CN113340859A - 一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗体‑明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用，所述方法包括：将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS基团功能化明胶纳米颗粒；将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；将所述NHS功能化明胶纳米颗粒于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板；将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得的抗体‑明胶纳米颗粒修饰的芯片，可以捕获多个循环肿瘤细胞，并通过水凝胶的选择性光固化实现单个循环肿瘤细胞分离，避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性。

Description

一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择 性分离单个循环肿瘤细胞中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)由于携带肿瘤患者的基因，是人类外周血中肿瘤转移的种子，可通过血液循环引起肿瘤增殖。作为肿瘤标志物，CTC可为肿瘤的早期诊断、临床治疗和术后疗效评价提供必要的依据。因此，近年来开发了多种CTCs分离平台。目前分离CTC的主要原理是基于细胞的物理性质、免疫磁珠、微流控器件、功能性质等。但需要注意的是，上述方法不可避免地分离出非靶向细胞。根据调查,主要的释放方法是通过外部刺激将捕获的细胞作为一个整体释放,然而，这样子收集的细胞可能含有非靶向细胞,这将导致CTC后续的基因检测结果可能不单单是CTC的结果.这就可能会导致有一个不准确的结果分析。因此，迫切需要开发一种单细胞释放平台来保证下游分析的准确性。近年来，许多单CTC基因突变分析被报道。据报道，单个CTC的分离方法有很多种，例如:显微操作、流式细胞术、激光捕获显微解剖、介质电泳分离等。
然而，现有技术中的这些方法都受到时间成本、操作复杂和效率低的限制，因此它们在CTC中的应用仍然有限。例如，激光切割分离单个CTC时，往往会将CTC从整个基底中剥离出来，这可能会因为基底的切割而干扰进一步的分析。还有一些其他的释放方法，比如通过外部刺激反应选择性释放单一的CTC,然而，这些不可避免的需要清洗步骤，这将导致细胞丢失，同时可能收集了靶向细胞和非靶向细胞，导致基因测试不准确。目前很难在不损失的情况下收集单个的CTC。维持细胞的高活性对于后续的细胞分析是至关重要的，有效的单细胞恢复平台能够保持细胞活力，对单个CTC的遗传分析是必要的。
因此，如何开发一种从患者血液中捕获并分离出活性较高的单个CTCs且效率高准确性高的方法或者材料工具，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用，该抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片可以捕获多个循环肿瘤细胞，再结合光固化水凝胶，可以从患者血液中分离出活性较高的单个CTCs，同时避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，所述方法包括：
将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS功能化明胶纳米颗粒；
将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；
将所述NHS功能化明胶纳米颗粒置于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板；
将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
进一步地，所述EDC/NHS溶液为将(3.5～4.5)mg/mL EDC和(5.5～6.5)mg/mL NHS溶解在(0.05～0.15)M的MES溶液中配制而得。
进一步地，所述APTES无水乙醇中APTES的质量分数为4～6％；所述乙醇溶液的质量分数为70～90％。
进一步地，所述将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，包括：
将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板于链酶亲和素中浸泡，后PBS洗涤，再与生物素化抗Epcam抗体室温孵育，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
在本发明的第二方面，提供了一种采用所述方法制备得到的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
在本发明的第三方面，提供了所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片在在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用。
在本发明的第四方面，提供了一种选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，所述方法采用所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，包括：
将细胞悬液加入到所述抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片上进行孵育，获得捕获多个循环肿瘤细胞的芯片；
将含有LAP的CSMA溶液滴加到所述捕获多个循环肿瘤细胞的芯片上，后采用405nm激光照射，获得含有光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞的芯片；
采用MMP-9酶溶液溶解基底以去除其他细胞，后通过微操作取出并获得所述光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞。
进一步地，所述孵育时间为15～120min。
进一步地，所述含有LAP的CSMA溶液中CSMA的质量分数为4.5～5.5％，LAP的质量分数为0.1～0.9％。
进一步地，所述MMP-9酶溶液的浓度为0.05～0.5mg/mL。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片中Gnp-chip表面是纳米结构，可以实现更牢固更高效地捕获循环肿瘤细胞，捕获效率最高达到了90％以上；
2、本发明提供的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用中，高效高特异性识别捕获循环肿瘤细胞，可用体外对模拟血液样本和临床病人血液样本中微量CTCs进行特异性识别和捕获，从而有望在癌症转移的预警和预防领域发挥重要作用；
3、本发明的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片用于选择性分离单个循环肿瘤细胞时，可以从患者血液中捕获多个循环肿瘤细胞，并结合了光固化水凝胶分离出活性较高的单个CTC，同时避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性，具体地：
(1)抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片中的Gnp-chip捕获细胞后，通过三色荧光鉴定确认CTC细胞，然后在Gnp-chip表面覆盖含有LAP的CSMA溶液，通过光斑缩小的装置将405nm的激光聚集在选择的单个细胞上，可以实现CSMA溶液固化，从而将细胞封装起来，进而实现单个循环肿瘤细胞的封装；
(2)利用MMP-9酶溶液可以裂解Gnp-chip的Gnp,MMP-9通过溶解基底的方式释放捕获的细胞，释放效率可以达到90％以上；
(3)通过MMP-9去除了未固化的细胞，固化的细胞可以通过微操作将细胞收集进行基因检测。这样的操作可以保证进行基因检测的细胞的纯度，保证基因检测的准确性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为光固化水凝胶策略结合Gnp-chip用于选择性捕获多个循环肿瘤细胞和释放单个循环肿瘤细胞原理图；
图2为制备Gnps的TEM图像；
图3为明胶纳米颗粒的SEM图像；
图4为MCF-7细胞附着在平板玻璃和gnp-chip上的SEM图像；
图5为不同捕获时间的捕获效率研究；
图6为比较不同细胞系在对比例1、对比例2、对比例3和实施例1上的捕获效率；图中E1表示实施例1，C1表示对比例1；C2表示对比例2；C3表示对比例3；
图7为选择性的光固化水凝胶封装细胞；
图8为本发明实施例提供的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法的流程图；
图9为本发明实施例提供的一种选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法的流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本发明实施例提供一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，如图8所示，所述方法包括：
S101、将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS功能化明胶纳米颗粒；
该实施方式中，明胶纳米颗粒可采用现有技术中的去溶剂法、凝聚相分离法、反相微乳法、乳化溶剂蒸发法和纳米沉淀法制得；作为一种可选的实施方式，本发明实施例的明胶纳米颗粒的制备方法，具体包括：
先称取0.625g的GelMA，在50度的温度下，水浴将其溶于12.5mL的去离子水中，在加入12.5mL的丙酮，丙酮在2分钟内加完后，看到底部有黏状沉淀，去除瓶内溶剂，12.5mL的去离子水再次加入，在50度的水浴锅中，沉淀再次溶解，用注射泵注射丙酮溶液，注射速度是1mL/min，待溶液变成奶白色停止滴加丙酮。将上述溶液拿出水浴锅，500ul的戊二醛加入1mL的丙酮溶液，将此溶液通过注射泵滴加到奶白色溶液中，流速为50ul/min.待溶液变成黄色时停止滴加戊二醛溶液，过夜搅拌。1000rpm离心洗涤获得的明胶纳米颗粒(Gnps)。
该实施方式中MES溶液(0.04M，pH 5.9)：以配1升为例，称量9.76g MES、29.22gNaCl、5mL10％的Brij35，溶于1升蒸馏水，用3mol/L NaOH在pHS-3B酸度计上调节pH＝6.0±0.1。
作为一种可选的实施方式，所述EDC/NHS溶液为将(3.5～4.5)mg/mL EDC和(5.5～6.5)mg/mL NHS溶解在(0.05～0.15)M的MES溶液中配制而得。所述溶剂的浓度为NHS功能化的常规范围。
S102、将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；
该实施方式中APTES的分子式是H2NCH2CH2CH2Si(OC2H5)3，APTES易水解，放出乙醇，生成相应的硅醇缩合物。APTES分子中的C-NH2键内氨基可与酸、羧酸酯、醛、酮、卤代烃、酰胺和腈等进行反应。
作为一种可选的实施方式，所述APTES无水乙醇中APTES的质量分数为4～6％(优选为5％)；APTES的质量分数为较优选的胺化范围，使得后续胺化底物和NHS功能化明胶纳米颗粒能成功交联；所述乙醇溶液的质量分数为70～90％。
作为一种可选的实施方式，所述玻片的大小可以根据需要调整，在本发明实施例中，所述玻片的长度和宽度分别为：1cm×1cm；
S103、将所述NHS功能化明胶纳米颗粒置于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板，简称Gnp-chip；
S104、将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片；简称anti-Epcam修饰的Gnp-chip；
所述步骤S104，具体包括：
将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板于链酶亲和素中浸泡，后PBS洗涤，再与生物素化抗Epcam抗体室温孵育，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
作为本发明实施例的一种实施方式，所述链酶亲和素的浓度为40～60μg/mL(优选为50μg/mL)；所述浸泡的条件为：2～6℃下浸泡6～15h；生物素化抗Epcam抗体的浓度为10～30μg/mL(优选为20μg/mL)；该范围有利于后续捕获循环肿瘤细胞；
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了用所述方法制备得到的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用。用于从全血中分离CTC，可以从患者血液中捕获并分离出活性较高的单个CTCs，同时避免了邻近细胞的干扰，保证了基因检测的纯度和准确性。
根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，所述方法采用所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，如图9所示，包括：
S201、将细胞悬液加入到所述抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片上进行孵育，获得捕获多个循环肿瘤细胞的芯片；
作为一种可选的实施方式，所述孵育时间为15～120min。随着捕获时间的增加，捕获效率呈现出增加的趋势，但超过60min后，捕获效率基本没有增加。
所述细胞悬液为高表达Epcam的细胞系，在实际操作中应选取那些研究集中、术后转移和复发程度中高的癌细胞株，可采用但不局限于下列癌细胞株：乳腺癌细胞株、前列腺癌细胞株、结肠癌细胞株、肝癌细胞株。优先推荐选用乳腺癌细胞系(即MCF-7细胞)作为体外循环肿瘤细胞模型。因乳腺癌细胞系(即MCF-7细胞)的转移和复发程度适中，风险性较小；且生物标记物Epcam在该细胞表面稳定性高度表达，故选取乳腺癌细胞系(即MCF-7细胞)为体外CTCs模型，将会有助于本研究的顺利开展。
所述细胞悬液可以为含有循环肿瘤细胞的血液样本，本发明的含有循环肿瘤细胞的血液样本取自术后转移和复发程度高的晚期癌症病人，可选取并不局限于下列癌症病人：结肠癌病人、乳腺癌病人、肝癌病人、前列腺癌病人。
作为一种可选的实施方式，所述细胞悬液的滴加量范围为100uL内含有10000个细胞，在其他实施方式中也可采用其他的滴加量范围。
S202、将含有LAP的CSMA溶液滴加到所述捕获多个循环肿瘤细胞的芯片上，后采用405nm激光照射，获得含有光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞的芯片；
对临床病人血液样本中CTCs的捕获研究手段，可采用但不局限于本方法：也可以获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本，经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层后，将其滴加在抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片上共孵育开始捕获。
包含LAP的CSMA溶液覆盖anti-Epcam修饰的Gnp-chip后，会与gnp形成一种掺杂的光固化水凝胶，即字面意义上的混合水凝胶，这样MMP-9溶解基底时不会把固化的位置溶解掉。如果溶解掉固化位置的基底，纳米包封细胞的水凝胶就可能被洗涤步骤冲走。
所述步骤S202中激光照射中通过光斑缩小装置将激光光斑缩小至200um左右的大小，从而只固化光斑照射的位置。
优选地，使用步骤S202中通过获取肿瘤医院的癌症病人血液样本，对捕获到的细胞进行三荧光染色之后，分析其捕获情况。
LAP为细胞相容性生物墨水蓝光引发剂；CSMA为甲基丙烯酸酯化硫酸软骨素，为蓝光固化细胞相容性系列墨水；在gnp芯片上覆盖上一层CSMA水凝胶，该水凝胶含有光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。将405nm激发光投射到单个靶细胞上，LAP使Gnp和CSMA新形成的混合水凝胶在30s内迅速交联，形成光固化水凝胶包封所选的CTC。
抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片捕获细胞后，优选先通过三色荧光鉴定确认CTC细胞，后在抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片表面覆盖CSMA溶液，通过光斑缩小的装置将405纳米的激光聚集在选择的单个细胞上，可以实现CSMA溶液固化，从而将细胞封装起来，实现单个细胞的封装。
作为一种可选的实施方式，所述含有LAP的CSMA溶液中CSMA的质量分数为4.5～5.5％(优选为5％)，所述LAP的质量分数为0.1～0.9％(优选为0.5％)；该范围内能实现单个细胞的封装。
S203、采用MMP-9酶溶液溶解基底以去除其他细胞，后通过微操作取出并获得所述光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞。
该实施方式中，用MMP-9酶溶液可以裂解Gnp-chip的Gnp,MMP-9通过溶解基底的方式释放捕获的细胞，释放效率可以达到90％以上；因为MMP-9去除了未固化的细胞，固化的细胞可以通过微操作将细胞收集进行基因检测。这样的操作可以保证进行基因检测的细胞的纯度，保证基因检测的准确性。
作为一种可选的实施方式，所述MMP-9酶溶液的浓度为0.05～0.5mg/mL(优选为0.1mg/mL)。该范围内释放效率高。
下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用进行详细说明。
实施例1抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法
1、明胶纳米粒子的制备。具体的步骤是先称取0.625g的GelMA，在50度的温度下，水浴将其溶于12.5mL的去离子水中，在加入12.5mL的丙酮，丙酮在2分钟内加完后，看到底部有黏状沉淀，去除瓶内溶剂，12.5mL的去离子水再次加入，在50度的水浴锅中，沉淀再次溶解，用注射泵注射丙酮溶液，注射速度是1mL/min，待溶液变成奶白色停止滴加丙酮。将上述溶液拿出水浴锅，500ul的戊二醛加入1mL的丙酮溶液，将此溶液通过注射泵滴加到奶白色溶液中，流速为50ul/min.待溶液变成黄色时停止滴加戊二醛溶液，过夜搅拌。1000rpm离心洗涤获得的明胶纳米颗粒(Gnps)。结果如图2。
2、Gnp-chip的制备。
首先用MES溶液彻底清洗Gnps，然后在200μL EDC/NHS溶液(4mg/mL EDC和6mg/mLNHS在0.1M MES溶液中)中浸泡30min，制成NHS功能化Gnps。
将玻片(1×1cm)在5％APTES无水乙醇中室温浸泡1h，然后用乙醇洗涤3次，获得胺化处理玻片；
将胺化的底物与功能化的COOH-Gnps反应1小时，将Gnps结合到玻片上获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板Gnp-chip；结果如图3。
3、将Gnp-chip浸没于100μL链酶亲和素有streptavidin(50μg/mL)中，4℃浸泡10h,PBS洗涤3次，与20μg/mL生物素化抗Epcam抗体室温孵育2h，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片(简称anti-Epcam修饰的Gnp-chip)。
实施例2抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法
1、明胶纳米粒子的制备。具体的步骤是先称取0.625g的GelMA，在50度的温度下，水浴将其溶于12.5mL的去离子水中，在加入12.5mL的丙酮，丙酮在2分钟内加完后，看到底部有黏状沉淀，去除瓶内溶剂，12.5mL的去离子水再次加入，在50度的水浴锅中，沉淀再次溶解，用注射泵注射丙酮溶液，注射速度是1mL/min，待溶液变成奶白色停止滴加丙酮。将上述溶液拿出水浴锅，500ul的戊二醛加入1mL的丙酮溶液，将此溶液通过注射泵滴加到奶白色溶液中，流速为50ul/min.待溶液变成黄色时停止滴加戊二醛溶液，过夜搅拌。1000rpm离心洗涤获得的明胶纳米颗粒(Gnps)。结果如图2。
2、Gnp-chip的制备。
首先用MES溶液彻底清洗Gnps，然后在200μL EDC/NHS溶液(3.5mg/mL EDC和5.5mg/mL NHS在0.05M MES溶液中)中浸泡30min，制成NHS功能化Gnps。
将玻片(1×1cm)在4％APTES无水乙醇中室温浸泡1h，然后用乙醇洗涤3次，获得胺化处理玻片；
将胺化的底物与功能化的COOH-Gnps反应1小时，将Gnps结合到玻片上获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板Gnp-chip；结果如图3。
3、将Gnp-chip浸没于100μL链酶亲和素有streptavidin(40μg/mL)中，4℃浸泡10h,PBS洗涤3次，与10μg/mL生物素化抗Epcam抗体室温孵育2h，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片(简称anti-Epcam修饰的Gnp-chip)。
实施例3抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法
1、明胶纳米粒子的制备。具体的步骤是先称取0.625g的GelMA，在50度的温度下，水浴将其溶于12.5mL的去离子水中，在加入12.5mL的丙酮，丙酮在2分钟内加完后，看到底部有黏状沉淀，去除瓶内溶剂，12.5mL的去离子水再次加入，在50度的水浴锅中，沉淀再次溶解，用注射泵注射丙酮溶液，注射速度是1mL/min，待溶液变成奶白色停止滴加丙酮。将上述溶液拿出水浴锅，500ul的戊二醛加入1mL的丙酮溶液，将此溶液通过注射泵滴加到奶白色溶液中，流速为50ul/min.待溶液变成黄色时停止滴加戊二醛溶液，过夜搅拌。1000rpm离心洗涤获得的明胶纳米颗粒(Gnps)。结果如图2。
2、Gnp-chip的制备。
首先用MES溶液彻底清洗Gnps，然后在200μL EDC/NHS溶液(4.5mg/mL EDC和6.5mg/mL NHS在0.15M MES溶液中)中浸泡30min，制成NHS功能化Gnps。
将玻片(1×1cm)在6％APTES无水乙醇中室温浸泡1h，然后用乙醇洗涤3次，获得胺化处理玻片；
将胺化的底物与功能化的COOH-Gnps反应1小时，将Gnps结合到玻片上获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板Gnp-chip；结果如图3。
3、将Gnp-chip浸没于100μL链酶亲和素有streptavidin(60μg/mL)中，4℃浸泡10h,PBS洗涤3次，与30μg/mL生物素化抗Epcam抗体室温孵育2h，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片(简称anti-Epcam修饰的Gnp-chip)。
对比例1
该对比例为未修饰的平板玻璃。
对比例2
该对比例为抗Epcam修饰的平板玻璃，即直接将平板玻璃浸没于100μL链酶亲和素有streptavidin(60μg/mL)中，4℃浸泡10h,PBS洗涤3次，与30μg/mL生物素化抗Epcam抗体室温孵育2h获得。
对比例3
未修饰的gnp芯片，即采用实施例1所述方法中将胺化底物与所述NHS功能化明胶纳米颗粒于所述胺化处理玻片上混匀以反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板，简称Gnp-chip。
应用例1采用所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法
1、将细胞悬液加入到所述抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片上进行孵育15～120min，获得捕获多个循环肿瘤细胞的芯片；
为了优化捕获时间，我们将1×104个的MCF-7滴加在实施例1-3中的anti-Epcam修饰的Gnp-chip上孵育不同的时间(15、30、60、90和120min)。然后，用PBS轻轻清洗芯片以去除未捕获的细胞。捕获过程结束后，在荧光显微镜下观察并计数细胞附着的gnp芯片。最后，捕获效率＝捕获的单元数/放入的单元数×100％。
不同时间下的捕集效率评价结果如图5所示，可知60min时捕获效率即可达到100％，随着捕获时间的增加，捕获效率呈现出增加的趋势，但超过60min后，捕获效率基本没有增加。因此我们将60min作为最佳孵育时间。
2、将含有质量分数为4.5～5.5％LAP的0.1～0.9％的CSMA溶液滴加到所述捕获多个循环肿瘤细胞的芯片上，后采用405激光照射，获得含有光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞的芯片；
3、采用浓度为0.05～0.5mg/mL的MMP-9酶溶液原位溶解以去除其他细胞，后通过微操作取出并获得所述光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞。选择性的光固化水凝胶封装细胞的结果如图7所示，可知采用本发明实施例的方法可以成功从患者血液中捕获并分离出活性较高的单个CTCs。
实验例1
1、anti-Epcam修饰的Gnp-chip捕获MCF-7细胞。
不同基底的扫描电子显微镜观察。我们用标准程序制备了细胞捕获的基底样品，实施例1的anti-Epcam修饰的Gnp-chip和对比例2的抗Epcam修饰的平板玻璃用于细胞捕获，将1×104个细胞悬液滴加到Gnp-chip和玻璃基底，在常温下孵育1h,pbs轻轻冲洗。然后用2.5％戊二醛固定。样品经15％、30％、50％、70％、80％、90％、100％酒精浓度脱水，超临界二氧化碳干燥。结果如图4；
为了探究gnp芯片的捕获性能，我们利用扫描电镜观察实施例1和对比例2的捕获细胞的效率。SEM图像显示(图4a和4b)，在实施例anti-Epcam修饰的Gnp-chip上捕获的细胞比在光滑的平板玻璃基板上捕获的细胞产生更多的伪足。
2、特异性捕获
比较不同细胞系(MCF-7、Hepg2和Hela)在对比例1的未修饰的平板玻璃、对比例3的未修饰的gnp芯片、实施例1的anti-Epcam修饰的Gnp-chip芯片和对比例2的抗Epcam修饰的平板玻璃上的捕获效率，具体方法为：
为了验证底物的特异性捕获，我们将三种不同的细胞系(MCF-7、Hepg2和HeLa细胞)悬液滴加在不同的基底上(平板玻璃、Gnp-chip、anti-Epcam修饰的Gnp-chip、和anti-Epcam修饰的平板玻璃)。将浓度1×105/mL的细胞系用FDA染色后，取100ul染色后的细胞置于不同基底中共孵育1h，然后在荧光显微镜下计算上细胞的数量，利用上述公式得到不同基底对不同细胞系的捕获效率。然后在荧光显微镜下观察MCF-7细胞附着在不同底物上的情况。结果如图6和表1所示。
表1
Figure BDA0003058516810000111
由表1的数据可知：
对比例1的未修饰的平板玻璃，对MCF-7细胞、Hepg2细胞和HeLa细胞的捕获能力较差，捕获效率约为6％。
对比例2的抗Epcam抗体修饰的平板玻璃，对MCF-7和Hepg2的捕获效率略有提高，捕获效率约为36％，对HeLa细胞系的捕获效率为10％；
对比例3的未修饰的gnp芯片，对MCF-7细胞系的捕获效率为24％，对Hepg2细胞系的捕获效率为20％，对HeLa细胞系的捕获效率为18％；
实施例1的anti-Epcam修饰的Gnp-chip，对靶细胞(MCF-7细胞系和Hepg2细胞系)的捕获效率显著提高(>80％)，而对HeLa的非特异性吸附率较低(20％)；
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将明胶纳米颗粒采用MES溶液清洗，后于EDC/NHS溶液中浸泡，获得NHS功能化明胶纳米颗粒；
将玻片于APTES无水乙醇中浸泡，后用乙醇溶液洗涤，获得胺化处理玻片；
将所述NHS功能化明胶纳米颗粒置于所述胺化处理玻片上反应，获得明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板；
将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
2.根据权利要求1所述的一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，其特征在于，所述EDC/NHS溶液为将(3.5～4.5)mg/mL EDC和(5.5～6.5)mg/mL NHS溶解在(0.05～0.15)M的MES溶液中配制而得。
3.根据权利要求1所述的一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，其特征在于，所述APTES无水乙醇中APTES的质量分数为4～6％；所述乙醇溶液的质量分数为70～90％。
4.根据权利要求1所述的一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片的制备方法，其特征在于，所述将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板的表面修饰抗Epcam抗体，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，包括：
将所述明胶纳米颗粒修饰的玻璃基板于链酶亲和素中浸泡，后PBS洗涤，再与生物素化抗Epcam抗体室温孵育，获得抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
5.一种采用权利要求1-4任一所述方法获得的一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片。
6.一种权利要求5所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用。
7.一种选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述方法采用权利要求5所述的抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片，包括：
将细胞悬液加入到所述抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片上进行孵育，获得捕获多个循环肿瘤细胞的芯片；
将含有LAP的CSMA溶液滴加到所述捕获了多个循环肿瘤细胞的芯片上，后采用405nm的激光照射，获得含有光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞的芯片；
采用MMP-9酶溶液溶解基底以去除其他细胞，后通过微操作取出并获得所述光固化水凝胶包封的单个循环肿瘤细胞。
8.根据权利要求7所述的选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述孵育时间为15～120min。
9.根据权利要求1所述的选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述含有LAP的CSMA溶液中CSMA的质量分数为4.5～5.5％，所述LAP的质量分数为0.1～0.9％。
10.根据权利要求1所述的选择性分离单个循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，所述MMP-9酶溶液的浓度为0.05～0.5mg/mL。
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