220rpm、30℃条件下培养12h～24h，OD600约8～12的菌液配制得到菌液。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述中草药组方发酵滤液与丁二醇的质量比例为1:1。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述采用过滤膜过滤得到澄清透明的浅黄色具有特征性气味的液体，其中，为采用0.22μm的过滤膜过滤。
作为本发明所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述高压灭菌得到中草药组方发酵滤液，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；灭菌得所述抗敏的中药组方发酵物，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。
本发明的另一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法制得的发酵物在制备具有抗敏、抗炎、修复肌肤屏障的精华水、乳液、膏霜护肤品中的应用，所述应用，其中，发酵发酵物在护肤品中添加量为以质量分数计为0.1％～10％。
本发明有益效果：
(1)本发明所述的中药组方发酵物采用酿酒酵母发酵，并采用绿色发酵工艺，将酵母菌及中草药有效成分得到较好的融合，具有很好的温度、光照、pH稳定性，同时具有较高的安全性；酵母是一种真菌，含有氨基酸、核苷酸，维生素及一些微量元素等众多营养成分，对于皮肤能起到很好的抗氧化、修复的作用；所述积雪草、艾叶、栀子，其中，积雪草的活性物质为积雪草甙和多种a-香树脂醇型的三萜成分，具有清热解毒，利湿消肿、滋补、消炎、镇定的作用；艾叶活性物质为挥发油、黄酮、三萜类及微量化学元素等，具有抗菌、抗过敏、镇静等功效；栀子活性物质为栀子苷、三萜类，栀子苷是栀子中含量较高的环烯醚萜类成分，具有抗炎杀菌及抗氧化作用。
(2)本发明所述的中药组方发酵物以积雪草、艾叶、栀子为原料并进行适合重量配比，制备得到中药组方发酵液，最大限度的发挥各自的功效以及协同功效，远高于单一组分的功效；所述的舒敏天然提取物可在一定程度上维护细胞屏障功能，保护肌肤免受外界刺激，起到抗敏功效；透明质酸酶抑制实验是最典型的抗敏活性评价体外方法，以透明质酸酶抑制率为指标评价物质的抗过敏活性，透明质酸酶抑制率越大，则抗过敏活性越强；本发明以Elson-Morgan改良法进行体外透明质酸酶抑制实验，评价组方的抗敏功效，以甘草酸二钾为对照(10mg/mL)，舒敏天然提取物对透明质酸酶的抑制率比其高45％左右。
(3)本发明以DPPH自由基清除率来评价组方的抗敏功效，所述的舒敏天然发酵液稀释至10％时，对DPPH自由基的清除能力可达90％，说明其具有较好的自由基清除能力，能有效阻断过敏介质的释放，减少其对人体组织和细胞带来的伤害，从而维护皮肤正常屏障结构，达到抗敏功效；大量自由基对肥大细胞和嗜碱性的氧化破坏是过敏发生的根源；抑制自由基活性，可以有效缓解外界刺激后产生的过量自由基作用下细胞结构功能的退化，进而维护包括皮肤在内各种器官的正常屏障结构，在一定程度上阻止人体出现敏感症状；因此，测定物质对自由基的清除效果，可以反映其抑制敏感的效果；所述的舒敏天然发酵液可在一定程度上具有较强大的修复和保护细胞能力，通过保护细胞，减少细胞损伤，以及修复受损细胞，可以增强皮肤屏障，增强抵外界刺激的能力，可使肌肤长期处于一个正常的平衡状态，所述的舒敏天然发酵液可在一定程度上维护皮肤屏障和保湿。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明中药组方发酵物对透明质酸酶活性的抑制能力的示意图；
图2为本发明中药组方发酵物对炎症因子IL-2的抑制能力的示意图；
图3为本发明实施例中鸡胚绒毛尿囊膜血管试验结果图；
图4为本发明实施例1中混合药物给药-效果曲线图；
图5为本发明实施例1中混合药物协同效果曲线图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明一种用于抗敏的中药组方发酵物，其配方中各组分具体解释说明如下：
积雪草提取物具有清热解毒，利湿消肿、滋补、消炎、镇定的作用；积雪草提取物中含有的积雪草甙能刺激深层皮肤细胞更替，紧致表皮与真皮连接部分，能使皮肤变柔软，有助于解决皮肤松弛现象，使皮肤光滑有弹性；促进真皮层中胶原蛋白形成，使纤维蛋白再生，重新连接起来，使肌肤达到紧致光滑的效果。还可帮助伤口的组织愈合及紧实肌肤。既能促进表皮与真皮之间的密切连接，又能抑制脂肪细胞的增加，防止皮肤水肿、出现肥胖。积雪草提取物适用于各种肤质。积雪草中含有多种a-香树脂醇型的三萜成分，具有镇静、安定作用，添加到化妆品中可以帮助镇定肌肤，缓解敏感现象。
艾叶提取物具有抗菌、抗过敏、消炎、镇静等功效，挥发油及三萜类化合物具有较强的生物活性，具有抗菌、抗炎症等作用；黄酮类物质是较强的抗氧化剂，具有抗炎、抗过敏、强化细胞膜、使受损细胞再生等多重功效；镁、铝、钙、铁等微量元素，可以促进皮肤组织中的新陈代谢，保湿锁水以及为皮肤提供必要的营养物质，增加皮肤的活性和弹性。
栀子提取物的活性物质为栀子苷、三萜类，栀子苷是栀子中含量较高的环烯醚萜类成分，具有抗炎杀菌及抗氧化作用；花生四烯酸在环氧酶的作用下生成前列腺素,过多的前列腺素常常是引起炎症的主要原因；栀子甙在体外能抑制碱性磷酸酶的活性,从而抑制花生四烯酸的生成；因而,栀子甙对碱性磷酸酶的抑制，表现出较好的抗炎活性。
本发明通过在TCMSP数据库及实验筛选，结合《已使用化妆品原料名称目录(2015版)》，优选化妆品可用中药组合，从滋补、镇静、抗炎、杀菌、抗氧化、促进细胞再生等综合功效方面得到抗敏的目的。
本发明中酵母菌为酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，同申请号：2020116407206中的酿酒酵母；其他原料，均为普通市售。
实施例1
1.植物的筛选与组合
1.1数据库筛选
在TCMSP数据库中，用特异性皮炎(Atopic Dermatitis)为关键词筛选得到361种植物。进一步通过《已使用化妆品原料名称目录(2021版)》检索化妆品可用植物提取物，最终锁定为30种植物。此30种植物中草药植物均可从北京同仁堂购买，以10份的单独中药发酵后进行NO(一氧化氮)的抑制活性的筛选。
1.2NO抑制活性筛选
具文献报道NO自由基在皮肤炎症应中起到关键性的作用，可对iNOS上调，也跟IL-1beta，IL-6，TNF-alpha等炎症因子相关。
NO是污染空气、雾霾中常见的自由基，所以为了减少自然对皮肤的危害，首先，筛选了NO的抑制活性。
方法：分别加入0.5mM的亚硝基铁氰化钠二水化合物(SNP)溶液50μL，加入植物发酵物10μL后，在UV-A照射60min后，添加Griess试剂A(1％磺胺溶在2％磷酸水溶液)，Griess试剂B(0.1％N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐)50μL，在550nm处检测吸收值。
其中，植物发酵物的制备方法为：
(1)种子酵母菌的培养：酵母菌接种在121℃，20min灭菌的YPD培养基中(g/L)，为蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，pH 6.5，纯水1.0L比列的液体培养基中，于220rpm,30度条件下培养24h，当OD600达到10，备用。
(2)中药组方培养基的准备：将各中药原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60～80目，按照所要配比混匀，得到中药组合物，即每组份按照30份来配比。上述中药组分别配伍0.5％脱脂奶粉、2％蜂蜜、2％葡萄糖、调节适当pH7.0，121℃灭菌30min后作为发酵培养基。
(3)发酵：上述种子液酵母菌菌液按照10％的比列接种至200mL装有发酵培养基的500mL三角摇瓶中，在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养36h备用。
(4)后处理：发酵液，纱布过滤，超声破壁300W,10s/10s,20min，然后用200nm陶瓷膜过滤。
(5)复配：所制备的中草药组方发酵滤液，加入相同质量的丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀。
抑制率％＝[1-(As/Ac)]×100；
以样品替代水的吸光值为Ac、样品吸光值为As。
其中，发现艾叶、栀子、积雪草的抑制率达到50％以上为效果最佳，所以选取此4种植物，具体见表1。
表1
Figure GDA0003833193750000071
1.3协同功效的验证
为了进一步的证明复配后的效果，各样品如以下表格等体积复配后，跟上述1.2的方法。
用Calcusyn 2.0计算出EC50时的CI(combination index)值，CI＝1添加有效果，CI<1具有协同效果，CI>1具有拮抗效果。表中可以看出7号为最好。图4为混合药物给药-效果曲线图；图5为混合药物协同效果曲线图，可以看出其协同效果是根据浓度的提升而提升的。
表2
序号 AA GF CA GU CI指数
1 + + - - 0.942
2 + - + - 0.885
3 + - - + 1.264
4 - + + - 0.726
5 - + - + 1.012
6 - - + + 1.287
7 + + + - 0.543
8 + - + + 1.174
9 + + - + 1.087
10 - + + + 0.945
11 + + + + 0.869
注：AA为艾叶；GF为栀子；CA为积雪草；GU为甘草。
1.4协同比列的验证
为了进一步的考察其配比后的协同能力的最佳化在整体发酵量为30份的条件下进行了，如下表3的配比后发酵，并考察NO清除活性在不同配下的CI值的变化。结果表明，AA：GF：CA在1:1:1时，其CI指数0.543为最佳，当AA：GF：CA在1:1:2时，最差CI值为0.887。
表3
Figure GDA0003833193750000081
注：AA为艾叶；GF为栀子；CA为积雪草
实施例2
一种具有抗敏的中药组方发酵物(Ⅰ)的制备
一种具有抗敏的中药组方发酵物，由包括以下重量份数的中药材组分制成：积雪草10份、艾叶10份、栀子10份。
制备方法如下：
(1)种子酵母菌的培养：酵母菌接种在121℃，20min灭菌的YPD培养基中(g/L)，为蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，pH 6.5，纯水1.0L比列的液体培养基中，于220rpm,30度条件下培养24h，当OD600达到10，备用。
(2)中药组方培养基的准备：将各中药原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60～80目，按照所要配比混匀，得到中药组合物。上述中药组分别配伍0.5％脱脂奶粉、2％蜂蜜、2％葡萄糖、调节适当pH7.0，121℃灭菌20～30min后作为发酵培养基。
(3)发酵：上述种子液酵母菌菌液按照10％的比列接种至200mL装有发酵培养基的500mL三角摇瓶中，在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养36h备用。
(4)后处理：发酵液，纱布过滤，超声破壁300W,10s/10s,20min，然后用200nm陶瓷膜过滤。
(5)复配：所制备的中草药组方发酵滤液，加入相同质量的丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀。
实施例3
一种具有抗敏的中药组方发酵物(Ⅱ)的制备
一种具有抗敏的中药组方发酵物，由包括以下重量份数的中药材组分制成：积雪草7.5份、艾叶15份、栀子7.5份。
制备方法如下：
(1)种子酵母菌的培养：酵母菌接种在121℃，20min灭菌的YPD培养基中(g/L)，为蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，pH 6.5，纯水1.0L比列的液体培养基中，于220rpm,30度条件下培养24h，当OD600达到10备用。
(2)中药组方培养基的准备：将各中药原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60～80目，按照所要配比混匀，得到中药组合物。上述中药组分别配伍0.5％脱脂奶粉、2％蜂蜜、2％葡萄糖、调节适当pH7.0，121℃灭菌20～30min后作为发酵培养基。
(3)发酵：上述种子液酵母菌菌液按照10％的比列接种至200mL装有发酵培养基的500mL三角摇瓶中，在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养36h备用。
(4)后处理：发酵液，纱布过滤，超声破壁300W,10s/10s,20min，然后用200nm陶瓷膜过滤。
(5)复配：所制备的中草药组方发酵滤液，加入相同质量的丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀。
实施例4
一种具有抗敏的中药组方发酵物(Ⅲ)的制备
一种具有抗敏的中药组方发酵物，由包括以下重量份数的中药材组分制成：积雪草7.5份、艾叶7.5份、栀子15份。
制备方法如下：
(1)种子酵母菌的培养：酵母菌接种在121℃，20min灭菌的YPD培养基中(g/L)，为蛋白胨20，酵母粉10，葡萄糖20，pH 6.5，纯水1.0L比列的液体培养基中，于220rpm,30度条件下培养24h，当OD600达到约10左右备用。
(2)中药组方培养基的准备：将各中药原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60～80目，按照所要配比混匀，得到中药组合物。上述中药组分别配伍0.2％～0.5％脱脂奶粉、1％～2％蜂蜜、1～2％葡萄糖、调节适当pH7.0，121℃灭菌20～30min后作为发酵培养基。
(3)发酵：上述种子液酵母菌菌液按照10％的比列接种至200mL装有发酵培养基的500mL三角摇瓶中，在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养36h备用。
(4)后处理：发酵液，纱布过滤，超声破壁300W,10s/10s,20min，然后用200nm陶瓷膜过滤。
(5)复配：所制备的中草药组方发酵滤液，加入相同质量的丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀。
试验例1
中药组方发酵物对透明质酸酶活性抑制能力检测：
透明质酸酶抑制实验是最典型的抗敏活性评价体外方法，以透明质酸酶抑制率为指标评价物质的抗过敏活性，透明质酸酶抑制率越大，则抗过敏活性越强。
本发明以Elson-Morgan改良法进行体外透明质酸酶抑制实验，评价组方的抗敏功效，以1％甘草酸二钾为对照。具体步骤如下：
将实施例2、3、4制备的一种具有抗敏的中药组方发酵物分别配制成质量分数为1％的水溶液作为试验样品。对比例1～5分别为1％的甘草酸二钾；质量分数为1％的酵母菌发酵液；1％的积雪草发酵液(30份发酵)；1％的艾叶发酵液(30份发酵)；1％的栀子发酵液(30份发酵)的水溶液作为测试样品。
取0.1mL的CaCl2溶液和0.5mL透明质酸酶溶液于37℃保温20min；加入样品液0.5mL，继续在37℃保温20min；加入0.5mL透明质酸钠液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1mL 0.4mol/L的NaOH溶液和0.5mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0mL，放置显色20min，在535nm处测定其吸光度值。结果见附图1。
由图可知，与相似浓度的阳性对照物甘草酸二钾相比，植物抗敏组方对透明质酸酶的抑制率比其高47％左右，且该中药组方发酵物对透明质酸酶的抑制率比任一单独组分的抑制率均高。因此，结果表明，经过发酵后，中药组方发酵物的抑制透明质酸酶的效果较单独中药发酵物得到显著增强。
试验例2
中药组方发酵物对DPPH自由基清除能力检测：
自由基是含有一个不成对电子的原子团，过敏体质的形成，以及过敏的发作，都与机体内的自由基过多地堆积有关。体内活性氧自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的活性氧自由基就会有破坏行为，大量自由基对肥大细胞和嗜碱性的氧化破坏是过敏发生的根源。抑制自由基活性，可以有效缓解外界刺激后产生的过量自由基作用下细胞结构功能的退化，进而维护包括皮肤在内各种器官的正常屏障结构，在一定程度上阻止人体出现敏感症状。因此，测定物质对自由基的清除效果，可以反映其抑制敏感的效果。本发明以DPPH自由基清除率来评价组方的抗敏功效，具体步骤如下：
将实施例2、3、4制备的一种具有抗敏的中药组方发酵物分别配制成质量分数为10％的溶液。对比例1～4分别为：质量分数为10％的酵母菌滤液；10％的积雪草发酵液(30份发酵)；10％的艾叶发酵液(30份发酵)；10％的栀子发酵液(30份发酵)。
将组方复配液分别稀释至浓度分别为10％、5％、2.5％、1.25％后，准确吸取1mL样品溶液，加入5mL DPPH溶液，混匀后在室温下(25℃)避光静置30min，测定517nm处的吸光值，计算清除率，DPPH自由基清除率公式如下：
y＝(A0-A1-A2)/A0*100％
y—清除率，％
A0—1mL蒸馏水+5mLDPPH溶液的吸光度
A1—1mL样品+5mLDPPH溶液的吸光度
A2—1mL样品+5mL乙醇溶液的吸光度(消除不同样品之间的误差)。
该中药组方发酵物对DPPH清除能力见表4，由表可知，本发明制备一种具有抗敏的中药组方发酵物具有较好的自由基清除能力，能有效阻断过敏介质的释放，减少其对人体组织和细胞带来的伤害，从而维护皮肤正常屏障结构，达到抗敏功效。组合物间的协同作用显著，对DPPH的清楚能力得到明显提高。
表4样品DPPH清除能力
Figure GDA0003833193750000121
试验例3
中药组方发酵物对细胞修复及保护能力检测
通过MTT实验法来测定不同处理条件下人体成纤维细胞的增殖，检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。活细胞数量越多，细胞活性越强。具体步骤如下：将实施例2～4制备的组方复配液分别稀释10％的样品液，利用培养基将近对数期生长的成纤维细胞浓度调整至20000个/ml，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中培养12小时，进行加药处理，继续培养12小时。MTT原液用DMEM+10％FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，然后每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5％CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。轻轻吸出原培养基，加150μL DMSO溶解，室温轻轻震荡5min，以保证结晶完全溶解；迅速取出96孔板，在酶联免疫检测仪，选择波长490nm测定每孔的吸光值。
细胞修复实验：
阳性对照：无血清培养液+成纤维细胞，光照处理
阴性对照：无血清培养液+成纤维细胞，无光照处理
实验组：无血清培养液+成纤维细胞，光照处理后加入稀释后的组方复配液
实验结果：如表5所示，中药组方发酵物具有较好的细胞修复能力。
细胞保护试验：
阳性对照：无血清培养液+成纤维细胞，光照处理
阴性对照：无血清培养液+成纤维细胞，无光照处理
实验组：无血清培养液+成纤维细胞，加入稀释后的组方复配液后光照处理
实验结果：如表6所示，中药组方发酵物具有较好保护能力。
表5细胞修复实验
Figure GDA0003833193750000131
表6细胞保护实验
Figure GDA0003833193750000132
Figure GDA0003833193750000141
试验例4
JurkatT细胞的培养：细胞使用RPMI完全培养基培养。RPMI完全培养基是在RPMI培养基的基础上加入10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)。将JurkatT细胞冻存管从超低温冰箱中取出，37℃下水浴至融化，吸取1mL细胞冻存液和20mL培养基加入培养皿(100mm)中，放入37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。
炎症因子白介素-2(IL-2)的测定：细胞经消化后，取密度为106个细胞/mL的JurkatT细胞培养于含RPMI完全培养基200μL的96孔板中，培养12h，加入10μg/mL PHA刺激细胞及样品，续培养12h后，取上清液，用IL-2的ELISA试剂盒测定其含量(图2)。结果表明实施例2的样品在0.25％时具有明显的对IL-2炎症因子的抑制能力，并且随着浓度提高显现出浓度依赖性降低。
试验例5
中药组方发酵物的安全性评价
(1)人体皮肤斑贴试验
依据2015化妆品技术规范中规定的方法进行。
志愿者要求：30名(20-40岁)正常受试者，未患有炎症性皮肤病临床未愈者，皮肤待试部位无瘢痕、色素、萎缩、鲜红斑痣或其它瑕疵的判定者，未参加其它的临床试验研究者，体质无高度敏感者，近一个月未进行过斑贴试验者。
实验方法：将实施例2制备的中药组方发酵物(Ⅰ)采用去离子水依次稀释得到10％，5.0％，1.0％，0.5％，0.1％的中药组方发酵物，将上述各个溶液加在斑试器所附的滤纸片上置于斑试器内，用量约为0.020～0.025mL，对照孔为空白对照(去离子水)，将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于前臂曲侧，用手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，持续24h。去除受试物斑试器后30min，待压痕消失后观察皮肤反应。如结果为阴性，于斑贴试验后24h和48h分别再观察一次记录反应结果，结果如表7所示。
表7人体皮肤斑贴试验结果
Figure GDA0003833193750000142
Figure GDA0003833193750000151
注：－(0):阴性反应；±(1):可疑反应(微弱红斑)；+(2):弱阳性反应(红斑反应)；红斑、浸润、水肿
实验结果：人体斑贴实验受试者30例均为0级反应，根据2015化妆品卫生规范中规定，舒敏天然发酵物以上浓度的样品均未对人体皮肤引起不良反应，由此可知，该中药组方发酵物的安全性很高，不存在刺激性的风险。
(2)鸡胚绒毛尿囊膜血管试验
鸡胚绒毛尿囊膜血管试验是通过检测化学物质对绒毛尿囊膜的损伤来评价刺激性。
实验设计：1.阳性对照：0.1N氢氧化钠(NaOH)溶液
1％SDS(Dodecyl Sulfate Sodium Salt)溶液
2.阴性对照：0.9％灭菌生理盐水(NaCl)溶液
3.测试样品：将实施例2制备的中药组方发酵物(Ⅰ)配制成10％的水溶液
实验结果：如图3所示，HET-CAM assay中,0.9％灭菌生理盐水无明显变化；1％SDS溶液毛细血管逐渐消失；0.1N氢氧化钠(NaOH)溶液，1min部分较细血管边缘逐渐模糊，5min细血管开始消散，10min主血管逐渐模糊，部分血管完全消散；10％舒敏天然发酵物无明显变化。因此高浓度(10％)的舒敏天然发酵物表现出无明显的刺激。
试验例6
中药组方发酵物的应用
中药组方发酵物具有良好的安全性及稳定性，在抗敏、消炎、修复方面有着卓越的效果，可应用于具有抗敏、消炎的精华水、乳液、膏霜等护肤品中，如表8、表9、表10所示。
表8抗敏精华水
Figure GDA0003833193750000161
表9抗敏平衡乳液
Figure GDA0003833193750000162
Figure GDA0003833193750000171
表10抗敏平衡修护霜
Figure GDA0003833193750000173
试验例7
中药组方发酵物抗敏效果的检测：
水分是皮肤上介电常数最大的物质。
因此，当水分含量发生变化时,皮肤的电容值同时发生变化，这种变化可以通过表皮含水量检测仪测得,从而间接反映出皮肤的含水量。敏感性皮肤者面部基础表皮含水量较正常皮肤低。因此通过评测样品补水保湿、修复皮肤屏障的功能等指标的改善效果，可以综合评测样品补水、保湿，舒缓刺激、温和肌肤的效果。
样品A(实施例4制备的膏霜)为实验组、样品B(膏霜基础配方)作为对照组，受试者两侧胳膊用乳酸刺激肌肤15min后，一侧胳膊使用样品A，另一侧胳膊作为对照使用样品B，对比受试者使用产品前后及相对对照组，皮肤生理指标的变化。受试者前臂内侧做好测量区域标记，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少30min，前臂暴露，呈测试状态放置，保持轻松。实验中前臂内侧标记3×3cm2实验区域，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔1cm。测试产品和空白对照均随机分布在手前臂上，先测量各测试区域清洁后30min的空白值，加入试验样品量0.2g，使用乳胶指套将受试样均匀涂布于实验区内，涂抹后分别测量0.5h、1h、2h、4h受试区域和对照区域的皮肤水分含量。同一个志愿者的测量由同一个测量人员完成。
测试流程
皮肤表面水分流失(TEWL值)测试
使用TewameterTM300对皮肤表面水分流失进行测试。测试区域为脸颊，每个测试区测试3次取平均值，测试结果如表11所示。
表11皮肤表面水分流失(TEWL值)测试
Figure GDA0003833193750000181
Figure GDA0003833193750000191
注：表11中为空处用“/”代替，“-”代表P>0.05，“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01。由表11可以看出，受试者涂抹乳酸刺激皮肤后，皮肤屏障功能被破坏，经皮水分散失量明显上升，测试区域使用样品A和样品B后，均可降低皮肤水分流失，其中，使用样品B的皮肤失水率明显低于样品液A，说明中药组方发酵物可降低皮肤水分流失，进而增强皮肤的屏障功能。
皮肤水分含量(MMV值)测试
样品A(实施例4制备的膏霜)为实验组、样品B(膏霜基础配方)作为对照组，在皮肤表面水分流失测试完成后，使用Corneometer CM 825对皮肤水分含量进行测试。测试区域为手前臂，每个测试区测试5次取平均值，测试结果如表12所示。
表12皮肤水分含量(MMV值)测试
Figure GDA0003833193750000192
注：表12中为空处用“/”代替，“-”代表P>0.05，“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01。由表12可以看出，受试者涂抹乳酸刺激皮肤后水分含量MMV值下降，样品液A和样品液B测试区域使用样品后，皮肤水分含量MMV值均高于使用前，其中，使用样品A的皮肤水合率(即MMV值变化率)显著高于样品B，说明样品液A的补水保湿效果显著高于样品液B，对皮肤保湿补水具有很好的效果，从而提高皮肤的抗敏能力。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (7)

1.一种用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：包括，
将积雪草、艾叶和栀子原料除杂、清洗、烘干，粉碎至60~80目，混匀，得到中药组合物，将中药组合物配伍0.2~0.5%脱脂奶粉、1%~2%蜂蜜、1%~2%葡萄糖、调节pH至6.5~7.0，121℃灭菌20~30 min后，制得发酵培养基；
配制106~108cfu/mL的酵母菌菌液；
将酵母菌菌液接种至发酵培养基中，进行发酵得到发酵液，其中，发酵pH值范围为3.0～7.0，发酵温度25～35℃，摇床速度100～250rpm，发酵时间3~4d，酵母菌菌液的接种量为10%~12%；
发酵结束后将所得发酵液纱布过滤，滤液超声破壁后，200nm陶瓷膜过滤，高压灭菌得到中草药组方发酵滤液；
将所制备的中草药组方发酵滤液，加入丁二醇，室温下低速搅拌混合均匀后，采用过滤膜过滤得到澄清透明的浅黄色具有特征性气味的液体，灭菌得所述抗敏的中药组方发酵物；
其中，以各原料重量份数计：积雪草1~30份、艾叶1~30份、栀子1~30份。
2.如权利要求1所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：中草药组方由以下重量份数的中药组分构成：积雪草5~10份、艾叶5~10份、栀子5~10份。
3.如权利要求1所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：所述配制106~108cfu/mL的酵母菌菌液，包括，
配制YPD培养基：以g/L计，取蛋白胨20、酵母粉10和葡萄糖20，加纯水1.0 L比例混合，控制体系pH 6.5，121℃、20 min灭菌制得YPD液体培养基；
将酵母菌接种在灭菌后的YPD培养基中，于220rpm、30℃条件下培养12h~24h，OD600为8~12的菌液配制得到菌液。
4.如权利要求1所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：所述中草药组方发酵滤液与丁二醇的质量比例为1:1。
5.如权利要求1所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：所述采用过滤膜过滤得到澄清透明的浅黄色具有特征性气味的液体，其中，为采用0.22μm的过滤膜过滤。
6.如权利要求1所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法，其特征在于：所述高压灭菌得到中草药组方发酵滤液，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20 min；灭菌得所述抗敏的中药组方发酵物，其中，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20 min。
7.权利要求1~6中任一所述用于抗敏的中药组方发酵物的制备方法制得的发酵物在制备具有抗敏、抗炎、修复肌肤屏障的精华水、乳液、膏霜护肤品中的应用，其特征在于：发酵物在护肤品中添加量以质量分数计为0.1%~10%。
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