CN113336697A - 一种cdk9抑制化合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种CDK9抑制化合物及其应用，其结构式为
Figure DDA0003102150060000011
其中，A为烷基二胺，X为卤素或H，R为取代苄基。本发明可作为CDK9抑制剂，下调癌细胞PD‑L1，用于肿瘤免疫疗法以及艾滋病治疗。

Description

一种CDK9抑制化合物及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种CDK9抑制化合物及其应用。
背景技术
细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，通过与不同的细胞周期蛋白(cyclin)结合形成异源二聚体来发挥其生物学效应。CDK除了能够调控细胞周期外，在细胞转录过程中也具有重要的作用。目前发现的CDKs共有十余种，其中细胞周期依赖性激酶9(CDK9)是细胞周期依赖性激酶(CDKs)亚家族的一员，是转录延伸因子P-TEPb的催化亚基，CDK9通过磷酸化RNA聚合酶Ⅱ(RNA Poly2)的C端、转录延伸抑制因子N-TEFs的BD亚基和转录延伸抑制因子NELF的SPT5亚基，促使转录延伸。CDK9可影响编码与耐药性相关的短寿命抗凋亡蛋白基因的表达，通过shRNA或siRNA沉默CDK9表达导致一系列表型，表明CDK9敲除可抑制癌细胞的增殖。此外，原代人星形胶质细胞或胶质母细胞瘤细胞CDK9抑制显著影响其基因表达模式。目前，CDK9被认为是癌症治疗理想的靶标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CDK9抑制化合物。
本发明的另一目的在于提供上述CDK9抑制化合物的应用。
本发明的再一目的在于提供一种癌症治疗药物组合物。
本发明的技术方案如下：
一种CDK9抑制化合物，其特征在于：其结构式为
Figure BDA0003102150040000011
其中，A为烷基二胺，X为卤素或H，R为取代苄基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述A为
Figure BDA0003102150040000012
Figure BDA0003102150040000021
在本发明的一个优选实施方案中，所述卤素为氯。
在本发明的一个优选实施方案中，所述R为间氟苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基或对甲基苄基。
在本发明的一个优选实施方案中，所述A为
Figure BDA0003102150040000022
Figure BDA0003102150040000023
所述X为氯或H，所述R为间氟苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基或对甲基苄基。
在本发明的一个优选实施方案中，其结构式为
Figure BDA0003102150040000024
Figure BDA0003102150040000025
Figure BDA0003102150040000031
本发明的另一技术方案如下：
上述CDK9抑制化合物在制备治疗CDK9相关疾病中的药物中的应用。
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物中还包括BRD4抑制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述药物的剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。
在本发明的一个优选实施方案中，所述CDK9相关疾病包括肾癌、非小细胞肺癌、肝癌、脑胶质瘤和乳腺癌。
本发明的再一技术方案如下：
一种癌症治疗药物组合物，包括上述CDK9抑制化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物、水合物和前药中的至少之一，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂。
在本发明的一个优选实施方案中，其有效成分还包括BRD4抑制剂。
进一步优选的，其有效成分为所述CDK9抑制化合物和BRD4抑制剂。
在本发明的一个优选实施方案中，其剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。
本发明的有益效果是：本发明可作为CDK9抑制剂，下调癌细胞PD-L1，用于肿瘤免疫疗法以及艾滋病治疗。
附图说明
图1为本发明实施例5的热力学分析实验结果图。
图2为本发明实施例6的BSA钓靶蛋白实验结果图。
图3为本发明实施例7中化合物ICDK9-7-1对CDK9的活性抑制结果图。
图4为本发明实施例8中ICDK9-7-1系列化合物可抑制CDK9功能的实验结果图。
图5为本发明实施例9中化合物ICDK9-7-1对肿瘤细胞信号通路的影响结果图。
图6为本发明实施例10中化合物ICDK9-7-1联合BRD4抑制剂、免疫检点抑制剂的抗肿瘤潜力结果图。
图7为本发明实施例11中化合物ICDK9-7-1对小鼠A498移植瘤模型的抑制结果图，分为对照组(Vehicle)、阳性药组(ICDK9)、实验组(ICDK9-7-1)三组，其中，a、各组小鼠所荷载的最终瘤重图，b、开始给药后肿瘤体积与时间关系，c、各组小鼠的存活情况，d、开始给药后各组小鼠每天的平均体重与时间的关系图，e、各组剥离的小鼠荷载肿瘤比较
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
除非另外定义，所有本文使用的科技术语都具有与要求保护的主题所属领域的科技人员一般理解相同的含义。
除非另有说明，本发明采用本领域技术范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学等常规方法。除非提供具体的定义，否则与本文描述的分析化学、合成有机化学、以及医学和药物化学等化学上相关的命名和实验操作和技术，是本领域技术人员已知的。
本发明的CDK9抑制化合物具体如下表1所示：
表1.CDK9抑制化合物
Figure BDA0003102150040000041
Figure BDA0003102150040000051
Figure BDA0003102150040000061
Figure BDA0003102150040000071
Figure BDA0003102150040000081
实施例1：N-((1r,4r)-4-((5'-氯-6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-二吡啶]-2'-基)氨基)环己基)-4-((E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酰胺(ICDK9-7-1)的合成
本实施例的反应式如下所示：
Figure BDA0003102150040000091
具体步骤如下：
(1)6-溴-N-(3-氟苄基)吡啶-2-氨的合成(中间体1)：将2-氟-6-溴吡啶(1.75g,10mmol)与3-氟苄胺(1.25g,10mmol)溶于25mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二异丙基乙胺(3.87g,30mmol)，氮气置换反应体系后升温至120℃反应4h。TLC检测原料反应完全后，停止加热，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，有固体析出，抽滤，取滤饼，干燥后得黄色固体6-溴-N-(3-氟苄基)吡啶-2-氨2.55g，收率91％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.48(t,J＝5.78Hz,1H),7.34-7.40(m,2H),7.29(dd,J＝7.52,8.07Hz,1H),7.11-7.18(m,2H),6.65(d,J＝7.34Hz,1H),6.47(d,J＝8.25Hz,1H),4.39(d,J＝6.05Hz,2H)，MS(ESI)：m/z280.0(M+H)+。
(2)5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶的合成(中间体2)：将2-氟-4-碘5-氯吡啶(2.56g,10mmol)、连硼酸频哪醇酯(3.05g,12mmol)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(0.93g,30mmol)加入25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，置换氮气，于氮气保护下升温至90℃反应3h，TLC检测原料2-氟-4-碘5-氯吡啶反应完全后，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，用(25mL×3)乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和食盐水反萃后有机相加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩后加入硅胶拌样，用柱层析硅胶色谱分离纯化，展开剂石油醚：乙酸乙酯＝5：1分离，得白色粉末5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3，2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶1.50g，收率58％。
(3)5'-氯-2'-氟-N-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-6-胺的合成(中间体3)：取厚壁耐压瓶，称取步骤(1)所得6-溴-N-(3-氟苄基)吡啶-2-氨(1.40g,5mmol)与步骤(2)所得5-氯-2-氟-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧代硼戊环-2-基)吡啶(1.30g,5mmol)以及碳酸钾(2.07g,15mmol)溶于25mL溶剂(乙二醇二甲醚：水＝4：1)中，氮气置换3次，升温至120℃反应过夜，TLC检测反应结束后，冷至室温后反应液用乙酸乙酯(30mL×3)萃取三次，合并有机相，水、饱和食盐水依次反洗，分离有机相后加入无水硫酸钠干燥，过滤除干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，利用柱层析色谱分离纯化，展开剂石油醚：乙酸乙酯＝100：1分离，得到5'-氯-2'-氟-N-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-6-胺0.98g，白色粉末，收率：30％，MS(ESI)：m/z 332.1(M+H)+。
(4)N2'-((1r,4r)-4-氨基环己基)-5'-氯-N6-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-2',6-二胺的合成(中间体4)：取厚壁耐压瓶，称取步骤(3)所得产物5'-氯-2'-氟-N-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-6-胺(0.43g,1mmol)，反式-1，4-环己二胺(0.91g,8mmol)溶于10mL二甲基亚砜中，氮气置换后，升温至150℃反应48h。反应结束后冷至室温，将反应液搅拌下倒入50mL冰水中，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相，水、饱和食盐水依次反洗，分离有机相后加入无水硫酸钠干燥，过滤除干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，利用柱层析色谱分离纯化，展开剂二氯甲烷：甲醇＝10：1分离纯化，得N2'-((1r,4r)-4-氨基环己基)-5'-氯-N6-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-2',6-二胺0.3g，白色固体，收率：70％，1H NMR(600MHz,CHLOROFORM-d)δ8.00(s,1H),7.39-7.45(m,1H),7.22(dt,J＝5.87,7.89Hz,1H),7.07(d,J＝7.70Hz,1H),7.02(d,J＝9.72Hz,1H),6.90(d,J＝7.34Hz,1H),6.86-6.89(m,1H),6.45(s,1H),6.33(d,J＝8.25Hz,1H),5.12(t,J＝5.78Hz,1H),4.47(d,J＝5.87Hz,2H),4.36(d,J＝8.07Hz,1H),3.39-3.47(m,1H),2.58-2.65(m,1H),2.02(d,J＝10.27Hz,2H),1.81(d,J＝10.09Hz,2H),1.11-1.21(m,4H)；13C NMR(151MHz,CHLOROFORM-d)δ162.8,161.2,157.1,155.9,152.3,147.0,146.4,141.2,136.6,129.1,129.1,121.8,121.8,116.2,113.3,113.1,113.1,113.0,112.9,107.4,105.6,49.1,49.0,44.7,34.2,31.0；MS(ESI):426.2(M+H)+。
(5)(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸的合成(中间体5、中间体6)：取250mL圆底烧瓶，依次加入将4-氨基苯甲酸叔丁酯(1.93g,10mmol)、(E)-4-(二甲氨基)丁-2-烯乌苏酸盐酸盐(1.98g,12mmol)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)(4.54g,12mmol)，加100mL二氯甲烷溶解，恒压滴液漏斗中加入N,N-二异丙基乙胺(6.91g,48mmol)，置换氮气三次，于冰浴下搅拌20min后缓慢滴入N,N-二异丙基乙胺，后缓慢升至室温反应24h，反应液依次用饱和柠檬酸、饱和碳酸氢钠、水、饱和食盐水洗涤，萃取后留有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，柱色谱分离纯化，以石油醚：乙酸乙酯＝2：1到纯乙酸乙酯洗脱，得(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸叔丁酯2.0g，白色固体，收率：66％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.36(s,1H),7.84-7.87(m,2H),7.75-7.78(m,2H),6.78(td,J＝5.87,15.41Hz,1H),6.30(td,J＝1.58,15.36Hz,1H),3.07(dd,J＝1.47,5.87Hz,2H),2.18(s,6H),1.53(s,9H)，MS(ESI)：305.1(M+H)+。将所得干燥的(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸叔丁酯于5mL三氟乙酸中搅拌反应过夜，减压蒸馏除去三氟乙酸，得(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸的三氟乙酸盐留待下一步反应。
(6)N-((1r,4r)-4-((5'-氯-6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-二吡啶]-2'-基)氨基)环己基)-4-((E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酰胺(ICDK9-7-1)的合成：将步骤(4)所得产物N2'-((1r,4r)-4-氨基环己基)-5'-氯-N6-(3-氟苄基)-[2,4'-二吡啶]-2',6-二胺(217mg,0.5mmol)与步骤(5)所得产物(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸的三氟乙酸盐(362mg,1mmol)以及1-羟基苯并三唑(HOBT)(81mg,0.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(115mg,0.6mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺(232mg,18mmol)室温反应12h，TLC检测反应完全后，将反应液搅拌下倒入20mL冰水中，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后，分出有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，利用柱层析色谱，以二氯甲烷：甲醇＝20：1的展开剂体系过柱分离，得到N-((1r,4r)-4-((5'-氯-6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-二吡啶]-2'-基)氨基)环己基)-4-((E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酰胺(ICDK9-7-1)200mg，白色固体，收率：61％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.35(s,1H),8.15(d,J＝7.70Hz,1H),8.02(s,1H),7.83(d,J＝8.62Hz,2H),7.74(d,J＝8.62Hz,2H),7.50(t,J＝7.79Hz,1H),7.32-7.39(m,1H),7.27(t,J＝5.96Hz,1H),7.19(d,J＝7.52Hz,1H),7.13-7.17(m,1H),7.05(d,J＝2.02Hz,1H),6.74-6.81(m,2H),6.68(d,J＝7.52Hz,1H),6.62(s,1H),6.58(d,J＝8.44Hz,1H),6.33(d,J＝15.41Hz,1H),4.55(d,J＝5.87Hz,2H),3.75-3.84(m,1H),3.65(d,J＝6.79Hz,1H),3.13(d,J＝5.50Hz,2H),2.49-2.54(m,1H),2.23(s,6H),2.03(d,J＝10.64Hz,2H),1.89(d,J＝10.45Hz,2H),1.41-1.54(m,2H),1.30(d,J＝12.10Hz,2H),1.23(br.s.,1H)。
实施例2：(E)-4-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基)-N-(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(ICDK9-7-2)的合成
本实施例的反应式如下所示：
Figure BDA0003102150040000121
(1)叔丁基(1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯(中间体1)的合成：将2-氟-4-溴吡啶(1.76g,10mmol)与哌啶-3-基氨基甲酸叔丁酯(2.01g,10mmol)溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二异丙基乙胺(3.87g,30mmol)，氮气置换反应体系后升温至120℃反应3h。TLC检测，2-氟-4-溴吡啶反应完全后，稍冷，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，有固体析出，抽滤，取滤饼，干燥后得白色固体(1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯3.17g，收率89％。取所得(1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯(3.37g,9.5mmol)与连硼酸频哪醇酯(3.05g,12mmol)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(2.79g,28.5mmol)依次加入反应瓶中，加入25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，于氮气保护下升温至90℃反应3h，TLC检测(1-(4-溴吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸叔丁酯反应完全后，稍冷，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，用(25mL×3)乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用适量纯水、饱和氯化钠溶液反萃后，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，蒸除有机溶剂，残留粗品用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂选择石油醚：乙酸乙酯＝4：1，得白色粉末中间体叔丁基(1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯，共3.20g，收率80％。
(2)叔丁基(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯(中间体2)的合成：取厚壁耐压瓶，依次称取加入中间体6-溴-N-(3-氟苄基)吡啶-2-氨(281mg,1mmol)与中间体叔丁基(1-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼环-2-基)吡啶-2-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯(443mg,1.1mmol)以及碳酸钾(414mg,3mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(30mg)，加入溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚:水＝4:1)，氮气置换3次，升温至120℃反应过夜，TLC检测反应结束后，冷至室温后，产物析出，反应液抽滤，滤饼用少量乙二醇二甲醚洗涤后，干燥得粗品；粗品溶于二氯甲烷：甲醇＝10：1体系，加入硅胶拌样，利用硅胶层析色谱柱分离纯化，洗脱剂选石油醚：乙酸乙酯＝1：1，得到化合物叔丁基(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯(中间体2)，白色粉末，248mg，收率52％。
(3)2'-(3-氨基哌啶-1-基)-N-(3-氟苄基)-[2,4'-联吡啶]-6-胺(中间体3)的合成：取步骤(2)得到的叔丁基(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)氨基甲酸酯溶于体积比二氯甲烷:三氟乙酸＝2:1的体系中室温搅拌反应2h，减压蒸除二氯甲烷和三氟乙酸，将残留固体继续用二氯甲烷分散，搅拌下三乙胺处理至碱性(pH＝8),有机相浓缩后加入硅胶拌样，用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂二氯甲烷:甲醇:氨＝10:1:0至二氯甲烷:甲醇:氨＝10:1:0.1，得2'-(3-氨基哌啶-1-基)-N-(3-氟苄基)-[2,4'-联吡啶]-6-胺(中间体3)，白色粉末。
(4)(E)-4-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基)-N-(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(ICDK9-7-2)的合成：将步骤(3)所得产物2'-(3-氨基哌啶-1-基)-N-(3-氟苄基)-[2,4'-联吡啶]-6-胺(189mg,0.5mmol)与(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸的三氟乙酸盐(362mg,1mmol)以及1-羟基苯并三唑(HOBT)(81mg,0.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(115mg,0.6mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺(232mg,18mmol)室温反应12h，TLC检测反应完全后，将反应液搅拌下倒入20mL冰水中，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后，分出有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，利用柱层析色谱，以二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂体系过柱分离，得到(E)-4-(4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基)-N-(1-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌啶-3-基)苯甲酰胺(ICDK9-7-2)151mg，白色固体，收率52％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.37(s,1H),8.17(br d,J＝7.79Hz,1H),8.00(s,1H),7.86(br d,J＝8.52Hz,2H),7.78(br d,J＝8.52Hz,2H),7.53(t,J＝7.83Hz,1H),7.31-7.37(m,1H),7.24(br t,J＝6.01Hz,1H),7.16(br d,J＝7.70Hz,1H),7.13(br d,J＝10.05Hz,1H),7.00-7.06(m,1H),6.72-6.79(m,2H),6.61-6.70(m,1H),6.56-6.59(m,1H),6.52(d,J＝8.46Hz,1H),6.31(br d,J＝16.04Hz,1H),4.60(br d,J＝5.89Hz,2H),3.62-3.72(m,1H),3.15(br d,J＝5.48Hz,2H),2.18(s,6H),2.03-2.10(m,2H),1.92(br d,J＝10.47Hz,2H),1.51-1.55(m,2H),1.28-1.39(m,2H)。
实施例3：(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-3)的合成
本实施例的反应式如下所示：
Figure BDA0003102150040000141
(1)4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊烷-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体1)的合成：取2-氟-5-溴吡啶(1.76g,10mmol)与N-Boc-哌嗪(1.86g,10mmol)溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二异丙基乙胺(3.87g,30mmol)，氮气置换反应体系后升温至120℃反应3h。TLC检测，2-氟-5-溴吡啶反应完全后，稍冷，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，有固体析出，抽滤，取滤饼，干燥后得白色固体4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯3.15g，收率92％，1H NMR(600MHz,CHLOROFORM-d)δ8.00-8.03(m,1H),6.74-6.79(m,2H),3.55-3.58(m,8H),1.48(s,9H)。
取所得4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(3.25g,9.5mmol)与连硼酸频哪醇酯(3.05g,12mmol)、1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(0.1mmol)、以及干燥的无水醋酸钾(2.79g,28.5mmol)依次加入反应瓶中，加入25mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，于氮气保护下升温至90℃反应3h，TLC检测4-(5-溴吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯反应完全后，稍冷，将反应液搅拌下倒入100mL冰水中，用(25mL×3)乙酸乙酯萃取，合并有机相，依次用适量纯水、饱和氯化钠溶液反萃后，收集有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，蒸除有机溶剂，残留粗品用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂选择石油醚：乙酸乙酯＝5：1，得白色粉末中间体4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊烷-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯，共3.00g，收率81％；1H NMR(600MHz,CHLOROFORM-d)δ8.50-8.59(m,1H),7.80-7.87(m,1H),6.55-6.63(m,1H),3.59-3.64(m,4H),3.52-3.56(m,4H),1.46-1.53(m,12H),1.32-1.35(s,9H)。
(2)4-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体2)的合成：取厚壁耐压瓶，依次称取加入中间体6-溴-N-(3-氟苄基)吡啶-2-氨(281mg,1mmol)与中间体4-(5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂戊烷-2-基)吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(428mg,1.1mmol)以及碳酸钾(414mg,3mmol)和1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(30mg)，加入溶于5mL溶剂(乙二醇二甲醚:水＝4:1)，氮气置换3次，升温至120℃反应过夜，TLC检测反应结束后，冷至室温后，产物析出，反应液抽滤，滤饼用少量乙二醇二甲醚洗涤后，干燥得粗品；粗品溶于二氯甲烷：甲醇＝10：1体系，加入硅胶拌样，利用硅胶层析色谱柱分离纯化，洗脱剂选石油醚：乙酸乙酯＝1：1，得到化合物4-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(中间体2)，白色粉末，278mg，收率60％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ8.46(d,J＝2.38Hz,1H),7.97(d,J＝5.32Hz,1H),7.84(dd,J＝2.48,8.89Hz,1H),7.35(dt,J＝6.33,7.84Hz,1H),7.19(d,J＝7.52Hz,1H),7.15(br d,J＝10.27Hz,1H),7.11(t,J＝6.14Hz,1H),7.03(dt,J＝2.57,8.53Hz,1H),6.93(d,J＝8.99Hz,1H),6.79(dd,J＝1.47,5.32Hz,1H),6.73(s,1H),4.54(d,J＝6.05Hz,2H),3.54-3.59(m,4H),3.44(br d,J＝4.77Hz,5H),1.43(s,9H)。
(3)：N-(3-氟苄基)-6'-(哌嗪-1-基)-[2,3'-联吡啶]-6-胺(中间体3)的合成：取步骤(2)得到的4-(6-((4-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯溶于体积比二氯甲烷:三氟乙酸＝2:1的体系中室温搅拌反应2h，减压蒸除二氯甲烷和三氟乙酸，将残留固体继续用二氯甲烷分散，搅拌下三乙胺处理至碱性(pH＝8)，有机相浓缩后加入硅胶拌样，用硅胶柱层析色谱分离纯化，洗脱剂二氯甲烷:甲醇:氨＝10:1:0至二氯甲烷:甲醇:氨＝10:1:0.1，得N-(3-氟苄基)-6'-(哌嗪-1-基)-[2,3'-联吡啶]-6-胺(中间体3)，白色粉末。
(4)(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-3)的合成：将步骤(3)所得产物N-(3-氟苄基)-6'-(哌嗪-1-基)-[2,3'-联吡啶]-6-胺(181mg,0.5mmol)与(E)-4-(4-(二甲氨基)丁-2-烯酰胺)苯甲酸的三氟乙酸盐(362mg,1mmol)以及1-羟基苯并三唑(HOBT)(81mg,0.6mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)(115mg,0.6mmol)溶于5mL的N,N-二甲基甲酰胺中，冰浴下加入N,N-二异丙基乙胺(232mg,18mmol)室温反应12h，TLC检测反应完全后，将反应液搅拌下倒入20mL冰水中，用二氯甲烷(20mL×3)萃取，合并有机相，饱和食盐水洗涤后，分出有机相，加入无水硫酸钠干燥，过滤除去干燥剂，有机相浓缩加入硅胶拌样，利用柱层析色谱，以二氯甲烷：甲醇＝10：1的展开剂体系过柱分离，得到(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-3)178mg，白色固体，收率：61％，1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.45(s,1H),8.74(d,J＝2.38Hz,1H),8.69(dd,J＝1.28,4.22Hz,1H),8.47(dd,J＝1.28,8.44Hz,1H),8.10(dd,J＝2.48,8.89Hz,1H),7.75(d,J＝8.62Hz,2H),7.40-7.43(m,1H),7.35(dt,J＝6.24,7.89Hz,1H),7.22(d,J＝7.70Hz,1H),7.15-7.20(m,2H),6.99-7.05(m,2H),6.88(d,J＝8.80Hz,1H),6.79(td,J＝6.83,15.31Hz,1H),6.40-6.46(m,2H),4.57(brd,J＝6.05Hz,2H),3.70(br d,J＝6.42Hz,2H),3.59-3.66(m,4H),3.35-3.45(m,4H),2.63(s,6H)。
本发明所列举的其余化合物：(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6-((4-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-4)、(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6'-((4-甲基苄基)氨基)-[3,3'-联吡啶]-6-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-5)、(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(2'-((3-氟苄基)氨基)-[3,4'-联吡啶]-6-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-6)、(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(2'-((4-甲氧基苄基)氨基)-[3,4'-联吡啶]-6-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-7)、(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(2'-((4-甲基苄基)氨基)-[3,4'-联吡啶]-6-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-8)、(E)-4-(二甲基氨基)-N-(4-(4-(6-((4-甲基苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-6'-基)哌嗪-1-羰基)苯基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-9)、(E)-N-(4-(4-(5'-氯-6-((3-氟苄基)氨基)-[2,4'-联吡啶]-2'-基)哌嗪-1-羰基)苯基基)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺(ICDK9-7-10)N-((1r，4r)-4-((5'-氯-6-((3-氟苄基)氨基)-[2,3'-联吡啶]-2'-基)氨基)环己基)-4-((E)-4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰胺基)苯甲酰胺(ICDK9-7-11)与化合物ICDK9-7-1、ICDK9-7-2、ICDK9-7-3的合成方法类似。
实施例4：本发明化合物对癌细胞增长的影响
MTS测细胞增殖。将不同的肿瘤细胞铺在96孔板中，每孔3000个细胞。12h后加入目标化合物处理，化合物在培养液中稀释为100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM和0.003μM，72h后弃去培养液，将新鲜的培养液和MTS按照20∶1的比例混合，每孔加入100μL混合液到，在37℃孵育2h，然后在490nm波长下检测。MTS购自promega。结果见表2及表3。
表2.ICDK9-7-1对不同细胞系的IC50(μM)
细胞 A498 ACNH RCC4 Caki-1 MCF-7 HCC1937 BT549
ICDK9-7-1 0.32 0.72 0.68 0.97 1.91 1.55 1.99
细胞 HCC1806 HST578 MDA-MB-468 AD293 HK-2 MCF10A MDA-MB-231
ICDK9-7-1 0.88 0.49 2.05 1.37 1.46 1.76 2.04
表3.ICDK9-7-1系列化合物对不同肿瘤细胞的抑制作用IC50(μM)
Figure BDA0003102150040000171
实施例5：化合物ICDK9-7-1靶向作用于CDK9
将构建好的质粒pCMV10-CDK9转染到293T细胞中，48h后收集细胞，用裂解液裂解细胞，然后离心取上清液，将上清液分为两个大组，记为control组和对照组，每个大组再分为7个小组，每个小组100μL的上清，control组加DMSO，对照组加ICDK9-7-1终浓度为250μM，然后在25℃水浴30min，水浴后，将其放在温度梯度PCR仪上进行加热3min，最后进行离心，取上清，做western blot。实验原理参见Science 341，84(2013)。
结论：结果如图1所示，CDK9是化合物ICDK9-7-1的作用靶标。
实施例6：化合物ICDK9-7-1靶向CDK9研究
为了确证ICDK9-7-1的作用靶点是CDK9，而不是上游关键调控蛋白，本实施例设计合成了ICDK9-7-1的BSA功能分子ICDK9-7-1-Bio(HRMS:[M+H]+1127.5195，结构式如下所示)进行了体外靶点结合实验，以肾癌A498细胞扩增提取足量的细胞全蛋白裂解液，将裂解液分为五组，依次加入10μM Biotin(空白组)、10μM功能分子、10μM功能分子+10倍ICDK9-7-1、10μM功能分子+100倍ICDK9-7-1和10μM功能分子+50倍ICDK9孵育过夜，然后每组加入50μL的键有strepavidin的琼脂珠子，孵育，PBS洗脱后，经功能分子钓出的靶蛋白用免疫印迹验证(结果如图2)，功能分子从蛋白裂解液中调出了靶蛋白CDK9，并且ICDK9-7-1可以以浓度依赖性的方式竞争功能分子结合CDK9(而对CDK7、PARP、BCL2不产生作用)。表明CDK9是ICDK9-7-1的作用靶标，而CDK7、PARP、BCL2不是。而化合物ICDK9表现出对ICDK9-7-1更强的竞争作用，说明ICDK9-7-1和ICDK9对靶标CDK9有共同的结合区域。
Figure BDA0003102150040000181
Figure BDA0003102150040000191
实施例7：ICDK9-7-1系列化合物对CDK9激酶活性抑制实验
将构建好的质粒pCMV10-CDK9复合物共转染到293T细胞中，48h后收集细胞，用裂解液裂解细胞，然后离心取上清，加入M2 beads和上清孵育4h，然后用裂解液洗脱beads，然后用3Xflag peptide进行竞争洗脱beads，再浓缩得到激酶复合物。通过用考染确定激酶的量，然后用promega公司的试剂盒ADP-GloTMKinase Assay ADP-GloTMKinase Assay确定具有酶的活性，底物为CTD短肽，确定了每个反应用0.1μg的酶。再将化合物稀释为100μM、30μM、10μM、3μM、1μM、0.3μM、0.1μM、0.03μM、0.01μM和0.003μM，参照ADP-GloTMKinase AssayADP-GloTMKinase Assay进行化合物对酶活的抑制效果的测定。另外对本专利化合物在10μM浓度下进行了CDK9激酶活性抑制实验，结果见表4
结论：ICDK9-7-1系列化合物对CDK9激酶表现出了较好的抑制活性(表4)，其中ICDK9-7-1对CDK9激酶IC50为200nM(图3)。
表4. 10μM本系列化合物对CDK9的激酶活性抑制率
编号 抑制率 编号 抑制率
ICDK9-7-1 101.2％ ICDK9-7-7 43.9％
ICDK9-7-2 23.6％ ICDK9-7-8 47.1％
ICDK9-7-3 71.9％ ICDK9-7-9 36.0％
ICDK9-7-4 97.1％ ICDK9-7-10 98.6％
ICDK9-7-5 96.8％ ICDK9-7-11 63.20％
ICDK9-7-6 40.6％
实施例8：ICDK9-7-1系列化合物抑制CDK9功能研究
CDK9/cyclinT参与组成转录延伸因子P-TEFb复合物，CDK9/cyclinT对RNA聚合酶II的羧基端结构域2号位的磷酸化是其在转录方面发挥功能的重要步骤之一，CDK9抑制剂可以阻断CDK9/cyclinT1对RNA聚合酶II的羧基端结构域2号位的磷酸化作用。因此，本实施例以ICDK9-7-1系列化合物对RNA聚合酶II的羧基端结构域2号位的磷酸化水平的影响作为一项指标，评价该系列化合物对CDK9的抑制效果(图4)。本实施例测试了ICDK9-7-1系列化合物处理后的A498细胞中RNA聚合酶II的羧基端结构域2号位的磷酸化水平，发现化合物ICDK9-7-1、ICDK9-7-4、ICDK9-7-5、ICDK9-7-10等都很好地抑制了RNA聚合酶II的羧基端结构域2号位的磷酸化水平。而作为比较发现，这些化合物对CDK7调控的丝氨酸5号位的磷酸化抑制作用作用不明显。
实施例9：化合物ICDK9-7-1对肿瘤细胞信号通路的影响
本实施例在肾癌A498细胞株中，评估了化合物ICDK9-7-1对细胞中CDK9以及与其信号通路相关的其他蛋白，如RNA聚合酶II的2号位与5号位丝氨酸磷酸化水平、MCL-1、c-MYC、BCL-2蛋白的表达情况。本实施例考察了ICDK9-7-1处理肾癌A498细胞株后相关蛋白与药物浓度依赖性以及时间依赖性关系。结果如图5所示。
结论：本发明化合物ICDK9-7-1对MCL-1、c-MYC、BCL-2以及RNA聚合酶II 2号位和5号位丝氨酸磷酸化水平有明显的抑制作用。
实施例10：化合物ICDK9-7-1联合其它药物可用于肿瘤免疫疗法
鉴于本发明化合物可显著降低癌细胞中PD-L1表达，本实施例尝试将其用于肿瘤免疫疗法，先用200nM的JQ1处理A498细胞12h，再用该化合物处理24h，结果如图6所示，发现两者联合用药可以显著地下调抗凋亡蛋白MCL-1、BCL2以及癌基因c-MYC。而且两者联合用药还可以显著地下调免疫检查点PD-L1的表达，由此本实施例设想是将该化合物和BRD4抑制剂(JQ1)以及CAR-T三药联用，增加对肿瘤细胞的杀伤作用，从而达到最佳的治疗效果。
实施例11：化合物ICDK9-7-1在人的肾癌A498细胞小鼠肿瘤模型中对实体瘤的抑制
经厦门大学实验动物中心从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买18只4-5周龄的Balb/c雌性小鼠并饲养于厦门大学实验动物中心SPF级实验室中。由专业饲养人员提供灭菌处理过的食物饮水和垫料，相关小鼠的所有操作均在无菌条件下进行。小鼠购回适应环境后的第五天分别在所有小鼠右侧前腋部皮下注入5×106个/100μL的A498肾癌细胞(分散于PBS缓冲液中)。第30天，确定每只小鼠成瘤并且小鼠接种的肿瘤长到足够的体积，将所有小鼠分成三组，对照组(Vehicle)、阳性对照组(ICDK9)、实验组(ICDK9-7-1)，每组六只小鼠。每两天向第一组小鼠腹腔注射含10％DMSO的5％的葡萄糖水溶液(D5W)，阳性对照组每两天天腹腔注射10mg/kg鼠重的化合物ICDK9(浓度为1mg/mL的含10％DMSO的5％的葡萄糖水溶液)，实验组每两天天腹腔注射10mg/kg鼠重的化合物ICDK9-7-1(浓度为1mg/mL的含10％DMSO的5％的葡萄糖水溶液)。从给药第一天开始每隔一天用游标卡尺测量记录每只小鼠的荷瘤大小(长和宽)，并测量每只小鼠的体重，观察化合物对小鼠体重的影响。给药第34天处死所有小鼠，剥离出皮下肿瘤，称重、拍照比较。取每组小鼠心、肝、脾、肺、肾做H&E染色，考察化合物毒性，用肿瘤样品组织分切为两部分分别用于H&E染色免疫组化和制备蛋白裂解液样品。统计给药第一天到给药第34天每组小鼠的荷瘤体积(按长×宽×宽/2mm3计算荷瘤体积大小)增长趋势和每组小鼠的体重随时间的变化趋势。
实验结果如图7所示，结果表明本发明公开的化合物ICDK9-7-1在10mg/kg剂量能明显抑制小鼠荷瘤增长，并对体重没有影响，说明化合物ICDK9-7-1能有效抑制小鼠皮下肿瘤增长，并且对老鼠本身的毒性小。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (14)

1.一种CDK9抑制化合物，其特征在于：其结构式为
Figure FDA0003102150030000011
其中，A为烷基二胺，X为卤素或H，R为取代苄基。
2.如权利要求1所述的一种CDK9抑制化合物，其特征在于：所述A为
Figure FDA0003102150030000012
Figure FDA0003102150030000013
3.如权利要求1所述的一种CDK9抑制化合物法，其特征在于：所述卤素为氯。
4.如权利要求1所述的一种CDK9抑制化合物，其特征在于：所述R为间氟苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基或对甲基苄基。
5.如权利要求1所述的一种CDK9抑制化合物，其特征在于：所述A为
Figure FDA0003102150030000014
Figure FDA0003102150030000015
所述X为氯或H，所述R为间氟苄基、对氟苄基、对甲氧基苄基或对甲基苄基。
6.如权利要求1至5中任一权利要求所述的一种CDK9抑制化合物，其特征在于：其结构式为
Figure FDA0003102150030000016
Figure FDA0003102150030000021
7.权利要求1至6中任一权利要求所述的CDK9抑制化合物在制备治疗CDK9相关疾病中的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物中还包括BRD4抑制剂。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述CDK9相关疾病包括肾癌、非小细胞肺癌、肝癌、脑胶质瘤和乳腺癌。
11.一种癌症治疗药物组合物，其特征在于：包括权利要求1至6中任一权利要求所述的CDK9抑制化合物、其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯、酸、代谢物、水合物和前药中的至少之一，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋型剂。
12.如权利要求11所述的一种癌症治疗药物组合物，其特征在于：其有效成分还包括BRD4抑制剂。
13.如权利要求12所述的一种癌症治疗药物组合物，其特征在于：其有效成分为所述CDK9抑制化合物和BRD4抑制剂。
14.如权利要求11至13中任一权利要求所述的一种癌症治疗药物组合物，其特征在于：其剂型包括糖浆剂、酏剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊、锭剂、水溶液、霜剂、膏剂、洗液剂、凝胶剂、乳剂或气雾剂。
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