CN113354535A - 一种提取猴头菇提取物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取猴头菇提取物的方法，包括：将猴头菇干燥粉碎得猴头菇粉末；将猴头菇料粉末投入二氧化碳超临界萃取釜中；在压力25‑35MP、温度30‑40℃、时间1‑2h、夹带剂乙醇含量0‑4mL/g条件下，得猴头菇粗提提取物。本发明的有益效果：该方法简单、环保，且所得到的单体化合物具有防治II型糖尿病的效果。

Description

一种提取猴头菇提取物的方法及其应用
技术领域
本发明属于猴头菇提取物的提取技术领域。
背景技术
猴头菌(Hericium erinaceum)又称猴头蘑、猴头菌、猴菇、对儿蘑、菜花菌、刺猬菌、山伏菌等，因形似猴头得名，是隶属于猴头菌科(Hericiaceae)，猴头菌属(Hericium)的传统名贵食药用真菌。明清时期，猴头菌更是作为贡品成为满汉全席的四大名菜(猴头、熊掌、燕窝、鱼翅)之一，有“素中荤”之称。中医认为，猴头菌利五脏、助消化等功效。研究表明猴头菌中能够产生化学结构多样、生物活性显著的二萜，酚类，生物碱类，脂肪酸类等多种活性次级代谢产物，活性评价揭示了这些化合物具有保肝护肝、抗癌、促进神经生长因子合成、抗氧化等广泛功效。
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，并可以导致严重的并发症如心血管疾病，肾病以及失明等。目前，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类重要的临床治疗糖尿病的药物，其可以减缓麦芽糖、蔗糖等淀粉水解物分解为葡萄糖，进一步减缓葡萄糖入血，从而达到控制血糖的目的。目前，临床应用的α-葡萄糖苷酶抑制剂存在比较明显的副作用，其可以抑制α-淀粉酶，延长淀粉在小肠中的分解时间，从而增加肠道菌群对淀粉的分解，容易引起胀气等不良反应。有报道称猴头菇具有一定的降糖作用，因此，研究猴头菇提取物以及单体化合物α-葡萄糖苷酶抑制活性为开发降糖药物以及保健品提供了新的可能。
超临界态是介于气液之间的一种既非气态又非液态的物态，这种物质只能在其温度和压力超过临界点时才能存在。超临界流体具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，使得超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质，因此用于萃取时萃取速率比液体快速而有效，尤其是溶解能力可随温度，压力和极性而变化。
二氧化碳是最常用的超临界流体，其临界温度低，31.05℃即可达到超临界状态，临界压力不算高，对多数溶质具有较大溶解度，且二氧化碳不可燃，无毒，安全，廉价易得。目前二氧化碳超临界流萃取是最常用的超临界萃取技术。萃取过程中，超临界流体与待提取的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小，沸点高低和分子量大小的成分萃取出来，然后借助减压，升降温的方法使超临界二氧化碳变成气体，被萃取物质则自动完全析出，从而达到分离提纯的目的。
目前针对猴头菇活性物质的现有提取技术，主要有超声以及有机溶剂回流等方法，因为涉及一些有毒的有机溶剂，以及高温，超声等操作，容易造成产品氧化、变性。利用乙醇、水等无毒溶剂萃取时，不能很好的将小极性的物质提取出来。二氧化碳超临界萃取技术则可以很好的避免上述缺点，能够在温和的条件下，将活性物质无毒无害无残留的提取，为猴头菇的高值化利用提供一种很好的处理技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种提取猴头菇提取物的方法，包括：将猴头菇干燥粉碎得猴头菇粉末；将猴头菇料粉末投入二氧化碳超临界萃取釜中；在压力25-35MP、温度30-40℃、时间1-2h、夹带剂乙醇含量0-4mL/g条件下，得猴头菇粗提提取物。
进一步地，所述温度优选为30℃。
进一步地，所述压力优选为25MPa。
进一步地，所述时间优选为1.5h。
进一步地，所述夹带剂乙醇含量优选为4mL/g。
本发明的第二目的是一种在制备治疗或预防糖尿病药物中应用的化合物，其结构式如下：
Figure BDA0002403069100000021
Figure BDA0002403069100000031
本发明的有益效果：该方法简单、环保，且所得到的单体化合物具有防治II型糖尿病的效果。
附图说明
图1.实施例3所得提取物液相色谱图。
图2.式1所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图3.式1所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图4.式2所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图5.式2所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图6.式3所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图7.式3所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图8.式4所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图9.式4所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图10.式5所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图11.式5所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图12.式6所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图13.式6所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图14.式7所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图15.式7所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图16.式8所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图17.式8所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图18.式9所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图19.式9所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图20.式10所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图21.式10所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图22.式11所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图23.式11所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图24.式12所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图25.式12所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图26.式13所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图27.式13所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图28.式14所示化合物的1H NMR谱(500Hz)。
图29.式14所示化合物的13C NMR谱(125Hz)。
图30.新化合物1-4质谱图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
将猴头菇充分干燥后，粉碎后过80目筛，得猴头菇粉；
将100g猴头菇粉末投入二氧化碳超临界萃取釜中，接入纯度为99.9％的二氧化碳。设置二氧化碳流速为15kg/h，萃取压力为25MPa，萃取温度为30℃，乙醇夹带剂为0，萃取1.0h。在与二氧化碳超临界萃取釜相连的分离釜中，得到最终的提取物。经称量得到提取物1.663g。并进行HPLC分析。
分析方法：HPLC仪器为岛津LC-20AT液相色谱仪配有SPD-M20A检测器，乙酸乙酯为溶剂将样品配制为1mg/mL的溶液，上样量10μL，色谱柱Kromasil 4.5×250mm C8(5μm)，流动相A为MeOH，B为H2O；洗脱程序为0-10min,85％MeOH，10-50min 85％-100％MeOH，50-80min 100％MeOH。柱温40℃，检测波长294nm，HPLC分析结果见图1。
实施例2
将猴头菇充分干燥后，粉碎后过80目筛，得猴头菇粉；
将100g猴头菇粉投入二氧化碳超临界萃取釜中，接入纯度为99.9％的二氧化碳。设置二氧化碳流速为15kg/h，萃取压力为25MPa，萃取温度为40℃，引入乙醇夹带剂2mL/g，萃取1.5h。在分离釜中，得到最终的提取物。挥干多余乙醇后，经称量得到提取物3.357g。并进行HPLC分析。
分析方法：HPLC仪器为岛津LC-20AT液相色谱仪配有SPD-M20A检测器，乙酸乙酯为溶剂将样品配制为1mg/mL的溶液，上样量10μL，色谱柱Kromasil 4.5×250mm C8(5μm)，流动相A为MeOH，B为H2O；洗脱程序为0-10min,85％MeOH，10-50min 85％-100％MeOH，50-80min 100％MeOH。柱温40℃，检测波长294nm，HPLC分析结果见图1。
实施例3
按照表1的设计，以及实施例1-2的操作，将100g猴头菇粉投入二氧化碳超临界萃取釜中，接入纯度为99.9％的二氧化碳。设置二氧化碳流速为15kg/h，设置萃取压力为25-35MPa，萃取温度为30-50℃，引入乙醇夹带剂0-4mL/g，萃取1-2h。在分离釜中，得到最终的提取物。挥干多余乙醇后，称量得到提取物产量。并进行HPLC分析。
分析方法为，HPLC仪器为岛津LC-20AT液相色谱仪配有SPD-M20A检测器，乙酸乙酯为溶剂将样品配制为1mg/mL的溶液，上样量10μL，色谱柱Kromasil 4.5×250mm C8(5μm)，流动相A为MeOH，B为H2O；洗脱程序为0-10min,85％MeOH，10-50min 85％-100％MeOH，50-80min 100％MeOH。柱温40℃，检测波长294nm，HPLC分析结果见图1。
表1二氧化碳超临界萃取所得提取物含量
Figure BDA0002403069100000061
注：萃取条件的选择是根据正交试验设计得到的。
实施例4
根据确定了二氧化碳超临界萃取的最优提取条件，萃取温度30℃，压力25MPa，时间1.5h，夹带剂乙醇含量4mL/g时，可以得到最大产量。根据上述条件，大量制备了猴头菇二氧化碳超临界萃取的提取物。
将猴头菇充分干燥后，粉碎后过80目筛，得猴头菇粉末；
将1000g猴头菇粉，加入到二氧化碳超临界萃取釜中，接入纯度为99.9％的二氧化碳。设置二氧化碳流速为15kg/h，萃取压力为30MPa，萃取温度为30℃，夹带剂乙醇含量4mL/g，萃取1.5h，最终得到提取物33.9g。
实施例5
猴头菇二氧化碳超临界提取物中单体化合物分离
将20猴头菇提取物与15g 200-300目硅胶混合干燥，通过硅胶正相柱色谱分离(色谱柱长500mm，内径30mm)，以石油醚(P):乙酸乙酯(E)体系(体积比为1:0,50:1,30:1,20:1,15:1,10:1,4:1,2:1)依次进行梯度洗脱，每个梯度洗涤2L。
根据TLC结果，合并得到10个流分(F-1～F-10)。
流分F-5(0.85g,P-E 100:2)进一步经反相色谱柱分离，85％甲醇/水洗脱得到5个子流分(F-5-1～F-5-5)。
在流分F-5-3(204mg)中，通过反相HPLC利用97％乙腈水洗脱，得到化合物1-4(5.1,3.2,3.5以及5.2mg,tR＝62.1,59.5,70.1以及80.2min)。
流分F-6(1.05g,P-E 100:5)通过Sephadex LH-20色谱柱分离，由MeOH-CH2Cl2(50％,v/v)洗脱得到7子流分(F-6-1～F-6-7)。
流分F-6-3进一步通过反相柱分离得到6子流分(F-6-3-1～F-6-3-6)。通过80％MeOH洗脱得到的流分F-6-3-3进一步通过利用HPLC制备由90％乙腈/水洗脱得到化合物5-8(25.4,43.1,33.9和51.2mg,tR 52.1,64.3,70.5以及49.3min)。
流分F-7(2.3g,P-E 100:10)同样的经凝胶Sephadex LH-20色谱柱分离，得到八个子流分(F-7-1～F-7-8)。流分F-7-3进一步利用78％乙腈水洗脱得到化合物9,11,12,14(15.5,31.4,22.3,22.2mg,tR 63.3,48.8,73.4,59.3min)。利用反相HPLC，经75％乙腈水洗脱,从流分F-7-4得到化合物10,13(31.8,42.9mg,tR 64.4,55.9min)。
经核磁质谱确认化合物为式1-14中结构。
通过分析质谱和核磁数据，确证式1所示化合物为(E)-4-(3,7-二甲基-5-(棕榈酰)辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基棕榈酸酯，(hericene E)，其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 809.6274[M-H]-(计算值C51H85O7,809.6295)，得到其分子式为C51H86O7；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.51(s),5.31(s),10.10(s),3.90(s),12.34(s),3.28(dd,J＝14.1,7.2Hz),3.33(dd,J＝14.1,7.2Hz),5.19(t,J＝7.2Hz),2.27(dd,J＝13.5,7.4Hz),2.08(dd,J＝13.5,6.3Hz),5.59(m),5.04(d,J＝9.2Hz),1.64(s),1.63(s),1.79(s),2.33(m),1.61(m),2.15(m),1.52(m),0.88(t,J＝6.8Hz),1.24(m)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δC 138.5,112.83,162.86,117.64,163.38,105.5,62.91,193.04,55.89,21.43,124.86,131.28,45.31,69.65,123.77,136.69,25.61,18.34,16.47,173.18,34.23,24.87,173.07,34.54,24.99,31.93,22.74,14.13,29.13-29.70。
Figure BDA0002403069100000071
通过分析质谱和核磁数据，确证式2所示化合物为(E)-8-(3-甲酰基-2-羟基-6-甲氧基-4-((棕榈酰氧基)甲基)苯基)-2,6-二甲基辛-2,6-二烯-4-基(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸，(hericene F)，其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 833.6285[M-H]-(计算值C53H85O7,833.6295)，得到其分子式为C53H86O7；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.51(s),5.31(s),10.10(s),3.90(s),12.34(s),3.28(dd,J＝14.1,7.2Hz),3.33(dd,J＝14.1,7.2Hz),5.19(t,J＝7.2Hz),2.27(dd,J＝13.5,7.4Hz),2.08(dd,J＝13.5,6.3Hz),5.59(m),5.04(d,J＝9.2Hz),1.64(s),1.63(s),1.79(s),2.33(m),1.61(m),2.15(m),1.52(m),2.04(m),5.34(m),2.76(t,J＝6.8),0.88(m),1.24(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.65,112.98,163.01,117.78,163.53,105.65,63.06,193.19,56.04,21.57,125.02,131.42,45.45,69.85,123.9,136.85,25.57,18.49,16.62,173.32,34.38,25.02,173.18,34.67,25.12,27.35,130.35,130.22,128.16,128.04,25.63,31.67,32.08,22.74,22.85,14.28,14.23,29.23-29.85。
Figure BDA0002403069100000081
通过分析质谱和核磁数据，确证式3所示化合物为(E)-8-(3-甲酰基-2-羟基-6-甲氧基-4-((棕榈酰氧基)甲基)苯基)-2,6-二甲基辛-2,6-二烯-4-基油酸酯，hericene G)，其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 835.6464[M-H]-(计算值C53H87O7,835.6452)，得到其分子式为C53H88O7；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH6.51(s),5.31(s),10.10(s),3.90(s),12.34(s),3.28(dd,J＝14.1,7.2Hz),3.33(dd,J＝14.1,7.2Hz),5.19(t,J＝7.2Hz),2.27(dd,J＝13.5,7.4Hz),2.08(dd,J＝13.5,6.3Hz),5.59(m),5.04(d,J＝9.2Hz),1.64(s),1.63(s),1.79(s),2.33(m),1.61(m),2.15(m),1.52(m),2.04(m),5.34(m),0.88(m),1.24(m')；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC138.67,113.04,163.03,117.81,163.55,105.76,63.11,193.27,56.04,21.56,125.04,131.44,45.45,69.92,123.92,136.85,25.74,18.48,16.61,173.40,34.36,25.01,173.36,34.67,25.11,27.36,130.18,127.88,32.05,32.07,22.83,22.84,14.26,29.20-29.90。
Figure BDA0002403069100000082
通过分析质谱和核磁数据，确证式4所示化合物为(E)-8-(3-甲酰基-2-羟基-6-甲氧基-4-((硬脂酰氧基)甲基)苯基)-2,6-二甲基辛-2,6-二烯-4-基(9Z,12Z)-十八烷基-9,12-二烯酸酯(hericene H)，其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 861.6597[M-H]-(计算值C55H89O7,861.6608)，得到其分子式为C5H90O7；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.51(s),5.31(s),10.10(s),3.90(s),12.34(s),3.28(dd,J＝14.1,7.2Hz),3.33(dd,J＝14.1,7.2Hz),5.19(t,J＝7.2Hz),2.27(dd,J＝13.5,7.4Hz),2.08(dd,J＝13.5,6.3Hz),5.59(m),5.04(d,J＝9.2Hz),1.64(s),1.63(s),1.79(s),2.33(m),1.61(m),2.15(m),1.52(m),2.04(m),5.34(m),2.76(t,J＝6.8),0.88(m),1.24(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.65,112.98,163.01,117.78,163.53,105.65,63.06,193.19,56.04,21.57,125.02,131.42,45.45,69.85,123.90,136.85,25.57,18.49,16.62,173.32,34.38,25.02,173.18,34.67,25.12,27.35,130.35,130.22,128.16,128.05,25.63,31.67,32.08,22.74,22.85,14.28,14.23,29.23-29.85。
Figure BDA0002403069100000091
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式5所示化合物为(E)-4-(3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基棕榈酸酯，(hericene A)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 555.4053[M-H]-(计算值C35H55O5,555.4049)，得到其分子式为C35H56O5；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.52(s),5.32(s,2H),10.1(s),3.91(s),12.36(s),3.34(d,J＝7.1Hz),5.17(t,J＝7.1Hz),1.97(m),2.04(m),5.05(t,J＝7.5Hz),1.63(s),1.57(s),1.76(s),2.33(t,J＝7.6Hz),0.88(t,J＝6.9Hz),1.61(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.4,112.9,162.9,118,163.5,105.6,63,193.1,55.9,21.4,121.2,131.2,39.8,26.7,124.3,135.8,25.7,17.7,16.1,173.2,34.2,14.1,31.9,29.7,29.7,29.7,29.6,29.6,29.4,29.4,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000092
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式6所示化合物为4-((E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基油酸酯，(hericene B)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 581.4209[M-H]-(计算值C37H57O5,581.4206)，得到其分子式为C37H58O5；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.52(s),5.32(s),10.1(s),3.91(s),12.36(s),3.34(d,J＝7.0Hz),5.17(t,J＝7.2Hz),1.97(m),2.03(m),5.05(t,J＝7.3Hz),1.63(s),1.57(s),1.77(s),2.34(t,J＝7.5Hz),0.88(t,J＝6.7Hz,9H),5.34(m),5.34(m),1.61(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.4,112.9,162.9,118.1,163.5,105.6,62.9,193.1,55.9,21.4,121.2,131.3,39.7,26.7,124.4,135.8,25.7,17.7,16.1,173.2,34.2,14.1,130.0,129.7,31.9,29.7,29.6,29.6,29.5,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000101
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式7所示化合物为(E)-4-(3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基硬脂酸酯，(hericene C)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 583.4358[M-H]-(计算值C37H59O5,583.4362)，得到其分子式为C37H60O5；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.52(s),5.31(s),10.1(s),3.91(s),12.36(s),3.33(d,J＝7.1Hz),5.15(d,J＝7.0Hz),1.95(m),2.04(m),5.05(t,J＝6.9Hz),1.63(s),1.56(s),1.76(s),2.32(t,J＝7.6Hz),0.87(t,J＝6.8Hz,4H),1.60(m)1.25(m)；13CNMR(125MHz,CDCl3)δC 138.4,112.9,162.9,118.0,163.5,105.6,63.0,193.1,55.9,21.4,121.2,131.2,39.8,26.7,124.3,135.8,25.7,17.7,16.1,173.2,34.2,14.1,31.9,29.7,29.7,29.7,29.6,29.6,29.4,29.4,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000102
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式8所示化合物为4-((E)-3,7-二甲基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯，(hericene D)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z579.4057[M-H]-(计算值C37H55O5,579.4049)，得到其分子式为C37H56O5；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.52(s),5.32(s),10.11(s),3.91(s),12.36(s),3.34(d,J＝7.1Hz),5.17(t,J＝8.0Hz),1.95(m),2.05(m),5.05(t,J＝7.1),1.64(s),1.57(s),1.77(s),2.33(t,J＝7.5Hz),0.88(t,J＝7.0Hz),5.37(m),2.77(t,J＝6.8Hz),2.05(m),1.61(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.4,112.9,162.9,118.1,163.5,105.6,63.0,193.1,55.9,21.4,121.2,131.2,39.8,26.7,124.4,135.7,25.6,17.6,16.1,173.1,34.2,14.1,127.9,128.1,130.0,130.2,31.5,29.6,29.3,29.7,29.4,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000111
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式9所示化合物为(E)-4-(3,7-二甲基-5-羰基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基棕榈酸酯，(hericenone C)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 593.5850[M-H]-(计算值C37H53O6,593.3842)，得到其分子式为C37H54O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.53(s),10.11(s),3.91(s),5.32(s),12.38(s),3.4(d,J＝7.2Hz),5.32(m),3.00(s),6.09(s),1.84(s),1.78(s),2.12(s),2.33(t,J＝7.6Hz),0.88(t,J＝6.9Hz),1.61(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.7,112.9,162.9,117.3,163.5,105.6,193.1,55.9,62.9,21.6,126.2,130.3,55.6,199.6,122.8,155.5,27.7,16.4,20.7,173.2,34.2,14.1,31.9,29.7,29.6,29.5,29.4,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000112
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式10所示化合物为(E)-4-(3,7-二甲基-5-羰基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基硬脂酸酯，(hericenone D)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 597.4148[M-H]-(计算值C37H57O6,597.4155)，得到其分子式为C37H58O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.53(s),10.11(s),3.91(s),5.32(s),12.38(s),3.4(d,J＝7.2Hz),5.32(m),3.00(s),6.09(s),1.84(s),1.78(s),2.12(s),2.33(t,J＝7.6Hz),0.88(t,J＝6.9Hz),1.61(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.7,112.9,162.9,117.3,163.5,105.6,193.1,55.9,62.9,21.6,126.2,130.3,55.6,199.6,122.8,155.5,27.7,16.4,20.7,173.2,34.2,14.1,31.9,29.7,29.6,29.5,29.4,29.2,29.1,24.9,22.7。
Figure BDA0002403069100000121
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式11所示化合物为4-((E)-3,7-二甲基-5-羰基辛-2,6-二烯-1-基)-2-甲酰基-3-羟基-5-甲氧基苯基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯，(hericenone E)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 593.3849[M-H]-(计算值C37H53O6,593.3842)，得到其分子式为C37H54O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 6.56(s),5.32(s),10.14(s),12.41(s),3.95(s),3.43(d,J＝7.2Hz),5.32(m),3.04(s),6.12(s),1.87(s),1.81(s),2.16(s),2.37(t,J＝7.6Hz),0.92(t,J＝6.9Hz),5.34(m),2.8(t,J＝6.5Hz),2.08(m),1.62(m),1.68(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 138.6,112.9,162.9,117.3,163.4,105.6,62.9,193.1,55.9,21.6,126.2,130.3,55.6,199.5,122.8,155.5,27.7,16.4,20.7,173.2,34.2,14.1,127.9,128.1,130.0,130.2,31.5,29.6,29.3,29.1,29.1,27.2,27.2,25.6,24.8,22.6。
Figure BDA0002403069100000122
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式12所示化合物为(8-甲酰基-5-甲氧基-2-甲基-2-(4-甲基-2-羰基戊-3-烯-1-基)二氢苯并哌喃-7-基)甲基棕榈酸酯，(hericenone F)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 569.3850[M-H]-(计算值C35H53O6,569.3842)，得到其分子式为C35H54O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 2.01(dd,J＝13.8,6.0Hz),1.92(dd,J＝13.8,6.9Hz),2.63(t,J＝6.8Hz),6.54(s),1.44(s),2.82(d,J＝14.1Hz),2.66(d,J＝13.9Hz),6.06(s),2.14(s),1.86(s),10.42(s),3.88(s),5.51(s),2.41(t,J＝7.6Hz),1.69(m),0.88(t,J＝6.9Hz),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC76.9,30.0,16.4,109.2,161.9,100.8,139.7,115.7,158.3,24.5,52.5,197.9,124.9,156.4,20.8,27.8,190.3,55.6,64.5,173.3,34.4,31.9,14.1,29.7,29.7,29.6,29.5,29.4,29.3,25.1,22.7。
Figure BDA0002403069100000131
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式13所示化合物为(8-甲酰基-5-甲氧基-2-甲基-2-(4-甲基-2-羰基戊-3-烯-1-基)二氢苯并哌喃-7-基)甲基硬脂酸酯，(hericenone G)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z 597.4160[M-H]-(计算值C37H57O6,597.4155)，得到其分子式为C37H58O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 2.01(m),1.92(m),2.63(t,J＝6.8Hz),6.54(s),1.44(s),2.82(d,J＝14.1Hz),2.67(d,J＝14.1Hz),6.06(s),2.14(s,3H),1.86(s),10.41(s),3.88(s),5.51(s),2.41(t,J＝7.6Hz),0.88(t,J＝6.9Hz),1.69(m),1.25(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 76.9,30.0,16.4,109.2,161.9,100.8,139.7,115.7,158.3,24.5,52.5,197.9,124.9,156.5,20.8,27.8,190.4,55.6,64.5,173.3,34.4,14.1,31.9,29.7,29.7,29.7,29.6,29.5,29.4,29.3,29.3,22.7,25.1。
Figure BDA0002403069100000132
通过分析核磁数据，并与文献对比，确证式14所示化合物为(8-甲酰基-5-甲氧基-2-甲基-2-(4-甲基-2-羰基戊-3-烯-1-基)二氢苯并哌喃-7-基)甲基(9Z,12Z)-十八烷-9,12-二烯酸酯，(hericenone H)。其波谱数据如下所示：负离子模式HRTOFMS质谱m/z593.3853[M-H]-(计算值C37H53O6,593.3842)，得到其分子式为C37H54O6；1H NMR(500MHz,CDCl3)δH 2.01(m),1.92(m),2.63(t,J＝6.8Hz),6.54(s),2.82(d,J＝14.2Hz),2.66(d,J＝14.2Hz),6.06(s),2.14(s),1.86(s),10.41(s),3.88(s),5.50(s),2.41(t,J＝7.6Hz),0.88(t,J＝6.8Hz),5.34(m),2.77(t,J＝6.7Hz),2.04(m),1.69(m)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δC 76.9,30.0,16.5,109.2,161.9,100.8,139.6,115.8,158.3,24.5,52.5,197.9,124.9,156.4,20.8,27.8,190.4,55.6,64.6,173.2,34.4,14.1,127.9,128.1,130.0,130.2,31.5,29.6,29.4,29.2,29.1,27.2,27.2,25.1,22.6,53.4,25.6,50.9,29.2。
Figure BDA0002403069100000141
实施例6
猴头菇单体化合物以及提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价
采用p-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷(PNPG)，麦芽糖、蔗糖三种底物，评价药物对α-葡萄糖苷酶抑制活性。
取1.0g小鼠肠粘膜匀浆悬浮于3mL 0.9％生理盐水中，然后在4℃超声处理(12次，每次30s)。4℃10000g离心30min，取上清，得到α-葡萄糖苷酶的粗提液。
10μL不同浓度的测试化合物、20μL 2.0mM p-硝基苯基-α-D-葡萄糖苷与60μL磷酸缓冲液(50mM，pH 6.8)混合，37℃水浴中反应40min。随后酶标仪405nm下检测产物p-硝基酚的吸光度。
10μL不同浓度的测试化合物或提取物、20μL 2.0mM麦芽糖或者2.0mM蔗糖与60μL磷酸缓冲液(50mM，pH 6.8)混合，37℃水浴中反应40min。利用葡萄糖测定试剂盒(GOD，葡萄糖氧化酶法)测定蔗糖酶和麦芽糖酶水解产生的葡萄糖含量，在550nm测定吸光度，确定葡萄糖的生成量。
以上三组实验的对照组，均以等体积磷酸缓冲液代替样品溶液；样品空白组中使用等体积磷酸缓冲液代替α-葡萄糖苷酶，阿卡波糖作为阳性对照。并按照以下公式计算抑制率，并根据抑制率与浓度的关系计算IC50值
抑制率(％)＝[(OD对照组-OD对照空白组)-(OD样品组-OD样品空白组)]/(OD对照组-OD对照空白组)×100％。
根据表2结果，化合物6，9，11，12，13，14对α-葡萄糖苷酶水解PNPG的抑制活性要比阳性药阿卡波糖强，其中13和14的IC50为15.4和21.1μM，而阿卡波糖的IC50为38.1μM。化合物9，13对α-葡萄糖苷酶水解蔗糖抑制活性的IC50为13.5和12.1μM，而阿卡波糖的IC50为20.2μM。另外化合物9对麦芽糖的水解有强的抑制活性，IC50为15.1μM，而阿卡波糖的IC50为16.1μM。提取物对α-葡萄糖苷酶也有较好的抑制活性，对α-葡萄糖苷酶水解PNPG、蔗糖以及麦芽糖的抑制活性IC50 37.5、39.0和71.2μg/mL。
表2猴头菌化合物及提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50,μM)
Figure BDA0002403069100000151
实施例7
猴头菇单体化合物以及提取物体外α-淀粉酶抑制活性评价
猪胰脏来源的α-淀粉酶购买自上海源叶，待测化合物溶解于DMSO中，1μL的待测化合物加入到199μL淀粉溶液中(其中包含1％淀粉和17mM NaCl)，随后加入10μL的α-淀粉酶(26U/mL溶解于0.1M磷酸缓冲液中，pH 7.0)摇床培养30min。随后加入20μL的2M NaOH溶液，使酶活反应停止。接着加入20μL二硝基水杨酸溶液(44mM 3,5-二硝基水杨酸，106mM酒石酸钾钠，40mM NaOH)，90℃反应20min。酶标仪540nm读数。实验的对照组，以等体积DMSO冲液代替样品溶液；样品空白组中使用等体积磷酸缓冲液代替α-淀粉酶，阿卡波糖作为阳性对照。并按照以下公式计算抑制率，并根据抑制率与浓度的关系计算IC50值
抑制率(％)＝[(OD对照组-OD对照空白组)-(OD样品组-OD样品空白组)]/(OD对照组-OD对照空白组)×100％。
根据测试，单体化合物对α-淀粉酶抑制活性的IC50>100μM,提取物的IC50>200μg/mL而阿卡波糖的IC50为56.1μM。由于阿卡波糖之所以存在副作用，是因为阿卡波糖对α-淀粉酶较强的抑制活性，而猴头菇中分离得到的单体化合物对α-淀粉酶的抑制活性较弱，因此在应用的过程中，在一定程度可以避免类似于阿卡波糖副作用的出现。
表3猴头菌化合物及提取物对α-淀粉酶抑制活性(IC50,μM)
Figure BDA0002403069100000161
实施例8
乙酸乙酯超声萃取制备猴头菇提取物
将干燥的猴头菌粉碎，过80目筛，将10g猴头菌粉加入到200mL乙酸乙酯中混悬，超声60min，过滤收集滤液，滤渣再提取两遍，滤液合并浓缩成浸膏，浸膏用20mL甲醇-二氯甲烷1:1的溶剂溶解，取可溶部分，浓缩，干燥称重，得到化合物的含量为0.359g。
实施例9
分别采用石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醇等提取溶剂按照上述提取方法，进行。具体过程为将干燥的猴头菌粉碎，过80目筛，将10g猴头菌粉加入到200mL提取溶剂中混悬，超声60min，过滤收集滤液，滤渣再提取两遍，滤液合并浓缩成浸膏，浸膏用20mL甲醇-二氯甲烷1:1的溶剂溶解，取可溶部分，浓缩，干燥称重，得到化合物的量分别为0.228、0.224、0.308、0148g。
实施例10
乙酸乙酯索氏提取制备猴头菇提取物
将干燥的猴头菌粉碎，过80目筛，将10g猴头菌粉加入到200mL乙酸乙酯中混悬，加入到索氏提取器中回流10min，收集滤液浓缩成浸膏，浸膏用20mL甲醇-二氯甲烷1:1的溶剂溶解，取可溶部分，浓缩，干燥称重，得到化合物的含量为0.423g。
实施例11
分别采用石油醚、正己烷、二氯甲烷、乙醇等提取溶剂按照上面的提取方法，进行。具体过程为将干燥的猴头菌粉碎，过80目筛，将10g猴头菌粉加入到200mL提取溶剂中混悬，加入到索氏提取器中回流10min，收集滤液浓缩成浸膏，浸膏用20mL甲醇-二氯甲烷1:1的溶剂溶解，取可溶部分，浓缩，干燥称重，得到化合物的含量分别为0.137、0.138、0.208、0.311g。
实施例12
猴头菇提取物中活性成分定量分析
根据液相分析，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物9为猴头菇提取物中的主要成分。因此对化合物9(hericeone C，式-9)，作为标准品进行了定量分析了实施例1-9，以及实施例14-23中得到的提取物中化合物9的含量。
HPLC分析方法
HPLC仪器为岛津LC-20AT液相色谱仪配有SPD-M20A检测器。乙酸乙酯为溶剂将样品配制为1mg/mL的溶液，上样量10μL，色谱柱Kromasil 4.5×250mm C8(5μm)，流动相A为MeOH，B为H2O；洗脱程序为0-10min,85％MeOH，10-50min 85％-100％MeOH。柱温40℃，检测波长294nm。该方法下，化合物9的保留时间为tR＝27.2min，在提取物中达到了基线分离，说明方法适用性良好。
标准曲线绘制
精密配制含有2mg/mL化合物9的乙酸乙酯溶液，对半梯度稀释，得到系列浓度的混合对照品溶液。按上述色谱条件进样测定，记录峰面积。以峰面积值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线并进行线性回归，得到回归方程Y＝4.4520x+0.1033，其相关系数R2为0.9997，说明在所配置的样品浓度范围内线性关系良好。含量测定
对不同方法得到的提取物，充分干燥，乙酸乙酯溶解定容配置成样品溶液，按照上述分析条件。根据积分面积，计算样品中化合物9含量，进一步计算粗提取中含量。通过比较可以发现，二氧化碳超临界萃取方法所得提取物中化合物9的含量最高为4.73％，因此该方法不仅提取率高，而且环保。
表4提取物中化合物9定量分析结果
Figure BDA0002403069100000181

Claims (7)

1.一种提取猴头菇提取物的方法，其特征在于，包括：
将猴头菇干燥粉碎得猴头菇粉末；
将猴头菇料粉末投入二氧化碳超临界萃取釜中；
在压力25-35MP、温度30-40℃、时间1-2h、夹带剂乙醇含量0-4mL/g条件下，得猴头菇粗提提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述温度优选为30℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述压力优选为25MPa。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述时间优选为1.5h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述夹带剂乙醇含量优选为4mL/g。
6.一种在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中应用的化合物，其结构式如下式之一：
Figure FDA0002403069090000011
Figure FDA0002403069090000021
7.一种在制备治疗或预防糖尿病药物中应用的化合物，其结构式如下式之一：
Figure FDA0002403069090000022
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