CN113350369B - 车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用 - Google Patents

车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用，具体地，涉及一种车前草多糖在制备用于预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用，属于抗病毒应用领域。通过体外细胞实验表明，车前草多糖能够有效抑制猪伪狂犬病病毒感染，可以显著减少猪伪狂犬病病毒引起的细胞病变。通过在病毒感染的不同阶段添加车前草多糖，发现车前草多糖主要抑制病毒对细胞的吸附和入胞。本发明所述的车前草多糖优点在于其属于中药提取物，毒副作用小、安全性高。

Description

车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，尤其涉及一种车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用。
背景技术
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)又称奥耶兹氏病(AujeszKy’s disease)，是由猪疱疹病毒1型(Suid herpesvirus 1,SuHV-1)或称伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多种家畜和野生动物共患的疾病，以发烧，严重瘙痒(猪除外)，呼吸系统和神经系统疾病以及脑脊髓炎为特征的急性病毒感染性疾病。传播途径十分广泛，其主要的传播方式是直接接触传播，也可通过带有病毒的空气飞沫传播此病。
猪伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科，甲型疱疹病毒亚科，水泡病毒属的猪疱疹病毒I型，主要由囊膜、衣壳、核心组成，外形为椭圆形或圆形，其粒子直径为150-180nm。PRV的基因组大小约为150kb，是线性双股DNA分子。PRV的自然宿主和传播者是猪，其主要传染源为病猪、隐性不发病带毒猪以及带毒鼠类。临床上，不同年龄阶段的猪均易感染。育肥猪表现为僵猪、生长发育迟缓，料肉比高；保育猪和新生仔猪常表现出典型的神经症状、顽固腹泻以及呼吸系统综合征，病死率高；公猪常表现为睾丸肿胀或萎缩，种用功能降低甚至丧失；母猪感染多表现为产死胎、木乃伊胎、流产等繁殖障碍性疾病。
自2011年以来，新的PRV变异株导致猪的伪狂犬病在我国内免疫猪场持续流行，这给猪伪狂犬病净化带来巨大阻力。针对猪伪狂犬病，现在国内外多采用疫苗免疫接种的手段进行预防，辅以加强卫生管理和药物治疗。但是，本病目前尚未有特效的药物和疗法。
因此，为了减少伪狂犬病造成的经济损失，开发新的抑制猪伪狂犬病的药物十分迫切，既有利于解决目前的临床问题，同时也是一种新的治疗选择。很多中药都已经被证明有免疫调节作用，而传统中药车前草是其中的一种，其药理研究显示车前草具有降血脂、肝损伤保护、利尿、抗氧化、抗菌消炎、降血尿酸、抗病毒、抗肿瘤和增加免疫力等作用。之前研究已经从车前草中分离提纯得到大分子成分—车前草多糖(plantago asiaticapolysaccaride，PLP)，据报道车前草多糖具有抗氧化、杀菌消炎、抗肿瘤等作用，但对于车前草多糖抗病毒的活性尚未报道。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提供一种车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用，目的是对猪伪狂犬病病毒感染提供了新的治疗选择。
基于上述目的，本发明提供了车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用。
所述抗猪伪狂犬病病毒感染制剂包括预防和/或治疗猪伪狂犬病病毒制剂。
所述抗猪伪狂犬病病毒感染制剂包括抑制猪伪狂犬病病毒吸附和/或抑制猪伪狂犬病病毒入胞的制剂。
所述制剂为药物制剂。
所述药物制剂的剂型包括喷雾剂、粉雾剂、软膏剂、喷鼻剂、溶液剂、混悬剂、乳剂。
所述制剂为消毒剂。
所述制剂为添加剂。所述添加剂优选为食品添加剂。
本发明的有益效果：本发明提供了车前草多糖的新用途，创新性的将车前草多糖应用于在抗猪伪狂犬病病毒感染的预防和/或治疗中，且车前草多糖在抗猪伪狂犬病病毒感染效果显著；车前草多糖可以减少猪伪狂犬病病毒引起的细胞病变，抑制猪伪狂犬病病毒的吸附、入胞，为临床治疗猪伪狂犬病提供了科学可靠的理论依据。同时，车前草多糖是从车前草中提取并作为其活性的主要成分之一，车前草在全国各地均有生产，可大量种植，具有药源丰富，廉价易得等优点；车前草多糖来源于中药，毒副作用小。车前草多糖在临床上还具有多种生物学意义，具降血糖、降血脂、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等药理作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中显微镜观察车前草多糖对猪伪狂犬病病毒感染PK-15细胞引起的细胞病变的影响；
图2为本发明实施例3中车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染的影响；其中，A为Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染的影响；B为TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染的影响；C为间接免疫荧光测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒感染的影响；
图3为本发明实施例4中车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响；其中，A为Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响；B为TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响；C为间接免疫荧光测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响；
图4为本发明实施例5中车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响；其中，A为Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响；B为TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响；C为间接免疫荧光测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响；
图5为本发明实施例6中车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响；其中，A为Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响；B为TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响；C为间接免疫荧光测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响；
图6为本发明实施例7中Western blot测定车前草多糖对不同感染复数的猪伪狂犬病病毒感染的影响；
图7为本发明实施例8中TCID50测定车前草多糖在对猪伪狂犬病病毒中的直接杀伤作用。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
需要说明的是，除非另外定义，本发明实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。
本发明中涉及的试验材料：
猪伪狂犬病病毒XJ5毒株、Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)及PK-15细胞(猪肾细胞)均为本实验室保存，车前草多糖购于杨凌慈缘生物技术有限公司。本发明对车前草多糖的来源没有特殊要求，采用本领域常规的市售产品或按照现有方法自行制备均可。
实施例1
一种抗猪伪狂犬病病毒感染的制剂，将车前草多糖溶解于0.01mol/L的PBS缓冲液中获得，车前草多糖的浓度为50mg/mL。
实施例2
车前草多糖对猪伪狂犬病病毒引起的细胞病变的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释并计数，铺到六孔板中以5×105个/孔的细胞浓度为宜，置于37℃，5％CO2的培养箱培养至细胞长到70-80％的密度(大概17-18h)后，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，分别用PBS、不同浓度的车前草多糖(100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL，600μg/mL)预处理1h后，加入PRV XJ5毒株(0.1MOI)感染细胞，置37℃,5％CO2培养箱感染1h后，用PBS溶液洗三遍，每孔换成含有2％胎牛血清的DMEM营养液，感染24h且药物一直存在，在显微镜下观察细胞的形态变化及病变情况。根据图1结果所示，车前草多糖可以减少猪伪狂犬病病毒引起的细胞病变，表明车前草多糖可以抑制猪伪狂犬病病毒的感染。
实施例3
车前草多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒感染的活性(Western blot、IFA和TCID50实验)
(1)Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒感染的活性
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到6孔板以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔各加入用1mL无血清的DMEM及相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)，与PK-15细胞置37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后，用猪伪狂犬病病毒感染细胞并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，放37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，换成每孔2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持且有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，放37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，每孔收集1mL细胞上清(放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，细胞用PBS洗三遍后吸尽残留液体，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Western blot检测。发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达(图2A)，初步证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的感染。
(2)TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒感染的活性
Vero细胞经0.25％胰酶消化后，用含8％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到96孔板中，以2×103/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后，弃去原培养液，用PBS洗三遍，吸尽残液后，将上述实施例3(1)中收取的细胞上清用无血清的DMEM稀释成不同浓度并加入含有Vero细胞的96孔板中，每个浓度做8个重复，置37℃，5％CO2接毒培养箱中感染1.5h后，换成含2％胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况，用Reed–Muench两氏法计算TCID50。结果发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒感染上清的病毒滴度(图2B)，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的感染。
(3)IFA测定车前草多糖在PK-15细胞上抑制猪伪狂犬病病毒感染的活性
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到6孔板以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔各加入1mL无血清的DMEM及相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)，与PK-15细胞置37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后，用猪伪狂犬病病毒感染细胞并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，放37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，换成每孔2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持且有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，放37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，细胞用PBS溶液洗三遍，加入4％多聚甲醛在37℃固定10min，然后用0.1％Triton X-100在37℃孵育10分钟，再加入5％BSA在4°封闭过夜。封闭后加入阳性PRV血清(血清：PBS＝1：200)在37℃孵育1h，再与FITC标记山羊抗猪IgG抗体(1：200)37°中孵育30分钟，DAPI染色7分钟后观察。发现车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒感染的活性(图2C)。
实施例4
车前草多糖对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响(Western blot、IFA和TCID50实验)
(1)Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，滴加到6孔板以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔各加入1mL冷的无血清DMEM及相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)并感染猪伪狂犬病病毒，4℃感染1h后，弃去液体，用冷的PBS洗三次，每孔各加入1mL含2％胎牛血清的DMEM并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后，细胞先用柠檬酸洗三遍，再用PBS洗三遍并吸尽残余液体，每孔加入2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持，置37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，每孔收集1mL细胞上清(放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Western blot检测。结果如图3A所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达，初步证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的吸附和入胞。
(2)TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响
Vero细胞经0.25％胰酶消化后，用含8％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到96孔板，以2×103/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后，弃去原培养液，用PBS洗三遍，吸尽残液后，将上述实施例4(1)中收取的细胞上清用无血清的DMEM稀释成不同浓度并加入含有Vero细胞的96孔板中，每个浓度做8个重复，置37℃，5％CO2接毒培养箱孵育1.5h后，换成含2％胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图3B所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒感染的病毒滴度，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的吸附和入胞。
(3)IFA测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附和入胞的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，滴加到6孔板以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔各加入1mL冷的无血清DMEM及相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)并感染猪伪狂犬病病毒，4℃感染1h后，弃去液体，用冷的PBS洗三次，每孔各加入1mL含2％胎牛血清的DMEM并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，在37℃，5％CO2培养箱中孵育1h后，细胞先用柠檬酸洗三遍，再用PBS洗三遍并吸尽残余液体，每孔加入2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持，置37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，细胞PBS溶液洗三遍，加入4％多聚甲醛在37℃固定10min，然后用0.1％Triton X-100在37℃孵育10分钟，再加入5％BSA在4°封闭过夜。封闭后加入阳性PRV血清(血清：PBS＝1：200)在37℃孵育1h，再与FITC标记山羊抗猪IgG抗体(1：200)37°中孵育30分钟，DAPI染色7分钟后观察。发现车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的吸附入胞(图3C)。
实施例5
车前草多糖对猪伪狂犬病病毒吸附的影响(Western blot、IFA和TCID50实验)
(1)Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到6孔板，以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔加入1mL不含胎牛血清的冷DMEM，再感染猪伪狂犬病病毒并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，置4℃孵育1h后，换成每孔含有2mL 2％胎牛血清的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，每孔收集1mL细胞上清(放-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，细胞用PBS洗三遍，吸尽残余液体，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Western blot检测。结果如图4A所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的吸附。
(2)TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响
Vero细胞经0.25％胰酶消化后，用含8％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到96孔板中，以2×103/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后，弃去原培养液，用PBS洗三遍，吸尽残液后，将上述实施例5(1)中收取的细胞上清用无血清的DMEM稀释成不同浓度并加入含有Vero细胞的96孔板中，每个浓度做8个重复，置37℃，5％CO2接毒培养箱孵育1.5h后，换成含2％胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图4B所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒感染的病毒滴度，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的吸附。
(3)IFA测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒吸附的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到6孔板，以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔加入1mL不含胎牛血清的冷DMEM，再感染猪伪狂犬病病毒并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，置4℃孵育1h后，换成每孔含有2mL 2％胎牛血清的DMEM营养液维持，放37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，细胞用PBS溶液洗三遍，加入4％多聚甲醛在37℃固定10min，然后用0.1％Triton X-100在37℃孵育10分钟，再加入5％BSA在4°封闭过夜。封闭后加入阳性PRV血清(血清：PBS＝1：200)在37℃孵育1h，再与FITC标记山羊抗猪IgG抗体(1：200)37°中孵育30分钟，DAPI染色7分钟后观察。发现车前草多糖能够抑制猪伪狂犬病病毒的吸附(图4C)。
实施例6
车前草多糖对猪伪狂犬病病毒入胞的影响(Western blot、IFA和TCID50实验)
(1)Western blot测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，滴加到6孔板，以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液洗三遍，吸尽残余液体，每孔各加入1mL无血清的冷DMEM并感染猪伪狂犬病病毒，置于4℃孵育1h后，弃去原培养液，用PBS溶液洗三遍并将残余液体吸尽，每孔加入1mL含2％胎牛血清的DMEM并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，37℃孵育1h后，细胞先用柠檬酸洗三遍，再用PBS洗三遍并吸尽残液，每孔换成2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持，置37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h后，每孔收集1mL的细胞上清(置于-70℃保存为后期TCID50实验做准备)，加入2×蛋白loading收集细胞样品，在金属浴96℃煮15min，然后进行Western blot检测。结果如图5A所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒gB蛋白的表达，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的入胞。
(2)TCID50测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响
Vero细胞经0.25％胰酶消化后，用含8％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加至96孔板，浓度达2×103/孔为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后，弃去原培养液，用PBS洗三遍，吸尽残余液体后，将上述实施例6(1)中收取的细胞上清用无血清的DMEM稀释成不同浓度，加入含有Vero细胞的96孔板中，每个浓度做8个重复，置于37℃，5％CO2接毒培养箱中孵育1.5h，而后换成含2％胎牛血清的DMEM维持，待感染72h后观察细胞病变的情况。结果如图5B所示，发现车前草多糖降低猪伪狂犬病病毒感染的病毒滴度，证实车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的入胞。
(3)IFA测定车前草多糖在PK-15细胞上对猪伪狂犬病病毒入胞的影响
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释到适当的密度，滴加到6孔板，以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液洗三遍，吸尽残余液体，每孔各加入1mL无血清的冷DMEM并感染猪伪狂犬病病毒，置于4℃孵育1h后，弃去原培养液，用PBS溶液洗三遍并将残余液体吸尽，每孔加入1mL含2％胎牛血清的DMEM并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，37℃孵育1h后，细胞先用柠檬酸洗三遍，再用PBS洗三遍并吸尽残液，每孔换成2mL含有2％胎牛血清的DMEM营养液维持，置37℃，5％CO2培养箱中培养，感染24h，细胞用PBS溶液洗三遍，加入4％多聚甲醛在37℃固定10min，然后用0.1％Triton X-100在37℃孵育10分钟，再加入5％BSA在4°封闭过夜。封闭后加入阳性PRV血清(血清：PBS＝1：200)在37℃孵育1h，再与FITC标记山羊抗猪IgG抗体(1：200)37°中孵育30分钟，DAPI染色7分钟后观察。发现车前草多糖抑制猪伪狂犬病病毒的入胞(图5C)。
实施例7
车前草多糖对不同感染复数的猪伪狂犬病病毒感染的影响(Western blot)
PK-15细胞经0.25％胰酶消化后，用含5％胎牛血清的DMEM营养液稀释，滴加到6孔板以5×105/孔的浓度为宜，置于37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁成单层后(约17-18h)，弃去原培养液，用PBS溶液将细胞洗三遍，吸尽残留液体后，每孔各加入用1mL无血清的DMEM并感染不同感染复数的猪伪狂犬病病毒(0.1MOI,0.5MOI,1MOI,2MOI)并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，置于37℃，5％CO2接毒培养箱中孵育1h后，弃去液体，细胞用PBS洗三遍并将残余液体吸尽，每孔加入2mL含2％胎牛血清的DMEM并有相应浓度的车前草多糖(100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、600μg/mL)存在，在感染后24h收取细胞样品，然后进行Western blot检测。结果如图6所示，发现车前草多糖对不同感染复数的猪伪狂犬病病毒感染均有较好的抑制作用。
实例8
车前草多糖对猪伪狂犬病病毒直接杀灭作用(TCID50实验)
将PBS或车前草多糖溶液(600μg/mL)与猪伪狂犬病病毒在37℃孵育1小时，然后用无血清的DMEM稀释上述孵育的病毒，每个稀释梯度作8个重复接种于提前铺好的Vero细胞，置于37℃，5％CO2的培养箱中。感染1.5小时后，用PBS将细胞洗3遍，换成含2％胎牛血清的DMEM维持。感染72小时观察细胞病变，用Reed–Muench两氏法计算TCID50。结果如图7，车前草多糖处理后的病毒的毒价没有降低，说明车前草多糖不能直接杀灭猪伪狂犬病病毒。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.车前草多糖在制备抗猪伪狂犬病病毒感染制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗猪伪狂犬病病毒感染制剂为抑制猪伪狂犬病病毒吸附和/或抑制猪伪狂犬病病毒入胞的制剂。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为药物制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物制剂的剂型包括粉雾剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述制剂为消毒剂。
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