CN106540261A

CN106540261A - 血管紧张素ii‑1型机械应力受体感受位点在制备治疗高血压的药物中的应用

Info

Publication number: CN106540261A
Application number: CN201611128144.0A
Authority: CN
Inventors: 邹云增; 龚惠; 姜红; 葛均波; 蒋国良; 王时俊; 杨春杰; 张国平; 张莉
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2017-03-29

Abstract

本发明涉及血管紧张素II‑1型受体感受位点的确定。本发明采用氨基酸残基点突变的方法来构建AT1R的不同突变体以发现AT1R的不同病理感受位点，发现AT1R的Lys199位点是Ang II的感受点，Leu212和Cys289位点是机械牵拉的感受点，Gln257位点则是Ang II和压力超负荷共同的感受位点。本发明可指导设计针对机械应力或Ang II活化氨基酸残基位点的新一代ARB药物，指导临床用药，提高AT1R介导的疾病如高血压性心肌肥厚等的治疗靶向性，评价和比较ARB类药物的适应症，指导相关疾病发生发展机制的基础研究等。

Description

血管紧张素II-1型机械应力受体感受位点在制备治疗高血压的药物中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体地说，涉及血管紧张素II-1型受体压力超负荷和血管紧张素II感受位点的确定，以及可激活以上位点引起血管紧张素II-1型受体构象改变的化合物在制备治疗血管紧张素II-1型受体介导的疾病(如高血压等)的药物中的应用，以及制备评价现有药物适应症或研究相关疾病发生发展机制的试剂中的应用。

背景技术

血管紧张素II-1型受体(AT1R)是具有七次跨膜结构的G蛋白偶联受体(GPCRs)家族一员，通过位于胞膜外N端结合细胞外分子信号，并向细胞内C端传递生物信号，再由胞内第二信使完成信号传递接力，通过目的基因转录最终完成细胞的生物事件。

目前，临床上成熟运用的AT1R阻断剂—俗称ARB类药物仅仅是针对AT1R跨膜区蛋白结构，通过顺时针或逆时针影响攀环构象实现对于AT1R功能的抑制。现有的ARB类药物还未达到分子水平层面，因此虽然显示出一定的功效，但是效果并非很理想。面对难治性或顽固性高血压，往往需要增加剂量或者加用ACEI、钙离子拮抗剂、利尿剂等其他类型抗高血压药物联合使用。基础研究越来越多的实验证据表明，这种层面的抑制效应不足以完全阻抑AT1R的激活。

现有研究表明，AT1R可以不依赖于AngII的刺激，在机械应力下独立发生构象改变并激活下游ERKs信号通路，导致心肌肥厚的发生；AT1R是血管紧张素II(Ang II)和压力超负荷作用细胞的共同感受器，后者激活AT1R引起的血管收缩和心肌重构，与临床上难治性高血压心脏病密切相关。

综上所述，开发在分子水平层面上针对AT1R的药物将是治疗难治性高血压心脏病等由AT1R介导的心血管疾病的有效途径。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，确定血管紧张素II-1型受体的不同病理感受位点，指导相关药物的开发和疾病的治疗。

在本发明的第一方面，提供了一种治疗高血压的药物化合物，所述的药物化合物是与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合进而引起血管紧张素II-1型受体构象的变化。

在本发明的第二方面，提供了能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备治疗血管紧张素II-1型受体介导的疾病的药物中的应用。

作为一种具体实施方式，所述的血管紧张素II-1型受体介导的疾病是难治性高血压、顽固性高血压、压力超负荷激活AT1R引起的血管收缩或心肌肥厚、难治性高血压心脏病等。

作为一种具体实施方式，所述的血管紧张素II-1型受体介导的疾病是压力超负荷激活AT1R引起的血管收缩或心肌肥厚。

在本发明的第三方面，提供了能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备评价高血压药物具体适应症的试剂中的应用。

在本发明的第四方面，提供了能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备研究AT1R介导的心血管疾病发生发展机制的试剂中的应用。

在本发明的第五方面，提供了血管紧张素II-1型受体K199Q、L212F、Q257A或C289A的突变型质粒或腺病毒在评价高血压药物具体适应症的试剂中的应用。

在本发明的第六方面，提供了血管紧张素II-1型受体K199Q、L212F、Q257A或C289A的突变型质粒或腺病毒在制备研究AT1R介导的心血管疾病发生发展机制的试剂中的应用。

本发明优点在于：

本发明采用氨基酸残基点突变的方法来构建AT1R的不同突变体以发现AT1R的不同病理感受位点，具体利用点突变法进行第199/212/257/289四个氨基酸位点的单点突变，并包装质粒和腺相关病毒，通过转染COS-7细胞、乳鼠心肌细胞以及小鼠在体转染实验，反复实验证实，Ang II(化学效应)和压力超负荷(机械效应)是通过不同位点激活细胞膜上的AT1R受体，引起受体构象改变并向细胞内传递生物信号。我们发现AT1R的Lys199位点是AngII的感受点，Leu212和Cys289位点是机械牵拉(压力超负荷)的感受点，Gln257位点则是AngII和压力超负荷共同的感受位点。且本发明选用了血管紧张素原基因敲除小鼠的乳鼠心肌细胞作为研究对象，排除了心脏组织局部产生的内源性Ang II的干扰。

本发明的应用主要体现在如下几方面：(1)可指导设计针对机械应力和Ang II活化氨基酸残基位点的新一代ARB药物，通过检测各种准新药对AT1R的199/212/257/289位点的亲和力，从而研发出具有不同作用靶点的ARB类新药，从而使高血压性心肌肥厚及相关疾病的治疗更具有靶向性，提高临床治疗功效，降低治疗成本；(2)可指导临床用药，首先对高血压性心肌肥厚的病人进行血清Ang II的检测，对Ang II水平不高的病人，采取与AT1R的212和289位点亲和力高的ARB类药物进行治疗，而对于Ang II水平升高的病人，采取与AT1R的257位点亲和力高的ARB类药物进行治疗，从而达到精准医疗的目的。且随着二代测序技术的推广和发展，不远的将来，患者都将拥有属于自己的个性化遗传密码的芯片，对于AT1R上的蛋白编码的个体差异筛查工作变得非常容易，从而可能实现大数据精准化医疗；(3)评价和比较目前临床上已经在使用的ARB类药物的降压、抑制心肌肥厚和心血管保护作用的优劣及各自的适应症；(4)指导高血压性心肌肥厚等AT1R介导的心血管疾病的发生发展机制的基础研究。

附图说明

图1.免疫荧光检测COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞转染质粒或感染腺病毒的效率。COS7细胞组绿色代表质粒Tag Rhodopsin(第1行)，红色代表α-actin(第2行)，蓝色代表细胞核(第3行)；心肌细胞组绿色代表GFP(第1行)，红色代表α-actin(第2行)，蓝色代表细胞核(第3行)。

图2.COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞转染质粒或感染腺病毒的效率。

图3-6.COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞在机械牵张或Ang II刺激后p-ERK的表达。A：COS7细胞在Ang II刺激后p-ERK的表达。B：ATG^-/-心肌细胞在Ang II刺激后p-ERK的表达。C：COS7细胞在机械牵张刺激后p-ERK的表达。D：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张刺激后p-ERK的表达。**P<0.01vs GFP对照组；#P<0.05vs GFP对照组；&&P<0.01vs AT₁R-WT+Ang II刺激组或AT₁R-WT+机械牵张刺激组。

图7-10.COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞在机械牵张或Ang II刺激后G_αq₁₁移位的检测。图7：COS7细胞在Ang II刺激后胞浆和胞膜G_αq₁₁的表达。图8：ATG^-/-心肌细胞在Ang II刺激后胞浆和胞膜G_αq₁₁的表达。图9：COS7细胞在机械牵张刺激后胞浆和胞膜G_αq₁₁的表达。图10：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张刺激后胞浆和胞膜G_αq₁₁的表达。**P<0.01vs GFP对照组。

图11-14.COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞在机械牵张或Ang II刺激后p-Jak2表达的检测。图11：COS7细胞在Ang II刺激后p-Jak2的表达。图12：ATG^-/-心肌细胞在Ang II刺激后p-Jak2的表达。图13：COS7细胞在机械牵张刺激后p-Jak2的表达。图14：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张刺激后p-Jak2的表达。**P<0.01vs GFP对照组。

图15-19：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张或Ang II刺激后心肌肥厚基因mRNA的表达检测。**P<0.01vs GFP对照组。

图20-23：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张或Ang II刺激后心肌细胞横截面积测定。图20：ATG^-/-心肌细胞在Ang II刺激后免疫荧光染色的细胞大小。图21：ATG^-/-心肌细胞在AngII刺激后免疫荧光染色的细胞大小柱状图。图22：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张刺激后免疫荧光染色的细胞大小。图23：ATG^-/-心肌细胞在机械牵张刺激后免疫荧光染色的细胞大小柱状图。**P<0.01vs AT₁R-WT感染组。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、材料与方法

1.材料与试剂

COS7细胞株为本实验室保种的冻存细胞株。ATG^-/-小鼠来自于日本千叶大学IsseiKomuro教授的实验室，饲养于复旦大学附属中山医院实验动物中心SPF级动物房。硅胶皿及牵张架、AT₁R野生型及突变型质粒和腺病毒(K199Q，L212F，Q257A及C289A)均来自于日本千叶大学心脏病研究实验室。洛沙坦和Ang II购自美国Sigma公司。AT₁R的一抗购自美国SANTA CRUZ公司，其余一抗购自美国CST公司。膜蛋白提取试剂盒购自德国Merck公司。蛋白提取液(RIPA)和蛋白酶抑制剂购自碧云天生物技术研究所。DMEM培养基、0.25％胰蛋白酶、Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂盒、RNA提取试剂Trizol及Super-Script^TM逆转录试剂盒均购自美国invitrogen公司。ANP、BNP、β-MHC、SAA、SERCA2、GAPDH的引物均由日本Takara公司合成。RT-PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。

2.硅胶皿处理

用于培养和牵张COS7细胞或心肌细胞的硅胶皿，预先经过如下处理：首先用洗涤液清洗干净，浸泡过夜；经清水冲洗干净后，再用75％的酒精浸泡过夜。然后用ddH₂O冲洗10次以去除残余酒精，之后置于洁净的150mm玻璃培养皿中，高压灭菌，烘干。置于超净操作台中，每个皿中加入1:50稀释的无菌鼠尾胶溶液，摇匀后风干，置于超净工作台中备用。

3.COS7细胞培养、转染质粒

COS7细胞复苏后置37℃、5％CO₂培养箱培养。通过镜下观察选取生长状态良好的COS7细胞以0.25％的胰酶消化后，按1-2×10⁵细胞/ml的细胞密度接种于经过上述步骤处理后的硅胶皿中。置于37℃、5％CO₂细胞培养箱孵育24小时，换无血清的DMEM再培养6小时后进行质粒转染，质粒转染根据Lipofectamine^TM 2000脂质体转染试剂盒说明书操作。转染后培养24-72h后予以药物干预或机械牵张。

4.ATG^-/-小鼠心肌细胞的培养、感染腺病毒

取ATG^-/-小鼠的1-3d乳鼠，用原代心肌细胞分离培养法分离ATG^-/-小鼠心肌细胞，差速贴壁法之后按照5×10⁵-1×10⁶细胞/ml，接种于铺好鼠尾胶的硅胶皿中(每皿2ml细胞接种液)，放置37℃、5％CO₂培养箱继续培养。原代培养的乳鼠心肌细胞生长24h后，换用新鲜无血清无双抗DMEM培养基，每皿加入1.5ml培养液，然后按照MOI为100的病毒量感染心肌细胞。轻微摇晃后放入37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育3-6h。3-6h之后吸弃原培养液，每皿加入无血清无双抗DMEM培养基2ml，继续培养24h后予以药物干预或机械牵张。

5.细胞的机械牵张及Ang II干预

将硅胶皿置于特制的牵张架中进行10％的细胞拉伸实验，根据牵张刺激不同时间段终止反应，收集细胞提取总蛋白和mRNA。一部分硅胶皿中细胞牵张刺激，把硅胶皿在钉板上拉长15％，或Ang II(1×10^-7mmol/L)干预8min后立即收集细胞提取总蛋白，进行下一步的免疫印迹分析和免疫荧光染色实验。另外部分硅胶皿中细胞牵张刺激24h后收集细胞提取总RNA进行逆转录PCR反应。

6.Western Blot蛋白印迹法分析目的蛋白表达

按照常规方法提取细胞总蛋白，根据德国Merck公司膜蛋白提取试剂盒的说明书提取细胞膜蛋白和浆蛋白，之后采用BCA法测定各样品蛋白质的浓度。于上述步骤所得细胞蛋白样品中加入5×蛋白上样缓冲液，混匀后95℃水浴中变性5分钟，-20℃保存备用。常规制胶、上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)电泳。然后将相关的蛋白质区带转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5％BSA室温封闭1h之后加入一抗4℃摇床过夜，次日洗脱之后加入二抗室温孵育1h，洗脱。用ECL化学发光试剂显色后，放在LAS-3000成像系统上曝光显影。实验以GAPDH作内参。

7.Real Time PCR检测心肌细胞中心肌肥厚基因mRNA表达

常规提取细胞总RNA，紫外吸收测定提取的各个RNA样本的浓度及OD 260/280、OD260/230的比值。选用OD 260/280介于1.8-2.0、OD 260/230介于2.1-2.2的RNA样品进行后续实验。按照SuperScript试剂盒的说明进行RNA的逆转录反应。之后依Takara公司的TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(200次量)说明书的操作进行Real time PCR实验。引物序列见表1。

表1：Realtime PCR引物序列

8.心肌细胞免疫荧光染色及检测

接种5×10⁵个心肌细胞于免疫荧光专用硅胶皿中培养24h；感染腺病毒之后24h予以机械牵张，把硅胶皿在钉板上拉长15％，或Ang II刺激8min；弃去培养液，用4℃预冷的PBS洗去残留培养液；4％多聚甲醛固定、0.2％TritonX-100进行膜透化处理后10％胎驴血清封闭60min；加入一抗，4℃湿盒过夜；用PBS洗脱后加入不同荧光颜色标记荧光二抗，暗室中室温孵育60min，之后用含有DAPl(1μg/ml)的PBS进行核染色10min，PBS洗脱后用激光扫描共聚焦显微镜观察并采集图像：将细胞置于Leica共聚焦显微镜的载物台上进行共聚焦成像观察并拍照采集图像。

9.统计学分析

测量数据结果使用SPSS16.0分析，以Mean±SD表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA，LSD)法，P<0.05代表有统计学显著性差异。统计图表的制作使用OriginPro 8.0完成。

二、结果

1.细胞转染质粒或感染腺病毒的效率测定

本实验COS7细胞在转染质粒48h后、ATG^-/-心肌细胞在感染腺病毒24h后，在荧光显微镜下观察荧光情况，以初步判定质粒转染或腺病毒感染的效率。实验结果见图1，可见各实验组荧光强度明显。接着收集细胞提取总蛋白检测目的蛋白AT₁受体或其Tag Rhodopsin蛋白表达水平，以判定质粒转染或腺病毒感染的效率。实验结果见图2，可见COS7细胞转染AT₁受体各相关质粒组的AT₁受体表达明显升高，并且各组之间无明显差异，而对照组中未检测到AT₁受体的表达。ATG^-/-心肌细胞AT₁受体各相关腺病毒感染组检测到Rhodopsin明显而又一致的表达，而对照组未见。由实验结果可见COS7细胞在转染质粒后、ATG^-/-心肌细胞在感染腺病毒后均有高效、一致而又稳定的目的蛋白表达。

2.Leu212,Gln257和Cys289是机械牵张活化AT₁受体导致ERK磷酸化的关键部位

为了排除内源性Ang II的干扰，我们给分别转染了AT₁R^WT，AT₁R^K199Q，AT₁R^L212F，AT₁R^Q257A，AT₁R^C289A或EGFP的COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞予以机械牵张或Ang II刺激，8min之后检测细胞总蛋白中p-ERK的表达。结果(图3-6)发现AT₁R^WT-COS7组中Ang II(10^-7mmol/L)的刺激使p-ERK的表达升高了5倍多，并且这种升高在AT₁R^K199Q-COS7组发生了明显抑制，在AT₁R^Q257A-COS7细胞组发生了中度抑制，但在AT₁R^L212F或AT₁R^C289A-COS7细胞组未见明显影响。相似的结果也发生在同样处理的ATG^-/-心肌细胞中。我们进一步观察了机械牵张对各细胞组p-ERK表达的影响，机械牵张刺激AT₁R^WT-COS7组使p-ERK的表达翻倍升高于GFP-COS7细胞对照组，但是这种升高在AT₁R^L212F-,AT₁R^Q257A-,和AT₁R^C289A-COS7细胞组均发生了明显抑制，而在AT₁R^K199Q-COS7细胞组基本不受影响。ATG^-/-心肌细胞在机械牵张后的相应实验结果与此一致。

这些实验数据均表明Leu212，Gln257和Cys289是机械牵张活化AT₁受体导致ERK磷酸化的关键部位。

3.Leu212,Gln257和Cys289是机械牵张激活AT₁受体导致G_αq₁₁活化入胞浆的关键部位

AT₁受体作为GPCR超家族中的一员，它是通过G蛋白偶联方式激活细胞内生物信号传导的。Ang II或机械牵张刺激转染AT₁受体的细胞均能活化G_αq₁₁从而使其由胞膜转位进入细胞浆中。在本研究中，Ang II或机械牵张刺激AT₁R ^WT--COS7细胞均能使细胞浆中G_αq₁₁表达升高，这提示并证实Ang II和机械牵张刺激均能活G_αq₁₁。并且Ang II刺激活化的G_αq₁₁在AT₁R^K199Q-和AT₁R^Q257A-COS7细胞组得以明显抑制，但在AT₁R^L212F-或AT₁R^C289A-COS7细胞组均不受影响。然而机械牵张刺激活化的G_αq₁₁在AT₁R^L212F-,AT₁R^Q257A-,和AT₁R^C289A-COS7细胞组均发生了明显抑制，而在AT₁R^K199Q-COS7细胞组基本不受影响。同时在过表达AT₁R野生型或不同突变型的ATG^-/-心肌细胞中也显示出与此相似的结果。结果见图7-10。

这些实验结果均证明Leu212，Gln257和Cys289是机械牵张激活AT₁受体导致G_αq₁₁活化入胞浆的关键部位。

4.Leu212,Gln257和Cys289是机械牵张活化AT₁受体导致Jak2磷酸化的关键部位

Janus激酶(Jak)是一类非受体酪氨酸激酶家族，邹等人的研究(Zou YZ,AkazawaH,Qin YJ,et al.Mechanical stress activates angiotensin ii type 1 receptorwithout the involvement of angiotensin ii[J].Nature Cell Biology,2004,6:499-506.)提示Jak可能在AT₁受体信号传导中扮演重要角色，表明Jak2的活化在机械牵张刺激通过非G蛋白偶联受体通路激活ERKs中作用关键。本研究显示(见图11-14)在AT₁R ^WT-COS7细胞组中，不管是机械牵张还是Ang II刺激均能导致Jak2的磷酸化，这与此前研究发现一致。进一步的研究表明，Ang II活化的Jak2在AT₁R^K199Q-COS7细胞中发生极为显著的抑制，在AT₁R^Q257A-COS7细胞中发生轻度抑制，但是在AT₁R^L212F或AT₁R^C289A-COS7细胞中这种活化并不受影响。然而对机械牵张活化的Jak2的抑制情况与此不同，在机械牵张刺激组，AT₁R^L212F-,AT₁R^Q257A-,和AT₁R^C289A-COS7细胞均能明显抑制Jak2的活化，但AT₁R^K199Q-COS7细胞组则不能。这些在转染AT₁受体野生型和不同突变型质粒的COS7细胞中得出的结果与感染AT₁受体野生型和不同突变型腺病毒的ATG^-/-心肌细胞的相应实验结果一致，它们均表明Leu212，Gln257和Cys289是机械牵张活化AT₁受体导致Jak2磷酸化的关键部位。

5.Leu212,Gln257和Cys289是机械牵张激活AT₁受体导致ATG^-/-心肌细胞发生肥大反应的关键部位

机械牵张和Ang II刺激均能激活AT₁受体导致心肌肥厚发生，表现为心肌肥厚相关基因(ANP,BNP,SAA等)的上调和心肌细胞横截面积的增加。在本研究中，Ang II刺激能够使感染wt-AT1R的ATG^-/-心肌细胞内ANP，BNP的mRNA表达明显上调，心肌细胞横截面积增加，且这种改变在AT₁R^K199Q和AT₁R^Q257A的ATG^-/-心肌细胞中得到明显抑制，在AT₁R^L212F和AT₁R^C289A的ATG^-/-心肌细胞中未见影响。然而对机械牵张导致的ATG^-/-心肌细胞肥大反应，在AT₁R^L212F、AT₁R^Q257A和AT₁R^C289A的ATG^-/-心肌细胞中得到明显抑制，而在AT₁R^K199Q的ATG^-/-心肌细胞中则未见任何影响。(结果见图15-23)。

综合这些研究数据，表明Leu212，Gln257和Cys289是机械牵张激活AT₁受体导致ATG^-/-心肌细胞发生肥大反应的关键部位。

三、分析

AT₁受体是一种七次跨膜结构的G蛋白偶联受体，它的活化在机械牵张导致的心肌肥厚发生发展中起着重要作用。传统研究认为细胞内源性AngII通过自分泌或旁分泌方式触发心肌肥厚发生，但是近期研究表明，机械牵张能够不依赖Ang II直接激活AT₁受体。本部分研究显示在机械牵张不依赖Ang II直接激活AT₁受体的过程中，AT₁受体的Leu212、Gln257和Cys289位点是重要的作用部位；同时AT₁受体的Lys199和Gln257位点对于Ang II激活AT₁受体作用关键。

首先，我们通过免疫荧光分析技术确定COS7细胞和ATG^-/-心肌细胞在转染AT₁受体相关质粒和腺病毒后有显著的AT₁受体过表达。AT₁受体通过ERK的磷酸化导致心肌肥厚。我们的研究显示在AT₁R-WT-COS7细胞中，Ang II刺激引起的ERK的磷酸化，可以被K199Q或Q257A点突变所部分抑制，然而机械牵张引起的ERK的磷酸化只有在L212F、Q257A或C289A点突变组明显抑制。为了排除内源性Ang II的影响，我们通过AT₁受体腺病毒感染ATG^-/-心肌细胞后检测p-ERK表达的方法，发现结果与COS7细胞的一致。这提示AT₁受体的Leu212、Gln257和Cys289位点是机械牵张激活AT₁受体的关键部位。AT₁受体作为一种GPCR家族成员，它是通过G蛋白的介导激活细胞内信号传递的。机械牵张或Ang II刺激可以促使G_αq₁₁亚基移位至胞浆从而激活ERK。除此之外，AT₁受体也可通过与Jak2结合并活化Jak2的方式的这种G蛋白非偶联途径激活ERK。我们的研究数据显示AT₁受体的Leu212、Gln257和Cys289位点是机械牵张激活AT₁受体导致G_αq₁₁亚基向胞浆移位和Jak2磷酸化的关键部位。既往研究表明，AT₁受体活化ERK在机械牵张导致的心肌肥厚中发挥重要作用。在本研究中，机械牵张导致了过表达 AT₁R-WT-ATG^-/-心肌细胞的肥大反应，同时它可以被过表达AT₁R^L212F-、AT₁R^Q257A-和AT₁R^C289A-所显著抑制，但是过表达AT₁R^K199Q-并不能。这进一步确证AT₁受体的Leu212、Gln257和Cys289位点是机械牵张活化AT₁受体导致心肌肥厚发生的关键部位。

总之，该研究表明Leu212、Gln257和Cys289在机械牵张非Ang II依赖性活化AT₁受体过程中至关重要，而Lys199和Gln257在Ang II活化AT₁受体时发挥关键作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属中山医院

<120> 血管紧张素II-1型受体感受位点的确定

<130> /

<160> 12

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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ggtgtccaac acagatctga 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccactagacc actcatctac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gttacagccc aaacgactga c 21

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

<213> 人工序列

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gctgtgagaa gctgtgagca 20

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<212> DNA

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cttcacagtc accgtcttgc 20

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accacagtcc atgccatcac 20

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<212> DNA

<213> 人工序列

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tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

1.一种治疗高血压的药物化合物，其特征在于，所述的药物化合物是与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合进而引起血管紧张素II-1型受体构象的变化。

2.能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备治疗血管紧张素II-1型受体介导的疾病的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的血管紧张素II-1型受体介导的疾病是难治性高血压、顽固性高血压、压力超负荷激活AT1R引起的血管收缩或心肌肥厚、难治性高血压心脏病。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的血管紧张素II-1型受体介导的疾病是压力超负荷激活AT1R引起的血管收缩或心肌肥厚。

5.能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备评价高血压药物具体适应症的试剂中的应用。

6.能够与血管紧张素II-1型受体的第199、212、257或289氨基酸位点结合的化合物在制备研究AT1R介导的心血管疾病发生发展机制的试剂中的应用。

7.血管紧张素II-1型受体K199Q、L212F、Q257A或C289A的突变型质粒或腺病毒在评价高血压药物具体适应症的试剂中的应用。

8.血管紧张素II-1型受体K199Q、L212F、Q257A或C289A的突变型质粒或腺病毒在制备研究AT1R介导的心血管疾病发生发展机制的试剂中的应用。