CN113355281A

CN113355281A - 高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法

Info

Publication number: CN113355281A
Application number: CN202110681912.XA
Authority: CN
Inventors: 王新霞; 刘禹熙; 陈炜; 陈雨诗; 汪以真
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-06-19
Filing date: 2021-06-19
Publication date: 2021-09-07
Anticipated expiration: 2041-06-19
Also published as: CN113355281B

Abstract

本发明公开了一种高效分离小鼠肌内纤维‑成脂祖细胞的方法，步骤包括：（一）胶原蛋白涂层培养皿；（二）小鼠骨骼肌的分离和消化；（三）差异贴壁分离FAP。通过细胞流式分析及油红O染色确定分离的细胞纯度高，分化潜能高，增殖速度快，存活率高；采用胶原蛋白涂层培养皿利于细胞贴附，大大缩短分离时间，提高细胞得率；所使用的C57BL/6小鼠来源广泛，较易得到，大大减小了实验方法复现的难度。且相比于传统的流式分选法，不需要流式分选仪，更加经济实惠，方便快捷；为研究骨骼肌的发育和再生中纤维/成脂祖细胞功能提供良好的细胞基础。

Description

高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法

技术领域

涉及细胞分离及培养分化技术，具体涉及一种小鼠肌内纤维-成脂祖细胞（Fibro-Adipogenic Progenitors，FAP）高效分离的方法。

背景技术

骨骼肌是健康人类中最丰富的组织，占体重的40％。在生理过程中起着至关重要的作用，包括运动功能，产能和呼吸等。它由称为肌纤维的多核收缩细胞组成，在分化过程中通过分化的单核肌肉细胞融合形成，并且其数量在出生后的生长过程中保持恒定。

骨骼肌由大量不同种类的细胞组成，它们相互作用以维持肌肉的动态平衡和协调再生。骨骼肌的再生潜力主要取决于卫星细胞（SCs），除此之外SC与肌肉生态位内其他细胞类型（包括运动神经元、内皮细胞、免疫细胞、成纤维细胞和成脂前体细胞）之间功能性串扰的建立对于肌肉修复和体内平衡同样至关重要。

纤维-成脂祖细胞是驻留在骨骼肌中的多能祖细胞。在骨骼肌的发育和再生过程中，FAP为肌纤维成熟和规范所需的成肌祖细胞提供营养支持。FAPs还是退行性疾病状态中纤维化的主要细胞来源，研究显示它还在衰老过程中的骨骼肌脂肪浸润和肌肉功能损伤中的纤维化等病理过程发挥重要作用。FAP是再生中必不可少的细胞，并且在维持再生环境中起着至关重要的作用。因此，有效和可重复的分离和培养高纯度FAP种群的方法对于进一步了解这些细胞的发育生物学，药物筛选和疾病建模至关重要。但是在现有的技术中，主要是通过流式细胞分选的方法得到FAP，该方法成本高昂，且分选过程影响细胞存活率和细胞干性，不利于后续研究。

发明内容

针对上述细胞分离技术存在的不足之处，本发明的目的是提供一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法。

一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的方法，步骤如下：

（一）胶原蛋白涂层培养皿

将2mL胶原蛋白添加到10cm细胞培养皿中，覆盖细胞培养皿表面，之后将细胞培养皿在通风橱中放置过夜干燥；

（二）小鼠骨骼肌的分离和消化

（2.1）选取平均月龄为2-3月大的C57BL/6小鼠，断颈法人道处死小鼠并在75%酒精浸泡消毒5min；

（2.2）在无菌操作台取出小鼠后肢肌肉，放在细胞培养皿上，倒入3mL 4°C预冷含100 U mL ^-1青霉素/链霉素的PBS溶液；

（2.3）将肌肉中其他组织剔除；

（2.4）用手术剪刀将修整后的肌肉切成粗浆，将切碎的组织浆液转移到15mL锥形管中；

（2.5）加10mL的0.2％胶原酶II型溶液进行消化；在37°C下孵育1小时，530g离心5分钟；

（2.6）吸出上清液，重悬于10mL 37°C预热的分散酶中；在37°C下孵育45分钟，以530g离心 5分钟，然后用GM终止消化；

（2.7）吸出上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL GM中，并用70μm细胞过滤器吸移重悬物；

（2.8）依次通过18G，23G和27G针抽吸，每个规格抽吸两次，使细胞悬浮液进一步解离；

（三）差异贴壁分离FAP

（3.1）将细胞悬液接种于10cm培养皿并在37°C，5％CO₂培养箱中孵育4小时，标记为P1；

（3.2）将含有非贴壁细胞的培养基转移到第二个有胶原涂层的培养皿中，标记为P2，并在P1培养皿中补充5mL GM，将培养皿放回培养箱；

（3.3）18小时后，吸出P2中的培养基，并补充5mL GM，将P1和P2培养皿放在培养箱中培养2-3天，即得到纤维/成脂祖细胞。

步骤（2.5）中0.2％胶原酶II型消化溶液酶为500U/mL。

所述的GM为补充有20％（vol / vol）FBS，0.5％（vol / vol）CEE和100 U mL ^-1青霉素/链霉素的DMEM，并通过0.22μm无菌滤头过滤。

步骤（2.5）中胶原酶消化的环境为37°C，5％CO₂培养箱。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供一种更加简便高效的纤维/成脂祖细胞的分离方法。通过细胞流式分析及油红O染色确定分离的细胞纯度高，分化潜能高，增殖速度快，存活率高。且本发明采用胶原蛋白涂层培养皿利于细胞贴附，大大缩短分离时间，提高细胞得率。

所使用的C57BL/6小鼠来源广泛，较易得到，大大减小了实验方法复现的难度。且相比于传统的流式分选法，不需要流式分选仪，更加经济实惠，方便快捷。为研究骨骼肌的发育和再生中纤维/成脂祖细胞功能提供良好的细胞基础。

附图说明

图1是本发明小鼠肌内纤维-成脂祖细胞的分离流程示意图。

图2是本发明制备的肌内纤维-成脂祖细胞体外培养状态图。

图3是本发明制备的肌内纤维-成脂祖细胞体外诱导成脂油红O染色效果图。

图4是本发明制备的肌内纤维-成脂祖细胞流式分析纯度比例图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步阐述，但不用于限定本发明的保护范围。

实验仪器与试剂：超净台；移液枪（Sigma）；孔径70μm细胞过滤器（（BD Falcon），18、23和27号针（BD PrecisionGlide，10或毫升无菌注射器（BD），聚苯乙烯板： 100 mm（BDFalcon），台式离心机（Sorvall Legend RT，Kendro）;无菌手术工具：不同尺寸的镊子，剪刀; CO 2培养箱（Kendro）;PBS（Invitrogen）; 15毫升离心管（BD Falcon）汉克缓冲盐溶液（HBSS）（Invitrogen）;100 U mL ^-1青霉素/链霉素（Invitrogen）;0.2％II型胶原酶（Sigma-Aldrich）;分散酶：2.4 U mL ^-1分散酶（Invitrogen）DMEM（高葡萄糖；Invitrogen）I型胶原蛋白（0.1 g/L;Sigma-Aldrich）；FBS（Invitrogen）。

实施例1

（一）胶原蛋白涂层培养皿

将2mL胶原蛋白添加到10cm细胞培养皿中。轻轻摇动溶液直至覆盖表面，以确保溶液均匀分布，之后将培养皿在通风橱中放置过夜干燥。

（二）小鼠骨骼肌的分离和消化

（2.1）在37°C下预热胶原酶II，分散酶。选取平均月龄为2-3月大的C57BL/6小鼠，断颈法人道处死小鼠并在75%酒精浸泡消毒5min。

（2.2）如图1所示，在无菌操作台将高温高压灭菌的手术器械拿出，75％乙醇喷洒小鼠皮肤，切近腹膜末端，并去除覆盖下后肢肌肉的皮肤。从身体上剪掉腿。将其放入装有4°C预冷含100 U mL ^-1青霉素/链霉素的PBS溶液的10cm培养皿中。

（2.3）取出小鼠后肢肌肉，包括腓肠肌、比目鱼肌和股四头肌，用镊子和剪刀将肌肉中其他组织剔除，包括骨骼，肌腱，神经，主要血管，脂肪和结缔组织。

（2.4）如图1所示，将肌肉转移到干净的10cm培养皿中，将2 mL无菌PBS加入培养皿中，并用手术剪刀将修整后的肌肉切成粗浆。使用10 mL移液管将切碎的组织浆液转移到15mL锥形管中，并在4°C下于530 g离心5分钟。除去上清液，用HBSS洗涤并再次离心。除去上清液。

（2.5）如图1所示，在15 mL锥形管中添加10 mL预热的0.2％胶原酶II型消化溶液开始酶消化。在5％CO₂培养箱中于37°C孵育1 h。每隔10分钟用手摇一摇，以530g离心5分钟。

（2.6）吸出上清液，然后将沉淀/浆液重悬于10 mL预热的分散酶（2.4 U / mL）中。在37°C下孵育45分钟。每隔10分钟摇动或轻轻摇动，以530g离心 5分钟。

（2.7）吸出上清液，将细胞沉淀重悬于10 mL GM中，并用70μm细胞过滤器吸移重悬物。

（2.8）依次通过18G，23G和27G针抽吸，每个规格抽吸两次，使细胞悬浮液进一步解离成单细胞。

（三）差异贴壁分离FAP

（3.1）如图1所示，将上述步骤（2.8）得到的细胞悬液接种于上述胶原蛋白包被的10cm培养皿并在37°C，5％CO₂培养箱中孵育4小时。标记为P1。

（3.2）如图1所示，将含有非贴壁细胞的培养基转移到第二个有胶原蛋白包被的的培养皿中，标记为P2，并在P1培养皿中补充5mL GM，将培养皿放回培养箱。

（3.3）18小时后，吸出P2中的培养基，并补充5mL GM，将P1和P2培养皿放在培养箱中培养2-3天，即能得到纤维/成脂祖细胞。所得细胞状态如图2所示，FAPS细胞比例如图4流式分析所示。

（四）纤维/成脂祖细胞的体外诱导分化

（4.1）细胞铺板：当细胞数量足够后，用0.25%胰酶将细胞消化下来后，细胞计数，铺板，继续培养。

（4.2）以生长到细胞接触抑制为第-2天，继续培养2天。

（4.3）第0天，更换诱导培养基MDI；3天后，更换维持培养基继续培养，直至形成成熟的脂肪细胞，成脂效果如图3流式分析所示。

上述的GM为补充有20％（vol / vol）FBS，0.5％（vol / vol）CEE和100 U mL ^-1青霉素/链霉素的DMEM通过0.22μm无菌过滤。

上述的成脂诱导培养液（MDI）：高糖DMEM基础培养基+20% FBS +0.25μM地塞米松＋1μg/mL胰岛素＋0.5 mM IBMX+5μM罗格列酮。

上述到的成脂维持培养液：高DMEM基础培养基+20% FBS＋1μg/mL胰岛素。

实施例2

与实施例1的区别在于：利用的离心机的转速改为650g，离心时间不变，其他步骤并没有差异。最后分离后会造成细胞的死亡。

实施例3

与实施例子1的区别在于：利用0.2％胶原酶II型消化溶液消化的时间延长至1h30min，其他步骤不存在什么差异，最后分离细胞的效果没有太大差异。

实施例4

与实施例子1的区别在于：所使用的GM培养基配方修改为15％（vol / vol）FBS，0.5％（vol / vol）CEE和100 U mL -1青霉素/链霉素的DMEM。其他步骤并没有差异，最后分离细胞的效果没有太大差异。

实施例5

与实施例子1的区别在于：接种第一个胶原蛋白包被的10cm培养皿后，在37°C，5％CO₂培养箱中孵育时间延长至8小时。其余步骤与实施例一相似，最后分离细胞的纯度与分化效果都远低于孵育4小时。

上述描述中的实施方案可以进一步组合或者替换，且实施方案仅仅是对本发明的优选实施例进行描述，并非对本发明的构思和范围进行限定，在不脱离本发明设计思想的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变化和改进，均属于本发明的保护范围。本发明的保护范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims

1.一种高效分离小鼠肌内纤维-成脂祖细胞（Fibro-Adipogenic Progenitors，FAP）的方法，其特征在于，步骤包括：

（一）胶原蛋白涂层培养皿

（二）小鼠骨骼肌的分离和消化

（2.2）在无菌操作台取出小鼠后肢肌肉，放在细胞培养皿上，倒入3mL 4°C预冷含100 UmL^-1青霉素/链霉素的PBS溶液；

（2.3）将肌肉中其他组织剔除；

（2.5）加10mL的0.2％胶原酶II型溶液进行消化；在37°C下孵育1小时-1小时30分钟，530g离心5分钟；

（三）差异贴壁分离FAP

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2.5）中0.2％胶原酶II型消化溶液酶为500U/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的GM为补充有20％（vol / vol）FBS，0.5％（vol / vol）CEE和100 U mL ^-1青霉素/链霉素的DMEM，并通过0.22μm无菌滤头过滤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3.1）中培养箱孵育时间以4-6小时为宜。