CN113350243B - 一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用。本发明包括：一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用，作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖的应用、抑制黑色素合成的应用，以及血人参提取物从血人参中分离纯化方法。本发明提出的血人参提取物分离提纯的方法，能够将血人参总黄酮的纯度提高至46％以上。本发明提出的血人参提取物能够作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖、抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的应用，具有很好的美白祛斑的作用。

Description

一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用
技术领域
本发明涉及应用血人参技术领域，特别是一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用。
背景技术
血人参，中药名。为豆科木蓝属植物茸毛木蓝(Indigofera stachyoides Lindl.)的干燥根。具有清热解表，化痰，利湿，活血止痛之功效。
血人参的黄酮类成分主要有表儿茶素、儿茶素、原儿茶醛、原儿茶酸、没食子酸等成分。在血人参的总黄酮提取工艺研究中发现其总黄酮在生药中的含量较低，其纯度只有4.33％，不利于活性成分的药效发挥。且目前对于血人参的应用，仅停留在传统功效上，未见对其开发出其他应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用。本发明提出的血人参提取物分离提纯的方法，能够将血人参提取物中总黄酮的纯度提高至46％以上。本发明提出了血人参提取物能够作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖、抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的应用，应用效果通过试验验证，所以血人参提取物能够很好的美白祛斑的作用。
本发明的技术方案：
一种血人参提取物在制备美白祛斑制剂方面的应用。
一种血人参提取物作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性的应用。
一种血人参提取物作为抑制剂抑制黑色素瘤细胞的增殖的应用。
一种血人参提取物作为抑制剂抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的应用。
前述的应用中，所述的血人参提取物从血人参中分离纯化得到。
前述的应用中，所述的血人参提取物从血人参中分离纯化的过程包括如下步骤：
(1)取血人参粉，用50-70％乙醇提取3次，每次1.5-2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40-50℃减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8-1.5倍水稀释后，取0.8-1.2倍体积的石油醚萃取1-2次，弃去石油醚层，水层继续加0.8-1.2倍体积的乙酸乙酯萃取5-7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡22-26h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2-5％盐酸溶液和2-5％NaOH溶液浸泡2.5-3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5-5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8-12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5-4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65-75mL4.7BV，以0.8-1.2mL/min的体积流量上样，待吸附2.5-3.5h后，纯水除杂，用110-130mL8BV的65-75％乙醇以2.5-3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
前述的应用中，所述过程包括如下步骤：
(1)称取5kg血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到5L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
一种美白祛斑的制剂，该制剂成分中包括血人参提取物或血人参。
前述的美白祛斑的制剂中，所述血人参提取物按照上述的步骤制备。
前述的美白祛斑的制剂中，所述血人参作为原料制备血人参粉，再按照上述的步骤制备血人参提取物。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提出了AB-8型大孔吸附树脂为纯化血人参提取物的最佳大孔吸附树脂型号。最佳纯化条件为：上样体积为70mL(4.7BV)，上样浓度为5.38mg/mL，上样液流量体积为1mL/min，洗脱剂体积流量为3mL/min，洗脱剂为70％乙醇，洗脱剂体积为120mL(8BV)。在现有技术所得到的血人参提取物纯度只有4.33％的基础上，本发明能够将血人参提取物纯度从29.20％上升至46.01％。纯度更高的血人参提取物的效果更好。
2、本发明中，血人参提取物对酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性均有抑制作用，能有效抑制酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性，且抑制率随着总黄酮质量浓度的增大而升高，IC50分别为88.78mg/L和34.46mg/L。通过对酪氨酸酶抑制动力学参数分析结果显示，由米氏方程可知Vmax随血人参提取物质量浓度的增大而减小，Km值随血人参提取物质量浓度的增大保持不变，因此可判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型为可逆非竞争性抑制，其抑制常数Ki为15.25mg/L。所以，血人参提取物对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制类型为可逆的非竞争性抑制，本发明为血人参作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用提供了一定的理论依据。
3、本发明中，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑素合成均具有一定的抑制作用。细胞形态学结果显示，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显，当细胞达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素合成的抑制作用均呈浓度和时间依赖关系。说明血人参提取物能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性以及黑色素合成。
综上所述：本发明提出了可在美白祛斑方面应用的血人参提取物分离提纯的方法，能够将血人参提取物中总黄酮的纯度提高至46％以上。本发明基于大量研究，发现了血人参提取物能够作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖、抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成，所以血人参提取物具有很好的美白祛斑的作用。
附图说明
图1是紫外全波长扫描图；
图2是表儿茶素对照品标准曲线图；
图3是静态吸附曲线图；
图4是静态解析曲线图；
图5是泄露曲线图；
图6是不同浓度对血人参提取物吸附率的影响图；
图7是不同上样体积流量对血人参提取物吸附率的影响图；
图8是不同洗脱体积流量对总黄酮解析率的影响图；
图9是洗脱剂不同体积分数对总黄酮解析率的影响图；
图10是洗脱溶剂体积的考察图；
图11是血人参提取物对单酚酶的作用进程曲线图；
图12是血人参提取物对酪氨酸单酚酶的抑制作用图；
图13是血人参提取物对酪氨酸二酚酶的作用进程曲线图；
图14是血人参提取物对酪氨酸二酚酶的抑制作用图；
图15是不同质量浓度血人参提取物下酪氨酸酶浓度与酶活力的关系图；
图16是血人参提取物对酪氨酸酶催化氧化L-DOPA抑制作用的Lineweaver-Burk图；
图17是不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶的Dixon曲线图；
图18是血人参提取物提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态观察图一；
图19是血人参提取物提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态观察图二；
图20是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响图；
图21是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响图；
图22是血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内黑色素形成抑制率的影响图。
附图说明：图18-图19中，A：对照组；B：2.5μg/mL总黄酮组；C：5μg/mL总黄酮组；D：10μg/mL总黄酮组；E：15μg/mL总黄酮组；F：20μg/mL总黄酮组；G：30μg/mL总黄酮组；H：40μg/mL总黄酮组；I：50μg/mL总黄酮组；图1中，A为对照品，B为样品。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1，一种血人参提取物。
血人参提取物从从血人参中分离纯化得到，过程如下：
(1)取4kg血人参粉，用50％乙醇提取3次，每次1.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40℃减压回收乙醇至无醇味，得到4L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加0.8倍水稀释后，取0.8倍体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加0.8倍体积的乙酸乙酯萃取5次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2％盐酸溶液和2％NaOH溶液浸泡2.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取8g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液65mL4.7BV，以0.8mL/min的体积流量上样，待吸附2.5h后，纯水除杂，用110mL8BV的65％乙醇以2.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的血人参提取物。
通过本方法得到的血人参提取物的用途是：用于制备美白祛斑制剂；具有抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖及抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的功效。
实施例2。一种血人参提取物。
血人参提取物从从血人参中分离纯化得到，过程如下：
(1)取6kg血人参粉，用70％乙醇提取3次，每次2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中50℃减压回收乙醇至无醇味，得到6L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1.5倍水稀释后，取1.2倍体积的石油醚萃取2次，弃去石油醚层，水层继续加1.2倍体积的乙酸乙酯萃取7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：取12g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4.5的步骤(4)得到的血人参提取物溶液75mL4.7BV，以1.2mL/min的体积流量上样，待吸附3.5h后，纯水除杂，用130mL8BV的75％乙醇以3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
通过本方法得到的血人参提取物的用途是：用于制备美白祛斑制剂；具有抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖及抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的功效。
实施例3。一种血人参提取物。
血人参提取物从从血人参中分离纯化得到，过程如下：
(1)称取5kg血人参粉，用60％乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到5L浓缩液；
(2)将步骤(1)得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
(3)大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95％乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用3.5％盐酸溶液和3.5％NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
(4)上样液溶液的制备：取步骤(2)得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
(5)纯化：精密称取10.0g步骤(3)得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤(4)得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70％乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
通过本方法得到的血人参提取物的用途是：用于制备美白祛斑制剂；具有抑制酪氨酸酶活性、抑制黑色素瘤细胞的增殖及抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素合成的功效。
研究本发明方案的过程中，发明做了大量实验，部分实验记录如下：
实验例1。大孔吸附树脂分离纯化血人参提取物工艺研究
1背景
血人参的黄酮类成分主要有表儿茶素、儿茶素、原儿茶醛、原儿茶酸、没食子酸等成分。在血人参的总黄酮提取工艺研究中发现其总黄酮在生药中的含量较低，其纯度只有4.33％，不利于活性成分的药效发挥。前期研究中发现血人参黄酮类成分主要集中在乙酸乙酯部位，将血人参提取物初步用乙酸乙酯纯化后，总黄酮纯度也只能达到29.20％。为提高血人参提取物中总黄酮的纯度，本实验以血人参乙酸乙酯部位提取物作为研究对象，利用大孔吸附树脂对其进行纯化处理，优化血人参总黄酮的纯化工艺，为血人参的进一步开发应用提供实验依据。
2方法
2.1溶液的配制
2.1.1标准溶液的配制
精密称取表儿茶素对照品适量，加入适量60％乙醇溶液超声溶解，冷却后定容至刻度线，配置成质量浓度为0.20mg/mL的表儿茶素对照品溶液。
2.1.2血人参上柱前样品溶液的制备
称取5.0kg血人参药材粗粉，用30倍60％乙醇回流提取三次，每次2h，合并提取液进行抽滤。将得到的滤液于45℃下减压回收乙醇，至药液无醇味，最终体积为5L。将浓缩液加一倍蒸馏水稀释后，取相同体积的石油醚萃取一次，再取相同体积的乙酸乙酯溶液萃取5-7次，回收乙酸乙酯，得到稠浸膏，于真空干燥箱中45℃下干燥成浸膏粉，总质量为228.05g。称取适量血人参乙酸乙酯部位浸膏粉，加水超声溶解，根据实验配制成所需浓度。
2.2测定波长的选择
精密吸取适量表儿茶素对照品溶液和供试品溶液，利用经典黄酮显色法(NaNO2-Al(NO3)3-NaOH)进行显色处理后，于400-700nm内进行扫描，测定最大吸收波长。
2.3方法学考察
2.3.1标准曲线的绘制
分别精密量取表儿茶素对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL置于10mL容量瓶中，各加60％乙醇补至5mL；精密加入5％亚硝酸钠溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入10％硝酸铝溶液0.3mL，摇匀，静置6min；加入4％氢氧化钠溶液4mL，加60％乙醇定容至刻度，摇匀，静置15min，得系列质量浓度的对照品溶液，采用紫外分光光度法于503nm波长处测定表儿茶素吸光度，以对照品系列质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线。
2.3.2精密度考察
精密量取表儿茶素对照品溶液0.4mL于10mL容量瓶中，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下连续测定6次，记录吸光度值，计算RSD值。
2.3.3稳定性考察
精密量取适量样品溶液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长进行测定，每分钟测定一次，连续测定15min，记录吸光度值，计算RSD值。
2.3.4重复性考察
精密称取10mg血人参乙酸乙酯部位浸膏粉6份于10mL容量瓶中，加蒸馏水超声溶解，分别取0.2mL于10mL容量瓶中，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，记录吸光度值A，计算RSD值。
2.3.5加样回收率考察
精密称取9份约10mg的血人参乙酸乙酯部位浸膏粉9份分别于25mL容量瓶中，分别在1-3号中加入1.5mg表儿茶素对照品，在4-6号中加入3mg表儿茶素对照品，在7-9号加入4.5mg表儿茶素对照品，分别加蒸馏水溶解后，取0.2mL按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算回收率。
2.4静态吸附-解析试验
2.4.1大孔吸附树脂的预处理
先用95％乙醇浸泡大孔吸附树脂24h，使其充分溶胀，过滤后反复用纯水清洗至无白色浑浊、无乙醇味后分别用5％盐酸溶液和5％NaOH溶液浸泡3h，用纯水反复冲洗至中性，最后用纯水保鲜，密封储存备用。
2.4.2大孔吸附树脂型号的筛选
2.4.2.1不同型号大孔吸附树脂对血人参提取物吸附性能的考察
分别称取2.0g预处理好的AB-8、D-101、HPD-100、HP-20、D-301、H-103大孔吸附树脂至100mL具塞锥形瓶中，分别加入50mL上样溶液(1.78mg/mL)，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)，过滤，得到吸附液，取样按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算其吸附量和吸附率。
静态吸附量(mg/g)＝(C0-C1)×V1/W
吸附率(％)＝(C0-C1)/C0×100％
注：C0为初始溶度(mg/mL)；C1为平衡液浓度(mg/mL)；V1为样品液体积(mL)；W为树脂重量(g)
2.4.2.2不同型号大孔吸附树脂对血人参提取物解析性能的考察
将上述各锥形瓶中吸附饱和的大孔吸附树脂用适量纯水冲去树脂表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)使充分解吸附后取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，并计算解吸后总黄酮的含量及解析率。
解吸量(mg/g)＝C2×V2/W
解吸率(％)＝C2×V2/(C0-C1)×V1×100％
注：C2为解吸液质量浓度(mg/mL)；V2为解吸液体积；W为树脂重量(g)；V1为溶液体积(mL)
2.4.3静态吸附动力学曲线
精密称取预处理过的理想树脂2.0g于100mL具塞锥形瓶中，加入50mL样品溶液，室温下于恒温振荡水槽中振摇12h(25℃，100rpm/min)，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h时取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，绘制浓度与时间的静态吸附动力学曲线。
2.4.4静态解析动力学曲线
将上述吸附饱和的大孔吸附树脂用适量纯水冲去树脂表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于摇床中振摇12h(25℃，100rpm/min)，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12h时取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，建立浓度与时间的静态解吸动力学曲线。
2.4.5上样液pH值对吸附率和解析率的影响
分别称取2.0g预处理好的理想大孔吸附树脂至100mL具塞锥形瓶中，分别加入采用1mol/L的HCl溶液和1mol/L的NaOH溶液调节pH值分别为2、3、4、5、6、7、8的样品溶液50mL，室温下于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)，过滤，得到吸附液，取样按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算其吸附量和吸附率。将上述各瓶中吸附饱和的树脂用适量纯水冲去表面的溶液和杂质，精密加入50mL的50％乙醇解吸附，室温下置于恒温振荡水槽中振摇24h(25℃，100rpm/min)使充分解吸附后取样，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，并计算解吸后总黄酮的含量及解析率，根据吸附率和解析率计算总黄酮回收率。
2.5动态吸附-解析试验
2.5.1泄露曲线的绘制
取3份预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g，精密称定，以湿法装柱缓慢装入层析柱中(15mm×300mm)，分别取250mL总黄酮浓度分别为1.73mg/mL、3.50mg/mL和5.38mg/mL的样品溶液，室温下pH值调为4，以1.0mL/min的体积流量加入树脂柱中，分段收集流出液，流出液每10mL收集1份，取每份流出液按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算总黄酮含量，并分别绘制泄露曲线，确定最佳上样体积。
2.5.2上样液浓度的考察
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取浓度分别为1.96、5.38、9.45、12.83、14.31mg/mL的上样液70mL，调pH值为4，以1.0mL/min的流速上样，分别收集滤液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算各质量浓度下的吸附率，确定上样液质量浓度。
2.5.3上样体积流量对动态吸附性能的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，调至pH值为4，分别以1.0、2.0、3.0、4.0mL/min的体积流量上样，分别收集滤液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算各体积流量下的吸附率，确定上样体积流量。
2.5.4洗脱体积流量对洗脱效果的影响
取预处理好的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，将pH值调至4，以1.0mL/min的流速上样，特吸附饱和后，用70％乙醇50mL分别以1.0、2.0、3.0、4.0mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算洗脱率，确定最佳洗脱体积流量。
2.5.5洗脱溶剂对AB-8大孔树脂洗脱血人参提取物效果的影响
精密称取10份预处理的AB-8型大孔吸附树脂10.0g湿法装柱(15mm×300mm)，取上样液70mL，将pH值调至4，以1.0mL/min的流速上样，特吸附饱和后，依次用超纯水及10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇溶液各120mL洗脱，分别收集洗脱液，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，确定最佳洗脱溶剂。
2.5.6洗脱溶剂用量对洗脱效果的影响
取预处理后的AB-8型大孔吸附树脂10.0g，按上述方法上样除杂，再用70％乙醇溶液(200mL)以3mL/min体积流量梯度洗脱，分别收集洗脱液，每10mL一份，按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下进行测定，计算每份洗脱液中的总黄酮含量，绘制洗脱曲线，确定最佳洗脱剂体积。
3结果
3.1测定波长的选择
如图1所示，对照品和样品均在503nm处有最大吸收，因此确定503nm为最大吸收波长。
3.2方法学考察结果
3.2.1标准曲线的绘制
以对照品系列质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，得线性回归方程：Y＝39.754X+0.0361，相关系数r＝1，说明表儿茶素对照品在4.00-24.00mg/L内线性关系良好，如图2所示。
3.2.2精密度试验
精密度试验结果如表3.1所示，计算得RSD为0.31％，说明仪器精密度良好。
表3.1精密度试验结果
Figure BDA0003148469050000121
3.2.3稳定性试验
稳定性结果如表3.2所示，计算得RSD为1.39％，说明样品溶液在15min内稳定性良好。
表3.2稳定性结果
时间(min) 吸光度 时间(min) 吸光度
0 0.7847 8 0.7685
1 0.7840 9 0.7669
2 0.7845 10 0.7658
3 0.7826 11 0.7618
4 0.7807 12 0.7604
5 0.7735 13 0.7563
6 0.7719 14 0.7570
7 0.7698 15 0.7540
3.2.4重复性试验
6批样品重复性试验结果如表3.3所示，计算得RSD为0.91％，说明该方法重复性良好。
表3.3重复性试验结果
Figure BDA0003148469050000131
3.2.5加样回收率试验
加样回收试验结果如表3.4所示，平均回收率为98.68％，处于95-105％之间，RSD为2.04％，说明本方法的回收率良好。
表3.4加样回收试验结果
Figure BDA0003148469050000132
Figure BDA0003148469050000141
3.3静态吸附-解析试验结果
3.3.1大孔吸附树脂型号的筛选结果
大孔吸附树脂的理化性质能显著影响目标成分的吸附、分离纯化效果，其主要是与其孔径和比表面积等因素有关，其中其孔径大小影响被吸附物质的扩散，比表面积大小影响吸附物质的量。本实验选择了6种不同型号的大孔吸附树脂通过静态吸附和静态解析试验进行比较，由表3.5可见，其吸附率由大到小分别是H-103＞AB-8＞D-101＞HPD-100＞HP-20＞D-301，解析率由大到小分别是HPD-100＞AB-8＞D-101＞HP-20＞H-103＞D-301，虽然H-103的吸附率比AB-8大，但解析率较其小，因此综合总黄酮回收率和成本问题，选择AB-8作为纯化血人参提取物的最佳树脂型号。
表3.5不同类型大孔吸附树脂对血人参提取物的吸附率、解析率、总回收率
Figure BDA0003148469050000142
3.3.2静态吸附曲线的绘制
由图3可见，在0-6h以内，血人参提取物的吸附率明显增加，随着吸附时间的增加，6h后其吸附率增长缓慢，趋于平衡。因此，AB-8大孔吸附树脂在6h时对血人参提取物的吸附基本达到饱和。
3.3.3静态解析曲线的绘制
由图4可见，AB-8大孔吸附树脂对血人参提取物的静态解析在1h时其解析率已达到83.20％，在3h内洗脱量较大，3h后其洗脱量增加缓慢，快速达到平衡，因此，血人参提取物的静态解析为快速平衡型。
3.3.4上样液pH值的确定
通过比较样品溶液不同pH值对总黄酮的吸附率和解析率的影响，结果见表3.6，随着pH值得增大，其吸附率越来越小，pH值为2时最大，但当pH为2时其解析率最低，pH为4时其解析率最高，因此综合考虑总黄酮回收率，选择pH 4作为最佳上样液pH。
表3.6不同pH值下对血人参提取物的吸附率、解析率、总黄酮回收率
编号 吸附率(％) 解析率(％) 总黄酮回收率(％)
pH2 92.53 74.71 69.13
pH3 88.50 88.44 78.27
pH4 88.51 90.25 79.88
pH5 87.93 89.89 79.04
pH6 86.78 87.37 75.82
pH7 85.06 88.30 75.11
pH8 79.31 76.14 60.39
3.4动态吸附-解析试验结果
3.4.1泄露曲线的绘制
当流出液中总黄酮质量浓度达到上样液中总黄酮质量浓度的十分之一时，到达泄漏点，认为此时为最佳上样体积。本实验考察了3个不同浓度样品溶液的泄露曲线，如图5所示，当浓度为1.73mg/mL时，在第16份流出液开始泄露，上样体积为160mL(10.7BV)；当浓度为3.50mg/mL时，在第11份流出液开始泄露，上样体积为110mL(7.3BV)；当浓度为5.38mg/mL时，在第7份流出液开始泄露。为考虑上样量和上样时间，选择上样液浓度为5.38mg/mL，上样体积为70mL(4.6BV)。
3.4.2上样液浓度的确定
如图6所示，当上样液浓度分别为1.96、5.38、9.45、12.83、14.31mg/mL时，其吸附率分别为99.97％、97.86％、94.04％、80.93％和78.61％，随着上样溶液浓度的增大吸附率减小，当浓度为1.96mg/mL时，吸附率接近100％，但浓度太低会加大上样量，会延长生产周期，而浓度太大，吸附率会降低，会导致样品和溶剂的浪费。浓度为5.38mg/mL时，吸附率为97.86％，较为理想，因此选择上样液浓度为5.38mg/mL。
3.4.3上样液体积流量的确定
如图7所示，随着上样体积流量的增加，其吸附率下降，体积流量在1-3mL/min时，下降得比较明显，在3-4mL/min下降趋于平缓。体积流量为1mL/min时，吸附率最高，为97.86％，因此确定最佳上样体积流量为1mL/min。
3.4.4洗脱溶剂体积流量的确定
如图8所示，洗脱溶剂在1-3mL/min时，随着体积流量的增大解析率增大，当体积流量为4mL/min时，解析率下降，3mL/min时的洗脱率为88.60％，因此选择3mL/min作为最佳洗脱溶剂体积流量。
3.4.5洗脱溶剂的确定
通过对水和不同浓度乙醇洗脱剂的考察，如图9所示，结果表明水、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、95％乙醇对血人参提取物的洗脱率分别为5.85％、21.87％、40.05％、40.25％、56.08％、90.03％、93.65％、94.22％、92.23％和90.74％。由此可见，70％乙醇对总黄酮的洗脱率最大，故选70％作为最佳洗脱溶剂
3.4.6洗脱剂洗脱体积曲线的绘制
如图10所示，血人参提取物的洗脱曲线峰型比较好，在第1份流出液中就有少量黄酮洗脱出来，第2份洗脱液的黄酮含量最高，当到达第12份时血人参提取物基本为洗脱完全，因此确定血人参提取物洗脱溶剂的用量为120mL(8BV)。
3.5验证性试验
分别称取3份10.0g预处理过得AB-8型大孔树脂，湿法上柱，取3份70mL样品溶液，调pH为4，以1mL/min的体积流量上样，收集流出液，待吸附3h后，用纯水除杂，再用70％乙醇120mL(8BV)以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液，取洗脱液按“2.3.1项下方法”进行显色处理，在503nm波长下测定吸光度，计算洗脱液中总黄酮含量，其余洗脱液于真空干燥箱中干燥成粉末。结果显示，其平均吸附率为97.48％(RSD％为0.32％)，平均解析率为91.97％(RSD％为2.77％)，纯度为46.01％(RSD％为2.23)。
表3.7验证性试验结果
编号 1 2 3 平均值 RSD(％)
总黄酮纯度(％) 44.83 46.52 46.68 46.01 2.23
4结论与讨论
血人参是贵州省少数民族常用药，广泛分布在贵阳、安顺、黔东南、黔西南等地。目前对血人参的研究主要是药理作用和化学成分的研究，对血人参提取物的纯化分离尚未见报道。在血人参提取物的提取工艺研究报道中发现总黄酮的含量较低，不利于活性成分药效的发挥。前期研究中发现血人参黄酮类成分主要集中在乙酸乙酯部位，因此采用乙酸乙酯对提取液进行初步纯化。为了更深入研究，在前期试验的基础上，采用大孔吸附树脂分离纯化技术对血人参提取物进行分离纯化。
大孔吸附树脂是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子材料，是分离纯化黄酮类化合物的常用介质。不同型号的大孔吸附树脂由于其本身极性、比表面积、孔径等不同而使自身对于同一物质的吸附能力和解吸能力有所不同，从而产生不同的吸附效果。本实验综合吸附能力和解吸能力，对6种不同型号的大孔吸附树脂进行考察，确定AB-8型大孔吸附树脂为纯化血人参提取物的最佳大孔吸附树脂型号。最佳纯化条件为：上样体积为70mL(4.7BV)，上样浓度为5.38mg/mL，上样液流量体积为1mL/min，洗脱剂体积流量为3mL/min，洗脱剂为70％乙醇，洗脱剂体积为120mL(8BV)。通过验证性试验，结果显示血人参提取物中总黄酮的纯度从29.20％上升至46.01％。虽然纯化后的总黄酮纯度有所提高，但仍未达到50％，尝试了不同除杂方式以及聚酰胺纯化后其总黄酮纯度均未得到提高。
综上所述，通过大孔吸附树脂静态、动态吸附-解吸试验优化的血人参提取物纯化工艺稳定，可靠，可有效提高总黄酮的纯度，为血人参的开发利用提供了一定的参考。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
试验例2。血人参提取物对酪氨酸酶的抑制作用研究
1背景
酪氨酸酶，又称多酚氧化酶，是一种结构复杂的含铜金属酶，广泛存在人体、动植物以及微生物中。酪氨酸酶在黑色素形成过程中起关键作用，它能够催化L-酪氨酸羟基化成L-DOPA，并将L-DOPA氧化成多巴醌，再经过一系列复杂反应形成黑色素。酪氨酸酶的异常过量表达，会引起雀斑、黄褐斑、老年斑等皮肤色素沉着类疾病，因此通过抑制酪氨酸酶的活性可以减少黑色素的合成，从而达到美白祛斑的作用。黄酮类化合物除具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗癌等众多生理和药理活性，同时其还具有安全、高效的酪氨酸酶活性抑制能力。近年来，酪氨酸酶抑制剂作为美白祛斑剂在化妆品市场中得到广泛的应用，但一些传统的酪氨酸酶抑制剂会出现过敏性、不良反应等问题，使得探寻更加天然、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂在美白祛斑化妆品中的开发具有很好的研究前景。本研究以血人参提取物为原料，研究其对酪氨酸单酚酶和二酚酶活性的抑制作用、对酪氨酸酶的抑制动力学以及抑制机理，为其在化妆品中的开发和应用提供参考。
2方法
2.1试剂的配制
2.1.150mmol/L PBS缓冲液(pH 6.8)的配制
精密称取NaH2PO4 7.80 g，用去离子水溶解后定容至1000mL作为母液1备用；精密称取Na2HPO417.90 g，用去离子水溶解后定容至1000mL作为母液2备用。需用时分别量取51mL母液1和49mL母液2混匀，得到浓度为50mmol/L pH 6.8的PBS缓冲溶液。
2.1.2L-酪氨酸溶液的配制
精密称取L-酪氨酸45.30mg，加pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，定容至50mL，得到浓度为5mmol/L的L-酪氨酸溶液，4℃避光保存备用。
2.1.3L-多巴溶液的配制
精密称取L-多巴(L-DOPA)49.33mg，置于50mL容量瓶中，加pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，并定容至刻度，得到浓度为5mmol/L的L-DOPA溶液，4℃条件下避光保存备用。
2.1.4酪氨酸酶(TYR)溶液的配制
精密称取酪氨酸酶1.0mg于10mL容量瓶中，用pH 6.8PBS缓冲溶液(50mmol/L)溶解，并定容至刻度，得到0.1mg/mL的酪氨酸酶溶液，4℃避光保存。
2.1.5血人参提取物溶液的配制
精密称取血人参提取物适量，用去离子水超声溶解，配制成浓度为5.0mg/mL的样品溶液，再取不同体积样品溶液在容量瓶中，加去离子水分别稀释得到0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0mg/mL的样品溶液，备用。
2.2不同浓度血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制作用
参考刘衬等的方法并稍加调整，以L-酪氨酸(5mmol/L)为底物，分别测定不同质量浓度血人参提取物(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67、100.00、133.33和166.67mg/L)对酪氨酸单酚酶活性的影响，按表2.1分别吸取50mmol/L的pH 6.8PBS溶液、10μL不同浓度样品溶液或去离子水、40μL酪氨酸酶溶液于96孔酶标板中，置于酶标仪中30℃中孵育振摇10min后，再加入100μL L-酪氨酸溶液(5mmol/L)，于475nm下测定其吸光度值(每分钟读取记录一次数据，连续测10min)。按公式(1)计算血人参提取物对酪氨酸酶的抑制率，以酶相对抑制率对样品浓度作图并计算IC50。
抑制率(％)＝[1-(A3-A4)/(A1-A2)]×100％  (1)
表2.1酪氨酸单酚酶酶活性测定的反应液的组成与用量
Figure BDA0003148469050000191
2.3不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶活性的抑制作用
参考刘衬等的方法并稍加调整，以L-DOPA(5mmol/L)为底物，分别测定不同浓度血人参提取物(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67、100.00、133.33和166.67mg/L)对酪氨酸二酚酶活性的影响，按表2.2分别吸取50mmol/L的pH 6.8PBS溶液、10μL不同浓度样品溶液或去离子水、20μL酪氨酸酶溶液于96孔酶标板中，置于酶标仪中30℃中孵育振摇10min后，再加入100μL L-DOPA溶液(5mmol/L)，于475nm下测定其吸光度值(每分钟读取记录一次数据，连续测10min)。按公式(1)计算血人参提取物对酪氨酸酶的抑制率，以酶相对抑制率对样品浓度作图并计算IC50。
表2.2酪氨酸二酚酶活性测定的反应液的组成与用量
Figure BDA0003148469050000192
Figure BDA0003148469050000201
2.4血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用机理
在实验中，改变酪氨酸酶浓度(终浓度分别为0、0.8、1.6、2.4、3.2mg/L)，固定底物L-DOPA的浓度为5mmol/L，测定不同浓度血人参提取物(0、16.67、33.33、50.00、66.67mg/L)对酪氨酸酶活力的影响，以酶质量浓度和相对酶活力作图，判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制作用是可逆抑制还是不可逆抑制，当得到的是一组通过原点的直线，则属于可逆抑制；如果得到的是一组平行的直线，则属于不可逆抑制。
2.5血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制动力学
在实验中，改变底物L-DOPA浓度(0.25、0.5、1、2、4mmol/L)，固定酪氨酸酶浓度为0.1mg/mL，加入不同质量浓度血人参提取物溶液(终浓度分别为0、16.67、33.33、50.00、66.67mg/L)，通过反应体系吸光度值随时间的变化，测定不同质量浓度血人参提取物对酪氨酸酶活力的影响。以Lineweaver-Burk双倒数作图法，以反应速率的倒数对底物L-DOPA浓度的倒数作图，判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型。在Lineweaver-Burk双倒数图中如果得到一组相交于Y轴的直线，则说明该反应的抑制类型为竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值保持不变，Km值增大；如果得到一组相交于X轴的直线，则属于非竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值保持不变；如果得到一组相交于第二象限的直线，则属于混合型抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值增大；如果得到一组平行的直线，则属于反竞争性抑制，动力学参数表现为Vmax值减小，Km值减小。使用Dixon作图法，以总黄酮浓度为横坐标，反应速率的倒数(1/V)为纵坐标进行二次作图，判断血人参提取物对酪氨酸二酚酶的抑制常数。
3结果
3.1不同浓度血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制作用结果
不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸单酚酶活力的作用进程曲线如图11，由图中可以看出，随着反应时间的增加，各反应体系的吸光度值随之升高，但在反应初期吸光度值上升较缓慢，存在一定的迟滞效应。在同一时间下随着血人参提取物质量浓度的增大，酶反应速率逐渐下降。说明血人参提取物能抑制酪氨酸单酚酶的酶促氧化反应。不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸单酚酶的相对抑制率如图12所示，血人参提取物对酪氨酸单酚酶有一定的抑制作用，其抑制作用跟血人参提取物的浓度呈正相关，即随着血人参提取物的质量浓度的增大，其对酪氨酸单酚酶活性的抑制率随之增大。当血人参提取物对酪氨酸单酚酶活性的抑制率达到50％时血人参提取物的浓度为88.78mg/L。
3.2不同浓度血人参提取物对酪氨酸二酚酶活性的抑制作用结果
不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸二酚酶的作用进程曲线如图13所示，随着时间的增加，各反应体系的吸光度值逐渐增大。同一时间下随着血人参提取物质量浓度的增大，反应体系的吸光度值减小即酶的反应速率减小。说明血人参提取物能抑制L-DOPA的酶促氧化。不同质量浓度的血人参提取物对酪氨酸二酚酶的相对抑制率如图14所示，结果表明，血人参提取物对酪氨酸二酚酶有一定的抑制作用，其抑制作用跟血人参提取物的浓度呈正相关，即随着血人参提取物的质量浓度的增大，其对酪氨酸二酚酶活性的抑制率随之增大。当血人参提取物对酪氨酸二酚酶酶活性的抑制率达到50％时血人参提取物的浓度为36.46mg/L，即IC50为36.46mg/L。
3.3血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制作用机理结果
不同质量浓度血人参提取物溶液下酪氨酸酶质量浓度与酶活力的关系如图15所示，酪氨酸酶质量浓度与酶活力作图后得到一组经过原点的直线，且直线斜率随着血人参提取物质量浓度的增大而逐渐减小，说明血人参提取物对酪氨酸酶的抑制属于可逆抑制，即血人参提取物是通过抑制酪氨酸酶活力而导致酶催化效率下降，而不是通过降低有效酶量所致。
3.4血人参提取物对酪氨酸酶活性的抑制动力学结果
通过改变底物L-DOPA的浓度研究不同质量浓度血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型，Lineweaver-Burk双倒数图如图16所示，得到一组相交于第二象限横坐标轴上的直线，根据此图可以得到米氏方程，通过米氏方程可以得到Km值和Vmax值，结果见表3.1。随着血人参提取物浓度的增大，Km值不变，Vmax值逐渐减小，即只影响了酶催化反应的最大速率，对米氏常数没有明显影响，符合非竞争性抑制的动力学参数。说明血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型是可逆非竞争性抑制，抑制剂不与底物抢占酶的活性中心，而是通过与活性中心以外的必需基团结合抑制酶的活性。
表3.1血人参提取物对酪氨酸酶的抑制动力学参数结果
总黄酮浓度(mg/L) 米氏方程 <![CDATA[K<sub>m</sub>(mmol/L)]]> <![CDATA[V<sub>max</sub>]]>
0 1/V＝4.3135X+6.0271 0.7157 0.2379
16.67 1/V＝8.3947X+11.5855 0.7246 0.1191
33.33 1/V＝13.4917X+19.0662 0.7076 0.0741
50.00 1/V＝17.9207X+25.0722 0.7148 0.0588
66.67 1/V＝22.2443X+30.9486 0.7187 0.0320
由Dixon曲线图(图17)所示，在不同浓度L-DOPA下，血人参提取物浓度对反应速率倒数(1/V)作图，得到一组相交于X轴的直线，交点横坐标的绝对值则为抑制常数Ki，其拟合方程抑制常数Ki如表3.2所示，Ki为15.25mg/L。
表3.2血人参提取物抑制酪氨酸酶作用的抑制常数
Figure BDA0003148469050000221
4结论与讨论
皮肤的颜色可由人体内4种发色团决定，即类胡萝卜素、血红蛋白、氧合血红蛋白和黑色素，其中黑色素是最主要的成分。黑色素的过量累积会导致许多皮肤病的出现，例如雀斑、老年斑、黄褐斑等，酪氨酸酶是黑素形成过程中主要的限速酶，酪氨酸酶抑制剂主要是通过抑制酪氨酸酶的活性从而影响黑色素生成，从而达到较好的美白祛斑效果。
实验结果表明，血人参提取物对酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性均有抑制作用，能有效抑制酪氨酸单酚酶和二酚酶的活性，且抑制率随着总黄酮质量浓度的增大而升高，IC50分别为88.78mg/L和34.46mg/L。通过对酪氨酸酶抑制动力学参数分析结果显示，由米氏方程可知Vmax随血人参提取物质量浓度的增大而减小，Km值随血人参提取物质量浓度的增大保持不变，因此可判断血人参提取物对酪氨酸酶的抑制类型为可逆非竞争性抑制，其抑制常数Ki为15.25mg/L。综上所述，血人参提取物对酪氨酸酶具有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性，抑制类型为可逆的非竞争性抑制，该研究为血人参作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用提供了一定的理论依据。
试验例3。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞黑色素合成的影响及其机制研究
1背景
皮肤的颜色主要取决于人体产生的黑色素，当黑色素表达过量，不能及时被代谢时，会使皮肤出现色斑、黄褐斑等色素沉着症状。因此，抑制或阻断黑色素的生成对皮肤美白至关重要。小鼠B16黑色素瘤细胞是一种用于筛选能够抑制黑色素合成的药物的肿瘤细胞，其黑色素合成功能与人正常黑素细胞基本一致，由于人体原代皮肤黑色素瘤细胞培养非常困难，该细胞株被广泛作为美白祛斑剂功效测定的受试细胞。以血人参提取物为效应物，B16黑色素瘤细胞为研究对象，研究血人参提取物对B16黑色素瘤细胞增殖活力、细胞内酪氨酸酶活性及黑色素合成的影响，以期为血人参提取物的美白祛斑作用提供一定的理论依据。
2方法
2.1溶剂的配制
2.1.1血人参提取物溶液的配制
精密称取血人参提取物，加RPMI-1640培养基超声溶解后，分别加培养基稀释得到浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的样品溶液。
2.1.2 MTT溶液的配制
精密称取MTT适量，用1×PBS溶液配制成5mg/mL的MTT溶液。
2.1.3 1％Triton X-100溶液的配制
精密称取Triton X-100适量，加1×PBS溶液(pH 7.4)配制成10％Triton X-100溶液，作为母液备用，需用时将母液用1×PBS溶液稀释成1％Triton X-100溶液。
2.2细胞的培养
在无菌条件下将小鼠B16黑色素瘤细胞接种于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，置于37℃，5％CO2培养箱中恒温培养，1-2天换液1次。
2.3血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，于培养箱中培养24h后弃去上清液，分别加入浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的血人参提取物溶液，空白对照组仅加相同体积的RPMI-1640培养液，每组设6个复孔，分别培养72h后，置于倒置显微镜下观察对照组和实验组的细胞大小、形态、生长密度、树突形态以及融合状态等，并拍照记录。
2.4血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为5×104个/mL，每孔100μL接种于96孔板中，于培养箱中培养24h后弃上清液，分别加入浓度为2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L的血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，每组设6个复孔，分别培养24h，48h，72h后，每孔加入20μL MTT溶液，于37℃，5％CO2细胞培养箱中恒温培养4h后弃上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡10min后，于酶标仪490nm处测定吸光度。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
2.5血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响
取对数生长期的小鼠B16黑色素瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，以每孔100μL细胞悬液的接种于96孔板中，置于培养箱中培养24h后弃去上清液，分别加入不同浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)的血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，每组设6个复孔。置于37℃，5％CO2恒温培养箱中分别培养24h、48h、72h后弃去培养液，用PBS溶液洗涤3次后，加入1％Triton X-100溶液100μL后置于-80℃冰冻30min，室温融化后置于37℃恒温预热，再加入1mg/mL的L-DOPA溶液100μL，于37℃恒温反应2h后，于酶标仪475nm处测定吸光度。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-(样品组吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
2.6血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成抑制率的影响
选择对数生长期小鼠黑色素瘤细胞用0.25％的胰蛋白酶溶液消化收集细胞，将细胞浓度调为1×105个/mL，接种于6孔细胞培养板中，每孔2mL，在37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h后弃去培养液，分别加入不同浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)血人参提取物溶液，空白对照组仅加等体积的RPMI-1640培养基，分别处理24、48、72h后用PBS溶液洗涤3次，消化收集细胞，将细胞悬液1200rpm/min离心10min后弃去上清液，加入1mL含10％DMSO的1mol/L NaOH溶液，在80℃下水浴1h使细胞裂解并溶解细胞内黑色素，分别取200μL上清液移到96孔细胞培养板，于酶标仪405nm处测定吸光度值。
计算公式为：抑制率(％)＝[1-样(品孔吸光度/空白对照组吸光度)]×100％
3结果
3.1血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞形态的影响结果
如图18-19可见，对照组细胞生长良好，形态正常。当加入不同质量浓度(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0、40.0和50.0mg/L)的血人参提取物溶液后，细胞形态和数量均出现不同程度的变化，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显；随着血人参提取物质量浓度的增大，细胞分布开始变稀疏，细胞树突减少或消失，不能相互融合形成网状结构；当血人参提取物浓度达到20mg/L时，细胞数量明显减少，细胞形态变化较明显；当血人参提取物浓度达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。由此可见，血人参提取物质量浓度在5mg/L以下时，细胞能正常生长。
3.2血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响结果
由表3.1和图20结果所示，用不同浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，跟对照组相比，血人参提取物对细胞的增殖具有抑制作用。分别对血人参提取物不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内对细胞增殖的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对B16黑色素瘤细胞的增殖具有较强的抑制能力，且随质量浓度的增大和时间的增加而升高。
表3.1血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖抑制率的影响
Figure BDA0003148469050000261
总黄酮浓度(mg/L) 24h 48h 72h
2.5 <![CDATA[3.20±1.26<sup>aA</sup>]]> <![CDATA[12.60±0.10<sup>aB</sup>]]> <![CDATA[20.94±0.51<sup>aC</sup>]]>
5 <![CDATA[5.59±0.76<sup>bA</sup>]]> <![CDATA[25.03±0.57<sup>bB</sup>]]> <![CDATA[43.04±0.37<sup>bC</sup>]]>
10 <![CDATA[17.62±0.18<sup>cA</sup>]]> <![CDATA[41.02±1.75<sup>cB</sup>]]> <![CDATA[58.82±1.12<sup>cC</sup><!-- 18 -->]]>
15 <![CDATA[30.65±0.46<sup>dA</sup>]]> <![CDATA[45.26±1.04<sup>dB</sup>]]> <![CDATA[70.80±0.16<sup>dC</sup>]]>
20 <![CDATA[40.41±0.53<sup>eA</sup>]]> <![CDATA[54.53±0.94<sup>eB</sup>]]> <![CDATA[73.09±1.35<sup>eC</sup>]]>
30 <![CDATA[46.53±0.90<sup>fA</sup>]]> <![CDATA[62.84±0.20<sup>fB</sup>]]> <![CDATA[75.29±1.44<sup>fC</sup>]]>
40 <![CDATA[50.09±0.78<sup>gA</sup>]]> <![CDATA[69.61±0.69<sup>gB</sup>]]> <![CDATA[77.08±0.77<sup>gC</sup>]]>
50 <![CDATA[56.63±1.01<sup>hA</sup>]]> <![CDATA[71.94±1.20<sup>hB</sup>]]> <![CDATA[78.13±1.11<sup>gC</sup>]]>
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)。
3.3血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响结果
如表3.2和图21所示，用不同质量浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，跟空白对照组相比，血人参提取物对细胞内的酪氨酸酶活性具有明显的抑制作用。分别对不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内的酪氨酸酶活性的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性具有较强的抑制能力，且随质量浓度的增大和时间的增加而升高。
表3.2血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性抑制率的影响
Figure BDA0003148469050000262
Figure BDA0003148469050000263
Figure BDA0003148469050000271
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)
3.4血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素合成抑制率的影响结果
由表3.3和图22可知，用不同质量浓度的血人参提取物作用于小鼠B16黑色素瘤细胞后，对B16黑色素瘤细胞内黑色素的形成有一定的抑制作用。分别对不同质量浓度同一时间下抑制率和同一质量浓度不同时间内的抑制率进行比较分析。结果显示，同一质量浓度不同时间内，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素形成的抑制率随时间的增加而增大；同一时间内不同质量浓度下，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素形成的抑制率随质量浓度的增大而增大。实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞内黑色素的形成具有较强的抑制能力，且与时间和浓度呈正相关。
表3.3血人参提取物对B16黑色素瘤细胞内黑色素形成抑制率的影响
Figure BDA0003148469050000272
总黄酮浓度 24h 48h 72h
2.5 <![CDATA[3.93±1.96<sup>aA</sup>]]> <![CDATA[8.74±1.37<sup>aB</sup>]]> <![CDATA[12.20±2.38<sup>aB</sup>]]>
5 <![CDATA[5.90±1.44<sup>aA</sup>]]> <![CDATA[13.11±0.62<sup>bB</sup>]]> <![CDATA[18.50±1.14<sup>bC</sup>]]>
10 <![CDATA[15.73±1.05<sup>bA</sup>]]> <![CDATA[21.43±1.13<sup>cB</sup>]]> <![CDATA[27.85±0.92<sup>cC</sup>]]>
15 21.10±0.47cA <![CDATA[28.65±1.93<sup>dB</sup>]]> <![CDATA[36.24±1.67<sup>dC</sup>]]>
20 <![CDATA[28.96±1.97<sup>dA</sup>]]> <![CDATA[37.33±0.50<sup>eB</sup>]]> <![CDATA[45.26±0.73<sup>eC</sup>]]>
30 <![CDATA[43.51±0.52<sup>eA</sup>]]> <![CDATA[49.77±0.88<sup>fB</sup>]]> <![CDATA[57.49±1.08<sup>fC</sup>]]>
40 <![CDATA[47.84±0.66<sup>fA</sup>]]> <![CDATA[57.26±0.94<sup>gB</sup>]]> <![CDATA[67.72±0.54<sup>gC</sup>]]>
50 <![CDATA[49.54±0.26<sup>fA</sup>]]> <![CDATA[62.13±0.19<sup>hB</sup>]]> <![CDATA[72.15±0.58<sup>hC</sup>]]>
注：a、b、c、d、e、f、g、h表示同一时间下不同样品浓度在之间的差异性，字母不同表示存在显著性差异；A、B、C表示同一样品浓度在不同时间下的差异性，字母不同表示存在显著性差异(P＜0.05)。
4结论与讨论
皮肤美白祛斑是现代人们关注的热点，对化妆品的要求也越来也高，追求更加天然、安全以及高效的化妆品成为目前的热潮。皮肤的颜色主要由皮肤色素(黑色素、胡萝卜素等)含量及分布决定，而黑色素是最主要的决定因素。因此抑制黑色素的形成是美白祛斑的主要途径之一。由于正常情况下体外培养的黑素细胞生产缓慢、增殖能力极为有限，容易被角质形成细胞和成纤维细胞污染，使得到的黑素细胞量少，限制了黑素细胞的临床应用。小鼠B16黑色素瘤细胞来源于高度转移能力的鼠类皮肤黑色素瘤，其基因组成与人表皮细胞有较高的相似性，且较人表皮黑素细胞更易培养，能够多次传代、生长快，是测试受试物对黑素细胞生物学功能影响的首选细胞模型。
实验结果表明，血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑素合成均具有一定的抑制作用。细胞形态学结果显示，当血人参提取物浓度小于5mg/L时，细胞形态和数量变化不明显，当细胞达到50mg/L时，细胞几乎全部死亡。血人参提取物对小鼠B16黑色素瘤细胞的增殖、细胞内酪氨酸酶活性以及黑色素合成的抑制作用均呈浓度和时间依赖关系。说明血人参提取物能够抑制黑色素瘤细胞的增殖、酪氨酸酶活性以及黑色素合成。

Claims (3)

1.一种美白祛斑的制剂，其特征在于：该制剂成分中包括血人参提取物；所述血人参提取物从血人参中分离纯化的过程包括如下步骤：
（1）取血人参粉，用50-70%乙醇提取3次，每次1.5-2.5h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中40-50℃减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
（2）将步骤（1）得到的浓缩液加0.8-1.5倍水稀释后，取0.8-1.2倍体积的石油醚萃取1-2次，弃去石油醚层，水层继续加0.8-1.2倍体积的乙酸乙酯萃取5-7次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
（3）大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95%乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用2-5%盐酸溶液和2-5%NaOH溶液浸泡2.5-3.5h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
（4）上样液溶液的制备：取步骤（2）得到的乙酸乙酯部位提取物，加蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5-5.5mg/mL的血人参提取物溶液；
（5）纯化：取8-12g步骤（3）得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，缓慢装入层析柱中，取调pH值为3.5-4.5的步骤（4）得到的血人参提取物溶液65-75mL4.7BV，以0.8-1.2mL/min的体积流量上样，待吸附2.5-3.5h后，纯水除杂，用110-130mL8BV的65-75%乙醇以2.5-3.5mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
2.如权利要求1所述的美白祛斑的制剂，其特征在于：所述血人参作为原料制备血人参粉，所述血人参提取物从血人参中分离纯化的过程包括如下步骤：
（1）称取血人参粉，用60%乙醇提取3次，每次2h，提取液过滤，将过滤液于旋转蒸发仪中45℃减压回收乙醇至无醇味，得到浓缩液；
（2）将步骤（1）得到的浓缩液加1倍水稀释后，取相同体积的石油醚萃取1次，弃去石油醚层，水层继续加相同体积的乙酸乙酯萃取6次，弃去水层，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩回收乙酸乙酯，于真空干燥箱中干燥，得到乙酸乙酯部位提取物；
（3）大孔吸附树脂的预处理：取AB-8型大孔吸附树脂，加2BV95%乙醇浸泡24h使其充分溶胀，过滤后反复用蒸馏水清洗至无白色浑浊、无乙醇味，然后分别用5%盐酸溶液和5%NaOH溶液浸泡3h，用蒸馏水反复冲洗至中性，最后用蒸馏水保鲜，密封储存，得到预处理的AB-8型大孔吸附树脂；
（4）上样液溶液的制备：取步骤（2）得到的乙酸乙酯部位提取物，加适量蒸馏水超声溶解，配制得到浓度为5.38mg/mL的血人参提取物溶液；
（5）纯化：精密称取10.0g步骤（3）得到的预处理的AB-8型大孔吸附树脂，湿法装柱，柱尺寸15mm×300mm，缓慢装入层析柱中，取调pH值为4的步骤（4）得到的血人参提取物溶液70mL4.7BV，以1mL/min的体积流量上样，待吸附3h后，纯水除杂，用120mL8BV的70%乙醇以3mL/min的体积流量进行洗脱，收集洗脱液浓度干燥，得分离纯化的成品。
3.如权利要求1所述的美白祛斑的制剂，其特征在于：所述血人参作为原料制备血人参粉，再按照权利要求1所述的步骤制备血人参提取物。
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