CN112300995A - 捕获循环肿瘤细胞的基底材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示了一种用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料及其制备方法和应用，所述基底材料包括基底层、附着在所述基底层上的颗粒层，所述颗粒层具有若干个纳米水凝胶颗粒，所述纳米水凝胶颗粒上连接有用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。该基底材料能够保证在高效捕获靶细胞的前提下降低非特异性细胞的粘附，提高获得的靶细胞的纯度。

Description

捕获循环肿瘤细胞的基底材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种医学临床CTC分离技术，具体的涉及一种用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法与应用，属于分子生物学领域。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTCs)是指从原发瘤体或转移位点脱落进入人体外周血的恶性肿瘤细胞。CTCs与癌症转移、治疗效果、癌症复发、用药指导及预后密切相关，因而被作为癌症转移早期诊断和治疗的重要生物标志物。对CTC的研究有望阐明癌症转移、药物敏感及耐药性产生的内在机理，从而实现对癌症病人的个体化有效治疗。然而，CTCs在外周血中的极低含量和固有的异质性使高纯度有效捕获CTC面临巨大困难。
CTCs作为新型液体生物标志物，用于CTC分离的方法被设计研究。其中，研究发现纳米结构基底能改善CTCs的捕获效率，并且具有制备容易、取材广泛、易与其它捕获方法结合等特点，得到了研究者的广泛关注，然而研究发现纳米结构的引入使基底的非特异性捕获增加，从而影响目标细胞的后续应用。因此很多研究通过对纳米结构基底表面进行改性来解决这一问题，例如，我们课题组在壳聚糖纳米纤维表面嫁接pCBMA线性聚合物来降低纳米结构对非特异性细胞的吸附，取得了较为理想的结果，然而也增加了基底制备过程的复杂性。因此制备一种本身就具有抗粘附性能，无需进一步改性的用于捕获CTCs的纳米结构基底是非常有意义的。
近年来，一系列水溶性两性离子化合物受到了广泛的关注，如磺基甜菜碱和羧基甜菜碱。两性离子化合物中同时具有正电荷和负电荷，其形成的材料表面通过静电相互作用具有很强的水化能力，展现了良好的防污性能。采用pSBMA和pCBMA改性的表面具有很好的抗蛋白、细胞的吸附能力。相比于CBMA，SBMA可以直接购买商品化产品，无需进一步合成，且价格低廉。本发明因此而来。
发明内容
本发明提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料，所述基底材料包括基底层、附着在所述基底层上的颗粒层，所述颗粒层具有若干个纳米水凝胶颗粒，所述纳米水凝胶颗粒上连接有用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。该方案用于解决现有技术中CTC的分离问题。
优选的技术方案中，所述捕获分子为核酸适配体或抗体。
本发明的另一目的在于提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)对基底层进行表面处理，在基底层表面上修饰上氨基；
(2)获得纳米水凝胶颗粒；
(3)使基底层表面的氨基与纳米水凝胶颗粒上的羧基发生缩合反应，在基底层表面连接上纳米水凝胶颗粒；
(4)在纳米水凝胶颗粒表面连接上用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。
优选的技术方案中，其中纳米水凝胶颗粒通过回流沉淀聚合方法合成得到。
优选的技术方案中，其中回流沉淀聚合方法包括：以甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)为单体，N’N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，在引发剂存在的条件下进行聚合反应，反应温度控制在90-130℃，并维持反应时间在5-30min的步骤。
优选的技术方案中，其中步骤(1)中基底层采用玻片为基底，具体方法包括：
使用食人鱼溶液对玻片基底进行表面处理，在玻片表面形成羟基；
使用硅烷偶联剂处理玻片表面，使玻片表面修饰上氨基官能团。
优选的技术方案中，其中步骤11)使用的食人鱼溶液为质量浓度为98％的浓硫酸与质量浓度为30％的过氧化氢的混合溶液，浓硫酸与过氧化氢的体积比为7：3。
优选的技术方案中，其中步骤12)使用的硅烷偶联剂选自3-氨基丙基三乙氧基硅烷。
优选的技术方案中，其中步骤(3)具体包括：
33)使用EDC/NHS活化水凝胶纳米颗粒表面的羧基；
34)使水凝胶纳米颗粒与氨基化修饰的基底层反应，反应时间控制在6-24h，在基底层上连接具有水凝胶纳米颗粒的颗粒层。
优选的技术方案中，其中步骤(4)具体包括：将表面连接上纳米水凝胶颗粒的基底层置于包含EDC和NHS的PBS溶液中，常温反应后再加入链霉亲和素进行反应，然后与用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子进行反应连接捕获分子的步骤。
本发明的另一目的在于提供一种用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂，所述捕获试剂包括所述的用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料作为固相载体。所述基底材料修饰有用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。
优选的技术方案中，所述捕获分子为anti-EpCAM抗体。
本发明的另一目的在于提供一种循环肿瘤细胞的捕获方法，所述方法包括：
使循环肿瘤细胞与用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料接触；以及
使捕获分子与循环肿瘤细胞特异性结合而捕获循环肿瘤细胞。
优选的技术方案中，所述方法中用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料按照如下方法制备：
(1)对基底层进行表面处理，在基底层表面上修饰上氨基；
(2)获得纳米水凝胶颗粒；
(3)使基底层表面的氨基与纳米水凝胶颗粒上的羧基发生缩合反应，在基底层表面连接上纳米水凝胶颗粒；
(4)在纳米水凝胶颗粒表面连接上用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。
本发明的另一目的在于提供所述的用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料在制备能够特异性识别和/或捕捉循环肿瘤细胞的产品中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述的用于捕获循环肿瘤细胞的捕获试剂在制备能够特异性识别和/或捕捉循环肿瘤细胞的产品中的应用。
优选的技术方案中，包括采用用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料对临床病人血样中CTCs进行计数的步骤。
因此在本发明中利用SBMA作为单体制备水凝胶纳米结构基底。首先利用回流沉淀聚合方法，以SBMA和MAA为单体，MBA为交联剂，合成水凝胶纳米颗粒，然后在玻片表面构筑水凝胶纳米结构基底，用EDC/NHS活化水凝胶上的羧基，与SA连接，最终通过生物素与SA的特异性作用，将EpCAM抗体修饰在水凝胶纳米颗粒基底表面。由于SBMA上的磺酸根基团很难被激活用于连接抗体。因此在本发明中，添加了MAA作为另一个水凝胶合成的单体，为抗体的修饰提供活性官能团。该纳米结构基底在形成时本身就具有良好的抗粘附性能，因此无需进一步修饰抗粘附分子，简化了基底制备的实验过程。同时该基底的纳米结构是由水凝胶构成的，因此具有良好的柔软性和细胞相容性，为捕获的细胞进一步原位培养提供了一个很好的平台。
本发明提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法与应用。本发明所述制备方法包括：先利用回流沉淀聚合方法，以甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)为单体，N’N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，合成水凝胶纳米颗粒；同时利用硅烷化试剂处理玻片，在其表面修饰上氨基官能团；进一步利用EDC/NHS活化水凝胶颗粒表面的羧基，然后与玻片表面的氨基反应；最终将水凝胶颗粒修饰到玻片表面构建了抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。再用EDC/NHS活化水凝胶颗粒上的羧基，然后与链霉亲和素分子(SA)上的活性氨基反应，最终通过生物素与SA的特异性作用，引入生物素化的可与CTCs特异识别的亲和分子，如上皮细胞粘附分子抗体(anti-EpCAM)到抗粘附纳米水凝胶颗粒基底表面。
相较于现有技术，本发明用于捕获CTCs的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，主要是利用抗粘附分子形成的水凝胶纳米结构与亲和分子的协同作用，不仅可以极大程度上降低血细胞的非特异性粘附，又可以高效率捕获CTCs。该纳米结构基底在形成时本身就具有良好的抗粘附性能，因此无需进一步修饰抗粘附分子，简化了实验过程。同时该基底的纳米结构是由水凝胶构成的，因此具有良好的柔软性和细胞相容性，为捕获的细胞进一步原位培养提供了一个很好的平台。该基底制备简单经济，该方法为临床上高效捕获高纯度高活性的CTCs提供了一种新的捕获基底。
与现有技术相比，本发明的优点包括：
1)本发明制备的纳米结构基底在形成时本身就具有良好的抗粘附性能，因此无需进一步修饰抗粘附分子，简化了基底制备的实验过程。
2)基于抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的CTC分离方法具有良好的细胞相容性，可以最大程度保持获得的癌细胞的活性和功能，这对后续的研究有重要意义；
3)该用于分离CTC的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，通过简单的回流沉淀聚合方法和氨基与羧基的缩合反应合成抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，即能为特异捕获分子的修饰提供活性位点，又能够保证在高效捕获靶细胞的前提下降低非特异性细胞的粘附，提高获得的靶细胞的纯度，这对CTCs后续的鉴定、分析及应用都具有重要意义；
4)该用于分离CTC的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，利用能够特异性识别肿瘤细胞表面高表达抗原的抗体，特异性捕获CTCs；
5)本发明还提供了一种用于纳米结构表面改性的方法。
6)本发明所述基底制备方法简单经济，具有普适性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施方案之中用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法和应用的原理图；
图2是本发明实施例中回流沉淀法合成的纳米水凝胶颗粒的透射电镜图；
图3是本发明实施例中纳米水凝胶颗粒的水合粒径和电势，其中平均粒径在312.9d.nm，多分散系数为0.025，Zeta电位为-48.9mV；
图4和5是本发明实施例中抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的扫描电镜图；
图6是本发明实施例中不同孵育时间下抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对MCF-7和K562细胞的捕获效率；
图7是本发明实施例中不同修饰基底对靶细胞的捕获效率；
图8是本发明实施例中抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对不同表型细胞的捕获效率。
图9是本发明实施例中抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底捕获细胞的存活率；
图10是本发明实施例中抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对少量MCF-7的捕获效率；
图11是本发明实施例中抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底从癌症患者血液样本中检测到的CTCs荧光图像；
图12是本发明实施例中抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底从健康人和病人血样中检测到的CTCs数量；
图13是本发明实施例中病人血样中WBCs在抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的残留数量。
具体实施方式
通过应连同所附图式一起阅读的以下具体实施方式将更完整地理解本发明。本文中揭示本发明的详细实施例；然而，应理解，所揭示的实施例仅具本发明的示范性，本发明可以各种形式来体现。因此，本文中所揭示的特定功能细节不应解释为具有限制性，而是仅解释为权利要求书的基础且解释为用于教示所属领域的技术人员在事实上任何适当详细实施例中以不同方式采用本发明的代表性基础。
本发明提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法与应用，所述的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法包括：
(1)通过简单的回流沉淀聚合方法合成纳米级水凝胶颗粒；
(2)普通玻片表面通过硅烷化修饰上氨基，利用氨基与羧基的缩合反应将上述水凝胶纳米颗粒修饰到玻片表面，形成抗粘附纳米水凝胶颗粒基底；
(3)再次通过氨基与羧基的缩合反应在水凝胶颗粒表面引入具有特异性捕获CTCs的亲和分子如抗体等。
步骤(1)包括：通过简单的回流沉淀聚合方法合成出约320nm的尺寸均一、分散性良好、呈负电性、形貌规则的水凝胶纳米颗粒。
步骤(1)具体包括：称取100-1000mg SBMA、10-500mg MAA、10-500mg MBA和1-100mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)(AIBN)置于150mL的单口烧瓶中，然后加入20-200mL的乙腈溶剂。超声1-20min后，在剧烈搅拌下加热到90-130℃，并维持10min。在14000rpm转速下离心10min，收集水凝胶纳米颗粒，并使用大量乙醇和去离子水进行清洗，最后分散于水中，并放入4℃冰箱中保存备用。
步骤(2)包括：利用硅烷化试剂处理玻片，在其表面修饰上氨基官能团；利用EDC/NHS活化步骤(1)合成的水凝胶颗粒表面的羧基，然后与玻片表面的氨基反应；最终将水凝胶颗粒修饰到玻片表面构建了水凝胶纳米结构基底。该基底具有极好的抗粘附性能，减少血细胞的粘附；能够为亲和分子如抗体的修饰提供活性位点；在形成时本身就具有良好的抗粘附性能，因此无需进一步修饰抗粘附分子，简化了实验过程；具有良好的柔软性和细胞相容性，为捕获的细胞进一步原位培养提供了一个很好的平台。
步骤(2)具体包括：将食人鱼溶液(piranha溶液)处理过的玻片切割成1cm x 1cm大小，浸入0.5-3％(v/v)的APTES乙醇溶液中反应过夜，并使用乙醇进行清洗，自然干燥，然后整齐摆放于培养皿中，并保存在干燥器中备用。使用0.1mol/L EDC和0.025mol/L NHS的1X PBS溶液活化一定量步骤(1)合成的水凝胶纳米颗粒，反应20-60min后直接转移到含有大量氨基修饰的玻片的培养皿中，放于摇床上反应6-24h，然后使用去离子水进行清洗，最后将制备抗粘附纳米水凝胶颗粒基底保存于4℃冰箱中备用。
步骤(3)包括：步骤(2)中抗粘附纳米水凝胶颗粒基底通过氨基与羧基的缩合反应在其表面修饰上特异识别CTCs的亲和分子，如anti-EpCAM抗体，使该基底能够特异性捕获EpCAM高表达的CTCs。
步骤(3)还包括：将步骤(2)中的抗粘附水凝胶纳米结构基底放入含有0.05-0.2mol/L EDC和0.01-0.05mol/L NHS的1X PBS溶液中，常温反应30min-120min。反应结束后，1X PBS清洗，然后滴加质量浓度为0.00005-0.0001链霉亲和素(SA)，常温过夜反应。反应结束后通过1X PBS清洗3-5次，滴加生物素修饰的EpCAM抗体，反应1-24h，1X PBS清洗3-5次，用质量浓度为0.1-10％的BSA溶液封闭未完全反应的活化后的羧基基团，获得用于捕获CTCs的抗体功能化的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。保存于4℃冰箱。
鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和实践，提出了本发明的技术方案。即，提供了一种用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法与应用。本发明所制备合成的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底可用于临床病人血样中CTCs的计数。
本发明的主要目的在于提供一种可以用于高效率高纯度捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法。该基底在形成时本身具有很好的抗粘附性能，无需进一步修饰抗粘附分子，简化了基底的制备过程。该方法工艺简单便捷，成本低。通过回流沉淀聚合方法和氨基与羧基的缩合反应合成抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，不仅能够降低血细胞的粘附，且为特异识别CTCs的亲和分子如抗体的修饰提供活性位点。利用抗粘附分子形成的柔软水凝胶纳米颗粒与亲和分子的协同作用实现CTCs的高效率高纯度捕获，有利于CTCs的后续鉴定、分析和应用。
本发明的另一目的在于提供一种可以更换不同亲和分子的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，用于不同表型肿瘤细胞的捕获。
本发明的又一目的在于提供所述用于捕获CTCs的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的用途。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
一种用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备，包括合成抗粘附纳米水凝胶颗粒，抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的构建及亲和分子对抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的表面功能化。
其中，采用的水凝胶纳米颗粒具有良好的细胞相容性和抗粘附性能。
进一步的，所述抗粘附纳米水凝胶颗粒旨在降低基底纳米结构对非特异性细胞的捕获，同时为亲和分子的修饰提供活性位点，在这里主要采用抗粘附性能极好的甲基丙稀酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和为亲和分子修饰提供活性官能团的甲基丙烯酸(MAA)合成水凝胶纳米颗粒。
进一步的，所述CTCs亲和捕获分子用以实现CTCs细胞的高效特异性捕获，其包括肿瘤细胞高表达的上皮细胞粘附分子，例如EpCAM生物素化抗体，且不限于此。
本发明的一个方面包括：通过简单的回流沉淀聚合方法合成尺寸均一、分散性良好的纳米级水凝胶颗粒。通过氨基与羧基的缩合反应在氨基硅烷试剂处理后的玻片表面形成抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。利用水凝胶颗粒的极好抗粘附性与亲和分子的协同作用，在极大程度上降低血细胞的粘附，同时高效捕获CTCs。
本发明的另一个方面包括：制备一种无需进一步表面抗粘附修饰的纳米结构基底，简化基底的制备步骤。
本发明的又一个方面包括：制备的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底用于捕获CTCs的操作。
本发明提供的用于捕获CTCs的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，合成经济简单，具有良好的细胞相容性、捕获效率、灵敏度及特异性，有利于CTCs的后续应用和分析。
该用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底的制备方法，其包括：
(1)通过简单的回流沉淀聚合方法合成纳米级水凝胶颗粒；
(2)普通玻片表面通过硅烷化修饰上氨基，利用氨基与羧基的缩合反应将上述水凝胶纳米颗粒修饰到玻片表面，形成抗粘附纳米水凝胶颗粒基底；
(3)再次通过氨基与羧基的缩合反应在水凝胶颗粒表面引入具有特异性捕获CTCs的亲和分子如抗体等。
在一较为优选的实施方案之中，步骤(1)包括：称取100-1000mg SBMA、10-500mgMAA、10-500mg MBA和1-100mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)(AIBN)置于150mL的单口烧瓶中，然后加入20-200mL的乙腈溶剂。超声1-20min后，在剧烈搅拌下加热到90-130℃，并维持10min。在14000rpm转速下离心10min，收集水凝胶纳米颗粒，并使用大量乙醇和去离子水进行清洗，最后分散于水中，并放入4℃冰箱中保存备用。
在一较为优选的实施方案之中，步骤(2)包括：将食人鱼溶液(piranha溶液)处理过的玻片切割成1cm x 1cm大小，浸入0.5-3％(v/v)的APTES乙醇溶液中反应过夜，并使用乙醇进行清洗，自然干燥，然后整齐摆放于培养皿中，并保存在干燥器中备用。使用0.1mol/L EDC和0.025mol/L NHS的1X PBS溶液活化一定量步骤(1)合成的水凝胶纳米颗粒，反应20-60min后直接转移到含有大量氨基修饰的玻片的培养皿中，放于摇床上反应6-24h，然后使用去离子水进行清洗，最后将制备抗粘附纳米水凝胶颗粒基底保存于4℃冰箱中备用。
在一较为优选的实施方案之中，步骤(3)包括：将步骤(2)中的抗粘附水凝胶纳米结构基底放入含有0.05-0.2mol/L EDC和0.01-0.05mol/L NHS的1X PBS溶液中，常温反应30min-120min。反应结束后，1X PBS清洗，然后滴加质量浓度为0.00005-0.0001链霉亲和素(SA)，常温过夜反应。反应结束后通过1X PBS清洗3-5次，滴加生物素修饰的EpCAM抗体，反应1-24h，1X PBS清洗3-5次，用质量浓度为0.1-10％的BSA溶液封闭未完全反应的活化后的羧基基团，获得用于捕获CTCs的抗体功能化的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。保存于4℃冰箱。
本发明实施例提供了由上述方法制备的用于捕获循环肿瘤细胞(CTCs)的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。
本发明实施例还提供了上述的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底用于捕获CTCs的操作过程。
本发明实施例还提供了上述的抗粘附纳米水凝胶颗粒的制备过程。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
除非另外具体陈述，否则本文中单数的使用包含复数(且反之亦然)。此外，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式“一(a、an)”及“所述(the)”包含复数形式。另外，在术语“约”的使用在量值之前之处，除非另外具体陈述，否则本发明教示还包括特定量值本身。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
实施例1水凝胶纳米颗粒基底的制备
制备方法具体如下：
a)称取100-1000mg SBMA、10-500mg MAA、10-500mg MBA和1-100mg 2,2'-偶氮双(异丁腈)(AIBN)置于150mL的单口烧瓶中，然后加入20-200mL的乙腈溶剂。超声1-20min后，在剧烈搅拌下加热到90-130℃，并维持10min。在14000rpm转速下离心10min，收集水凝胶纳米颗粒，并使用大量乙醇和去离子水进行清洗，最后分散于水中，并放入4℃冰箱中保存备用。
b)将食人鱼溶液处理过的玻片切割成1cm x 1cm大小，浸入0.5-3％(v/v)的APTES乙醇溶液中反应过夜，并使用乙醇进行清洗，自然干燥，然后整齐摆放于培养皿中，并保存在干燥器中备用。使用0.1mol/L EDC和0.025mol/L NHS的1X PBS溶液活化一定量步骤a)合成的水凝胶纳米颗粒，反应20-60min后直接转移到含有大量氨基修饰的玻片的培养皿中，放于摇床上反应6-24h，然后使用去离子水进行清洗，最后将制备抗粘附纳米水凝胶颗粒基底保存于4℃冰箱中备用。
c)将步骤b)中的抗粘附水凝胶纳米结构基底放入含有0.05-0.2mol/L EDC和0.01-0.05mol/L NHS的1X PBS溶液中，常温反应30min-120min。反应结束后，1X PBS清洗，然后滴加质量浓度为0.00005-0.0001链霉亲和素(SA)，常温过夜反应。反应结束后通过1XPBS清洗3-5次，滴加生物素修饰的EpCAM抗体，反应1-24h，1X PBS清洗3-5次，用质量浓度为0.1-10％的BSA溶液封闭未完全反应的活化后的羧基基团，获得用于捕获CTCs的抗体功能化的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底。保存于4℃冰箱。
图1是该基底的制备方法和应用的原理图，图2、3、4和5是该基底的表征图。
实施例2
将作为阴性细胞模型的K562和阳性细胞模型的MCF-7，分别使用终浓度为10μg/mL的DiO和DiI在细胞培养箱中进行染色20min，用PBS清洗3次，计数，调整MCF-7细胞悬液的密度为0.25x 105/mL，K562细胞的密度为1x 105/mL。将1mL细胞溶液重新分散于24孔细胞培养板中，分别与抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底在细胞培养箱中孵育不同时间，然后进行清洗，利用荧光显微镜记录细胞的捕获情况，并计算不同时间的捕获效率，选择最佳孵育时间用于后续细胞捕获实验。捕获效率定义为捕获的细胞数与最初加入的细胞数的百分比。图6为不同孵育时间下抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对MCF-7和K562细胞的捕获效率。40min时的捕获效率达到最大。
实施例3
将MCF-7细胞用DiI染料染色20min，使用PBS进行清洗，计数，调整MCF-7细胞悬液的密度为0.25x 105/mL。将1mL细胞溶液重新分散于24孔细胞培养板中，分别与空白玻片(普通玻片)、抗粘附纳米水凝胶颗粒基底(水凝胶颗粒基底)、链霉亲和素修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底(链霉亲和素修饰后的基底)和EpCAM抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底(抗体修饰后的基底)不同修饰界面的基底在细胞培养箱中孵育40min，使用PBS清洗3次，然后加入2.5％戊二醛固定。利用倒置荧光显微镜观察并拍照记录捕获到的细胞数量，最终计算捕获效率。结果如图7。实验结果表明，纳米水凝胶颗粒基底本身具有很好的抗粘附性能，无需进一步修饰抗粘附分子。抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对靶细胞有很好的捕获效率。
实施例4
选用EpCAM低表达细胞系HeLa、K562和人胚胎肾细胞系293T作为阴性细胞模型，EpCAM高表达细胞系MCF-7作为阳性细胞模型。分别对这五种细胞进行染色，清洗，计数，配制成固定浓度的细胞溶液，然后分别与置于24孔板中的抗体修饰后的基底孵育40min，清洗，使用荧光显微镜拍照并记录结果，最终统计捕获效率。实验结果汇总见图8。实验结果表明，抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底具有很好的选择性和特异性。
实施例5
将MCF-7细胞与抗体修饰后的基底置于培养箱中孵育40min，清洗，然后与AM和PI(细胞死活双荧光鉴定染料)的混合溶液孵育20min，温和清洗两次。同时将捕获前的MCF-7细胞也进行AM和PI的双染色处理，用于对照实验。其中AM用于活细胞染色，PI用于死细胞染色。使用荧光显微镜拍照并记录实验结果，最终统计细胞的存活率。实验结果见图9。实验结果显示，捕获细胞具有很好的活性，说明该抗粘附纳米水凝胶颗粒基底具有良好的生物相容性。
实施例6
首先提取外周血单核细胞：提前在SepMateTM-15离心管中加入5mL人白细胞分离液(Ficoll-Paque)，然后将用等体积的无菌PBS稀释一倍的抗凝全血加入上述离心管中，尽量保持两者间的界面清晰。然后2000rpm转速离心20分钟，离心结束后，可以观察到红细胞在最底部。将红细胞上面的溶液全部转移到一个新的离心管中，加入一定量的PBS溶液，混匀，再次使用1500rpm离心20分钟，取出丢弃上清液，重新加入一定量PBS分散WBCs，再次离心，最后根据最初的血液体积加入等量的PBS分散，整个处理过程都在无菌下操作。
分别将5、10、20、50和100个DiI预染色的MCF-7细胞分散到1mL上述分离的白细胞液中，从而得到人工制备的血液样本。最后将上述制备好的血液样本分别与抗体修饰后的基底孵育，清洗，利用荧光显微镜统计捕获的细胞个数。同时用PBS溶液替代白细胞液作为对照组。
实验结果见图10。实验结果表明，EpCAM抗体修饰后的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底对靶细胞的捕获具有很好的灵敏度。
实施例7
使用EDTA抗凝真空采血管收集病人血样1mL，离心分离包括CTCs在内的外周血单核细胞，具体提取步骤参照实施例6。然后与抗体修饰后的基底孵育，清洗。用4％多聚甲醛固定30min，然后使用封闭液封闭一小时，接着与0.3％Triton X-100、2％BSA、Alexa Fluor488标记的anti-CD45和Alexa Fluor 555标记的anti-Pan-Keratin的PBS缓冲液孵育染色，在4℃冰箱中避光染色8h。接着用Hoechst 33342染色细胞核，PBS进行清洗，最后使用激光共聚焦观察并计数。荧光图像呈现PanCK+/CD45-/Hoechst 33342+的细胞被认为是CTCs，PanCK-/CD45+/Hoechst 33342+的细胞为WBCs。图11是从癌症患者血液中检测出的CTCs和残留的白细胞的荧光免疫染色鉴定后的图像。在这10个血液样品中，其中编号1到5的是半年内体检合格的健康人的血样，而6和7号是肾癌病人血样，8号是肾错构瘤病人血样，9和10号是乳腺癌患者的血样。在ICC荧光免疫染色鉴定后，5例健康人的血液中均未检出CTCs，肾错构瘤患者1mL血样中也未发现CTCs，而在四个癌症患者1mL血液中检测出了不同数量的CTCs，结果总结在图12中。基底残留的白细胞数被总结在图13中，大约是4000个。这初步的病人样检测结果表明该anti-EpCAM-SMHNPs基底具有良好的临床应用潜能。
综上所述，藉由本发明的上述技术方案，本发明构筑了具有良好细胞相容性的抗粘附纳米水凝胶颗粒基底，该基底本身具有很好的抗粘附性能，无需进一步修饰抗粘附分子，简化了基底的制备过程。同时该基底也具有较高的捕获效率、捕获特异性和灵敏度，且制备方法简单经济。
此外，本案发明人还参照实施例1的方式，以本说明书中列出的其它原料和条件等进行了试验，并同样构建了表达不同目的蛋白的高表达细胞系，该构建细胞系的方法具有很好的适用性。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (11)

1.一种用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料，其特征在于，所述基底材料包括基底层、附着在所述基底层上的颗粒层，所述颗粒层具有若干个纳米水凝胶颗粒，所述纳米水凝胶颗粒上连接有用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。
2.根据权利要求1所述的基底材料，其特征在于，所述捕获分子为核酸适配体或抗体。
3.一种用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)对基底层进行表面处理，在基底层表面上修饰上氨基；
(2)获得纳米水凝胶颗粒；
(3)使基底层表面的氨基与纳米水凝胶颗粒上的羧基发生缩合反应，在基底层表面连接上纳米水凝胶颗粒；
(4)在纳米水凝胶颗粒表面连接上用于特异性捕获循环肿瘤细胞的捕获分子。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(2)中纳米水凝胶颗粒通过回流沉淀聚合方法合成得到，具体方法包括：
以甲基丙烯酰乙基磺基甜菜碱(SBMA)和甲基丙烯酸(MAA)为单体，N’N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)为交联剂，在引发剂存在的条件下进行聚合反应，反应温度控制在90-130℃，并维持反应时间在5-30min的步骤。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(1)中基底层采用玻片为基底，具体方法包括：
11)使用食人鱼溶液对玻片基底进行表面处理，在玻片表面形成羟基；
12)使用硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷进一步处理玻片表面，使玻片表面修饰上氨基官能团。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(3)具体包括：
31)使用EDC/NHS活化水凝胶纳米颗粒表面的羧基；
32)使水凝胶纳米颗粒与氨基化修饰的基底层反应，反应时间控制在6-24h，在基底层上连接具有水凝胶纳米颗粒的颗粒层。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，其中步骤(4)具体包括：将表面连接上纳米水凝胶颗粒的基底层置于包含EDC和NHS的PBS溶液中，常温反应后再加入链霉亲和素进行反应，然后与用于特异性捕获循环肿瘤细胞的生物素标记的捕获分子进行反应连接捕获分子的步骤。
8.根据权利要求3所述的用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料，其特征在于，其中步骤(4)中所述捕获分子为anti-EpCAM抗体。
9.一种循环肿瘤细胞的捕获方法，其特征在于，所述方法包括：
使循环肿瘤细胞与权利要求1至2中任一所述的用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料接触；以及
使捕获分子与循环肿瘤细胞特异性结合而捕获循环肿瘤细胞。
10.权利要求1至2中任一所述的用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料在制备能够特异性识别和/或捕捉循环肿瘤细胞的产品中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，包括采用用于捕获循环肿瘤细胞的基底材料对临床病人血样中CTCs进行计数的步骤。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113340859A (zh) * 2021-05-10 2021-09-03 武汉大学 一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用
CN117660344A (zh) * 2023-08-11 2024-03-08 聊城市人民医院 一种双网络水凝胶表面及其制备方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148315A (zh) * 2015-04-14 2016-11-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种基于壳聚糖纳米粒子的ctc捕获与纯化基底及其制备方法
CN109232833A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 浙江工业大学 一种低细菌粘附、细菌释放并可再生的高强度纳米复合水凝胶的制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148315A (zh) * 2015-04-14 2016-11-23 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 一种基于壳聚糖纳米粒子的ctc捕获与纯化基底及其制备方法
CN109232833A (zh) * 2018-08-02 2019-01-18 浙江工业大学 一种低细菌粘附、细菌释放并可再生的高强度纳米复合水凝胶的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PING SONG等: "DNA Hydrogel with Aptamer-Toehold-Based Recognition, Cloaking, and Decloaking of Circulating Tumor Cells for Live Cell Analysis", 《NANO LETTERS》 *
SONG-WEI LV等: "Near-Infrared Light-Responsive Hydrogel for Specific Recognition and Photothermal Site-Release of Circulating Tumor Cells", 《ACS NANO》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113340859A (zh) * 2021-05-10 2021-09-03 武汉大学 一种抗体-明胶纳米颗粒修饰的芯片及其制备方法与在选择性分离单个循环肿瘤细胞中的应用
CN117660344A (zh) * 2023-08-11 2024-03-08 聊城市人民医院 一种双网络水凝胶表面及其制备方法与应用

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