CN112125911A - Cdk9抑制剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种CDK9抑制剂，CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，且化学结构通式如式I所示：

CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，该嘧啶并吡咯类激酶所适应的蛋白靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶CDK9，该CDK9抑制剂表现出较高的特异性以及较低的细胞毒性，提供了一种用于预防或治疗肿瘤生长与转移的对CDK9具有选择性的、毒副效果小、作用效果强的CDK9抑制剂，从而通过该抑制剂调控CDK9的生物学功能，抑制肿瘤的生长、增殖过程。

Description

CDK9抑制剂及其制备方法与应用

技术领域

本申请属于药物化学技术领域，尤其涉及一种CDK9抑制剂及其制备方法，以及一种药物组合物。

背景技术

目前，癌症的发病率越来越高，全球每年约有420万人死于癌症。中国的癌症在2012年的发病个案占全球近一半，高居第一位。治疗癌症的药物主要包括细胞毒性药物(cytotoxic drugs)与分子靶向药物(molecular target drugs)。细胞毒性药物，即传统化疗药物，主要通过杀伤迅速分裂的肿瘤细胞来达到抑制肿瘤生长的目的。然而，细胞毒性药物同时可以危害在正常情况下快速分裂的细胞如：骨髓、胃肠道及毛囊细胞等，导致化疗中常见的副反应：骨髓抑制、粘膜炎、脱发等。靶向药物治疗通过干扰影响肿瘤细胞增生的特定蛋白靶标来实现治疗。一个优秀的蛋白或酶靶标具有肿瘤细胞特异性的突变或其他遗传改变，而在正常组织细胞中则没有，从而实现特异性的细胞选择性。但是，靶向药物往往由于耐药性和靶点分子相关毒副作用等缺陷，导致许多药物候选尽管在动物模型上呈现较好效果，在临床实验中失败。采取靶向抑制剂与细胞毒性药物联合的用药方式，可以通过两种不同的作用机制来提高药效，进而通过降低给药量来获得更佳的药效/毒性窗口。

细胞周期蛋白依赖激酶(cyclin-dependent kinase,CDKs)是调控细胞周期的一个蛋白家族。其中CDK1～CDK7与相应的调节亚基(细胞周期蛋白cyclin)结合组成的复合物是细胞周期的主要调节者。作用于CDK4/CDK6的药物瑞博西尼(ribociclib)已获得上市，其作用机制正是抑制肿瘤细胞从G1期进入S期，从而抑制癌细胞的分裂与增殖；而CDK9与cyclin T组成的正性转录因子pTEFb复合物在细胞基因转录的调节中处于核心地位。CDK9是该复合物中的催化亚基，通过磷酸化RNA聚合酶II及其它转录因子使转录从起始部位得以延伸。CDK4/CDK9及相关功能的异常与多种疾病如癌症、炎症、艾滋病、心血管疾病的治疗密切相关。

然而，目前靶向CDK4/CDK9的药物研究稀缺，绝大多数为非选择性抑制剂，常见的CDK9的非选择性抑制剂的代表药物包括flavopiridol、P276-00、roscovitine、SCH-727965、AT7519和R547，非选择性抑制剂在使用过程中具有明显的毒副作用如中性粒细胞减少症、血小板减少症等。因此，提供一类高活性且具有选择性的作用于CDK9的嘧啶并吡咯类激酶抑制剂十分重要。

发明内容

本申请的目的在于提供一种CDK9抑制剂及其制备方法，以及一种药物组合物；旨在解决现有技术中CDK9非选择性抑制剂毒副效果明显且作用效果差的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种CDK9抑制剂，所述CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，且化学结构通式如式I所示：

其中，R¹选自氰基、卤素、

中的任意一种，且X为CH₂、O、S或含N的取代基；Y为O、S或N-R¹²；A为CR¹²、CR¹²R¹³、N或NR¹²；B为CR¹²或N；R⁶～R¹³为H、OH、NH₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基；

R²选自C₃-C₇环烷基、立方烷基、金刚烷基、并环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环芳香基、硅烷基中的任意一种；

R³选自氨基、氰基、卤素、

中的任意一种，且Z为O、S或含N取代基；R¹⁴为H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基；

R⁴选自氨基、氰基、三氟甲基中的任意一种；

R⁵选自H、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环烷基。

第二方面，本申请提供一种CDK9抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

第三方面，本申请提供一种药物组合物，所述药物组合物包括含有所述的CDK9抑制剂的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本申请第一方面提供的一种CDK9抑制剂，所述CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，该嘧啶并吡咯类激酶所适应的蛋白靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶CDK9，该抑制剂以反式-环己二胺的骨架结构的特定立体构型为母核结构，同时提供了R¹、R²、R³、R⁴、R⁵五个取代基位置，可以提高该抑制剂的空间敏感性，促进抑制剂与CDK9的ATP口袋较好地结合，进而提高对CDK4/CDK9的酶活性，同时反应过程中IC₅₀<20nM，该CDK9抑制剂表现出较高的特异性以及较低的细胞毒性，提供了一种用于预防或治疗肿瘤生长与转移的对CDK9具有选择性的、毒副效果小、作用效果强的CDK9抑制剂，从而通过该抑制剂调控CDK9的生物学功能，抑制肿瘤的生长、增殖。

本申请第二方面提供的CDK9抑制剂的制备方法，该制备方法通过取代反应、催化环化/氧化反应、缩合或环化反应、胺化或烷基化反应，实现CDK9抑制剂的制备，反应过程中原材料易获取，且反应过程简单易操作，正向反应速率高，底物原子利用率高，显著提高了其生产效率，降低生产成本。

本申请第三方面提供的一种药物组合物，所述药物组合物包括含有所述的CDK9抑制剂的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂；基于CDK9抑制剂对CDK9具有较高的特异性以及较低的细胞毒性，该药物组合物对预防或治疗肿瘤生长与转移具有较强的作用效果，应用性广。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的CDK9抑制剂和溶剂对照组进行单剂量毒性实验中肿瘤体积分析图。

图2是本申请实施例提供的CDK9抑制剂P3-42、抑制剂YH-011、P3-42和YH-011的组合物、溶剂对照组进行体内抗肿瘤活性分析实验中试验动物体重分析图。

图3是本申请实施例提供的CDK9抑制剂P3-42、抑制剂YH-011、P3-42和YH-011的组合物、溶剂对照组进行体内抗肿瘤活性分析实验中试验动物肿瘤体积分析图。

图4是本申请实施例提供的CDK9抑制剂P3-01与CDK9相互作用的示意图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本发明实施例中所涉及的化合物及其衍生物均是按照IUPAC(国际纯粹与应用化学联合会)或CAS(化学文摘服务社，位于俄亥俄州哥伦布市)命名系统命名的。因此，本发明实施例中具体涉及到的化合物基团做如下阐述与说明：

本发明中的术语C_0-10烷基，C₀烷基是指H，因此，C_0-10烷基包括H、C₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基、C₇烷基、C₈烷基、C₉烷基、C₁₀烷基。

本发明中的术语C_1-10亚烷基，包括C₁亚烷基、C₂亚烷基、C₃亚烷基、C₄亚烷基、C₅亚烷基、C₆亚烷基、C₇亚烷基、C₈亚烷基、C₉亚烷基、C₁₀亚烷基。

本发明中的术语C_3-10环烷基，包括C₃环烷基、C₄环烷基、C₅环烷基、C₆环烷基、C₇环烷基、C₈环烷基、C₉环烷基、C₁₀环烷基。

本发明中的术语C_1-6烷基，包括HC₁烷基、C₂烷基、C₃烷基、C₄烷基、C₅烷基、C₆烷基。

本发明中的术语C_1-6直链烷基，包括甲基、乙基、C₃直链烷基、C₄直链烷基、C₅直链烷基、C₆直链烷基。

本发明中的术语C_3-6环烷基，包括C₃环烷基、C₄环烷基、C₅环烷基、C₆环烷基。

本发明的术语卤素，包括氟、氯、溴、碘。

本发明的术语杂环烷基是指含3-10个环原子，优选5-10个环原子的非芳香的饱和单环或多环环系，其中的一个或多个环原子不是碳原子，而是例如氮、氧或硫原子。优选的杂环烷基含有5-6个环原子。杂环烷基前的前缀氮杂、氧杂或硫杂分别是指至少有一个氮、氧或硫原子作为环原子。代表性的单环杂环烷基包括哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、噻唑烷基、1,3-二氧戊环基、1,4-二氧杂环己烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。

本发明的术语杂环芳香基是指含5-14个环原子，优选5-10个环原子的芳香单环或多环环系，其中的一个或多个环原子不是碳原子，而是例如氮、氧或硫原子。优选的杂环芳香基含有5-6个环原子。代表性的杂环芳香基包括吡嗪基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、嘧啶基、异噁唑基、异噻唑基、噁唑基、噻唑基、吡唑基、呋咱基、吡咯基、吡唑基、三唑基、1,2,4-硫杂二唑基、吡嗪基、哒嗪基、喹喔啉基、2,3-二氮杂萘基、咪唑并[1,2-a]吡啶、咪唑并[2,1-b]噻唑基、苯并呋咱基、吲哚基、氮杂吲哚基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、喹啉基、咪唑基、噻吩并吡啶基、喹唑啉基、噻吩并嘧啶基、吡咯并吡啶基、咪唑并吡啶基、异喹啉基、苯并氮杂吲哚基、1,2,4-三嗪基、苯并噻唑基等。

本发明的术语Me代表甲基的缩写。本发明的术语Ph代表苯基的缩写。本发明的术语Boc代表叔丁氧羰基的缩写。

像本发明所描述的，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基所取代，如上面的通式化合物，或者像实施例里面特殊的例子，子类，和本发明所包含的一类化合物。应了解“任选取代的”这个术语与“取代或非取代的”这个术语可以交换使用。一般而言，术语“取代的”表示所给结构中的一个或多个氢原子被具体取代基所取代。除非其他方面表明，一个任选的取代基团可以在基团各个可取代的位置进行取代。当所给出的结构式中不只一个位置能被选自具体基团的一个或多个取代基所取代，那么取代基可以相同或不同地在各个位置取代。其中的取代基可以是，但并不限于氘，氟，氯，溴，碘，氰基，羟基，硝基，氨基，羧基，烷基，烷氧基，烷氧基烷基，烷氧基烷氧基，烷氧基烷氨基，芳氧基，杂芳基氧基，杂环基氧基，芳基烷氧基，杂芳基烷氧基，杂环基烷氧基，环烷基烷氧基，烷氨基，烷氨基烷基，烷氨基烷氨基，环烷基氨基，环烷基烷氨基，烷硫基，卤代烷基，卤代烷氧基，羟基取代的烷基，羟基取代的烷氨基，氰基取代的烷基，氰基取代的烷氧基，氰基取代的烷氨基，氨基取代的烷基，烷基酰基，杂烷基，环烷基，环烯基，环烷基烷基，杂环基，杂环基烷基，杂环基酰基，芳基，芳基烷基，芳氨基，杂芳基，杂芳基烷基，杂芳基氨基，酰胺基，磺酰基，氨基磺酰基等等。

本发明的术语“单位剂型”指适合作为人受试者和其它哺乳动物的单一剂量的物理上离散的单位，每个单位包含与需要的药物载体结合的经计算可在治疗期间的过程中产生期望的预防或治疗效果的预定量的活性物质。

本发明的术语“辅料”含义是该成分没有生物活性或其他不良活性的杂质，例如该成分可以纳入公开的药物制剂并给与患者，但不引起显著的不良生物效果或以有害的方式和该制剂中包含的其他成分产生相互作用。

本发明的术语“治疗”包括抑制、延迟、缓和、减弱、限制、减轻或消退疾病、障碍、病症或状态，其发生和/或进程，和/或其症状。

本发明的术语“预防”包括减小以下风险：患有、感染或经历疾病、障碍、病症或状态，其发生和/或进程，和/或其症状。

本发明的术语“包含”表示"开放"或"包含性"用语，使得它们包括列举的要素，而且还允许包括额外的、未提及的要素。

本发明的术语“约”通常意指值的+/-5％，更通常指值的+/-4％，更通常指值的+/-3％，更通常指值的+/-2％，更通常指值的+/-1％，更通常指值的+/-0.5％。

本申请实施例第一方面提供一种CDK9抑制剂，CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，且化学结构通式如式I所示：

本申请第一方面提供的一种CDK9抑制剂，CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，该嘧啶并吡咯类激酶所适应的蛋白靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶CDK9，该抑制剂以反式-环己二胺的骨架结构的特定立体构型为母核结构，同时提供了R¹、R²、R³、R⁴、R⁵五个取代基位置，可以提高该抑制剂的空间敏感性，促进抑制剂与CDK9的ATP口袋较好地结合，进而提高对CDK4/CDK9的酶活性，同时反应过程中IC₅₀<20nM，该CDK9抑制剂表现出较高的特异性以及较低的细胞毒性，提供了一种用于预防或治疗肿瘤生长与转移的对CDK9具有选择性的、毒副效果小、作用效果强的CDK9抑制剂，从而通过该抑制剂调控CDK9的生物学功能，抑制肿瘤的生长、增殖。

具体的，本申请提供的CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，其适应的蛋白靶点是丝氨酸/苏氨酸激酶CDK9，其化学结构通式中，以反式-环己二胺的骨架结构的特定立体构型为母核结构，同时提供了R¹、R²、R³、R⁴、R⁵五个取代基位置，可以提高该抑制剂的空间敏感性，促进抑制剂与CDK9的ATP口袋较好地结合，进而提高对CDK4/CDK9的酶活性。

具体的，R¹选自氰基、卤素、

中的任意一种，且X为CH₂、O、S或含N的取代基；Y为O、S或N-R¹²；A为CR¹²、CR¹²R¹³、N或NR¹²；B为CR¹²或N；R⁶～R¹³为H、OH、NH₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基。R¹位置的取代基位于吡咯环上，提供R¹位置具有不同的取代基，R¹位置的取代基能够与CDK9的活性区域的重要氨基酸形成氢键作用，可提高该抑制剂的活性，改变该抑制剂与CDK9的作用强度，进一步提高与CDK9的结合效果，提高对肿瘤细胞的抑制效果。

优选的，含N的取代基选自NH、N-O-H、N-取代烷基、N-O-取代烷基中的任意一种。选择连接-N的取代烷基或连接-N-O的取代烷基作为取代基，均能够提高该抑制剂的活性，活化该抑制剂与CDK9的相互作用效果，进而提供对肿瘤细胞的抑制作用。

优选的，R¹中，C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基中，烷基、烯基、炔基上的任意碳原子被单个或多个卤素取代。

具体的，R²选自C₃-C₇环烷基、立方烷基、金刚烷基、并环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环芳香基、硅烷基中的任意一种。R²位置的取代基位于吡咯环上，提供R²位置具有不同的取代基，R²位置的取代基为R¹位置的取代基的邻位，会影响CDK9抑制剂与CDK9结合时的空间位阻情况，因此，R²位置的取代基选择的是具有较大的空间位阻的取代基，保证该抑制剂与CDK9在结合的过程中，能够锚定蛋白骨架，提高二者的结合效果。

优选的，并环烷基选自[2,2,1]-并环烷基或[2,2,2]-并环烷基；进一步优选的，取代的杂环芳香基选自含N取代的杂环芳香基、含S取代的杂环芳香基、含O取代的杂环芳香基中的任意一种。

优选的，R²中，C_3-7环烷基、立方烷基、金刚烷基、并环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环芳香基、硅烷基中，烷基、芳基、杂环烷基、杂环芳香基、硅烷基上的任意碳原子被一个或两个以上的以下基团任意取代：卤素、氰基、-OC_0-10烷基、-S(O)_mC_0-10烷基、-SO₂N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)O(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)N(C_0-10烷基)、-C(＝O)C_0-10烷基、-C(＝O)OC_0-10烷基、-C(＝O)N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环芳香基、杂环烷基、芳基、-C_1-10烷基芳基、-C_1-10烷基杂环芳香基、-N杂环芳香基、-S杂环芳香基或-O杂环芳香基，其中，m为0、1或2。

具体的，R³选自氨基、氰基、卤素、

中的任意一种，且Z为O、S或含N取代基；R¹⁴为H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基。R³位置取代基位于吡咯环上，提供R³位置具有不同的取代基，R³位置取代基为R¹位置取代基的邻位取代基、R²位置取代基的间位取代基，R³位置取代基与R²位置取代基协同作用，均为对空间位阻较为敏感的取代基，通过在这两个位置同时进行取代，能够进一步提高CDK9抑制剂与CDK9的锚定作用，使二者稳定结合，为R¹位置取代基与蛋白质的ATP活性口袋相互作用提供支持，促进二者的相互作用，提高CDK9的抑制效果。

优选的，R³中，C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7环烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7环烷氧基中，烷基、烯基、炔基上的任意碳原子被单个或多个卤素取代。由于R³位置取代基与R²位置取代基为间位取代基且二者协同进行定位作用，当R²位置取代基选择空间位阻较大的取代基的情况下，R³位置取代基选择含有N、CN、Cl、Br、F、I、At、Ts等易于进行结合的取代基进行取代反应，进而提高抑制剂与CDK9的结合能力。

具体的，R⁴选自氨基、氰基、三氟甲基中的任意一种；R⁴位置取代基位于嘧啶环上，提供R⁴位置具有不同的取代基，主要是为了与R²位置取代基和R³位置取代基协同作用，共同调节该抑制剂的空间位阻，以保证该抑制剂能够与CDK9的ATP活性区域进行锚定，提高二者的结合效果。

具体的，R⁵选自H、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环烷基。R⁵位置取代基位于嘧啶环的侧链上，提供R⁵位置具有不同的取代基，R⁵位置的取代基能够与CDK9的活性区域的重要氨基酸形成氢键作用，与R¹位置的取代基可提高该抑制剂的活性，改变该抑制剂与CDK9的作用强度，进一步提高与CDK9的结合效果，提高对肿瘤细胞的抑制效果。

优选的，R⁵中，C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环烷基中，烷基、芳基、杂环烷基、杂环芳香基、烯基或炔基上的任意碳原子可被一个或两个以上的以下基团任意取代：卤素、-CN、-OC_0-10烷基、-S(O)_mC_0-10烷基、-SO₂N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)O(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)N(C_0-10烷基)、-C(＝O)C_0-10烷基、-C(＝O)OC_0-10烷基、-C(＝O)N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环芳香基、杂环烷基、芳基、-C_1-10烷基芳基、-C_1-10烷基杂环芳香基、-N杂环芳香基、-S杂环芳香基或-O杂环芳香基，其中，m为0、1或2。

优选的，本申请实施例还提供包括化学结构通式如式I的化合物，及其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物。

在一些实施例中，药学上可接受的盐包括酸加成盐和碱加成盐。优选的，酸加成盐包括但是不限于来自无机酸诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸和膦酸的盐，来自有机酸如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、链烷二酸、芳香酸和脂肪族和芳香族磺酸的盐，以及来自包含氨基酸的盐如精氨酸盐，葡糖酸盐，半乳糖醛酸盐。

在本发明优选实施例中，酸加成盐包括但是不限于硫酸盐，焦硫酸盐，硫酸氢盐，亚硫酸盐，亚硫酸氢盐，硝酸盐，磷酸，磷酸一氢盐，磷酸二氢盐，偏磷酸盐，焦磷酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，碘酸盐，乙酸盐，丙酸盐，辛酸盐，异丁酸盐，乙二酸盐，丙二酸盐，琥珀酸盐，辛二酸，癸二酸盐，富马酸盐，马来酸盐，苦杏仁酸盐，苯甲酸盐，氯代苯甲酸盐，甲基苯甲酸盐，二硝基苯甲酸盐，酞酸盐，苯磺酸盐，甲苯磺酸盐，苯基乙酸盐，柠檬酸盐，乳酸盐，马来酸盐，酒石酸，甲磺酸盐，精氨酸盐，葡糖酸盐，半乳糖醛酸盐。

进一步的，碱加成盐加成盐的制备方法可选自通过以常规方式使游离酸形式与足够量的所需碱反应形成盐，或，通过盐与酸反应重新生成游离酸且进行游离酸分离的方法。

优选的，碱加成盐为碱与碱金属或碱与有机胺的复合物。其中，碱金属包括但是不限于钠、钾、镁、和钙；有机胺包括但是不限于N，N′-二苄基乙二胺，氯普鲁卡因，胆碱，二乙醇胺，乙二胺(乙烷-1，2-二胺)，N-甲基葡糖胺和普鲁卡因。

进一步的，酸加成盐的制备方法可选自通过以常规方式使游离碱形式与足够量的所需酸反应形成盐，或通过盐与碱反应重新生成游离碱且进行游离碱分离的方法。

在一些实施例中，立体异构体包括对映体、非对映体和几何异构体中的至少一种。在本发明优选实施例中，包含环烷基取代基的化合物，可在超过一个碳原子上被取代，在这种情况下，其所有的几何形式，包括顺式和反式，及其混合物，都处在本发明的范围内。

在一些实施例中，前药指适于对患者给药的无过分毒性、刺激性和变态反应等的并且对其应用目的有效的式(I)化合物形式，包括缩醛、酯和两性离子形式。前药在体内转化(例如通过在血液中水解)得到上式的母体化合物。

在一些实施例中，溶剂化物是指本发明的化合物(I)与一种或多种溶剂分子的物理结合，其中，该物理结合包括各种程度的离子、共价键合、氢键合。溶剂化物包括溶液相的和可分离的溶剂化物；在某些情况下，溶剂化物可被分离出来，例如当一个或多个溶剂分子掺入到结晶固体的晶格中。在本发明优选实施例中，溶剂化物包括但不限于乙醇化物、甲醇化物。

在本发明具体实施例中，包括化学结构通式如式I的化合物，及其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物包括但不限于以下表1所示化合物：

表1

本申请实施例第二方面提供一种CDK9抑制剂的制备方法，包括如下步骤：

本申请第二方面提供的CDK9抑制剂的制备方法，该制备方法通过取代反应、催化环化/氧化反应、缩合或环化反应、胺化或烷基化反应，实现CDK9抑制剂的制备，反应过程中原材料易获取，且反应过程简单易操作，正向反应速率高，底物原子利用率高，显著提高了其生产效率，降低生产成本。

本发明化合物的制备过程中所采用的原料均为已知，或能根据已知方法制备，或商业可得的化合物。本发明所涉及的中间体均为已知，或能根据已知方法制备，或商业可得，或采用实施实例合成的化合物。本发明所涉及的中间体和终产物，都可以通过常规方法进行处理和/或纯化，常规方法包括pH条件、萃取、过滤、干燥、浓缩、色谱法、研磨、重结晶、蒸馏等。另外，本发明的化合物还可通过领域内已知的各种方法和/或本文方法的变通方法实现制备。

在一些实施例中，CDK9抑制剂的制备方法包括如下步骤：

优选的，制备方法a步骤中，通过取代反应将化合物A1的一个取代基进行取代反应，在a步骤取代反应中，包括但不限于提供N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、丙烯酸乙酯(EA)、R²NH₂等化合物反应物进行取代反应。进一步优选的，进行a步骤取代反应之后，包括但不限于进行萃取、收集、干燥、浓缩、纯化等分离得到产物A2。

优选的，制备方法b步骤中，通过催化环化/氧化反应，将A2进行氧化作用生成A3，在b步骤反应过程中，包括但不限于提供氧化剂或催化剂进行加热反应。进一步优选的，在b步骤反应过程中，包括但不限于提供氯化亚铜、碳酸钾、碘化钠和6-甲基-2-吡啶甲酸等化合物进行加热处理，以进行催化环化反应；再提供包括但不限于稀盐酸进行氧化反应。进一步优选的，进行b步骤取代反应之后，包括但不限于进行萃取、收集、干燥、浓缩、过滤等分离得到产物A3。

优选的，制备方法c步骤中，将A3通过缩合或环化反应生成A4，在c步骤反应过程中，通过缩合反应或环化反应在吡咯环提供R¹取代基。优选的，在c步骤反应过程中，包括但不限于提供过氧单磺酸钾和二甲基甲酰胺等化合物进行反应，得到化合物A4。进一步优选的，进行c步骤取代反应之后，包括但不限于进行过滤、干燥等分离得到产物A4。

优选的，制备方法d中，以化合物A4为反应物，通过烷基化或酰基化的反应得到化合物A5，通过烷基化反应在吡咯环中引入取代基R³。优选的，在d步骤反应过程中，包括但不限于采用N-氯代丁二酰亚胺(NCS)、N-溴代丁二酰亚胺(NBS)、二氯乙烷(DCE)等化合物进行回流处理，或，采用氯化铝、酰基氯、二甲基甲酰胺(DCM)等化合物进行回流处理，或，采用酮类、氨基酸、Na(AcO)₃BH、AcOH、二甲基甲酰胺(DCM)等化合物进行反应的方法进行烷基化反应，得到化合物A5。

优选的，制备方法e步骤中，以化合物A5为反应物，通过胺化反应得到化学结构通式如式I的化合物，通过胺化反应在嘧啶环中引入氨基取代基，同时添加取代基R⁵。优选的，在e步骤反应过程中，包括但不限于提供N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、R⁵NH₂等化合物进行反应，得到化学结构通式如式I的化合物。进一步优选的，进行e步骤取代反应之后，包括但不限于进行萃取、收集、干燥、浓缩、纯化等分离得到化学结构通式如式I的化合物。

在一些实施例中，CDK9抑制剂的制备方法包括如下步骤：

优选的，制备方法f中，以化合物A6为反应物，通过烷基化反应得到化学结构通式如式I的化合物，通过烷基化反应引入取代基R⁵。优选的，在f步骤反应过程中，包括但不限于提供四氢吡喃酮、三乙酰氧基硼氢化钠、DCM，醋酸等化合物进行反应，得到化学结构通式如式I的化合物。进一步优选的，进行f步骤取代反应之后，包括但不限于进行萃取、收集、干燥、浓缩、纯化等分离得到化学结构通式如式I的化合物。

在本发明实施例中，根据不同的取代基类型可选自不同的合成路径进行制备，不以任何方式对本发明的制备方法进行限制。

本申请实施例第三方面提供一种药物组合物，药物组合物包括含有的CDK9抑制剂的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

本申请第三方面提供的一种药物组合物，药物组合物包括含有的CDK9抑制剂的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂；基于CDK9抑制剂对CDK9具有较高的特异性以及较低的细胞毒性，该药物组合物对预防或治疗肿瘤生长与转移具有较强的作用效果，应用性广。

优选的，药物组合物还包括治疗肿瘤的抑制剂药物，其中，肿瘤包括淋巴瘤，母细胞瘤，髓母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，滑膜细胞肉瘤，神经内分泌肿瘤，类癌肿瘤，胃泌素瘤，胰岛细胞癌，间皮瘤，神经鞘瘤，听神经瘤，脑膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病或淋巴样恶性肿瘤，鳞状细胞癌，上皮鳞状细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，腺癌肺癌，肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，转移性乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，梅克尔细胞癌，食管癌，胆道肿瘤，头颈部癌和血液恶性肿瘤。

优选的，治疗肿瘤的抑制剂药物选自烷化剂、激酶抑制剂、顺铂类药物、胞嘧啶核苷衍生物、紫杉醇衍生物、长春花生物碱类、阿霉素、柔红霉素、放线菌素、丝裂霉素、博莱霉素、Topo I抑制剂、血管抑制剂、血管生成抑制剂等中的至少一种。本申请提供的药物组合物包括如化学结构通式(I)提供的CDK9抑制剂以及其他治疗肿瘤的抑制剂药物协同进行使用，能够提高抑制肿瘤生长的效果，进而实现较好的治疗作用。

进一步优选的，激酶抑制剂选自以EGFR为靶点的激酶抑制剂、以ALK为靶点的激酶抑制剂、以JAK为靶点的激酶抑制剂、以PDGFR为靶点的激酶抑制剂中的至少一种。

在一些实施例中，药物组合物包括CDK9抑制剂和Topo I抑制剂，当二者联合使用，能够提高肿瘤抑制作用，同时未呈现出毒副症状。

优选的，药物组合物配制为以下任意一种形式：糖浆剂，酏剂，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，锭剂，水溶液，霜剂，膏剂，洗液剂，凝胶剂，乳剂，气雾剂。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

化合物P3-01的制备

步骤a：在装有磁子的反应瓶中依次加入5-溴-2,4-二氯嘧啶(1.0eq)、乙酸乙酯(0.3M)、DIPEA(2.0eq)和环戊胺(1.5eq)，然后室温下反应6小时。反应结束后，向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次后，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，分离得到产物S1。

步骤b：在装有磁子的反应瓶中依次加入S1(1.0eq)、氯化亚铜(0.1eq)、碳酸钾(3.0eq)、碘化钠(1.0eq)和6-甲基-2-吡啶甲酸(0.3eq)，用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水DMSO(0.2M)，再用注射器加入3,3-二乙氧基丙-1-炔(2.0eq)。加料结束后，加热到115℃反应20小时。待反应结束后向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次后，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，获得反应中间体。

步骤c：将步骤b获得的中间体浓缩后，在瓶中加入磁子，倒入适量THF(0.2M),再加入1M盐酸水溶液，室温反应半小时，过滤得到产物S2，无需其他纯化处理。

步骤d：在装有磁子的反应瓶中依次加入S2(1.0eq)、DMF(0.2M)和过氧单磺酸钾(1.2eq)，室温下反应6小时。TLC监测反应结束后，向体系中加入水，过滤、干燥得到固体产物S3，无需其他纯化处理。

步骤e：在装有磁子的反应瓶中加入S3(1.0eq)和HBTU(1.1eq)。用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水DMF(0.5M)，用注射器加入DIPEA(1.2eq)、约2M的二甲胺甲醇溶液(1.1eq)，室温搅拌反应。TLC监测反应结束后，向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝1:1，分离得到产物S4。

步骤f：在装有磁子的反应瓶中加入S4(1.0eq)、反式-1,4-环己二胺(3.0eq)和DIPEA(1.2eq)，用氩气置换瓶中空气后，加入溶剂NMP(0.3M)。反应液在150℃下进行约3小时。TLC检测反应结束后，向体系中加入水，乙酸乙酯萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为MeOH/DCM＝1:15，分离得到产物P3-01。

实施例2

化合物P3-14的制备

步骤g：1)在装有磁子的反应瓶中加入S3(1.0eq)和HBTU(1.1eq)。用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水DMF(0.5M)，用注射器加入DIPEA(2.3eq)、二甲羟胺盐酸盐(1.1eq)，室温搅拌反应。TLC监测反应结束后，向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯，分离得到产物；2)将步骤g 1)的产物(1.0eq)浓缩、干燥后，在反应瓶中加入磁子。用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水THF(0.3M)。将反应瓶置于0℃冰水浴中，用注射器缓慢滴加甲基格氏试剂(1.1eq)。滴加完成后，将反应瓶从冰水浴中移出，在室温下继续反应半小时。TLC监测反应结束后，向体系中缓慢加入适量饱和氯化铵水溶液，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝4:1，分离得到产物S5。

然后，按照步骤f可从S5获得P3-14

实施例3

化合物P3-21的制备

步骤h：在装有磁子的封管中依次加入S4(1.0eq)、甲苯(0.3M)和劳森试剂(0.55eq)，用氩气置换瓶中空气后，加热至110℃反应过夜。待反应液冷却至室温，向体系中加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝1:1，分离得到产物S6。

然后，按照步骤f可从S6获得P3-21

实施例4

化合物P3-22的制备

步骤i：1)在装有磁子的反应瓶中加入S4(1.0eq)和催化量的DMF，在冰水浴下小心滴加氯化亚砜(5.0eq)。加料结束后，在80℃下回流3小时。然后，加入适量甲苯，旋蒸浓缩反应液。在浓缩的反应液中，滴加氨水(1mL/mmol)，室温反应。TLC检测反应结束后，将反应液浓缩、旋干，并用二氯甲烷/石油醚重结晶，获得中间产物；2)将步骤i 1)获得的产物转移到密封管中，用氩气置换瓶中空气后，依次加入氯仿(0.5M)和三氯氧磷(5.0eq)，加热至80℃反应。TLC监测反应结束后，将反应液小心地倒在冰上，并用二氯甲烷萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再用二氯甲烷/石油醚重结晶，获得产物S7。

然后，按照步骤f可从S7获得P3-22

实施例5

化合物P3-33的制备

步骤j：1)在装有磁子的反应瓶中加入S3(1.0eq)和TBTU(1.0eq)。用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水DCM(0.3M)，用注射器加入DIPEA(1.0eq)和乙醇胺(1.0eq)，室温搅拌反应。TLC监测反应结束后，向体系中加入水，用DCM萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为MeOH/DCM＝1:30，分离得到产物；2)向装有前一步产物(1.0eq)的反应瓶中，依次加入DCM(0.3M)，三乙胺(10eq)和TsCl(1.7eq),45℃下反应过夜。反应结束后，向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相；3)向反应瓶中继续加入适量DCM(0.2M)和DDQ(1.5eq)，加热回流。TLC监测反应结束后，向体系中加入适量饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝7:1，分离得到产物S8。

然后，按照步骤f可从S8获得P3-33

实施例6

化合物P3-35的制备

步骤k：在装有磁子的封管中依次加入P3-01(1.0eq)、四氢吡喃酮(1.0eq)、三乙酰氧基硼氢化钠(1.5eq)、DCM(0.2M)，然后缓慢加入醋酸(1.5eq)。反应液加热至50℃，TLC检测反应进程。反应结束后，向体系中加入水和DCM，DCM萃取三次后，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为MeOH/DCM＝1:9，分离得到产物P3-35。

实施例7

化合物P3-36的制备

步骤l：在装有磁子的封管中依次加入P3-01(1.0eq)、碳酸钾(1.0eq)、2-溴乙基甲基醚(1.0eq)和乙腈(0.1M)。反应液加热至80℃，TLC检测反应进程。反应结束后，向体系中加入水和乙酸乙酯，乙酸乙酯萃取三次后，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为MeOH/DCM＝1:9，分离得到产物P3-36。

实施例8

化合物P3-77的制备

步骤m：1)在装有磁子的反应瓶中加入S3(1.0eq)和TBTU(1.0eq)。用双排管将瓶中的空气置换为氩气，然后加入无水DCM(0.3M)，用注射器加入DIPEA(1.0eq)和乙醇胺(1.0eq)，室温搅拌反应。TLC监测反应结束后，向体系中加入水，用DCM萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为MeOH/DCM＝1:30，分离得到产物；

2)向装有步骤m 1)得到的产物(1.0eq)的反应瓶中，依次加入甲苯(0.3M)，三乙胺(10eq)和劳森试剂(0.5eq),加热回流。反应结束后，向体系中加入水，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相；3)向反应瓶中继续加入适量DCM(0.2M)和DDQ(1.5eq)，加热回流。TLC监测反应结束后，向体系中加入适量饱和碳酸氢钠溶液，用乙酸乙酯萃取三次，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝7:1，分离得到产物S9。

然后，按照步骤f可从S9获得P3-77

实施例9

化合物P3-32的制备

步骤n：在装有磁子的反应瓶中加入S3(1.0eq)和乙酰肼(2.0eq)，在冰水浴下小心滴加三氯氧磷(5.0eq)。加料结束后，加热回流。TLC检测反应结束后，将反应液倒入冰水中，调节pH到5-6后，用乙酸乙酯萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝2:1，分离得到产物S10。

然后，按照步骤f可从S10获得P3-32

实施例10

化合物P3-26的制备

步骤o：在装有磁子的反应瓶中依次加入S2(1.0eq)、TsCH2CN(2.0eq)、碳酸钾(5.0eq)和1,4-二氧六环(0.3M)。加料结束后，加热回流反应液过夜。TLC检测反应结束后，待反应液冷却至室温，加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝6:1，分离得到产物S11。

然后，按照步骤f可从S11获得P3-26

实施例11

化合物P3-59的制备

步骤p：在装有磁子的反应瓶中依次加入S12(1.0eq)和干燥的THF(0.2M)，将反应液降温至-80℃。在低温下，逐滴加入预先配置好的LDA(1.2eq，1.0M THF溶液)。LDA滴加完后，继续反应2小时；然后用注射器一次性加入三氟乙酸乙酯(2.0eq)，并在该温度下继续反应半小时；之后，让反应液温度缓慢恢复至室温，继续反应1小时。TLC检测反应结束后，加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，分离得到产物S13。

步骤q：1)在装有磁子的反应瓶中依次加入S13(1.0eq)和过量NaOH的THF/水溶液(THF/H2O＝3:1，0.5M)，室温进行反应。TLC检测反应结束后，调节pH到8-9，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相；2)向装有前一步产物(1.0eq)的反应瓶中，冰浴下依次加入溴代环戊烷(1.2eq)、干燥的DMF(0.5M)和被煤油包裹的NaH(60％，1.5eq)，反应液在氩气环境下反应；待加料结束后，缓慢升温至室温，继续反应2小时。TLC检测反应结束后，用饱和的氯化铵溶液淬灭反应，并加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，分离得到产物S14。

然后，按照步骤f可从S14获得P3-59

实施例12

化合物P3-63的制备

步骤r：在装有磁子的反应瓶中依次加入S12(1.0eq)和干燥的THF(0.2M)，将反应液降温至-80℃。在低温下，逐滴加入预先配置好的LDA(1.2eq，1.0M THF溶液)。LDA滴加完后，继续反应2小时；然后用注射器一次性加入碘的THF溶液(1.5eq)，并在该温度下继续反应半小时；之后，让反应液温度缓慢恢复至室温，继续反应1小时。TLC检测反应结束后，加入饱和的硫代硫酸钠溶液和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，分离得到产物S15。

然后，按照步骤q可从S15获得S16。

步骤s：在装有磁子的反应瓶中依次加入S16(1.0eq)、Pd2(dba)3(5mol％)和xantphos(10mol％)，用双排管将反应瓶中的空气置换成氩气。用注射器向反应瓶中加入含有三乙胺(1.2eq)和膦烷(1.5eq)的1,4-二氧六环溶液(0.2M)，室温下搅拌反应。TLC检测反应结束后，加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为二氯甲烷/甲醇＝30:1，分离得到产物S17。

然后，按照步骤f可从S17获得P3-63

实施例13

化合物P3-62的制备

步骤t：在装有磁子的反应瓶中，让S4(1.0eq)溶解于DCE(0.3M)中，将NCS(1.1eq)缓慢加入反应瓶中，然后室温反应5分钟。之后，将反应液加热至回流，继续反应。TLC检测反应结束后，加入水和乙酸乙酯，用乙酸乙酯进行萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝1:1，分离得到产物S18。

然后，按照步骤f可从S18获得P3-62

实施例14

化合物P3-16的制备

步骤u：在装有磁子的反应瓶中，依次加入无水氯化锂(3.0eq)、干燥的DCM(0.3M)和乙酰氯(5.0eq)，室温搅拌半小时。然后，将S19的干燥DCM溶液(1.0eq)通过注射器，缓慢滴加到反应瓶中。加料结束后，将反应液加热至回流。TLC检测反应结束后，缓慢淬灭反应，之后用DCM萃取，收集、过滤、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝9:1，分离得到产物S20。

然后，按照步骤f可从S20获得P3-16

实施例15

化合物P3-15的制备

步骤v：在装有磁子的反应瓶中，依次加入S5(1.0eq)、醋酸钠(1.2eq)和盐酸羟胺(1.1eq)，加入乙醇/水混合液(v:v＝3:1，0.5M)。然后，将反应液加热至回流。TLC检测反应结束后，待反应液冷却至室温，向反应液中加入水，再用乙酸乙酯加以萃取，收集、干燥、浓缩有机相，再通过硅胶柱层析法进行纯化，流动相为正己烷/乙酸乙酯＝1:2，分离得到产物S21。

然后，按照步骤f可从S21获得P3-15

实施例16

根据实施例1～15的制备过程，选取不同的反应物及反应条件，可进一步实现结构衍化，一共得到82个不同结构的化合物，具体如下表1：

表1

性质测试：

性质测试(一)

将制备得到的化合物P3-01～P3-82的82个化合物结构进行鉴定分析，得到鉴定数据。

性质测试(二)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-01～P3-82的82个化合物进行体外生物活性检测，分别进行酶活性抑制试验(分别以CDK9、CDK7、CDK4、CDK6为测试蛋白)，以及细胞毒性试验(以MCF-7细胞为试验细胞)。

酶活性抑制实验：将1体积的蛋白培养液进行4倍稀释，并加入50μM的二硫代苏糖醇，作为培养液待用。在384孔板上加入不同浓度的待测化合物(10μM为起始浓度，3倍稀释，10个浓度，复孔)。密封待检测的384孔板，1000g离心孔板1分钟。将2倍的CDK蛋白(测试蛋白)与1倍蛋白培养液混合均匀后，取2.5μL蛋白混合液加入到每个孔板中，1000g离心板30s，室温10min。同时，将2倍的底物和ATP与1倍蛋白培养液混合摇匀。将2.5μL底物、ATP混合液加入到孔板中，1000g离心板30s，密封孔板，室温反应1h。反应结束后，每孔加入5μLADP-Glo试剂，室温反应40min。之后，加入10μL蛋白检测试剂，室温反应40min。最后，用Envision 2104获取荧光数值，并计算出对应的蛋白抑制率。

细胞毒实验：在供应商推荐的培养基(含10％胎牛血清)中培育MCF-7细胞。在96孔培养板中加入细胞1×103/孔，在37℃、5％CO2环境下过夜培养。之后，在每孔中加入含不同浓度的待测试化合物(10μM为起始浓度，3倍稀释，10个浓度，复孔)的培养液，继续培养72h，，经台盼蓝染色，活细胞达95％以上。在培养终止前4h，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，继续孵育4h。弃培养液，加入二甲基亚砜150μL，振荡15min。选择570nm波长，用酶标仪测定吸光度值(A值)，并计算增殖抑制率。

性质测试(三)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-01、P3-22、P3-36、P3-42的4个化合物进行药代动力学性质测试，测试操作如下：将待测化合物溶解、配置成所需浓度的储液备用。然后，将雄性健康小鼠进行分组，每组3只。小鼠先禁食一晚，自由饮水，之后再进行喂食，4小时后给药。给药剂量如上表。全血样本在指定时间点(0.083h，0.25h,0.5h，1h，2h，4h，8h，24h)经眼眶静脉采集,采取30μL流入肝素钠抗凝管中样本4000rcf/4℃离心5分钟后取上层血浆样本。最后利用LC-MS/MS对样本进行数据采集，经过数据处理后，获得待测化合物的药代动力学参数。

性质测试(四)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-42进行单剂量毒性实验分析，提供溶剂作为对照组试验，操作如下：根据BALB/c裸鼠的体重进行分组(BW>19g)，随机均匀分入各组。之后，根据下表4，按指定时间对动物进行给要处理。给药期间每日称量实验动物体重，记录动物体重的变化与给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动、进食等一般状态。计算公式如下：体重变化率(％)＝BW_{Day X}/BW_Day1×100％。Day 1即给药第1天，BW_{Day 1}即给药第1天的体重。最后，进行数据整理，对各组动物体重进行组间统计学分析。P<0.05认为有显著性差异。

表4

性质测试(五)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-42、购买得到的抑制剂YH-011、P3-42和YH-011的组合物进行体内抗肿瘤活性分析，提供溶剂作为对照组试验，操作方法如下：用含有灭活的10％胎牛血清，100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素以及2mM谷氨酰胺的MEM培养基在37℃、5％CO₂的培养箱中培养MCF-7肿瘤细胞，每隔3至4天待细胞长满后分瓶传代。将处于对数生长期的肿瘤细胞用于体内肿瘤的接种。

将无血清MEM培养液与Matrigel 1:1混合液重悬的MCF-7肿瘤细胞1.5x10⁷/200μL接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，共接种45只动物。动物每周两次皮下注射苯甲酸雌二醇注射液40μg/20μL。待肿瘤生长至249mm³时，按照下表5进行分组给药。分成4组，每组5只动物。

给药期间对动物体重和肿瘤大小进行测量，每周2次。肿瘤体积计算公式为：体积＝0.5×长径×短径²，使用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径。在进行肿瘤测量的同时，称量实验动物体重。记录动物体重的变化与给药时间的关系。同时观察小鼠的存活情况和健康状况如给药期间动物活动、进食等一般状态。

相对肿瘤增殖率T/C(％)＝T_RTV/C_RTV×100％。(T_RTV：治疗组RTV；C_RTV：溶剂对照组RTV)，其中相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝V_t/V₀。其中V₀为分组给药时(即给药第1天)测量所得肿瘤体积，V_t为每一次测量时的肿瘤体积。肿瘤生长抑制率TGI(％)＝(1-T/C)×100％。最后，对肿瘤体积和肿瘤重量进行组间统计分析，获得实验结果。

表5

性质测试(六)

以P3-01为优选抑制剂，采用计算机模拟分析CDK9抑制剂P3-01与CDK9相互作用的模式。

结果分析：

结果分析(一)

将制备得到的P3-01～P3-8282个化合物分别进行鉴定，得到的化合物结构鉴定数据如下：

P3-01:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.50(s,1H),6.50(s,1H),4.79–4.62(m,1H),3.81–3.75(m,1H),3.15(s,6H),2.95–2.89(m,1H),2.56–2.40(m,2H),2.26–2.15(m,2H),2.15–2.00(m,6H),1.78–1.64(m,2H),1.50–1.34(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.12,159.38,154.26,152.92,132.17,112.03,102.47,58.74,50.99,50.92,33.38,31.85,31.64,26.47.

P3-02:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.51(s,1H),4.76–4.67(m,1H),3.47–3.43(m,2H),3.16(s,6H),2.99–2.71(m,2H),2.70–2.32(m,2H),2.09–2.02(m,4H),1.75–1.65(m,6H),1.54–1.48(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.22,160.15,154.48,152.81,132.10,111.94,102.56,58.74,42.38,41.12,31.51,30.06,29.59,26.25,25.14.

P3-03:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.97(d,J＝1.5Hz,1H),3.69–3.61(m,3H),3.17(s,6H),2.61(t,J＝7.5Hz,2H),2.04(tdd,J＝12.2,5.6,1.8Hz,2H),1.87–1.55(m,8H),1.32(q,J＝8.1Hz,2H),1.10(s,2H).

P3-04:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.97(d,J＝1.5Hz,1H),4.60(p,J＝6.9Hz,1H),3.65(s,2H),3.65(d,J＝15.1Hz,1H),3.17(s,6H),2.61(t,J＝5.1Hz,2H),2.06(dtd,J＝12.0,6.9,6.1,2.0Hz,2H),1.91–1.70(m,3H),1.74–1.54(m,5H),1.37–1.20(m,6H).

P3-05:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.08(d,J＝1.5Hz,1H),7.37–7.21(m,10H),7.08(d,J＝1.6Hz,1H),4.72(p,J＝6.9Hz,1H),4.47(s,3H),3.71(p,J＝6.8Hz,1H),3.28–3.16(m,1H),2.15–2.02(m,3H),2.02–1.59(m,10H),1.56–1.31(m,4H),1.12(s,2H).

P3-06:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.51(s,1H),6.47(s,1H),4.69–4.57(m,1H),3.85–3.77(m,1H),3.67–3.44(m,4H),3.21–3.13(m,1H),2.52–2.42(m,2H),2.31–2.21(m,2H),2.19–2.13(m,2H),2.11–2.03(m,4H),1.76–1.66(m,2H),1.63–1.53(m,2H),1.51–1.37(m,2H),1.30–1.24(m,8H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ165.89,159.27,154.11,152.77,132.87,112.16,100.56,58.71,50.95,50.50,31.72,31.34,31.03,26.46.

P3-07:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.91(d,J＝1.5Hz,1H),4.56(p,J＝6.8Hz,1H),3.78(p,J＝6.8Hz,1H),3.21(dd,J＝12.7,2.5Hz,2H),3.21(s,2H),2.00(s,1H),2.06–1.93(m,2H),1.96–1.77(m,4H),1.81–1.66(m,6H),1.68–1.54(m,2H),1.47–1.32(m,2H),1.27(ddt,J＝12.0,9.9,4.0Hz,2H),1.07(s,2H),0.92(t,J＝6.6Hz,6H).

P3-08:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.90(d,J＝1.6Hz,1H),4.57(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.21(t,J＝7.5Hz,4H),3.10(dtd,J＝12.0,6.9,3.1Hz,1H),2.00(s,1H),2.05–1.94(m,1H),1.98–1.54(m,10H),1.49–1.19(m,8H),1.06(s,2H),0.97(t,J＝6.6Hz,6H).

P3-09:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.50(s,1H),6.63(s,1H),4.95–4.85(m,1H),3.91–3.71(m,1H),3.66–3.60(m,4H),2.86–2.79(m,1H),2.53–2.44(m,2H),2.21–2.17(m,2H),2.11–1.90(m,10H),1.75–1.68(m,2H),1.53–1.27(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ164.12,159.50,154.38,153.12,132.88,111.88,103.38,58.61,51.09,51.02,34.37,32.07,31.60,27.08,26.50,25.25.

P3-10:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),7.00(d,J＝1.5Hz,1H),4.61(p,J＝6.9Hz,1H),3.90(t,J＝5.2Hz,5H),3.83(q,J＝6.9Hz,1H),3.10(dtd,J＝11.9,6.9,3.1Hz,1H),2.14–1.98(m,3H),1.94–1.82(m,2H),1.87–1.63(m,11H),1.67–1.57(m,2H),1.46–1.19(m,5H),1.06(s,2H).

P3-11:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.06(d,J＝1.5Hz,1H),7.54(dd,J＝7.6,2.0Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),7.21(ddt,J＝7.5,6.2,2.1Hz,1H),7.00(d,J＝1.5Hz,1H),4.84–4.72(m,1H),3.57(s,3H),3.53(q,J＝6.8Hz,1H),2.80(p,J＝7.0Hz,1H),2.04(s,1H),2.08–1.94(m,2H),1.91–1.51(m,10H),1.50–1.36(m,2H),1.09(s,2H).

P3-12:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.53(s,1H),6.71(s,1H),5.31–5.27(m,1H),4.51–4.36(m,2H),4.26–4.15(m,2H),3.85–3.78(m,1H),3.16–3.09(m,1H),2.55–2.45(m,2H),2.45–2.34(m,2H),2.28–2.25(m,2H),2.18–1.98(m,6H),1.76–1.66(m,2H),1.61–1.51(m,2H),1.50–1.39(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ164.97,159.55,154.76,153.70,129.28,111.85,105.69,58.16,50.94,50.58,31.48,31.38,26.57,16.64.

P3-13:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.53(s,1H),6.79(s,1H),4.99–4.89(m,1H),3.87–3.77(m,1H),3.69(s,3H),3.41(s,3H),3.00–2.94(m,1H),2.54–2.44(m,2H),2.25–2.19(m,2H),2.09–2.02(m,8H),1.78–1.67(m,2H),1.49–1.40(m,4H).

P3-14:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.64(s,1H),7.38(s,1H),5.93–5.84(m,1H),3.88–3.80(m,1H),3.25–3.15(m,1H),2.55(s,3H),2.48–2.36(m,2H),2.31–2.22(m,2H),2.21–2.13(m,2H),2.13–2.05(m,2H),2.05–1.92(m,2H),1.79–1.66(m,2H),1.66–1.52(m,2H),1.52–1.40(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ192.52,160.36,155.84,134.38,114.23,111.42,57.42,50.89,50.47,31.30,31.18,30.87,27.83,26.64.

P3-15:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.02(d,J＝1.5Hz,1H),6.48(d,J＝1.5Hz,1H),4.41(p,J＝6.9Hz,1H),3.51(p,J＝6.9Hz,1H),3.13(s,3H),2.80(p,J＝6.9Hz,1H),2.44(s,1H),2.07–1.94(m,3H),1.92–1.50(m,11H),1.44(dq,J＝11.3,6.5,6.0Hz,2H),1.06(s,2H).

P3-16:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.94(s,1H),8.06(s,1H),5.01–4.95(m,1H),4.60(s,1H),3.89–3.81(m,1H),3.15–3.07(m,1H),2.49(s,3H),2.28–2.19(m,5H),2.17–1.98(m,7H),1.88–1.72(m,2H),1.70–1.37(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ195.38,160.11,155.56,153.17,134.21,117.24,110.52,57.81,50.95,50.31,33.06,31.58,31.41,26.55,25.33.

P3-17:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.09(s,1H),7.38(s,1H),4.61(s,1H),3.53(s,1H),3.08(s,1H),2.81(s,1H),2.23(dt,J＝13.3,6.8Hz,2H),2.05(dd,J＝13.1,6.3Hz,2H),2.03–1.92(m,3H),1.90–1.78(m,1H),1.83–1.70(m,7H),1.74–1.66(m,2H),1.70–1.52(m,4H),1.57–1.45(m,2H),1.44(tdd,J＝9.2,5.6,3.6Hz,4H),1.07(s,2H).

P3-18:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.77(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),7.67–7.57(m,1H),7.54(t,J＝7.4Hz,2H),7.33(s,1H),4.63(p,J＝6.9Hz,1H),3.54(p,J＝6.9Hz,1H),2.88–2.76(m,1H),2.06–1.93(m,3H),1.89–1.69(m,7H),1.74–1.66(m,1H),1.68–1.58(m,1H),1.62–1.53(m,2H),1.58–1.44(m,2H),1.48–1.38(m,1H),1.07(s,2H).

P3-19:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.08(d,J＝1.4Hz,1H),7.04(d,J＝1.4Hz,1H),4.80(p,J＝6.9Hz,1H),3.52(p,J＝6.9Hz,1H),2.80(p,J＝6.9Hz,1H),2.73(q,J＝6.7Hz,2H),2.13–2.00(m,3H),1.89–1.76(m,2H),1.80–1.64(m,5H),1.69–1.50(m,3H),1.45(dt,J＝12.2,6.9Hz,2H),1.36(t,J＝6.7Hz,3H),1.07(s,2H).

P3-20:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.88(s,1H),6.93(s,1H),4.58(p,J＝6.9Hz,1H),3.55–3.44(m,1H),3.12(s,3H),2.86–2.74(m,1H),2.52(s,1H),2.05–1.92(m,3H),1.89–1.51(m,10H),1.55–1.38(m,2H),1.08(s,2H).

P3-21:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.43(s,1H),6.21(s,1H),4.64–4.56(m,1H),3.80–3.73(m,1H),3.59(s,3H),3.26(s,3H),2.90–2.78(m,1H),2.50(s,2H),2.24–2.16(m,2H),2.15–1.96(m,6H),1.76–1.62(m,2H),1.46–1.26(m,6H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ191.75,158.99,154.02,152.01,138.85,112.54,98.19,58.50,51.09,51.03,44.39,42.79,34.15,32.05,26.55.

P3-22:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.08(d,J＝1.5Hz,1H),7.11(d,J＝1.5Hz,1H),4.46(p,J＝7.0Hz,1H),3.54(p,J＝6.8Hz,1H),2.81(p,J＝6.8Hz,1H),2.01(s,1H),2.09–1.94(m,2H),1.93–1.49(m,10H),1.49–1.35(m,2H),1.07(s,2H).

P3-23:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.96(d,J＝1.5Hz,1H),4.63(p,J＝6.9Hz,1H),3.85(p,J＝6.9Hz,1H),3.61(p,J＝6.9Hz,1H),3.17(s,6H),2.10–1.89(m,5H),1.91–1.76(m,3H),1.80–1.57(m,5H),1.54(s,1H),1.42(dq,J＝12.5,6.9Hz,2H).

P3-24:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.94(d,J＝1.5Hz,1H),4.57(p,J＝6.9Hz,1H),3.50(p,J＝7.0Hz,1H),3.21(t,J＝7.6Hz,2H),2.95(s,3H),2.85–2.74(m,1H),2.13–1.98(m,3H),1.91–1.79(m,2H),1.83–1.66(m,8H),1.71–1.35(m,8H),1.06(s,2H),0.97(t,J＝6.6Hz,3H).

P3-25:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.93(d,J＝1.5Hz,1H),4.55(p,J＝6.9Hz,1H),3.79(p,J＝6.8Hz,1H),3.51(t,J＝7.7Hz,2H),3.10(dtd,J＝11.9,6.8,2.9Hz,1H),2.98(s,3H),2.81(t,J＝7.7Hz,2H),1.99(s,1H),2.05–1.90(m,2H),1.94–1.79(m,4H),1.83–1.68(m,2H),1.69–1.56(m,2H),1.46–1.18(m,4H),1.07(s,2H).

P3-26:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.49(s,1H),7.98(s,1H),7.22(s,1H),6.52(s,1H),4.98(d,J＝7.5Hz,1H),4.75–4.67(m,1H),3.81–3.70(m,1H),2.83–2.71(m,1H),2.58–2.46(m,2H),2.26–2.16(m,2H),2.13–1.88(m,12H),1.75–1.62(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ159.15,154.91,153.71,152.41,145.73,130.85,126.63,125.67,112.90,103.47,58.49,50.95,50.52,31.62,31.40,31.20,26.62.

P3-27:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.63(s,1H),7.56–7.35(m,5H),6.80(s,1H),3.77–3.65(m,1H),3.01(s,3H),2.98(s,3H),2.92–2.81(m,1H),2.18–2.10(m,2H),2.02–1.92(m,2H),1.46–1.22(m,9H).

P3-28:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.03(d,J＝1.5Hz,1H),6.59(d,J＝1.5Hz,1H),4.41(p,J＝6.9Hz,1H),3.81(p,J＝6.8Hz,1H),3.60(t,J＝6.7Hz,2H),3.10(dtd,J＝11.9,6.9,2.9Hz,1H),2.07–1.93(m,3H),1.94–1.79(m,6H),1.83–1.67(m,2H),1.62(dddd,J＝12.2,7.5,5.1,2.8Hz,2H),1.50(t,J＝6.7Hz,2H),1.46–1.18(m,4H),1.06(s,2H).

P3-30:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.51(s,1H),6.52(s,1H),4.75–4.67(m,1H),3.84–3.77(m,1H),3.16(s,6H),3.09–3.01(m,2H),2.54–2.44(m,2H),2.39(s,3H),2.33–2.25(m,3H),2.24–2.16(m,3H),2.14–2.02(m,6H),1.77–1.67(m,2H),1.67–1.58(m,2H),1.58–1.40(m,4H).

P3-31:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.47(s,1H),6.33(s,1H),5.01(d,J＝7.3Hz,1H),4.82–4.62(m,1H),4.42–3.88(m,4H),3.81–3.69(m,1H),3.39–3.28(m,2H),3.12(s,6H),2.95(m,1H),2.89–2.77(m,2H),2.74–2.61(m,1H),2.52–2.37(m,2H),2.28–2.18(m,2H),2.10–1.90(m,8H),1.71–1.53(m,5H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.17,159.38,154.30,152.91,132.21,112.04,102.49,58.78,53.45,51.36,51.13,44.73,32.05,31.65,30.98,26.51.

P3-32:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.6Hz,1H),6.93(d,J＝1.6Hz,1H),4.36(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.10(dtd,J＝11.9,6.9,3.1Hz,1H),2.48(s,3H),2.06–1.94(m,2H),1.98(s,2H),1.94–1.76(m,5H),1.80–1.68(m,2H),1.73–1.57(m,2H),1.45–1.17(m,4H),1.06(s,2H).

P3-33:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.52(s,1H),7.95(s,1H),7.31(s,1H),6.98(s,1H),6.02–5.94(m,1H),3.80–3.74(m,1H),2.81–2.70(m,1H),2.59–2.50(m,2H),2.23–2.11(m,4H),2.10–2.03(m,2H),2.02–1.94(m,2H),1.81–1.69(m,2H),1.46–1.27(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ159.49,157.58,155.25,153.12,140.00,128.94,126.18,112.26,104.85,57.95,51.26,51.04,35.26,32.26,31.25,26.67.

P3-35:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.51(s,1H),6.51(s,1H),4.77–4.64(m,1H),4.04(m,2H),3.86–3.79(m,1H),3.51–3.44(m,3H),3.30–3.19(m,1H),3.16(s,6H),2.50–2.44(m,2H),2.34–2.26(m,2H),2.26–2.18(m,2H),2.15–2.04(m,4H),2.05–1.95(m,2H),1.78–1.68(m,2H),1.68–1.63(m,2H),1.63–1.50(m,2H),1.50–1.40(m,2H).¹³C NMR(500MHz,chloroform-d)δ164.40,157.86,153.17,151.32,131.22,111.13,101.19,66.33,57.42,53.04,51.64,49.36,46.09,31.14,30.91,29.93,29.79,28.40,25.49,8.80.

P3-36:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.49(s,1H),4.74–4.66(m,1H),3.81–3.70(m,1H),3.51(t,J＝5.4Hz,2H),3.37(s,3H),3.14(s,6H),2.80(t,J＝5.4Hz,2H),2.59–2.41(m,3H),2.23–2.15(m,2H),2.14–1.98(m,6H),1.75–1.64(m,2H),1.43–1.22(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.08,159.42,154.28,152.90,132.09,111.92,102.47,72.40,59.02,58.73,57.42,51.58,47.08,32.57,32.15,31.65,26.48.

P3-37:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.50(s,1H),4.74–4.66(m,1H),3.84–3.75(m,1H),3.16(s,6H),2.83(q,J＝7.2Hz,2H),2.79–2.69(m,1H),2.56–2.43(m,2H),2.28–2.18(m,2H),2.17–2.00(m,7H),1.77–1.66(m,2H),1.46–1.29(m,6H),1.21(t,J＝7.2Hz,3H)..¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.20,159.39,154.31,152.90,132.21,112.04,102.48,58.78,57.34,51.34,41.74,31.95,31.65,31.57,26.49,13.90.

P3-38:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.43(s,1H),6.15(s,1H),4.93(d,J＝7.4Hz,1H),4.58–4.49(m,1H),3.80–3.68(m,1H),3.59(s,3H),3.54(t,J＝5.1Hz,2H),3.36(s,3H),3.23(s,3H),2.86(t,J＝5.1Hz,2H),2.60–2.50(m,2H),2.48–2.43(m,1H),2.38–2.26(s,2H),2.26–2.18(m,2H),2.09–1.97(m,5H),1.68–1.55(m,2H),1.42–1.15(m,4H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ191.47,157.96,152.90,151.56,136.90,111.52,97.43,71.88,58.97,57.36,56.71,50.45,46.68,44.06,42.65,31.82,31.54,30.71,25.66.

P3-39:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.43(s,1H),6.21(s,1H),4.65–4.56(m,1H),3.79–3.76(m,1H),3.59(s,3H),3.27(s,3H),2.86–2.77(m,2H),2.76–2.68(m,1H),2.59–2.41(m,2H),2.28–2.18(m,2H),2.18–1.98(m,7H),1.78–1.64(m,2H),1.45–1.27(m,6H),1.23–1.17(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ191.79,158.98,154.03,152.02,138.87,112.56,98.20,58.51,57.37,51.40,44.37,42.78,41.78,32.00,31.68,26.56,13.99.

P3-41:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.48(s,1H),6.50(s,1H),4.73–4.65(m,1H),4.38–4.32(m,1H),3.82–3.71(m,1H),3.74–3.68(m,2H),3.15(s,6H),3.00–2.96(m,2H),2.52–2.41(m,2H),2.26–2.14(m,3H),2.14–2.00(m,4H),2.00–1.90(m,2H),1.73–1.67(m,2H),1.41–1.28(m,2H),1.25–1.11(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.20,159.40,154.29,152.89,132.18,112.00,102.45,67.78,63.21,61.68,58.78,51.36,31.65,31.58,29.62,26.51.

P3-42:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.48(s,1H),6.33(s,1H),4.95(d,J＝7.5Hz,1H),4.77–4.68(m,1H),3.77–3.72(m,1H),3.67(t,J＝5.2Hz,2H),3.13(s,6H),2.90–2.86(m,2H),2.59–2.51(m,1H),2.51–2.39(m,2H),2.35–2.12(m,6H),2.10–2.96(m,6H),1.72–1.57(m,2H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ164.50,158.25,153.08,152.03,130.67,111.01,101.28,61.33,57.46,56.41,50.41,48.51,32.23,31.63,30.87,29.82,25.60.

P3-43:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.47(s,1H),6.32(s,1H),4.98(d,J＝7.4Hz,1H),4.81(dd,J＝7.5,6.1Hz,2H),4.76–4.67(m,1H),4.39(m,2H),3.80–3.68(m,1H),3.12(s,6H),3.10–3.01(m,1H),3.00–2.95(m,2H),2.53–2.38(m,3H),2.28–2.14(m,2H),2.08–1.95(m,6H),1.82–1.69(m,2H),1.69–1.57(m,3H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ164.46,158.23,153.05,152.00,130.64,110.96,101.25,76.15,57.45,56.80,50.78,50.44,35.70,32.30,31.58,30.83,29.80,25.58.

P3-44:

¹H NMR(500MHz,methanol-d4)δ8.50(s,1H),6.50(s,1H),4.73–4.67(m,1H),3.84–3.78(m,1H),3.19–3.08(m,7H),2.92(d,J＝7.4Hz,2H),2.50–2.43(m,2H),2.32–2.20(m,4H),2.18–2.05(m,4H),1.79–1.65(m,2H),1.63–1.50(m,2H),1.49–1.36(m,2H),1.13–1.05(m,1H),0.86–0.59(m,2H),0.42–0.39(m,2H).¹³C NMR(500MHz,methanol-d4)δ166.19,159.38,154.30,152.94,132.35,112.22,102.43,58.78,57.33,51.27,50.73,31.66,31.47,29.57,26.45,23.88,8.63,4.57.

P3-45:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.6Hz,1H),6.95(d,J＝1.5Hz,1H),4.67(p,J＝6.9Hz,1H),3.82–3.71(m,1H),3.17(s,6H),2.85–2.73(m,4H),2.15–2.03(m,1H),2.06–1.70(m,9H),1.71–1.55(m,2H),1.48–1.21(m,4H),1.28(s,2H),1.11(s,1H).

P3-46:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.50(s,1H),5.02–4.90(m,1H),4.74–4.65(m,2H),4.60–4.55(m,1H),3.81–3.75(m,1H),3.15(s,6H),3.09–2.83(m,2H),2.78–2.70(m,1H),2.64–2.58(m,1H),2.52–2.43(m,3H),2.22–2.17(m,2H),2.13–2.00(m,6H),1.75–1.68(m,2H),1.45–1.24(m,5H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.19,159.42,154.31,152.88,132.15,111.97,102.47,82.76,69.91,58.78,57.57,53.72,51.57,32.54,32.40,32.15,32.14,31.65,26.50,26.35.

P3-47:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.50(s,1H),4.80–4.66(m,1H),3.82–3.75(m,1H),3.15(s,6H),2.90(t,J＝6.9Hz,2H),2.68(t,J＝6.9Hz,2H),2.67–2.61(m,1H),2.54–2.43(m,2H),2.26–2.19(m,2H),2.12(s,3H),2.11–2.01(m,6H),1.77–1.65(m,2H),1.43–1.28(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.16,159.39,154.29,152.89,132.16,111.98,102.47,58.76,57.25,51.47,45.78,33.95,32.27,32.05,31.65,26.50,14.99.

P3-48:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.49(s,1H),6.50(s,1H),4.74–4.65(m,1H),3.82–3.75(m,1H),3.66–3.60(m,4H),3.59–3.53(m,2H),3.40(s,3H),3.15(s,6H),2.88(t,J＝5.3Hz,2H),2.68–2.61(m,1H),2.56–2.42(m,2H),2.26–2.17(m,2H),2.15–1.99(m,6H),1.77–1.65(m,2H),1.43–1.29(m,4H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ166.17,159.41,154.30,152.90,132.16,111.98,102.47,72.95,71.07,70.36,59.12,58.77,57.43,51.50,47.02,32.15,31.65,26.51.

P3-50:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.96(d,J＝1.5Hz,1H),4.62(p,J＝6.9Hz,1H),3.73(hept,J＝6.7Hz,1H),3.17(s,6H),2.11–1.96(m,3H),1.91–1.53(m,6H),1.15(d,J＝6.9Hz,6H).

P3-51:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(s,1H),6.95(s,1H),4.65(s,1H),3.71(d,J＝11.6Hz,1H),3.17(s,6H),2.06–1.96(m,3H),1.91–1.82(m,3H),1.83–1.72(m,3H),1.70–1.55(m,6H),1.48–1.22(m,4H).

P3-52:

¹H NMR(400MHz,methanol-d4)δ8.40(s,1H),7.08(d,J＝3.7Hz,1H),6.35(d,J＝3.7Hz,1H),5.23–4.93(m,1H),3.87–3.80(m,1H),3.07–2.99(m,1H),2.31–2.18(m,2H),2.18–2.04(m,4H),2.03–1.90(m,4H),1.83–1.70(m,2H),1.59–1.47(m,2H),1.46–1.35(m,2H).¹³C NMR(400MHz,methanol-d4)δ159.20,153.98,150.78,125.04,113.42,100.73,56.65,51.02,50.41,33.17,32.19,31.92,25.40.

P3-53:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.43(s,1H),6.14(s,1H),4.96(d,J＝7.3Hz,1H),4.81(dd,J＝7.5,6.1Hz,2H),4.58–4.49(m,1H),4.39(m,2H),3.77–3.66(m,1H),3.59(s,3H),3.23(s,3H),3.12–3.01(m,1H),3.00–2.95(m,2H),2.60–2.37(m,3H),2.26–2.16(m,2H),2.10–1.94(m,6H),1.75–1.54(m,4H),1.31–1.13(m,4H).¹³C NMR(400MHz,Chloroform-d)δ191.39,157.94,152.87,151.54,136.86,111.48,97.40,77.16,57.31,56.82,50.79,50.45,44.05,42.63,35.66,32.28,31.55,25.63.

P3-54:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.43(s,1H),6.15(s,1H),4.96–4.90(m,2H),4.71–4.65(m,1H),4.59–4.45(m,2H),3.76–3.71(m,1H),3.59(s,3H),3.23(s,3H),3.02–2.80(m,2H),2.74–2.61(m,1H),2.60–2.36(m,4H),2.26–2.16(m,2H),2.11–1.98(m,5H),1.82–1.67(m,2H),1.68–1.54(m,2H),1.30–1.12(m,4H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ191.45,157.97,152.89,151.56,136.85,111.46,97.43,81.78,68.84,57.33,56.64,53.41,50.51,44.06,42.64,32.26,32.21,31.58,25.65,25.34.

P3-55:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.43(s,1H),6.15(s,1H),4.94(d,J＝7.4Hz,1H),4.60–4.51(m,1H),3.87–3.66(m,1H),3.59(s,3H),3.23(s,3H),2.86(t,J＝6.4Hz,2H),2.67(t,J＝6.4Hz,2H),2.60–2.40(m,3H),2.28–2.18(m,2H),2.10(s,3H),2.07–1.98(m,6H),1.97–1.84(m,4H),1.72–1.56(m,2H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ191.44,157.94,152.89,151.54,136.89,111.49,97.42,57.34,56.37,50.49,45.17,44.06,42.64,34.68,32.22,31.56,25.66,15.32.

P3-56:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.41(s,1H),6.13(s,1H),5.01(d,J＝7.4Hz,1H),4.55–4.47(m,1H),3.76–3.68(m,1H),3.61–3.58(m,4H),3.57(s,3H),3.55–3.50(m,2H),3.36(s,3H),3.21(s,3H),2.85–2.82(m,2H),2.57–2.38(m,6H),2.27–2.14(m,2H),2.08–1.84(m,6H),1.67–1.54(m,2H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ191.34,157.89,152.83,151.45,136.82,111.39,97.36,71.89,70.59,70.31,59.07,57.27,56.54,50.43,46.63,44.01,42.58,31.89,31.47,25.60.

P3-57:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.42(s,1H),6.15(s,1H),4.92(d,J＝7.4Hz,1H),4.57–4.48(m,1H),4.46–4.40(m,1H),3.74–3.71(m,1H),3.69–3.63(m,2H),3.59(s,3H),3.23(s,3H),2.94–2.87(m,2H),2.60–2.35(m,3H),2.25–2.13(m,2H),2.11–1.94(m,4H),1.90–1.80(m,2H),1.69–1.55(m,2H),1.27–1.08(m,4H).¹³C NMR(400MHz,chloroform-d)δ191.38,157.86,152.86,151.50,136.92,111.50,97.40,66.63,62.80,61.98,57.33,50.21,44.07,42.65,30.94,28.84,25.68.

P3-58:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.42(s,1H),6.14(s,1H),4.99(d,J＝7.4Hz,1H),4.56–4.48(m,1H),3.78–3.69(m,1H),3.58(s,3H),3.22(s,3H),3.00–2.68(m,2H),2.64–2.56(m,1H),2.54(d,J＝7.0Hz,2H),2.59–2.35(m,2H),2.25–2.16(m,2H),2.10–1.96(m,5H),1.68–1.54(m,2H),1.41–1.29(m,2H),1.29–1.17(m,2H),1.04–0.94(m,1H),0.56–0.45(m,2H),0.25–0.10(m,2H).¹³C NMR(400MHz,Chloroform-d)δ191.36,157.90,152.84,151.50,136.84,111.46,97.37,57.30,56.43,52.17,50.35,44.04,42.61,31.61,31.49,25.63,10.94,3.73.

P3-59:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.09(d,J＝1.6Hz,1H),7.19(d,J＝1.6Hz,1H),4.75(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.10(dtd,J＝12.0,6.9,3.1Hz,1H),2.12–1.99(m,3H),1.96–1.70(m,4H),1.75–1.57(m,2H),1.47–1.32(m,2H),1.27(ttd,J＝12.9,11.8,6.3,5.7,2.6Hz,2H),1.06(s,2H).

P3-60:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.06(d,J＝1.5Hz,1H),6.57(d,J＝1.5Hz,1H),4.28(p,J＝6.9Hz,1H),3.85(p,J＝6.9Hz,1H),3.10(dtd,J＝12.0,6.9,3.1Hz,1H),2.10–1.96(m,3H),1.95–1.54(m,8H),1.46–1.32(m,2H),1.35–1.20(m,2H),1.07(s,2H).

P3-61:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.00(d,J＝1.5Hz,1H),6.33(d,J＝1.5Hz,1H),4.72–4.61(m,2H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),2.42(s,6H),2.07–1.93(m,3H),1.95–1.70(m,6H),1.69–1.55(m,2H),1.38(ddd,J＝13.8,8.9,6.2Hz,2H),1.31–1.21(m,2H),1.06(s,2H).

P3-62:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.93(s,1H),4.57(p,J＝6.9Hz,1H),3.85(p,J＝6.9Hz,1H),3.17(s,6H),3.10(dtd,J＝11.9,6.8,3.1Hz,1H),2.06–1.69(m,8H),1.71–1.55(m,2H),1.47–1.32(m,2H),1.33–1.22(m,2H),1.06(s,2H).

P3-63:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),7.60(d,J＝1.6Hz,1H),4.42(p,J＝6.9Hz,1H),3.83(p,J＝6.9Hz,1H),3.10(dtd,J＝11.9,6.9,3.0Hz,1H),2.10–1.96(m,8H),1.88(s,3H),1.96–1.57(m,7H),1.45–1.19(m,4H),1.06(s,2H).

P3-64:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.92(d,J＝1.5Hz,1H),6.10(d,J＝1.6Hz,1H),3.71(p,J＝6.9Hz,1H),3.60(s,1H),2.95(p,J＝6.9Hz,1H),2.57(p,J＝6.8Hz,1H),2.47(s,6H),1.94–1.40(m,15H).

P3-65:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.08(d,J＝1.5Hz,1H),6.81(d,J＝1.5Hz,1H),4.90(p,J＝6.9Hz,1H),3.71(p,J＝6.7Hz,1H),3.11(ddt,J＝10.3,8.3,3.5Hz,1H),2.78(s,6H),2.11–1.73(m,9H),1.65(ttd,J＝6.9,4.1,3.1,1.8Hz,2H),1.46–1.31(m,2H),1.26(s,1H),1.33–1.19(m,1H),1.07(s,2H).

P3-66:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.84(s,1H),4.62(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.8Hz,1H),3.50(s,2H),3.17(s,6H),3.10(dtd,J＝12.0,6.8,3.1Hz,1H),2.07–1.69(m,9H),1.70–1.54(m,2H),1.46–1.32(m,2H),1.32–1.21(m,2H),1.06(s,2H).

P3-67:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.09(d,J＝9.4Hz,3H),4.64(p,J＝6.9Hz,1H),3.86(p,J＝7.0Hz,1H),3.17(s,6H),2.09–1.95(m,2H),2.02(s,1H),1.95–1.66(m,5H),1.69–1.54(m,2H),1.44–1.32(m,2H),1.33–1.19(m,2H),1.06(s,2H).

P3-68:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.07(s,1H),4.71(p,J＝7.0Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.17(s,6H),3.10(dtd,J＝11.9,6.9,3.2Hz,1H),2.06(s,1H),2.05–1.70(m,7H),1.70–1.58(m,1H),1.47–1.38(m,1H),1.42–1.29(m,1H),1.33–1.23(m,1H),1.07(s,2H).

P3-69:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ7.04(s,1H),4.76–4.64(m,1H),3.85(p,J＝6.9Hz,1H),3.17(s,6H),3.10(dtd,J＝11.9,6.8,3.1Hz,1H),2.05(s,1H),2.04–1.86(m,2H),1.90–1.78(m,2H),1.82–1.69(m,2H),1.71–1.54(m,2H),1.46–1.22(m,3H),1.07(s,2H).

P3-70:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.09(d,J＝1.5Hz,1H),7.46(d,J＝1.7Hz,1H),4.77(p,J＝6.8Hz,1H),3.80(p,J＝6.8Hz,1H),3.16–3.04(m,1H),2.11–1.97(m,3H),1.97–1.87(m,1H),1.88(d,J＝1.8Hz,1H),1.90–1.71(m,5H),1.75–1.57(m,2H),1.47–1.31(m,2H),1.33–1.19(m,2H),1.07(s,2H).

P3-71:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ8.92(d,J＝1.5Hz,1H),7.05(d,J＝1.6Hz,1H),3.96(t,J＝6.8Hz,1H),3.60(s,1H),3.17(s,6H),2.95(p,J＝6.8Hz,1H),2.57(p,J＝6.8Hz,1H),2.03–1.83(m,3H),1.85–1.64(m,5H),1.69–1.61(m,1H),1.50(s,2H),1.60–1.30(m,6H).

P3-72:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.02(d,J＝1.5Hz,1H),6.49(d,J＝1.5Hz,1H),4.47(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.8Hz,1H),3.28(s,6H),3.10(dtd,J＝11.8,6.7,3.1Hz,1H),2.05–1.68(m,9H),1.73–1.54(m,2H),1.45–1.31(m,2H),1.32–1.21(m,2H),1.06(s,2H).

P3-73:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.95(d,J＝1.6Hz,1H),4.63(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.54(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),3.37(s,3H),3.32(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.17(s,6H),2.90(h,J＝6.8Hz,1H),2.28(p,J＝6.9Hz,1H),2.10–1.97(m,2H),2.01(s,1H),1.96–1.63(m,7H),1.61(tdd,J＝6.8,4.7,2.2Hz,2H),1.45–1.21(m,4H),1.11(s,1H),1.02(d,J＝6.9Hz,3H).

P3-74:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.6Hz,1H),6.96(d,J＝1.5Hz,1H),4.59(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.66(dd,J＝12.5,7.0Hz,1H),3.46(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),3.17(s,6H),2.68(h,J＝6.9Hz,1H),2.34(s,1H),2.25–2.13(m,1H),2.14–1.99(m,3H),1.93–1.72(m,6H),1.77–1.67(m,2H),1.71–1.55(m,2H),1.47–1.22(m,4H),1.06–0.98(m,4H).

P3-75:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.50(d,J＝1.5Hz,1H),4.20(p,J＝6.9Hz,1H),3.78–3.66(m,1H),3.54(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.37(s,3H),3.34(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),3.17(s,6H),2.83(h,J＝6.9Hz,1H),2.20(p,J＝6.9Hz,1H),2.06–1.90(m,4H),1.95–1.82(m,3H),1.83(ddd,J＝8.6,4.8,2.0Hz,1H),1.82–1.51(m,4H),1.46–1.22(m,4H),1.06–0.97(m,4H).

P3-76:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.50(d,J＝1.5Hz,1H),4.20(p,J＝6.9Hz,1H),3.83(ddd,J＝21.1,13.1,7.0Hz,2H),3.37(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),3.17(s,6H),2.79(h,J＝6.9Hz,1H),2.39(s,1H),2.00(s,2H),2.06–1.93(m,1H),1.97–1.80(m,4H),1.85–1.73(m,2H),1.77–1.66(m,2H),1.71–1.54(m,2H),1.47–1.21(m,4H),1.09–1.01(m,4H).

P3-77:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),8.19(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(d,J＝7.5Hz,1H),7.19(d,J＝1.5Hz,1H),4.69(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝7.0Hz,1H),3.10(dtd,J＝12.0,6.9,3.0Hz,1H),2.07(ddt,J＝12.3,7.0,3.8Hz,2H),2.03(s,1H),1.95–1.73(m,5H),1.64(dtdt,J＝13.4,8.4,5.3,2.5Hz,2H),1.47–1.32(m,2H),1.34–1.19(m,2H),1.07(s,2H).

P3-78:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.04(d,J＝1.5Hz,1H),6.64(d,J＝1.5Hz,1H),4.50(p,J＝6.9Hz,1H),3.76(dt,J＝21.4,6.6Hz,3H),2.90(t,J＝6.3Hz,2H),2.02(s,1H),2.07–1.96(m,1H),2.00–1.91(m,1H),1.90(qt,J＝7.1,2.2Hz,3H),1.89–1.68(m,3H),1.61(dddd,J＝10.1,6.9,5.1,2.9Hz,2H),1.46–1.33(m,2H),1.33–1.19(m,2H),1.07(s,2H).

P3-79:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.95(d,J＝1.6Hz,1H),4.63(p,J＝6.9Hz,1H),3.84(p,J＝6.9Hz,1H),3.58(h,J＝6.9Hz,1H),3.36(s,3H),3.17(s,6H),2.96(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),2.69(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),2.16–1.97(m,2H),2.01(s,1H),1.94–1.81(m,3H),1.86–1.64(m,4H),1.68–1.55(m,2H),1.44–1.34(m,2H),1.38–1.24(m,3H),1.21(d,J＝6.7Hz,3H).

P3-80:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.50(d,J＝1.5Hz,1H),4.20(p,J＝6.9Hz,1H),3.79–3.67(m,1H),3.58(h,J＝6.9Hz,1H),3.37(s,3H),3.17(s,6H),3.00(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.68(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),2.17–1.98(m,1H),2.02–1.89(m,4H),1.93–1.78(m,3H),1.82–1.51(m,4H),1.46–1.36(m,1H),1.40–1.28(m,1H),1.26(dd,J＝27.7,6.3Hz,4H),1.11(s,1H).

P3-81:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.6Hz,1H),6.95(d,J＝1.5Hz,1H),4.60(p,J＝6.9Hz,1H),3.85(dp,J＝10.1,6.9Hz,2H),3.17(s,6H),3.01(dd,J＝12.3,7.0Hz,1H),2.75(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),2.57(s,1H),2.15–1.97(m,4H),1.93–1.63(m,8H),1.67–1.54(m,1H),1.47–1.21(m,5H),1.15(d,J＝6.9Hz,3H).

P3-82:

¹H NMR(400MHz,chloroform-d)δ9.05(d,J＝1.5Hz,1H),6.50(d,J＝1.5Hz,1H),4.21(p,J＝6.9Hz,1H),3.93–3.80(m,2H),3.17(s,6H),3.14(dd,J＝12.4,6.9Hz,1H),2.81(dd,J＝12.4,7.0Hz,1H),2.55(d,J＝12.8Hz,2H),2.00(s,2H),2.06–1.92(m,2H),1.90–1.74(m,5H),1.78–1.49(m,5H),1.47–1.24(m,4H),1.16(d,J＝6.9Hz,3H).

结果分析(二)

将制备得到的化合物P3-01～P3-82的82个化合物进行体外生物活性检测，分别进行酶活性抑制试验(分别以CDK9、CDK7、CDK4、CDK6为测试蛋白)，以及细胞毒性试验(以MCF-7细胞为试验细胞)，试验结果如下表2所示，从表2可以发现各化合物对不同的测试蛋白(CDK9、CDK7、CDK4、CDK6)的IC₅₀的浓度以及对于MCF-7细胞的GI₅₀的浓度。表格中，“+”代表“活性>5μM”；“++”代表“1μM<活性<5μM”；“+++”代表“0.5μM<活性<1μM”；“++++”代表“0.1μM<活性<0.5μM”；“+++++”代表“活性<0.1μM”。可以看出，所提供的82个CDK9抑制剂中，对CDK4/CDK9的酶活性强，IC₅₀<20nM，最强的酶活性<10nM，对CDK6/7的选择性>50倍；该类抑制剂对肿瘤细胞的细胞毒性GI₅₀<1μM，其中对MCF-7的细胞毒性GI₅₀<0.5μM，最强效的可达到63nM的水平。

表2

结果分析(三)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-01、P3-22、P3-36、P3-42的4个化合物进行药代动力学性质测试分析，得到的结果分析如下表3所示，由表3可知，CDK9抑制剂P3-01、P3-22、P3-36、P3-42在小鼠体内的药代动力学数据表现良好，部分呈现优异的药代动力学性质；其中，抑制剂P3-42，在IV 2.68mg/kg q7d的条件下，小鼠耐受性好，未观测到毒性症状。

表3

结果分析(四)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-42进行单剂量毒性实验分析，提供溶剂作为对照组试验，如附图1所示，溶剂对照组的实验动物体重与添加了抑制剂P3-42的实验动物体重没有显著性差异，可以看出单独添加抑制剂不会对实验动物有影响，未检测到毒性症状。

结果分析(五)

将制备得到的CDK9抑制剂P3-42、购买得到的抑制剂YH-011、P3-42和YH-011的组合物进行体内抗肿瘤活性分析，提供溶剂作为对照组试验，如附图2所示，肿瘤接种后，CDK9抑制剂P3-42、购买得到的抑制剂YH-011、P3-42和YH-011的组合物和溶剂对照组注射的试验动物的体重均没有显著性差异，差别不大。如附图3所示，肿瘤接种后，实验动物体内的肿瘤体积呈现不同的情况，当肿瘤接种后41天时，溶剂对照组的实验动物体内，肿瘤体积约为800mm³，CDK9抑制剂P3-42的实验动物体内，肿瘤体积约为620mm³，抑制剂YH-011的实验动物体内，肿瘤体积约为600mm³，CDK9抑制剂P3-42和抑制剂YH-011组合物的实验动物体内，肿瘤体积约为500mm³。可以发现，在MCF-7人源乳腺癌异种移植模型中，本发明的抑制剂P3-42在IV 2.68mg/kg q7d的条件下，肿瘤生长抑制率为28.2％。YH-011在IV 4.0mg/kg，q7d的条件下，肿瘤生长抑制率为34.6％。当P3-42和YH-011联合给药时，肿瘤生长抑制率为44.6％，肿瘤抑制作用增强，同时未呈现出毒副症状。

结果分析(六)

如图4所示，当CDK9抑制剂P3-01与CDK9相互作用时，CDK9的Asp¹⁶⁷的氢键与R¹位置的取代基相互作用，Cys¹⁰⁶的氢键与羰基与嘧啶环上的N原子相互作用，Asp¹⁰⁹的氢键与R⁵位置的取代基相互作用，保证构建的嘧啶并吡咯类激酶抑制剂对CDK9的酶活性强，能表现出较高的特异性以及较低的细胞毒性。

以上仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CDK9抑制剂，其特征在于，所述CDK9抑制剂为嘧啶并吡咯类激酶抑制剂，且化学结构通式如式I所示：

其中，R¹选自氰基、卤素、

中的任意一种，且X为CH₂、O、S或含N的取代基；Y为O、S或N-R¹²；A为CR¹²、CR¹²R¹³、N或NR¹²；B为CR¹²或N；R⁶～R¹³为H、OH、NH₂、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基；

R²选自C₃-C₇环烷基、立方烷基、金刚烷基、并环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环芳香基、硅烷基中的任意一种；

R³选自氨基、氰基、卤素、

中的任意一种，且Z为O、S或含N取代基；R¹⁴为H、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C₃-C₇环烷基、C_1-6烷氧基或C₃-C₇环烷氧基；

R⁴选自氨基、氰基、三氟甲基中的任意一种；

R⁵选自H、C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环烷基。

2.根据权利要求1所述的CDK9抑制剂，其特征在于，所述含N的取代基选自NH、N-O-H、N-取代烷基、N-O-取代烷基中的任意一种；和/或，

所述并环烷基选自[2,2,1]-并环烷基或[2,2,2]-并环烷基；和/或，

所述取代的杂环芳香基选自含N取代的杂环芳香基、含S取代的杂环芳香基、含O取代的杂环芳香基中的任意一种。

3.根据权利要求1或2所述的CDK9抑制剂，其特征在于，所述R¹中，所述C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基中，所述烷基、所述烯基、所述炔基上的任意碳原子被单个或多个卤素取代；和/或，

所述R³中，所述C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、C_3-7环烷基、C_1-6烷氧基、C_3-7环烷氧基中，所述烷基、所述烯基、所述炔基上的任意碳原子被单个或多个卤素取代。

4.根据权利要求1或2所述的CDK9抑制剂，其特征在于，所述R²中，所述C_3-7环烷基、立方烷基、金刚烷基、并环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环芳香基、硅烷基中，所述烷基、芳基、杂环烷基、杂环芳香基、硅烷基上的任意碳原子被一个或两个以上的以下基团任意取代：卤素、氰基、-OC_0-10烷基、-S(O)_mC_0-10烷基、-SO₂N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)O(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)N(C_0-10烷基)、-C(＝O)C_0-10烷基、-C(＝O)OC_0-10烷基、-C(＝O)N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环芳香基、杂环烷基、芳基、-C_1-10烷基芳基、-C_1-10烷基杂环芳香基、-N杂环芳香基、-S杂环芳香基或-O杂环芳香基，其中，m为0、1或2。

5.根据权利要求1或2所述的CDK9抑制剂，其特征在于，所述R⁵中，所述C_1-10烷基、C_2-10烯基、C_2-10炔基、C_3-10环烷基、杂环烷基、芳香基、取代的杂环烷基中，所述烷基、芳基、杂环烷基、杂环芳香基、烯基或炔基上的任意碳原子可被一个或两个以上的以下基团任意取代：卤素、-CN、-OC_0-10烷基、-S(O)_mC_0-10烷基、-SO₂N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)O(C_0-10烷基)、-N(C_0-10烷基)C(＝O)N(C_0-10烷基)、-C(＝O)C_0-10烷基、-C(＝O)OC_0-10烷基、-C(＝O)N(C_0-10烷基)(C_0-10烷基)、-杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环烷基、-N(C_0-10烷基)杂环芳香基、杂环烷基、芳基、-C_1-10烷基芳基、-C_1-10烷基杂环芳香基、-N杂环芳香基、-S杂环芳香基或-O杂环芳香基，其中，m为0、1或2。

6.一种CDK9抑制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括含有权利要求1～5任一所述的CDK9抑制剂的化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体、醚、酯、前药和溶剂化物，以及可药用的载体、稀释剂或赋形剂。

8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括治疗肿瘤的抑制剂药物，其中，所述肿瘤包括淋巴瘤，母细胞瘤，髓母细胞瘤，视网膜母细胞瘤，肉瘤，脂肪肉瘤，滑膜细胞肉瘤，神经内分泌肿瘤，类癌肿瘤，胃泌素瘤，胰岛细胞癌，间皮瘤，神经鞘瘤，听神经瘤，脑膜瘤，腺癌，黑素瘤，白血病或淋巴样恶性肿瘤，鳞状细胞癌，上皮鳞状细胞癌，肺癌，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，腺癌肺癌，肺鳞癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃癌，肠癌，胰腺癌，成胶质细胞瘤，子宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，转移性乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫癌，唾液腺癌，肾癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，肝癌，肛门癌，阴茎癌，梅克尔细胞癌，食管癌，胆道肿瘤，头颈部癌和血液恶性肿瘤。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗肿瘤的抑制剂药物选自烷化剂、激酶抑制剂、顺铂类药物、胞嘧啶核苷衍生物、紫杉醇衍生物、长春花生物碱类、阿霉素、柔红霉素、放线菌素、丝裂霉素、博莱霉素、Topo I抑制剂、血管抑制剂、血管生成抑制剂等中的至少一种。

10.根据权利要求7～9任一所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物配制为以下任意一种形式：糖浆剂，酏剂，悬浮剂，粉剂，颗粒剂，片剂，胶囊，锭剂，水溶液，霜剂，膏剂，洗液剂，凝胶剂，乳剂，气雾剂。

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