CN113332455B - 一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用 - Google Patents

一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用，所述动物模型为小鼠，所述钙调控机制紊乱为通过基因突变抑制小鼠体内肌浆网/内质网钙ATP酶2(SERCA2)基因表达产物的活性,造成钙调控机制紊乱，导致显著的肺血管重构和右心室收缩压随年龄增加。针对钙调控紊乱及其下游相关机制的干预可以有效改善肺血管重构。本发明构建了基于钙调控紊乱相关机制的新型肺血管重构和肺动脉高压的动物模型，可有效模拟肺动脉高压病人的肺血管重构病变，用于研究肺动脉高压发病机制、病变进程和药物筛选。

Description

一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺 动脉高压药物筛选中的应用
技术领域
本发明属于通过医学动物模型筛选治疗药物的研究领域，具体涉及一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用。
背景技术
肺高血压(pulmonary hypertension，PH)是一种较难治愈的慢性心血管疾病，发病机制复杂且预后差。PH是指各种原因导致的肺动脉压力升高(海平面静息状态下右心导管测定的肺动脉平均压≥25mmHg)，包括肺动脉高压、左心疾病所致PH、肺部疾病(或)低氧所致PH、肺动脉阻塞所致PH以及未知因素和(或)多因素所致PH。PH的主要特征是肺血管重构引起阻力进行性升高，最终导致右心衰竭。临床表现为劳力性呼吸困难、晕厥、心绞痛等。
在各类PH中，肺动脉高压病变最为严重，尤其是发生区别于其他类型PH的丛状病变。特发性肺动脉高压是最常见的肺动脉高压，在活性氧增多的疾病中发病率明显增加，例如肥胖和糖尿病。肺动脉高压发病率约有1％，在65岁以上人群高达5-10％。肺动脉高压特征是远端中小肺动脉发生重构，形成丛状病变，造成管腔横截面积缩小，增加肺血管阻力。有相当比例的肺动脉高压患者也同时发生肺静脉重构。肺动脉高压患者5年生存率在未经治疗时约为20％，经靶向药物治疗虽提高到50％左右，但治疗费用极其昂贵，造成巨大的经济负担。低氧引起肺动脉收缩和重构是最常用肺动脉高压模型。血管内皮毒物野百合碱导致的肺动脉重构接近结缔组织病相关肺动脉高压，与炎症有关。血流动力学改变(体动脉-腔静脉分流、一侧肺叶切除等)造成肺动脉压力增加，导致肺动脉重构和肺动脉高压。这些肺动脉高压动物模型在病理学方面不能完全模拟人类梗阻性肺动脉高压肺血管重构模式。因此解析肺血管重构的机制，构建模拟临床上肺血管重构和肺动脉高压的动物模型对于药物筛选非常关键。
近年来，基因工程技术制备肺动脉高压模型前景光明。Beppu等制备了BMPR2(骨形成蛋白受体2，bone morphogenetic protein receptor 2)基因敲除的小鼠(去除外显子4,5)，这种小鼠可以正常生存和繁殖。将这些小鼠暴露在低氧环境中会导致肺小动脉收缩、肌化以及平均肺动脉压升高。Yasuda T等通过基因修饰抑制肺血管平滑肌细胞的BMPR2等位基因的表达，发现在这种小鼠的肺血管出现了类似肺动脉高压丛状病变的血管重构。该模型主要用来模拟家族性肺动脉高压,也常用作药效评估。除了BMPR2敲除模型，还有一些其他的敲除模型，如Said S.I的血管活性肠肽敲除模型，Weng等人建立的载脂蛋白E敲除模型。
基因工程技术制备肺动脉高压模型方法对技术的要求很高，造模成功率和动物存活率很低。基因靶向技术还未完全成熟，转入的外来基因可能会影响宿主的基因组，造成基因畸变和污染。
尚未看到肌浆网/内质网钙ATP酶2(sarco/endoplasmic reticulum calciumATPase 2,SERCA2)基因突变制备的机制清楚的肺动脉高压模型成功的报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用。
本发明提供的技术方案如下：
一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用，所述动物模型为小鼠，所述钙调控机制紊乱为通过基因突变抑制小鼠体内SERCA2基因表达产物的活性。所述基因突变为SERCA2基因第14外显子发生突变，其中，密码子TGT突变成TCC，所述密码子TGT编码C674，所述密码子TCC编码S674。
所述基因突变引起反映肺动脉压力的右心室收缩压(RVSP)或右心室肥大的Fulton指数随年龄增加。
所述基因突变导致类似于肺动脉高压病人的肺血管重构，包括肺静脉重构(静脉肥厚)和各种类型的肺动脉重构，所述肺动脉重构为肺动脉中膜肥厚、新生内膜病变、丛状病变、肺小动脉肌化、纤维化和肺动脉血栓。
所述基因突变促进肺动脉平滑肌细胞、肺动脉内皮细胞和肺静脉平滑肌细胞来源的细胞过度增殖。
所述基因突变导致肺组织活性氧生成增加，活性氧相关氧化酶表达增加，抗氧化酶表达减少，炎性因子表达增加。
所述基因突变引起肺动脉平滑肌细胞胞浆钙增加，激活胞浆内钙依赖活化T淋巴细胞核因子NFAT信号通路，抑制过氧化物酶体增殖物激活受体PPARγ，诱导内质网应激，激活IRE1α-XBP1s信号通路，增加细胞转型相关蛋白和炎性因子的表达，加速细胞周期，促进肺动脉平滑肌细胞转型(增殖和爬行)，抑制NFAT通路、内质网应激或IRE1α-XBP1s信号通路或是激活PPARγ或SERCA2均可改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
所述肺血管重构或肺动脉高压为活性氧增多相关疾病引起的肺血管重构或肺动脉高压。
所述肺血管重构或肺动脉高压为SERCA2功能障碍相关疾病引起的肺血管重构或肺动脉高压。
所述肺血管重构或肺动脉高压为钙调控机制紊乱相关疾病引起的肺血管重构或肺动脉高压。
本发明还提供通过上述动物模型筛选出的治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物。
所述药物为NFAT通路抑制剂环孢霉素A，其抑制NFAT通路，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
所述药物为PPARγ激活剂匹格列酮，其激活PPARγ，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
所述药物为内质网应激抑制剂4-苯基丁酸，其可抑制内质网应激，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。4-苯基丁酸是一种组蛋白去乙酰化酶和内质网应激抑制剂。
所述药物为基因药物SERCA2b，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
所述药物为IRE1α-XBP1s通路抑制剂4μ8C，其阻断IRE1α-XBP1s通路,抑制细胞周期相关蛋白的表达，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型和肺血管重构。4μ8c是一种有效的和无毒性的IRE1 RNase活化抑制剂。
所述药物为SERCA2激活剂CDN1163，其激活SERCA2，抑制细胞周期相关蛋白的表达，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型和肺血管重构。
血管中膜平滑肌细胞过度增殖是引起肺血管重构的重要细胞基础，其表型转换是关键。平滑肌细胞在内环境稳定时处于分化状态，但在一些条件刺激时可发生去分化，具有了增殖、爬行、合成以及诱导炎性反应等能力，包括合成和分泌胶原蛋白Ⅰ型(ColI)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及炎性因子(IL-6等)，参与肺血管重构。PPARγ是维持平滑肌细胞分化表型的关键调控蛋白，抑制细胞增殖、爬行和炎性通路的激活。PPARγ激活剂吡格列酮改善肺动脉高压。
胞浆Ca2+在时空上严紧调控血管平滑肌细胞的收缩和舒张，还可激活多种转录因子，如NFAT调控编码收缩蛋白、骨架蛋白以及细胞增殖和生长等相关蛋白的表达，影响平滑肌细胞表型和功能。病理情况下NFAT的激活促进肺动脉平滑肌细胞转型和肺动脉重构。钙调神经磷酸酶(CaN)是调控NFAT活性的关键酶，在胞浆Ca2+浓度升高时将NFAT去磷酸化，导致NFAT入核活化。免疫抑制剂环孢霉素A是CaN-NFAT通路的抑制剂。内质网是蛋白质合成和加工的场所，也是细胞内最大的Ca2+库，维持内质网高水平Ca2+是内质网功能的保障。内质网钙库枯竭引起持续的内质网应激，激活IRE1α、PERK和ATF6信号通路。上调的IRE1α促进肺动脉平滑肌细胞增殖和爬行，可以被IRE1α及其下游XBP1s通路的抑制剂4μ8C逆转。4μ8C是否改善肺血管重构和肺动脉高压尚无报道。内质网应激参与缺氧引起的肺血管重构，其抑制剂4-苯基丁酸改善肺动脉高压。活性氧参与肺动脉高压血管重构，在线粒体中靶向表达过氧化氢酶改善缺氧引起的肺血管重构和肺动脉高压。
SERCA的主要功能是将胞浆内的Ca2+摄入至肌浆网和内质网，维持细胞内钙稳态。SERCA2是血管中主要亚型，包括SERCA2a和SERCA2b两种基因型。抑制SERCA2的活性引起缺氧性肺静脉重构。肺动脉高压病人及野百合碱造模大鼠重构肺动脉中SERCA2a表达降低；SERCA2a基因治疗降低野百合碱造模大鼠的肺动脉压，改善肺动脉重构、右心室肥厚和纤维化，与其拮抗NFAT通路抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和爬行相关。作为肺动脉平滑肌细胞中的主要基因型，SERCA2b与肺动脉高压的关系尚不清楚。位于SERCA2a和SERCA2b胞浆侧的674位半胱氨酸(cysteine 674，C674)是调控SERCA2活性的关键谷胱甘肽化位点；病理情况大量增加的活性氧/氮自由基造成C674的不可逆性氧化(C674-SO3H)失活，干扰SERCA2功能，诱导内质网应激，破坏血管稳态。CDN1163独立于C674位点增加SERCA2的活性。CDN1163是否改善肺血管重构和肺动脉高压尚无报道。本发明人发现导致氧化应激的病理情况都增加C674-SO3H。在低氧低压诱导肺动脉高压小鼠，肺动脉重构明显并伴有C674-SO3H染色增加，推测C674失活引起肺血管重构和肺动脉高压。本发明人将C674突变成丝氨酸(C674→S674)来模拟氧化还原位点C674的失活，在SERCA2启动子的调控下构建了C674S基因突变敲入鼠(SERCA2 C674S knock-in mouse，SKI)。关于SKI的构建过程和鉴定细节参见我们已申请的国家专利(国家知识产权局申请号：202011120173.9)。纯合子SKI死于胚胎期。杂合子SKI(以下简称SKI)发生显著的肺血管重构，主要是包括丛状病变在内的各种类型肺动脉重构，右心室收缩压随年龄增加。SKI的肺动脉平滑肌细胞存在细胞转型，细胞周期加快，增殖和爬行能力增强，表明C674的氧化还原状态调控肺动脉平滑肌细胞表型，C674失活引起肺血管重构和肺动脉高压。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明构建了基于钙调控紊乱相关机制的新型肺血管重构和肺动脉高压的动物模型，有效模拟肺动脉高压病人的肺血管重构病变，可以用于研究肺动脉高压发病机制、病变进程和药物筛选。
2.本发明公开了通过上述动物模型进行治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选的途径。肺血管重构和肺动脉高压的易感因素，如缺氧、肥胖、糖尿病、吸烟、衰老、病毒感染等引起长期的氧化应激，造成持续的C674不可逆性氧化失活，干扰SERCA2功能，引起钙调控机制紊乱，激活胞浆钙依赖信号通路，诱导内质网应激，增加活性氧和炎性因子生成，促进肺动脉平滑肌细胞转型(增殖和爬行)，导致肺血管重构和肺动脉高压。本发明首次证明活性氧增多的病理情况下SERCA2中C674的氧化失活可诱导类似于肺动脉高压病人的肺血管重构病变，包括肺静脉重构(静脉肥厚)和各种类型的肺动脉重构，主要表现为肺动脉中膜肥厚、新生内膜病变、丛状病变、肺小动脉肌化、纤维化及肺动脉血栓，为肺动脉高压病人，尤其是特发性肺动脉高压病人的肺血管重构病变提供了新的分子机制。C674失活引起细胞(肺动脉平滑肌细胞、肺动脉内皮细胞和肺静脉平滑肌细胞)的过度增殖是引起肺血管重构的关键。针对钙调控紊乱及其下游相关机制的干预可以有效改善肺血管重构。
3.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：NFAT通路抑制剂环孢霉素A，其抑制NFAT通路，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
4.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：PPARγ激活剂匹格列酮，其激活PPARγ，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
5.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：内质网应激抑制剂4-苯基丁酸，其可抑制内质网应激，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
6.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：过表达SERCA2b改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型。
7.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：IRE1α-XBP1s通路抑制剂4μ8C，其阻断IRE1α-XBP1s通路,抑制细胞周期相关蛋白的表达，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型和肺血管重构。
8.本发明通过上述筛选途径，获得治疗肺血管重构或肺动脉高压的药物：SERCA2激活剂CDN1163，其激活SERCA2抑制细胞周期相关蛋白的表达，改善所述基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型和肺血管重构。
附图说明
图1为SKI基因鉴定及突变序列测序示意图：
其中图1A为测序图谱结果；图1B为SKI基因型鉴定电泳结果。
图2为SKI肺中不同类型的肺血管重构：
其中图2A为12月龄SKI肺中不同类型的肺血管重构(Masson染色)。图2A(a)肺动脉偏心性新生内膜病变(肺动脉平滑肌细胞来源)和纤维化；图2A(b)静脉肥厚；图2A(c)细胞性新生内膜(内皮细胞来源)；图2A(d)瘤样丛状病变(方框，肺动脉平滑肌细胞来源)；图2A(e)有血栓形成的肺动脉；图2A(f)茎样丛状病变(内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞来源)。图2B为Verhoeff-van-Gieson染色显示不同类型的肺血管重构代表图。a-b来自同窝对照野生型小鼠(wild type mice,WT)，c-h来自SKI。图2B(a)正常肺动脉；图2B(b)正常静脉；图2B(c)肺动脉中膜肥厚；图2B(d)细胞性新生内膜病变(内皮细胞来源)；图2B(e)向心性新生内膜病变(肺动脉平滑肌细胞来源)；图2B(f)茎样丛状病变(内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞来源)；图2B(g)瘤样丛状病变(肺动脉平滑肌细胞来源)；图2B(h)静脉肥厚(平滑肌细胞来源)。标尺＝50μm。
图3为平滑肌细胞和内皮细胞都参与了SKI的肺血管重构：
其中平滑肌细胞(SMC)用α-SMA染色表示。内皮细胞(EC)用von Willebrandfactor(VWF)染色表示。细胞核由DAPI表示。比例尺＝50μm。
图4为SKI的肺血管重构和右心室收缩压随年龄变化：
其中图4A为肺血管重构的严重程度。中膜厚度占管腔直径的百分比(上，左)；内皮细胞来源的细胞性新生内膜发生率(上，中)；肺动脉平滑肌细胞来源的同心或偏心新生内膜(上，右)严重程度评分；内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞来源的茎样丛状病变严重程度评分(下，左)，肺动脉平滑肌细胞来源的瘤样丛状病变严重程度评分(下，中)，肺动脉血栓发生率(下，右)。图4B为肺动脉丛状病变的Heath-Edward评分。图4C为肺小动脉的肌化。αSMA染色指示平滑肌细胞。VWF染色指示内皮细胞。DAPI指示细胞核。图4D为肺动脉中膜细胞增殖指标Ki67的阳性比例。图4E为肺静脉重构严重程度评分。标尺＝50μm。图4F为SKI的右心室收缩压(RVSP)和右心室肥大的Fulton指数随年龄增加。同龄WT和SKI小鼠体重没有差异。RV，右心室；LV，左心室；S，室间隔。A、B、D、E、F：SKI，灰色柱；WT，白色柱。
图5为C674失活增加肺动脉平滑肌细胞胞浆钙促进细胞增殖和爬行：
其中图5A为肺动脉平滑肌细胞中SERCA2的蛋白表达水平。图5B为Fluo-4检测胞浆Ca2+浓度。图5C为细胞周期相关蛋白的表达。图5D为细胞周期。图5E为细胞增殖和爬行。
图6为内质网应激和NFAT等通路的激活参与了C674失活诱导的肺动脉平滑肌细胞转型：
其中图6A为肺动脉平滑肌细胞转型相关蛋白的表达。内质网应激相关蛋白(IRE1α-XBP1s)，CaN-NFAT通路，平滑肌细胞转型相关蛋白(PPARγ、ColI和MMP2)和炎性因子(IL-6)。图6B为在WT的肺动脉平滑肌细胞，过表达SERCA2a和SERCA2b的C674突变体(S674)或是XBP1s促进细胞增殖。图6C为在SKI的肺动脉平滑肌细胞，过表达SERCA2b C674、抑制内质网应激(4-PBA和4μ8C)、抑制CaN-NFAT通路(CsA)、激活PPARγ(PIOG)和SERCA2(CDN1163)抑制细胞增殖。图6D为在SKI的肺动脉平滑肌细胞，4-PBA、4μ8C、CsA和PIOG抑制细胞爬行。(4-PBA即4-苯基丁酸；CsA即环孢霉素A；PIOG即匹格列酮)。
图7为阻断IRE1α-XBP1s通路或是激活SERCA2改善SKI的肺血管重构：
其中图7A为4μ8C和CDN1163的小鼠体内给药方案。图7B为体重、Fulton指数和右心室收缩压。图7C为肺血管重构指标。肺动脉中膜肥厚，细胞性新生内膜病变，Heath-Edward评分，肺动脉中膜Ki67阳性细胞的比例，肺小动脉肌化，肺静脉肥厚。图7D-E为肺组织中磷酸化IRE1α、XBP1s和细胞周期相关蛋白的表达。
图8为SKI肺组织中活性氧生成和炎性因子的表达增加：
其中图8A为SKI肺组织中SERCA2 C674-SO3H增加。图8B为DHE染色显示SKI肺组织中活性氧增多。图8C为肺动脉高压相关蛋白的表达。炎性因子(MCP1、TNFα、VCAM1、ICAM1和磷酸化p65NFκB)，TGFβ1(Nox4的激活剂和致纤维化细胞因子)和Nox4(NADPH氧化酶，过氧化氢的来源)，线粒体来源的抗氧化酶SOD2。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
实施例1
本实施例以小鼠为目标动物，对本发明提供的钙调控机制紊乱的动物模型的构建方法进行说明，具体步骤如下：
(1)关于SKI的构建过程和鉴定细节参见我们已申请的国家专利(国家知识产权局申请号：202011120173.9)。异性间的杂合子SKI进行交配繁殖来获得纯合子的SKI。由于纯合子SKI具有胚胎致死性。本发明中使用的小鼠均来自杂合子SKI(50％的C674和50％的S674)和C57BL/6J小鼠的交配繁育，获得杂合子SKI和其同窝出生的对照WT(100％的C674)。杂合子SKI通过心脏组织cDNA测序确定C674S敲入成功。
cDNA测序结果如下，加粗序列为突变序列，TNN为突变点序列。
ATTGGCATCTTTGGGCAGGATGAGGATGTGACATCAAAGGCTTTTACAGGGCGAGAGTTTGATGAATTAAGCCCTTCAGCCCAGAGAGATGCCTGCTTAAATGCCCGCTNN(TGT/TCC)TTTGCTCGAGTTGAACCTTCCCACAAG
结合图1A测序图谱结果，可以得出，经cDNA测序，所构建的SKI基因组第14外显子核苷酸序列中674位同时存在编码半胱氨酸(C)的密码子TGT和编码丝氨酸(S)的密码子TCC，且二者峰度一致，表明编码C674密码子TGT有一半突变成编码S674的密码子TCC，确定所得小鼠为杂合子SKI。
实施例2
对实施例1中获得的杂合子SKI进行基因型鉴定，方法步骤如下：
(1)取20天出生幼鼠的鼠尾，置于1.5mL EP管中,加入200μL 50mM NaOH，98℃加热1小时。
(2)室温冷却30分钟，加入20μL 1M Tris-Hcl缓冲液(pH 8.0)，12000g离心5分钟，取少许上清作为模板进行PCR扩增。
(3)PCR扩增反应体系：
SKI小鼠鉴定引物序列(5’-3’)如下：
Forward primer：CCACAAATGGCTCTCAGGTT(SEQ ID NO：1)
Reverse primer：CAGCTCTAGGCAGAGGGACT(SEQ ID NO：2)
(4)PCR反应条件：94℃预变性5分钟；98℃变性30秒,62℃退火30秒,72℃延伸60秒，共35个循环；72℃延伸10分钟，4℃保存。
(5)琼脂糖凝胶电泳
称量0.37g琼脂糖溶于TBE缓冲液中，微波炉加热融化后，加入2.5μL GoldView核酸染料，制成1.5％的琼脂糖胶。取10μL PCR产物，120V恒压进行琼脂糖电泳。
①结果如图1B所示，2-4泳道有一个条带，位于100bp-250bp之间，为WT；1和5泳道有两个条带为SKI。
实施例3
测定小鼠右心室压力，方法步骤如下：
(1)右心室压力以及其它右心功能指标参数测定采用漂浮导管法。首先，用20％乌拉坦麻醉待测小鼠，然后在小鼠右颈部剪出一小口，暴露出右颈外静脉。
(2)聚乙烯导管一端经右颈外静脉插入右心室，另一端连接微型压力传感器。记录右心室压力波形图以及其它右心功能指标参数。右心室的参数，包括右心室收缩压和右心室舒张末期压力(RVEDP)是由生理记录仪(PowerLab)记录。
(3)当测量完成后，分别称右心室壁(RV)以及左心室(LV)和室间隔(S)的重量。用Fulton指数[RV/(LV+S)weight]来评估右心室肥厚。
①结果如图4F所示，在相同年龄段，SKI与WT的体重没有差异。SKI的右心室收缩压随年龄增长而升高，尤其是12月龄(10只中有8只超过25mmHg)，而WT的右心室收缩压不随年龄变化。评估右心室肥大的Fulton指数[RV/(LV+S)weight]在SKI随年龄增长而增加，在12月龄最为显著，而WT的Fulton指数不随年龄变化。
②结果如图7B所示，8周龄的SKI和WT在体重、Fulton指数以及右心室收缩压没有差异。与溶剂对照(Ctrl)相比，4μ8C和CDN1163给药对小鼠体重、Fulton指数以及右心室收缩压没有影响。
实施例4
对实施例3中的小鼠执行安乐死，取肺组织，进行以下检测：
(1)病理切片的制备步骤如下：
1)收集新鲜肺组织，在4％多聚甲醛中固定24小时。
2)进行石蜡包埋的预处理，包括洗涤、乙醇梯度脱水、透明和透蜡。将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡一起倒入容器，然后立即投入冷水中使其凝固成蜡块。
3)将已固定和修好的石蜡块夹在切片机上，调整卡槽方向，设置切片厚度7μm，进行石蜡切片。
(2)Masson三色染色，方法步骤如下：
1)首先进行组织脱蜡。将石蜡切片放置在二甲苯中脱蜡20分钟，然后依次放入无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇各3分钟。PBS漂洗5分钟。
2)用配好的Bouin氏染液预处理切片1小时。水洗20分钟。
3)Weigert铁苏木素染液染色5分钟。酸性乙醇分化液分化10秒后水洗。
4)滴加Masson蓝化液返蓝5分钟后水洗。
5)丽春红染液染色5分钟后，滴加弱酸工作液终止染色。
6)滴加磷钼酸溶液分化2分钟，显微镜下观察。待分化完成，滴加弱酸工作液终止分化。
7)滴加苯胺蓝染液染色1分钟，滴加弱酸工作液终止染色。
8)95％乙醇和无水乙醇脱水三次，每次5秒。二甲苯透明2次，每次2分钟。用中性树脂进行封片后拍照。
①结果如图2中A所示，在12月龄SKI的肺组织，纤维化广泛发生于肺动脉的新生内膜和中膜(图2A-a)、丛状病变(图2A-d，f)和肺静脉(图2A-b)。
(3)Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色，方法步骤如下：
1)首先进行组织脱蜡。将石蜡切片放置在二甲苯中脱蜡20分钟。然后依次放入无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75乙醇各3分钟。PBS漂洗5分钟。
2)将5％乙醇苏木精、10％氯化铁以及Weigert’s碘溶液按照20：8：8的比例混合，得到所需要的Verhoeff’s工作液。将Verhoeff’s工作液滴加到切片的样品组织，染色1小时，中途补加工作液以防止样品干燥。
3)待染色完成后，自来水冲洗切片3分钟。组织经2％氯化铁分化2分钟，显微镜下观察。待分化结束后，用自来水终止分化。
4)切片滴加5％硫代硫酸钠1分钟。自来水冲洗5分钟。
5)用预先配好的Van Gieson’s染液染色5分钟。
6)85％乙醇、95％乙醇分别脱水30秒。无水乙醇脱水2次，每次1分钟。二甲苯透明2次，每次2分钟。用中性树脂进行封片后拍照。①结果如图2中B所示，WT肺动脉(图2B-a)和肺静脉(图2B-b)表现正常，无病变发生。SKI发生明显的肺血管重构，主要包括中膜增厚(图2B-c)、细胞性内膜增生(图2B-d)、同心型新内膜病变(图2B-e)、茎样丛状病变(图2B-f)、瘤样丛状病变(图2B-g)、肺静脉肥厚(图2B-h)。
(4)肺组织免疫荧光染色，方法步骤如下：
1)对于石蜡组织切片，首先进行组织脱蜡。将石蜡切片放置二甲苯中脱蜡20分钟。然后依次放入无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％
乙醇各3分钟。PBS漂洗5分钟。
2)将准备好的组织切片放入提前配置好的柠檬酸盐抗原修复液中，放入100℃烘箱中加热修复50分钟，抗原修复液的温度维持在95℃。
3)待抗原修复完成后，室温冷却20分钟。取出切片，用蒸馏水漂洗3次，每次5分钟。
4)用滤纸将组织周围的液体吸干，然后滴加山羊血清，室温封闭1小时。
5)滴加含α-SMA、VWF或Ki67的一抗孵育液，4℃过夜孵育。
6)孵育完成后，PBS漂洗3次，每次5分钟。加入荧光二抗(AlexaFluor 488、CY3-conjugated Affinipure)和DAPI的混合液，室温孵育2小时。待孵育完成后，PBS漂洗3次，每次5分钟。
7)70％灭菌甘油封片。正置荧光显微镜拍照，并采用Las X软件分析荧光强度和蛋白表达部位。
①结果如图3所示，SKI增厚的肺动脉中膜、同心或偏心新生内膜、茎样和瘤样丛状病变、增厚的肺静脉均被平滑肌细胞标志物α-SMA标记，表明引起这些重构的细胞来源是平滑肌细胞(SMC)，而在细胞性新生内膜和茎样丛状病变则被内皮细胞标志物VWF标记，表明引起这些重构的细胞来源是内皮细胞(EC)。这其中茎样丛状病变被α-SMA和VWF共同标记。
②结果如图4中A所示，肺组织切片VVG染色和免疫荧光染色的分析结果显示，SKI肺动脉中膜(肺动脉直径50～100μm)厚度随年龄增长而增加，而WT的中膜厚度不随年龄变化(上，左)。2月龄SKI的小肺动脉(直径～50μm)出现内皮细胞来源的细胞性新生内膜，但是其发生率随着年龄的增长而下降(上，中)。与同龄WT相比，4月龄和12月龄的SKI平滑肌细胞来源的同心或偏心新生内膜病变更严重(上，右)。SKI内皮细胞和肺动脉平滑肌细胞来源的茎样丛状病变(下，左)和肺动脉平滑肌细胞来源的瘤样丛状病变(下，中)随着年龄的增长变得更严重。在SKI，肺动脉血栓的发生率随年龄增长而增加，而所有WT都不发生血栓(下，右)。
③结果如图4中B所示，由于SKI出现类似于肺动脉高压病人的丛状病变，我们根据Heath-Edward分类(后由Wagenvoort等人修订)进行评分，丛状病变分为四个等级(Ⅰ-Ⅱ级可逆，Ⅲ级临界，Ⅳ级不可逆)。除了2只WT评分为Ⅰ级和Ⅱ级外，其余WT均正常。SKI在2月龄的等级介于Ⅰ级和Ⅱ级之间(Ⅱ级>50％)，4月龄(75％为Ⅲ级)和12月龄(IV级>60％)为Ⅲ级。
④结果如图4中C所示，远端肺小动脉(<50μm直径)的肌化是肺动脉重构的另一个重要指标。我们用α-SMA染色来指示平滑肌细胞和VWF染色来指示内皮细胞，评估肺小动脉的肌化程度。α-SMA染色显示内皮层外有平滑肌细胞存在。完全肌化是α-SMA染色形成完整的环，无肌化则是没有α-SMA染色，部分肌化介于两者之间。SKI肺小动脉的部分和完全肌化的百分比均高于同龄WT。
⑤结果如图4中D所示，细胞过度增殖是血管重构的细胞基础。在SKI的肺动脉中膜，细胞增殖指数Ki67阳性细胞百分比高于同龄WT，尤其是在2月龄和4月龄。
⑥结果如图4中E所示，大部分SKI在2月龄发生肺静脉重构，并且在4月龄和12月龄变得更严重。
⑦结果如图7中C所示，4μ8C和CDN1163都可以逆转SKI的肺血管重构至WT水平，包括：肺动脉中膜增厚，内皮细胞来源的细胞性新生内膜的形成，Heath-Edward等级，肺静脉重构，Ki67阳性细胞的百分比以及远端肺小动脉的肌化程度。
实施例5
原代肺动脉平滑肌细胞分离和培养：
(1)选取2月龄雄性小鼠，异氟烷麻醉后处死小鼠。用消毒的手术器械在显微镜下剪取3级以下的肺动脉以及其分支，然后用无菌含双抗的PBS冲洗2次清除血液。纵向切开动脉，刮去内膜并剥去外膜来去除内皮细胞和外膜成纤维细胞。
(2)在超净工作台将组织块取出放入含双抗的DMEM中清洗2次。夹出组织块贴壁放置在培养皿中，倒置5分钟。
(3)加入含20％FBS的DMEM，37℃，5％CO2的培养箱中培养。
(4)当组织块周围细胞生长到半径约0.5cm时，用0.2％胰蛋白酶消化，离心收集细胞，加入含有10％FBS的DMEM培养。肺动脉平滑肌细胞表型经α-SMA免疫荧光染色确定。
实施例6
小鼠给药方案
(1)选取4周龄雄性WT和SKI，分成4组：WT溶剂对照组(WT/Ctrl)，SKI溶剂对照组(SKI/Ctrl)，SKI 4μ8C给药组(SKI/4μ8C)和SKI CDN1163给药组(SKI/CDN1163)。
(2)通过腹腔注射同体积的4μ8C(10mg/kg/day)、CDN1163(25mg/kg/day)或溶剂对照(5％DMSO，40％PEG400，10％Tween 80，40％生理盐水)，每日一次。4周后检测右心室压力等功能指标。处死动物后收集心脏进行右心室肥厚等指标的分析，收集肺组织进行肺血管重构指标的分析和蛋白表达的分析。
实施例7
Fluo-4染色测量肺动脉平滑肌细胞胞浆中Ca2+浓度，方法步骤如下：
(1)接种在玻片上的细胞密度达到60％，更换培养基为含0.2％FBS的DMEM过夜。
(2)次日PBS清洗培养皿两次。加入含Fluo-4的HBSS孵育液(1:500)，在细胞培养箱孵育20分钟。加入5倍体积的含0.2％FBS的DMEM，继续孵育40分钟。
(3)用HEPES缓冲液清洗细胞3次。夹出玻片放置在载玻片上，用75％甘油封片，正置荧光显微镜拍照。采用Las X软件分析荧光强度和蛋白表达位置。
①结果如图5中B所示，与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中Fluo-4荧光更强，表明C674失活增加肺动脉平滑肌细胞胞浆中Ca2+浓度。
实施例8
免疫印迹，方法步骤如下：
(1)蛋白的提取：
1)组织蛋白提取：取新鲜组织放置在提前预冷的研磨器内，加入100μL含有1％PMSF的RIPA裂解液。将研磨器置于冰水中，反复研磨组织呈混悬状态后转移至1.5mL的EP管，冰上裂解30分钟。1200rpm 4℃离心10分钟，收集上清液，BSA法测量上清液中蛋白浓度。将上清液用裂解液稀释至2μg/μL，分装待用。
2)细胞蛋白提取：将培养皿放置冰上，用预冷的PBS清洗细胞2次。加入含1％PMSF的细胞裂解液，用细胞刮刮下贴壁的细胞，收集细胞悬液到EP管，置于冰水中裂解30分钟。细胞裂解完成后，用超声波破碎仪破碎细胞。4℃，1200rpm离心10分钟，收集上清液，BSA法测量上清液中蛋白浓度。将上清液用裂解液稀释至2μg/μL，分装待用。
(2)蛋白样品准备：取提前分装好的蛋白提取液，加入1/4体积的5X上样缓冲液，混匀。95℃加热5分钟。
(3)电泳：提前配制好相应浓度的SDS-PAGE蛋白分离胶。将准备好的含上样缓冲液的蛋白样品加入分离胶的样品孔。70V电压电泳30分钟，然后将电压调至110V，电泳约2小时。
(4)转膜：将蛋白分离胶和用甲醇激活的PVDF膜放入预冷的转膜缓冲液中平衡。在转膜夹从负极到正极依次放入滤纸-蛋白分离胶-PVDF膜-滤纸，避免气泡产生。将转膜夹放入转膜槽中，加入预冷的转膜缓冲液和冰袋，300mA转膜2小时。
(5)免疫反应及显影：
1)将转好蛋白样品的PVDF膜取出，含有蛋白样品的正面朝上，加入配置好的5％脱脂奶粉，摇床室温封闭1小时。
2)封闭完成后，将相应分子量的条带剪好，放入对应的一抗稀释液中，摇床4℃孵育过夜。一抗孵育后，TBST快速清洗PVDF膜3次，每次10分钟。
3)然后将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉的二抗稀释液中，摇床室温孵育1小时。TBST快速清洗PVDF膜3次，每次10分钟。
4)将配置好的ECL发光液均匀孵育PVDF膜。暗室曝光显影。扫描胶片，分析条带浓度。
按照上述免疫印迹方法检测以下蛋白的表达：SERCA2，SERCA2 C674-SO3H，细胞周期蛋白(cyclin A1、cyclin B1、CDK1和CDK2)，内质网应激相关蛋白(磷酸化IRE1α和XBP1s)，CaN/NFAT通路(CaN和NFAT4)，平滑肌细胞转型相关蛋白(PPARγ、Col I和MMP2)，炎性因子(IL-6、MCP1、TNFα、VCAM1、ICAM1和磷酸化p65NFκB)，TGFβ1(Nox4的激活剂和致纤维化细胞因子)和Nox4(NADPH氧化酶，过氧化氢的来源)，线粒体来源的抗氧化酶SOD2。
①SERCA2表达结果如图5中A，SERCA2的蛋白表达在WT和SKI的肺动脉平滑肌细胞中没有差异，说明C674失活不影响SERCA2的蛋白表达。
②SERCA2 C674-SO3H表达结果如图8中A所示，与WT相比，SKI肺组织中SERCA2C674-SO3H表达增加，说明C674失活引起活性氧增多。
③细胞周期蛋白表达结果如图5中C所示，与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中cyclin A1、cyclin B1、CDK1、CDK2表达增加。
④内质网应激相关蛋白表达结果如图6中A所示：与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中磷酸化IRE1α和XBP1s表达增加，说明C674失活激活IRE1α-XBP1s通路。
⑤CaN/NFAT通路蛋白表达结果如图6中A所示：与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中CaN和NFAT4的表达增加，说明C674失活激活CaN/NFAT通路。
⑥平滑肌细胞转型相关蛋白表达结果如图6中A所示：与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中PPARγ、Col I和MMP2表达增加，说明C674失活促进肺动脉平滑肌细胞转型。
⑦炎性因子IL-6的表达结果如图6中A所示：与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞中IL-6表达增加，说明C674失活促进炎性反应。
⑧图7中D和E所示，与溶剂对照相比，4μ8C和CDN1163的体内给药均逆转SKI肺组织中IRE1α-XBP1s通路和细胞周期相关蛋白的表达(磷酸化IRE1α、XBP1s、cyclin A1、cyclinB1、CDK1和CDK2)至WT水平，说明抑制IRE1α-XBP1s通路或者激活SERCA2都可以抑制C674失活对细胞周期蛋白的调控。
⑨肺组织肺血管重构相关蛋白的表达结果如图8中C所示：与WT相比，SKI炎性因子(MCP1、TNFα、VCAM1、ICAM1、磷酸化p65NFκB)、TGFβ1和Nox4表达增加，SOD2表达降低。说明C674失活促进炎性反应，激活TGFβ1通路诱导肺组织纤维化，通过上调Nox4的表达来增加活性氧的生成，通过抑制SOD2的表达来减少活性氧的清除。
实施例9
细胞周期测定，方法步骤如下：
(1)肺动脉平滑肌细胞以2×105细胞数接种至6孔板。待细胞贴壁后，将培养基更换为含0.2％FBS的DMEM培养24小时，目的是让细胞恢复至静息状态。
(2)将细胞培养基更换为含10％FBS的DMEM生长培养基或含药物的生长培养基，继续培养24小时。
(3)用0.25％胰蛋白酶轻轻消化细胞，避免破坏细胞。收集细胞悬液，室温1000rpm离心5分钟，收集细胞沉淀。
(4)细胞经预冷的PBS清洗两次，70％乙醇4℃过夜固定。
(5)次日，室温1000rpm离心5分钟收集细胞。PBS清洗细胞一次，收集细胞。
(6)加入含溴化乙锭(PI,50μg/mL)、RNase A(100μg/mL)、Triton X-100(0.2％)的PBS混合液500μL，4℃暗箱孵育30分钟。
(7)将孵育好的细胞进行流式细胞仪(CytoFLEX A00-1-1102)上样。使用CytExpert软件和ModFit LT 3.2软件分析数据，测量细胞各周期的百分比。
实验结果如图5中D所示，SKI的肺动脉平滑肌细胞处于S期和G2/M期的细胞比例明显多于WT的肺动脉平滑肌细胞，表明C674失活加速肺动脉平滑肌细胞的细胞周期。
实施例10
肺动脉平滑肌细胞增殖实验，方法步骤如下：
(1)先将肺动脉平滑肌细胞以5×104细胞数接种至6孔板。在一些实验，细胞预先分别过表达SERCA2a S674、SERCA2b S674、SERCA2b C674、XBP1s和它们的对照(Ctrl)。待细胞贴壁后，更换培养基为含0.2％FBS的DMEM培养24小时，目的是让细胞恢复到静息状态。
(2)将培养基更换为含10％FBS的DMEM。在一些实验，细胞中分别加入了不同药物：4-PBA(500μM)，4μ8C(30μM)，CsA(1μM)，PIOG(10μM)，CDN1163(10μM)或是DMSO溶剂对照(Ctrl)，继续培养48小时。0.25％胰蛋白酶消化细胞，收集细胞计数。
①实验结果如图5中E所示，SKI的肺动脉平滑肌细胞数目多于WT，说明C674失活促进肺动脉平滑肌细胞增殖。
②实验结果如图6中B所示，在WT的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，过表达SERCA2a S674或SERCA2b S674增加细胞数，说明
SERCA2a或SERCA2b中C674失活均促进肺动脉平滑肌细胞增殖。
③实验结果如图6中B所示，在WT的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，过表达XBP1s增加细胞数，说明XBP1s促进肺动脉平滑肌细胞增殖。
④实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，过表达SERCA2b C674减少细胞数，说明SERCA2b抑制肺动脉平滑肌细胞增殖参与了对肺血管稳态的调控。
⑤实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，4-PBA减少细胞数，说明内质网应激介导了C674失活引起的肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
⑥实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，4μ8C减少细胞数，说明IRE1α-XBP1s通路的激活介导了C674失活引起的肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
⑦实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，CsA减少细胞数，说明CaN/NFAT通路的激活介导了C674失活引起的肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
⑧实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，PIOG减少细胞数，说明下调的PPARγ介导了C674失活引起的肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
⑨实验结果如图6中C所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，CDN1163减少细胞数，说明激活SERCA2抑制C674失活引起的肺动脉平滑肌细胞过度增殖。
实施例11
爬行实验，方法步骤如下：
(1)在12孔板底部用细头记号笔在孔中间画一条横线。接种细胞，每孔1×105个。
(2)待细胞生长到密度为100％时，用100μL枪头在孔中间轻轻画一条竖线造成细胞间空出一定距离。PBS清洗脱落的细胞，然后重新加入1mL含10％FBS的DMEM。在一些实验，分别加入4-PBA、4μ8C、CsA、PIOG或溶剂对照(Ctrl)。
(3)采用光学显微镜拍照的方法记录划线部位0小时的宽度，8小时后在相同的位置拍照记录划线部位的宽度。根据两次结果计算出每个孔细胞爬行的距离。
①实验结果如图5中E所示，与WT的肺动脉平滑肌细胞相比，SKI的肺动脉平滑肌细胞爬行能力增强，说明C674失活促进肺动脉平滑肌细胞爬行。
②实验结果如图6中D所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，4-PBA抑制细胞爬行，说明内质网应激介导了C674失活加速的肺动脉平滑肌细胞爬行。
③实验结果如图6中D所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，4μ8C抑制细胞爬行，说明IRE1α-XBP1s通路的激活介导了C674失活加速的肺动脉平滑肌细胞爬行。
④实验结果如图6中D所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，CsA抑制细胞爬行，说明CaN/NFAT通路的激活介导了C674失活加速的肺动脉平滑肌细胞爬行。
⑤实验结果如图6中D所示，在SKI的肺动脉平滑肌细胞，与对照(Ctrl)相比，PIOG抑制细胞爬行，说明下调的PPARγ介导了C674失活加速的肺动脉平滑肌细胞爬行。
实施例12
DHE染色实验检测活性氧生成，方法步骤如下：
(1)将小鼠执行安乐死后，迅速摘取肺组织，用PBS清洗多余血液。取一片肺组织置于OCT中进行低温包埋并进行冰冻组织切片。
(2)将组织切片置于湿盒中，PBS漂洗3次去掉多余OCT。操作轻柔防止组织脱片。
(3)组织切片滴加50μL的DHE染液(终浓度为15μM)，37℃孵育40分钟。
(4)PBS漂洗3次，用75％甘油封片，避免气泡产生。
(5)使用荧光正置显微镜观察红色荧光强度并拍照。用Leica X软件分析小鼠肺组织红色荧光强度的平均光密度值，进行统计分析。
实验结果如图8中B所示，与WT相比，SKI肺组织中(尤其是肺血管)DHE荧光强度明显增加，说明C674失活增加活性氧的生成。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 重庆大学
<120> 一种基于钙调控机制紊乱的动物模型在治疗肺血管重构或肺动脉高压药物筛选中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccacaaatgg ctctcaggtt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagctctagg cagagggact 20

Claims (1)

1.SERCA2的激活剂CDN1163在制备治疗肺血管重构或肺动脉高压药物中的应用，其激活SERCA2抑制细胞周期相关蛋白的表达，改善基因突变导致的肺动脉平滑肌细胞转型和肺血管重构。
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