CN113355329A - 一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体及其在抑制逆转录酶活性中的应用，所述核酸适配体序列为以下四种序列中的至少一种：(1)如SEQ ID No.1所示的DNA序列；(2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上的同源性，且能够特异性结合逆转录酶的DNA序列。本发明提供的核酸适配体能与逆转录酶以极高的特异性相结合，低温下能与逆转录酶结合从而实现了逆转录酶温启动的目的，经过溶解曲线法验证，测得逆转录酶的启动温度可达37℃，对逆转录酶原本的功能并未产生影响，同时本发明提供的核酸适配体序列简单，合成难度低，且可以通过设置序列互补部分的碱基数量来使其匹配不同逆转录温度。

Description

一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体及其应用。
背景技术
在分子诊断领域，目前用于核酸扩增的主要手段仍然是PCR技术，在PCR过程中，用于识别核酸扩增信号的方法主要有两类，一类是利用与靶向核酸序列特异性结合的荧光探针(例如TaqMan探针)，在解离过程中释放出荧光信号来表示核酸扩增结果，另一类是通过与双链扩增产物非特异结合的荧光染料(例如SYBR)释放的荧光信号来表示，前者更适用于特定疾病的核酸检测。在核酸扩增之前，通常使用加热或其他变性方法将双链RNA或DNA靶标分离成单链，以便与引物探针结合，而在这之前RNA的处理要较DNA多一步逆转录过程，这也使得RNA扩增体系中要比DNA体系多一个逆转录酶。
而在扩增前体系中游离的单链引物低温下容易在taq酶和逆转录酶的作用下产生部分的碱基配对，即引物二聚体，引物二聚体也会进行PCR扩增，它的存在会消耗PCR体系中的原料，所以当靶核酸的原浓度较低时，会因为引物二聚体的竞争作用而使得扩增结果较差，表现在扩增曲线形态差、荧光增量低等方面，这会大大降低PCR扩增体系的灵敏度。在商品化PCR扩增产品中，大部分厂商会选择加入Taq酶抗体来封闭低温下Taq酶的活性，从而避免Taq酶在低温下刺激产生引物二聚。而在PCR扩增的变性阶段，Taq酶抗体会失活从而失去封闭Taq酶活性的功能，我们称之为Taq酶的热启动。但是由于逆转录酶工作的环境温度不高(50℃左右)，逆转录酶酶抗体是无法在这个温度下失活的，这样也导致了市面上很少有在低温下封闭逆转录酶活性的商品化原料，逆转录酶热启动也就成为了一个技术难题。
发明内容
基于上述技术问题，本发明提出了一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，应用所述核酸适配体，能实现PCR反应体系中逆转录酶的温启动，解决了逆转录酶热启动的技术难题。
本发明提供一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，采用如下技术手段：一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为以下两种序列中的至少一种：
(1)如SEQ ID No.1所示的DNA序列；
(2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上的同源性，且能够特异性结合逆转录酶的DNA序列。
优选地，所述核酸适配体与SEQ ID No.1所示DNA序列具有70％以上的同源性，且能特异性结合逆转录酶的DNA序列。
优选地，所述核酸适配体与SEQ ID No.1所示DNA序列具有90％以上的同源性，且能特异性结合逆转录酶的DNA序列。
优选地，所述核酸适配体末端互补碱基数量为22-36。
优选地，所述核酸适配体末端互补碱基数量为22-28。
优选地，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
优选地，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶。
一种上述任一项的核酸适配体在抑制逆转录酶活性中的应用。
一种逆转录反应试剂盒，其特征在于，包括如上述任一项的核酸适配体。
优选地，还包括PCR用水、逆转录反应缓冲液、dNTP和逆转录反应引物中的至少一种。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供核酸适配体，经过SELEX技术筛选得到，能与逆转录酶以极高的特异性相结合，低温下能与逆转录酶结合从而实现了逆转录酶温启动的目的，经过溶解曲线法验证，测得逆转录酶的启动温度可达37℃，对逆转录酶原本的功能并未产生影响；
(2)本发明提供的特异性结合逆转录酶的核酸适配体，为人工体外合成，所用生产技术成熟，合成序列简单，生产周期短，适用于大规模的商业生产；
(3)本发明提供的特异性结合逆转录酶的核酸适配体，可以通过调整适配体末端的互补碱基数量，使其适用于不同启动温度的逆转录酶。
附图说明
图1为本发明实施例3反应体系中添加核酸适配体以及未添加核酸适配体的PCR扩增曲线图；
图2为本发明实施例3反应体系中添加核酸适配体，且反应混合液37℃下孵育1h后PCR反应的熔解曲线分析图；
图3为本发明实施例3反应体系中未添加核酸适配体，且反应混合液37℃下孵育1h后PCR反应的熔解曲线分析图；
图4为本发明实施例6的PCR电泳检测图，其中第一泳道为标志物DL2000，第二泳道至第五泳道分别代表A组至D组的实验结果。
具体实施例
本文包括以下的实施例，用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解，可以在所公开的特定的实施方式中进行许多改变但是仍然获得相似或类似的结果，而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实施方式仅用于解释本发明，而非意图通过任何方式限制本发明。
实施例1特异性结合逆转录酶的核酸适配体的筛选
1.ssDNA随机文库及富集文库：
所用的DNA随机文库及引物序列均由生工生物工程(中国上海)股份有限公司合成并经高效液相色谱(HighperformanceLiquidChromatographyHPLC)纯化。
2.核酸适配体的筛选过程
200pm随机ssDNA文库在Hank’s溶液中95℃变性5min，冰浴10min，为了降低非特异性的结合，在Hank’s溶液中加入0.1mg/mlsalmonspermDNA和1mg/mlBSA作为bindingbuffer。然后，随机文库和偶联有2ug靶标多肽的磁珠在200ulbindingbuffer中37℃反应30min，Hank’s洗3次。最后用结合了ssDNA的磁珠为模板，用标记有FITC和生物素的引物扩增dsDNA。双链产物经磁珠分离后得到富集的单链文库，用于下一轮筛选。4轮筛选后，用没有修饰的引物扩增dsDNA，TA克隆，测序。
3.文库筛选进程的检测
FITC标记的单链文库和靶标多肽包被的磁珠在含有10％FBS的binding buffer中37℃反应30min，PBS洗两遍，流式细胞分析仪检测，未经筛选的初始随机文库作为阴性对照。
4.筛选文库的克隆测序
(1)将已经富集了的筛选文库用没有经过修饰的引物扩增dsDNA。
(2)取适当PCR产物和1ulpEASY-T1SimpleCloningVector轻轻混匀，室温反应5min。反应结束后将离心管置于冰上。
(3)加连接产物于50ulTrans1-T1感受态，轻弹混匀，冰浴20-30min.
(4)42℃热激30s，立即置于冰上2min。
(5)加250ul平衡至室温的LB培养基，200转，37℃孵育1h，取200ul菌液铺板，培养过夜。
(6)挑取白色克隆至1ml含有氨苄霉素和卡纳霉素阳性的液体LB培养基中，过夜培养。
(7)取新鲜菌液2ul扩增插入片段DNA，用分离的单链产物和靶标多肽包被的磁珠反应，流式检测其和靶标的结合能力，最后将结合能力高的克隆进行测序。
5.特异性结合的检测
为了检测筛选出的适配子和逆转录酶的特异性结合，用FITC标记的适配子在200ulbindingbuffer中分别和BSA或29-AA多肽包被的磁珠孵育，37℃反应30min，PBS洗两遍，用流式细胞分析磁珠表面的荧光强度，每个样品检测磁珠数不少于10000个。
6.Kd值的测定
靶标多肽包被的磁珠和FITC标记的不同浓度的适配子在200ulbinding buffer反应，37℃，30min，PBS洗两遍，流式细胞分析仪检测评价荧光强度，未筛选的随机文库作为阴性对照用于非特异性的集合，适配子和靶标结合的平均荧光强度减去随机文库非特异性结合的平均荧光强度，根据公式Y＝BmaxX/(Kd+X)计算适配子和靶标结合的Kd值。
通过上述筛选方法，最终获得一条逆转录酶核酸适配体：SEQ IDNO.1。
SEQ IDNO.1所示的序列为：
Blocker-AGGTAATAGTACCCTCCCCCTCCCCTCCCTACTATTACCT-Blocker
实施例2逆转录酶核酸适配体的使用方法
1.反应体系
本实施例中，本发明的逆转录酶核酸适配体用于以下的反应体系，所述反应体系包括彼此独立的试剂R1以及试剂R2。
(1)试剂R1按照下述配方进行配制：
组分 每人份(μL) 单位/浓度
10×Buffer for Taq 3.2 /
MgCl2 0.2 100mM
dATP 0.01 100mM
dCTP 0.01 100mM
dGTP 0.01 100mM
dUTP 0.02 100mM
H<sub>2</sub>O 3.54 /
(2)试剂R2按照下述配方进行配制：
酶液成分 每人份(微升) 单位/浓度
Taq 0.3 5U/μL
Anti-Taq 0.3 5U/μL
RNaseInhibitor 0.05 40U/μL
UNG,heat-labile 0.02 2U/μL
RT 0.005 40U/μL
核酸适配体 0.01 1OD/mL
H<sub>2</sub>O 1.315 /
反应体系＝7μL试剂R1+2μL试剂R2+1μL引物探针mix；
扩增体系＝10μL试剂R1+10μL模板+1μLSYBRGreen(20×)
2.反应程序
本实施例中，PCR反应程序如下所示：
Figure BDA0003105124120000061
实施例3逆转录酶核酸适配体的性能验证
共设置3组实验，其中每组实验使用的试剂盒与实施例2的区别仅在于试剂R2中的逆转录酶核酸适配体：
A组：选用如SEQ IDNO.1所示序列的核酸适配体配制PCR反应体系；
B组：未添加逆转录酶核酸适配体，同时添加0.01μL超纯水。
(1)逆转录酶核酸适配体在PCR温启动中的应用：
以超纯水为模板，按照实施例2所述的反应程序进行PCR反应。反应结果如图1所示，结果显示：在未添加模板的反应体系中，B组的CT值显著低于A组，说明其体系中有较多的引物二聚体产生，而A组CT值较大，说明其体系中存在的引物二聚体含量较少。实验结果说明，使用本发明所述的两种逆转录核酸适配体低温下可以有效封闭逆转录酶的活性，从而实现逆转录酶温启动的目的。
(2)逆转录酶启动温度验证
以超纯水为模板，将两组试剂盒的反应混合物分别置于37℃水浴锅中孵化1h，随后按照实施例2所述的反应程序进行PCR反应。
扩增后进行熔解曲线分析，结果显示：未加入逆转录酶核酸适配体的B组，其熔解曲线存在明显的非特异性引物二聚扩增峰(如图3所示)，而加入了逆转录酶核酸适配体的A组，其熔解曲线不存在非特异性引物二聚峰(如图2所示)。实验结果说明，本发明的逆转录酶核酸适配体在37℃(室温)下仍然可以很好的封闭逆转录酶的活性，而在达到了逆转录酶的启动温度(50℃)时，可以与逆转录酶解离，恢复逆转录酶活性，从而开始PCR扩增反应。
实施例4
为验证逆转录酶核酸适配体末端的互补碱基数量与逆转录酶的启动温度呈正相关，共设置3组试剂盒，其中每组试剂盒与实施例2的区别仅在于试剂R2中的逆转录酶核酸适配体：
A组：选用如SEQ IDNO.1所示序列的核酸适配体配制PCR反应体系；
B组：选用如SEQ IDNO.2所示序列的核酸适配体配制PCR反应体系；
C组：选用如SEQ IDNO.3所示序列的核酸适配体配制PCR反应体系；
D组：选用如SEQ IDNO.4所示序列的核酸适配体配制PCR反应体系。
选取临床样本作为模板，将3组试剂盒分别进行逆转录酶不同启动温度的PCR验证反应，所述反应程序与实施例2反应程序的区别仅在于第2步骤中的逆转录温度(共设置两组反应程序，第一组的逆转录温度为50℃，第二组的逆转录温度为58℃)，反应结果如下表所示：
表1
Figure BDA0003105124120000071
其中逆转录酶核酸适配体末端的互补碱基数量为：A组＜B组＜C组＜D组，结果显示，在相同的逆转录温度以及时间下，随着核酸适配体末端的互补碱基数量的增加，SYBRCt值呈逐渐降低的趋势，同时靶标Ct值呈上升趋势；而在使用相同逆转录酶核酸适配体的情况下，随着逆转录温度的提高(由50℃上升为58℃)，四组实验的靶标Ct值均有相应的降低。实验结果说明，当核酸是配体末端的互补碱基数更多时，核酸适配体更难以与逆转录酶分离，逆转录酶难以恢复活性，导致了逆转录阶段的模板量减少，进而导致扩增产物量减少。于此同时，适当的提高温度，可以促进核酸适配体与逆转录酶的分离，因此可以通过设置核酸适配体末端互补碱基的数量，使其适用于不同逆转录温度的反应。
实施例5逆转录酶核酸适配体在PCR反应中的应用
为验证逆转录酶核酸适配体在反应体系中最适宜的用量，共设置4组试剂盒，其中每组试剂盒与实施例2的区别仅在于试剂R2中核酸适配体的含量：
A组：核酸适配体的含量为1.0OD/ml×0.010μL；
B组：核酸适配体的含量为1.0OD/ml×0.015μL；
C组：核酸适配体的含量为1.0OD/ml×0.008μL；
D组：核酸适配体的含量为1.0OD/ml×0.004μL；
以超纯水为模板，按照实施例2所述的反应程序进行PCR反应
选取临床样本为模板，按照实施例2所述的反应程序进行PCR反应，将反应结束后的样品用琼脂糖电泳检测，结果如图4所示，其中第一泳道为标志物DL2000，第二泳道至第五泳道依次代表A组至D组实验结果。实验结果表明，当逆转录酶核酸适配体在试剂R2中达到1.0OD/ml×0.01μL的用量时，可以有效实现逆转录酶的低温封闭。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变形。
Figure BDA0003105124120000091
序列表
<110> 重庆中元汇吉生物技术有限公司
<120> 一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体及其应用
<130> 2021.3.29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 1
aggtaatagt accctccccc tcccctccct actattacct 40
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 2
tagatagagt agttccctcc ccctcccctc ccaactactc tatcta 46
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 3
gtaataagta ggtagtccct ccccctcccc tcccactacc tacttattac 50
<210> 4
<211> 54
<212> DNA
<213> MOUSE
<400> 4
agtgccttaa ctactgtacc ctccccctcc cctccctaca gtagttaagg cact 54

Claims (10)

1.一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列为以下两种序列中的至少一种：
(1)如SEQ ID No.1所示的DNA序列；
(2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有60％以上的同源性，且能够特异性结合逆转录酶的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体与SEQ ID No.1所示DNA序列具有70％以上的同源性，且能特异性结合逆转录酶的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体与SEQ ID No.1所示DNA序列具有90％以上的同源性，且能特异性结合逆转录酶的DNA序列。
4.根据权利要求1所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体末端互补碱基数量为22-36。
5.根据权利要求4所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体末端互补碱基数量为25-28。
6.根据权利要求1所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列被修饰，所述修饰包括磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化或同位素化。
7.根据权利要求1所述的一种特异性结合逆转录酶的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列上连接荧光标记物、放射性物质、治疗性物质、生物素、地高辛、纳米发光材料或酶。
8.一种如权利要求1-7任一项所述核酸适配体在抑制逆转录酶活性中的应用。
9.一种逆转录反应试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1-7任一项所述的核酸适配体。
10.根据权利要求9所述的一种逆转录反应试剂盒，其特征在于，还包括PCR用水、逆转录反应缓冲液、dNTP和逆转录反应引物中的至少一种。
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