CN103966309B - 外周血细胞TRPC6mRNA水平用于早期预测/诊断老年性痴呆 - Google Patents

外周血细胞TRPC6mRNA水平用于早期预测/诊断老年性痴呆 Download PDF

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Abstract

本发明涉及外周血细胞TRPC6mRNA水平用于早期预测/诊断老年性痴呆。具体地，本发明公开了经典型瞬时受体电位通道6(TRPC6)基因或其蛋白的用途，它们被制备预测或诊断阿尔茨海默病的试剂或试剂盒。本发明还涉及用于制备治疗AD药物的多肽及其组合物。

Description

外周血细胞TRPC6mRNA水平用于早期预测/诊断老年性痴呆
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地涉及经典型瞬时受体电位通道6(transientreceptorpotentialcanonical6，简称为TRPC6)基因或其蛋白的用途，它们被制备预测或诊断阿尔茨海默病的试剂或试剂盒。本发明还涉及用于制备治疗AD药物的多肽及其组合物。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimerdisease，AD)，即老年性痴呆，是老年人群中引起痴呆的最常见的神经退行性疾病。据美国约翰霍普金斯大学的一份研究报道，到2050年，世界上每85人中就将有一人患有老年性痴呆。AD的临床表现为记忆和认知功能不断恶化，日常生活自理能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。AD患者死后的脑组织切片上显示有特征性的细胞外老年斑和细胞内神经纤维缠结。其中老年斑主要由具有神经毒性的β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)组成，目前主流的Aβ假说据此认为Aβ过多是AD致病的重要原因之一。
另外，Aβ由其前体蛋白AmyloidPrecursorProtein(APP)先后被β和γ分泌酶切割而产生，而α分泌酶切割APP则能在阻止Aβ形成的同时产生具有神经营养作用的sAPPα(Mudher,A.&Lovestone,S.TrendsNeurosci25,22-26(2002)；Selkoe,D.J.AnnInternMed140,627-638(2004)；Selkoe,D.J.NatMed17,1060-1065)。
就AD的诊断而言，目前AD确诊的金标准是在患者死后取脑组织切片做病理检查，确定细胞外老年斑和细胞内神经纤维缠结的存在。而临床诊断主要依靠检查患者认知水平，如用简明精神状态量表(MMSE)等进行测试。但作为一项以主观量表为诊断依据的测试，MMSE指标的特异性和敏感度很低。
然而，如果能早期预测AD的患病风险并进行早期干预，显然比在AD患者出现认知障碍之后甚至在死亡之后进行诊断更具临床意义。
因此，本领域迫切需要开发特异性的、可靠的、适合早期预测/诊断AD的生物标记物，以便在尚未发生认知障碍之前，就能客观、准确地筛查出可能得病的高危人群，早期提示AD发生的可能性，并为预防、治疗AD提供足够的时间窗。
就AD的治疗而言，目前认为，通过调节各种分泌酶(如γ分泌酶)对APP的切割从而减少Aβ的形成可用于治疗AD。然而，用γ分泌酶的抑制剂治疗AD的临床试验并未取得成功。目前主要观点认为，临床试验的失败是由于γ分泌酶的底物除了APP之外，还有例如Notch,E-cadherin,ErbB-4等诸多其他底物(Haapasalo,A.&Kovacs,D.M.JAlzheimersDis25,3-28；Xia,W.&Wolfe,M.S.JCellSci116,2839-2844(2003))。这些底物通过γ分泌酶的切割来实现各自重要的生理功能。因此抑制γ分泌酶的药物可能阻止了很多底物发挥正常的生理功能。
最近，礼来公司终止了一种γ分泌酶抑制剂(Semagacestat，LY450139)的3期临床试验。其临床结果显示，服用Semagacestat以后，AD患者认知水平下降，皮肤癌倾向增加并伴有胃肠道的不良反应，其中后两项被认为与该测试药物不利地抑制了γ分泌酶切割Notch相关(Siemers,E.,etal.Safety,ClinNeuropharmacol28,126-132(2005)；Siemers,E.R.,etal.Neurology66,602-604(2006).；Hofmann,T.,Schaefer,M.,Schultz,G.&Gudermann,T.ProcNatlAcadSciUSA99,7461-7466(2002).)。这表明，理想的治疗AD的药物应能特异地抑制γ分泌酶切割APP但不影响其切割其它底物的功能。
因此，本领域还迫切需要开发可用于治疗或预防AD且副作用较低的药物。
发明内容
本发明的一个目的是提供了特异性的、可靠的、适合早期预测/诊断AD的生物标记物，及其在预测或诊断阿尔茨海默病中的应用。
本发明的另一目的是提供一种可用于治疗或预防AD且副作用较低的治疗剂及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种经典型瞬时受体电位通道6(transientreceptorpotentialcanonical6，TRPC6)基因或其蛋白的用途，用于制备通过检测而预测或诊断阿尔茨海默病(AD)的试剂或试剂盒。
在另一优选例中，所述的TRPC6基因包括TRPC6的DNA序列或mRNA序列。
在另一优选例中，所述的检测是测定外周血细胞中TRPC6mRNA水平。
在另一优选例中，所述的TRPC6来自哺乳动物，较佳地来自人、小鼠、大鼠。
在另一优选例中，所述的试剂包括：引物、探针、核酸芯片、蛋白芯片、特异性针对TRPC6的抗体。
在另一优选例中，所述的引物如SEQIDNO.：1(正义链)和SEQIDNO.：2(反义链)所示的引物对。
本发明第二方面，提供了一种通过测定外周血细胞中TRPC6mRNA进而预测或诊断阿尔茨海默病的试剂盒，所述的试剂盒包括用于检测TRPC6的核酸芯片或特异性扩增TRPC6mRNA或cDNA的引物，以及说明书，其中所述说明书包括以下说明：通过测定外周血细胞中TRPC6mRNA来预测或诊断阿尔茨海默病。
在另一优选例中，所述的试剂盒还含有选自下组的一种或多种试剂：
(i)用于提取外周血总RNA的试剂；
(ii)用于反转录的引物；
(iii)用于反转录反应的反转录酶；
(iv)用于PCR反应的聚合酶。
本发明第三方面，提供了一种TRPC6mRNA的检测试剂的用途，用于制备通过检测外周血细胞中TRPC6mRNA的表达水平从而早期预测或诊断阿尔茨海默病的试剂盒。
在另一优选例中，所述的早期指对早期AD(如MCI患者)进行预测或诊断，其中，所述的早期AD患者指MMSE>15的患者。
在另一优选例中，所述MCI患者指已出现轻度认知障碍，但尚未达到AD诊断标准的患者。
在另一优选例中，所述检测包括检测外周血细胞中TRPC6mRNA的表达水平，并与正常对照(或正常人群)比较。
在另一优选例中，所述的试剂包括引物、探针、核酸芯片、蛋白芯片。
本发明第四方面，提供了一种检测方法，包括步骤：
(a)提取来自检测对象的外周血或外周血细胞的mRNA；
(b)检测所述mRNA中TRPC6mRNA的表达水平，并与正常人群进行比较，如果显著低于正常人群，则提示该对象患AD的机率或易感性高于正常人群患AD的机率或易感性。
在另一优选例中，所述的检测是实时荧光定量PCR检测。
本发明第五方面，提供了一种TRPC6蛋白或其衍生蛋白或促效剂的用途，用于(a)制备预防和/或治疗AD的药物；(b)制备降低β-淀粉样蛋白水平的药物；和/或(c)制备γ分泌酶活性的调制剂(尤其是作为选择性抑制剂)。
在另一优选例中，用于制备降低神经元中β-淀粉样蛋白产生水平的药物。
在另一优选例中，所述的TRPC6蛋白是小鼠的，更佳地氨基酸序列如SEQIDNO.：5所示。
在另一优选例中，所述的衍生蛋白选自下组：
(a)由含TRPC6蛋白的第487-507位的氨基酸序列所构成的多肽；
(b)由多肽(a)与穿膜肽元件形成的融合蛋白；
(c)由多肽(a)或(b)通过添加、缺失、或改变一个或多个氨基酸而衍生的且具有下调Aβ水平且不影响γ分泌酶切割Notch的功能的衍生多肽；
(d)氨基酸序列对应于TRPC6蛋白的TM2区(487-507aa)的多肽，或TM2区与穿膜肽元件形成的融合蛋白，并且所述多肽或融合蛋白(d)具有下调Aβ水平且不影响γ分泌酶切割Notch的功能。
本发明的第六方面，提供了一种分离的多肽，所述多肽选自下组：
(a)由含TRPC6蛋白的第487-507位的氨基酸序列所构成的多肽；
(b)由多肽(a)与穿膜肽元件形成的融合蛋白；
(c)由多肽(a)或(b)通过添加、缺失、或改变一个或多个氨基酸而衍生的且具有下调Aβ水平且不影响γ分泌酶切割Notch的功能的衍生多肽；
(d)氨基酸序列对应于TRPC6蛋白的TM2区(487-507aa)的多肽，或TM2区与穿膜肽元件形成的融合蛋白，并且所述多肽或融合蛋白(d)具有下调Aβ水平且不影响γ分泌酶切割Notch的功能。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNO.：4。
本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第六方面所述的多肽。
在另一优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQIDNO.：3中第1459-1521位所示。
本发明第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第七方面，所述的多核苷酸。
本发明第九方面，提供了一种宿主细胞，所述细胞含有本发明第八方面所述的载体，或所述细胞的基因组整合有外源的本发明第七方面所述的多核苷酸。
本发明第十方面，提供了一种产生本发明第六方面所述的多肽的方法，所述方法包括：
(i)培养本发明第九方面所述的宿主细胞，从而表达本发明第六方面所述的多肽；和
(ii)从培养体系中分离本发明第六方面所述的多肽。
本发明第十一方面，提供了一种药物组合物，含有药学上可接受的载体和本发明第六方面所述的多肽。
本发明第十二方面，提供了一种本发明第六方面所述的多肽、本发明第七方面所述的多核苷酸、本发明第八方面所述的载体或本发明第是一方面所述的药物组合物的用途，用于(a)制备预防和/或治疗AD的药物；(b)制备降低β-淀粉样蛋白水平的药物；和/或(c)制备γ分泌酶活性的调制剂(尤其是选择性抑制剂)。
本发明第十三方面，提供了一种筛选预防或治疗AD化合物的方法，包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中TRPC6的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中TRPC的表达量和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的TRPC6的表达量和/或活性高于对照组，就表明该测试化合物是对TRPC6的表达和/或活性有增强作用的预防或治疗AD的候选化合物。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对Aβ的抑制作用。
本发明第十四方面，提供了一种预防和或治疗AD和/或MCI的方法，向所需要的对象施用安全有效量的如权利要求9所述的多肽或权利要求14所述的药物组合物。
在另一优选例中，所述的AD包括早期AD(MMSE>15)。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了在不同人群中，外周血细胞中TRPC5和TRPC6的mRNA水平。
其中，图1a：与年龄匹配的非AD对照组相比，AD病人的外周血细胞TRPC6mRNA水平显著较低，而TRPC6mRNA水平在年龄匹配的非AD对照组和年轻的非AD对照组之间则没有差异；
图1b：外周血细胞的TRPC5mRNA水平在AD组，年龄匹配的非AD对照组和年轻的非AD对照组之间没有显著差异；
图1c：外周血细胞TRPC6mRNA水平在PD患者和年龄匹配的非PD对照组之间没有显著差异；
图1d、f、g：扩大样本量后，所得结果分别与图1a、b、c相同。
图1e显示了ROC曲线分析显示AUC=0.8324,敏感度=78.74%，特异度=71.82%，可见TRPC6mRNA的水平对于区分AD和年龄匹配的非AD对照而言，特异度和灵敏度都非常高。
图1h显示了对TRPC6mRNA和MMSE进行的线性回归分析，结果显示：R2=0.1179,P=0.0002，可见痴呆程度越严重的AD患者，其外周血细胞TRPC6mRNA水平越低。
图1i显示了早期AD患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平显著低于年龄匹配的非AD对照组(P<0.0001)。
图1j：显示了ROC曲线分析显示AUC=0.8235,敏感度=78.43%，特异度=70.91%，可见，TRPC6mRNA水平能够对早期AD患者进行有效的诊断。
图1k显示了MCI患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平显著低于年龄匹配的非MCI对照组(***P<0.0001)。
图1l：显示了ROC曲线分析显示AUC=0.0.8370,敏感度=76.79%，特异度=84.62%，可见，TRPC6mRNA水平能够对MCI患者进行有效的诊断。
图2显示了在不同小鼠中，外周血细胞和脑组织中TRPC5和TRPC6的水平。
图2a和2b：HEK293细胞中通过表达APP而提高Aβ的积累不影响TRPC6和TRPC5的mRNA及蛋白水平；
图2c和2d：与野生型(WT)小鼠相比，APP/PS1小鼠的外周血细胞和脑组织的TRPC6和TRPC5mRNA水平没有明显差异；
图2e：与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠脑组织的TRPC6蛋白水平没有明显差异。
图3显示了TRPC6的表达水平可影响Aβ水平。
图3a：ELISA结果表明，HEK293APP细胞中过表达TRPC6减少了Aβ水平，但过表达TRPC5则没有类似作用；
图3b，ELISA结果表明，原代培养的皮层神经元中用RNAi敲除TRPC6增加了Aβ水平。
图3c，ELISA结果表明，原代培养的皮层神经元中用RNAi敲除TRPC6增加了Aβ水平，但敲除TRPC5则没有类似作用。
图4显示了不同小鼠的脑片的老年斑染色结果和分析。
图4a：APP/PS1和APP/PS1/TRPC6小鼠脑片用Aβ抗体进行老年斑染色的代表图。标尺=500um；
图4b，老年斑沉积的定量分析显示，APP/PS1/TRPC6小鼠脑片的老年斑面积的百分比要显著低于APP/PS1小鼠；
图4c～e：ELISA结果显示，APP/PS1/TRPC6小鼠的总Aβ、TBST可溶和不溶Aβ水平都要显著低于APP/PS1小鼠。
图5显示了TRPC6可特异性抑制γ分泌酶对APP的切割。
图5a：ELISA结果显示，COS7C99稳定细胞株中过表达TRPC6降低了Aβ水平；
图5b：在HEK293APP细胞中过表达TRPC6减少了γ分泌酶切割引起的C99-GVP/UAS-荧光素酶活性；
图5c：免疫印迹结果表明，过表达TRPC6不影响γ分泌酶切割Notch△E-myc而产生的NICD的量。
图6显示了TRPC6的结构以及含487-507aa的TRPC6突变体(或片段)可下调Aβ水平。
图6a：TRPC6的拓扑结构图，显示其有6个跨膜区和位于胞内的N端和C端；
图6b：ELISA结果显示，过表达TRPC6-1/405或TRPC6-725/930不影响Aβ水平；
图6c：TRPC6截短突变体的示意图；
图6d：ELISA结果显示，过表达包含437-508aa的TRPC6突变体可以下调Aβ，而过表达不包含437-508aa的TRPC6突变体则不能下调Aβ，提示437-508aa对于TRPC6下降Aβ水平是重要的；
图6e：ELISA结果显示在HEK293APP细胞中，TAT-TM2融合蛋白可剂量依赖地下调Aβ水平；
图6f：免疫印迹显示TAT-TM2不能改变γ分泌酶切割Notch△E-myc而产生的NICD的量；
图6g显示了TRPC6包含TM2结构域（487-507aa）突变体的构成示意图；
图6h显示了TRPC6包含TM2结构域（487-507aa）突变体质粒均不能下降Aβ水平。
图7显示了本发明多肽在人、小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、犬以及猫的TRPC6蛋白中所对应位置的比对结果。
图8a：APOE3基因型的个体TRPC6mRNA水平相对较高，APOE4基因型的个体TRPC6mRNA水平相对较低（***P<0.001）；其中，AD-4*4,AD-3*3，AD-3*4,分别表示AD患者中APOE4纯合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体。Control-2*3,Control-3*3，Control-3*4,分别表示对照中APOE2和3杂合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体。Combined-2*3,Combined-3*3，Combined-3*4,分别表示所有个体中APOE2和3杂合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体；
图8b：含有APOE3的培养液上清可以增加Jurkat细胞中TRPC6的mRNA水平，但是含有APOE4的培养液上清不影响Jurkat细胞中TRPC6的mRNA水平。
图8c：含有APOE3的培养液上清可以增加大鼠神经元中TRPC6的mRNA水平，但是含有APOE4的培养液上清不影响大鼠神经元中TRPC6的mRNA水平。
图9a：融合肽TAT-TM2以及突变体肽TAT-TM2-mut对HEK293APP稳转细胞系Aβ的水平的影响，其中，TAT-TM2能够显著降低Aβ的水平，但TAT-TM2-mut则无法对Aβ的水平产生明显的影响；
图9b：ELISA结果显示在HEK293APP细胞中，TAT-TM2融合蛋白可剂量依赖地下调Aβ水平；
图9c：在原代培养皮层神经元中，融合肽TAT-TM2能够显著降低Aβ水平；
图9d-e：显示了TAT-TM2-C可以在HEK293APP细胞上下调Aβ水平，其突变体TAT-TM2-C-m2和TAT-TM2-C-m3以及TAT-TM2-N则不能影响Aβ水平；
图9f：在小鼠体内实验中，融合肽TAT-TM2同样能够显著降低Aβ水平。
图10a-b：TAT-TM2减少了C99被γ分泌酶切割产生的Aβ，也减少了C99被γ分泌酶切割后所激活的荧光素酶活性;
图10c：TAT-TM2不会改变NICD水平,即TAT-TM2不影响γ分泌酶对Notch的切割。
具体实施方式
本发明人经过长期深入的研究，首次意外地发现：在AD患者中，外周血细胞的TRPC6mRNA表达水平较低，且并非由于年龄增长而减少的。因此，外周血细胞中的TRPC6mRNA水平与AD的发病(或易感性)存在强相关性，可作为早期预测、诊断AD的生物标记物。
此外，本发明人还首次证实了：来源于人TRPC6蛋白第488-508位或小鼠TRPC6蛋白第487-507位氨基酸序列或含有上述氨基酸序列的TRPC6片段或突变蛋白多肽，能够特异性地降低Aβ的水平，从而改善AD症状，并且副作用小。
在上述发现的基础上，本发明人完成了本发明。
TRPC6
TRPC6(transientreceptorpotentialcanonical6，经典型瞬时受体电位通道6)是TRP(transientreceptorpotential,TRP)基因超家族C亚家族(canonical)的成员之一，编码钙可通透的非选择性阳离子通道。在脑部组织中可检测到TRPC6的mRNA。研究已表明，TRPC6在神经发育、学习记忆、疼痛调节等方面起一定作用。
功能性TRPC6离子通道为同源或异源四聚体结构，对Na+、K+、Ca2+具有通透性。N-末端含有三个锚蛋白结构域，可能与通道的膜定位有关；C-末端具有TRPC家族保守序列的EWKFAR盒和两个三磷酸肌醇(inositoltriphosphate,IP3)受体结构域，其中第二个结构域与一个钙调蛋白(calmodulin,CaM)结合位点重叠。
本发明TRPC6在多物种中有着高度的同源性，可用于本发明的TRPC6可来自于任何哺乳动物，包括(但并不限于)：人、啮齿动物(如小鼠、大鼠)、黑猩猩、牛、犬、猫等。此外，TRPC6包括野生型TRPC6和突变型TRPC6及其活性片段(例如包含487-507aa的TRPC6突变体或活性片段)。一种野生型的TRPC6的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，其编码的TRPC6蛋白如SEQIDNO.：5所示。
预测或诊断应用
本发明提供了一种预测或诊断(尤其是早期辅助性预测或诊断)AD疾病或其易感性的方法和相应试剂盒。
本发明方法利用了检测对象的外周血细胞中TRPC(尤其是TRPC6)表达水平与AD患病机率之间的相关性。
本发明的研究表明，外周血细胞中某些TRPC(如TRPC5)表达水平与AD患病机率之间无相关性；然而，出人意料的是，作为一种非脑组织，外周血细胞中TRPC6的表达水平与AD患病机率之间存在显著相关性，因此特别适合用于AD的早期辅助性预测或诊断的生物标志物。
本发明的检测方法可以基于TRPC6的mRNA表达水平，或TRPC6的蛋白质表达水平。
在本发明中，TRPC6基因包括TRPC6的各种核酸序列，例如DNA序列或mRNA序列。
一种优选的检测方法是检测外周血细胞中TRPC6mRNA的表达水平。一种代表性的方法包括步骤：
1)提取待测对象的外周血细胞的总RNA；
2)反转录得到cDNA；
3)对cDNA进行实时荧光定量PCR，得到TRPC6mRNA的定量检测结果，并与正常人群的TRPC6mRNA的表达水平进行比较，如果显著低于正常人群，则提示该对象患AD的机率或易感性高于正常人群患AD的机率或易感性。
含487-507aa的TRPC6突变体或活性片段
如本文所用，术语“本发明多肽”指一类特别有用的多肽，该多肽是对应于小鼠TRPC6的第487-507位氨基酸(487-507aa)活性片段(简称为“核心区”)，如SEQIDNO.：4所示，或含所述核心区的TRPC6突变体，或含所述核心区的融合蛋白、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制炎症功能或活性的多肽。本发明多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
如图7所示，显示了本发明多肽在人、小鼠、大鼠、黑猩猩、牛、犬以及猫的TRPC6蛋白中所对应的位置。可见本发明多肽与多种哺乳动物中TRPC6蛋白具有高度同源性。
优选的本发明多肽是含有来自小鼠的TRPC6蛋白第487-507位氨基酸序列(487-507aa)的活性片段或具有源自人相应TRPC6蛋白第488-508位序列的活性片段或蛋白(如图7所示)。应理解，该含有上述核心区的活性片段的长度可以不局限于21个氨基酸，还可以含有额外的来源于TRPC6蛋白(如人或非人哺乳动物TRPC6蛋白)的侧翼氨基酸序列，通常该活性片段的长度为20-100个，较佳地21-70个，更佳地21-40个氨基酸。在本发明中，活性片段不包括全长TRPC6蛋白。
本发明的研究表明，本发明多肽可特异性地抑制γ分泌酶对APP的切割，从而有效降低Aβ的水平，进而改善AD症状。此外，与现有的γ分泌酶抑制剂相比，本发明多肽的显著优点在于，由于它不改变γ分泌酶对其他底物(如Notch)的切割功能，因此副作用小。
APOE基因
APOE基因在人群当中有APOE2，APOE3，APOE4这三种基因型。人群中约80%的个体携带APOE3,约20%的个体携带APOE4，但是约有40-50%散发型AD患者携带APOE4基因型。因此APOE基因被认为是散发型AD中最重要的风险基因。人体内的APOE主要由肝脏产生后释放到血液里，再随血液循环到达全身各处。中枢神经系统中胶质细胞也可以分泌APOE。APOE基因在AD中的作用体现在APOE3可以发挥众多正常的生理作用：如介导Aβ的清除和降解，促进神经元突起的生长等；而一旦APOE突变为APOE4以后，这些正常的生理功能就受到影响，从而增加了AD的患病风险。
药物组合物和治疗用途
本发明多肽或TRPC6促效剂(或激活剂)可直接用于疾病治疗和预防，例如，用于AD的治疗。在使用本发明多肽或TRPC6促效剂时，还可同时使用其他治疗剂。
本发明多肽或TRPC6促效剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供一种或多种以下效果：(a)预防和/或治疗AD；(b)降低β-淀粉样蛋白水平；和/或(c)选择性抑制γ分泌酶。此外，本发明多肽或TRPC6激动剂不仅可取得良好的治疗效果，而且其副作用小(例如，基本上不影响γ分泌酶对其他底物的切割功能)。
通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。当TRPC6促效剂是非蛋白类物质时，还可以通过口服给药。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明多肽或其激动剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明多肽或其激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
编码本发明多肽的多聚核苷酸也可用于治疗或预防目的，例如通过基因治疗方式。
药物筛选方法
本发明还提供了基于TRPC6进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(增强)TRPC6表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对Aβ的抑制作用。
本发明提供的筛选预防或治疗AD候选化合物的方法，基于该化合物对TRPC6的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤：
(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中TRPC6的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中TRPC6的表达量和/或活性；
其中，如果测试组中细胞的TRPC6的表达量和/或活性高于对照组，就表明该测试化合物是对TRPC6的表达和/或活性有促进作用预防或治疗AD候选化合物的候选化合物。和/或
(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对Aβ的抑制作用。例如，在测试组中，转染APP的细胞培养体系中添加测试化合物，并测试其对Aβ的抑制情况；在对照组中，在不添加测试化合物的情况下，测试Aβ的抑制情况；其中，如果测试组中Aβ量低于对照组，就表明该测试化合物是对Aβ有抑制作用的预防或治疗AD的候选化合物。
由于TRPC6的表达水平与降低Aβ的关系更为密切，因此优选检测TRPC6的表达量(表达水平)。
TRPC6的表达水平可以在mRNA水平或蛋白水平进行，例如通过常规方法或市售的设备和试剂(如抗体、引物等)进行。
本发明的主要优点包括：
1.首次提供了一种存在于外周血细胞中的、易于早期预测或早期诊断AD的客观的生物标志物。本发明首次证实了外周血细胞TRPC6mRNA与AD发病的明显的相关性，从而确定外周血细胞中的TRPC6mRNA水平可以作为诊断AD的分子生物学依据，同时也避免了MMSE指标在临床应用的主观性和不确定性。
2.将AD诊断时间窗提前：本发明直接从外周血细胞检测TRPC6mRNA以预测或早期诊断AD，改进了以往技术中只能通过脑组织测定TRPC6mRNA水平，将AD的诊断时间窗大幅提前，为预防治疗AD进行的早期干预提供了宝贵的时间。
3.筛选出对治疗AD起主要作用的多肽：本发明在细胞水平和动物实验均进行了大量筛选和验证，证实了487-507aa构成的核心区是对治疗AD起主要作用的肽段，推进了AD治疗药物的开发。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
1.外周血细胞总RNA的提取
血液RNA提取使用RNABloodMiniKits(QIAGENCat：52304)试剂盒，实验操作主要参照其说明书进行，步骤如下：
1)1倍体积血液加入5倍体积BufferEL，冰浴10分钟。
2)4℃400xg离心10分钟。加入2倍体积BufferEL重悬细胞，再次离心。
3)加入BufferRLT，震荡裂解细胞。
4细胞裂解液转至QIAshredderspincolumn，16000xg离心2分钟。
5)加入70%体积的乙醇，震荡。.
6)样品转至QIAampspincolumn.8000xg离心15秒。
7)加入700μlBufferRW1洗柱，8000xg离心15秒。
8)加入500μlBufferRPE，8000xg离心15秒。
9)加入500μlBufferRPE，20,000xg离心3分钟。16000xg离心1分钟。
10)加入50μlRNase-free水，8000xg离心1分钟，将RNA洗脱至1.5ml离心管。
2.反转录
1)往反应体系中加入总RNA10ul和随机引物1ul，70℃退火5分钟，让引物和模板结合。
2)之后往反应体系中加入逆转录酶Buffer4ul，RibolockRNaseinhibitor0.5ul，RNase-free水1.5ul，dNTPs2ul，M-MLVReverseTranscriptase1ul，震荡混匀后短暂离心，得到20ul反应体系，设置反应温度25℃，10分钟，42℃，1小时，70℃，10分钟，即可得到cDNA
3.实时荧光定量PCR
配制反应体系：2×qPCRMasterMix10ul，水4ul，稀释的cDNA5ul，引物1ul。震荡混匀后短暂离心，加到PCR反应管内。放入qPCR仪中，运行程序95℃，2min，1cycle→95℃，10s+63℃，30s，40cycles→95降到60℃，1cycle。为降低操作误差每个样本做3个复孔，并先配制混合液再分装为3个复管。
TRPC6引物序列如SEQIDNO.：1(正义链)；SEQIDNO.：2(反义链)所示；
TRPC5引物序列为SEQIDNO.：6(正义链)；SEQIDNO.：7(反义链)所示；
actin引物序列SEQIDNO.：8(正义链)；SEQIDNO.：9(反义链)所示。
4.细胞和脑组织总RNA的提取
细胞和脑组织总RNA的提取使用Reagent(InvitrogenCat：15596)，实验操作主要参照其说明书进行，步骤如下：
1)用1mlTrizol匀浆细胞或半脑,混匀后于RNAsefree的EP管内室温静置5min。
2)每个EP加0.2ml氯仿，剧烈震荡30s，室温静置3min。4度13200g离心15min。
3)离心后液体分为3层，小心将上层透明液相转入一个新的RNasefree1.5mlEP管。
4)每个EP加0.5ml异丙醇，剧烈震荡30s，室温静置10min。4度13200g离心10min。
5)弃上清，往EP管中加入1ml75%乙醇，吹打沉淀。4度13200g离心10min。
6)弃上清，往EP管中加入1ml无水乙醇，吹打沉淀。4度13200g离心10min。
7)弃上清，晾干沉淀。加入20ulRNasefree水溶解RNA。
5.细胞和脑组织蛋白的提取和WB检测
细胞直接用SDS刮取后95℃变性10分钟提取蛋白。脑组织用RIPA匀浆后在4度旋转混合30分钟，13,200转4度离心取上清，加SDS95℃变性10分钟提取蛋白。蛋白用SDS-PAGE分离，并用TRPC6(SAB,1：300)和TRPC5(Alomone,1：200)抗体检测。
6.APP/PS1的AD小鼠模型的建立
a)APP/PS1小鼠(B6C3背景)购自美国Jacksonlaboratory(#004462)。
b)构建TRPC6转基因小鼠
用包含有CaMKIIα编码区上游8.5Kb的启动子和mouseTRPC6编码区的线性质粒注射C57BL6小鼠和FBN小鼠交配产生的受精卵，得到的子一代小鼠再与C57BL6小鼠交配，得到纯C57BL6背景的TRPC6转基因小鼠。CaMKIIα启动子驱动TRPC6在前脑的兴奋性神经元表达。TRPC6转基因小鼠基因型的鉴定通过如SEQIDNO.：10和SEQIDNO.：11所示的引物进行。
c)将C57背景的野生型小鼠与6.1所述APP/PS1小鼠交配，获得C57背景的子代，再将TRPC6转基因小鼠与C57背景的APP/PS1小鼠交配，获得的子代为APP/PS1和APP/PS1/TRPC6的小鼠模型。
7.免疫组化
老年斑的免疫组化参照了VectaStainUniversalABCkit(VECTOR)的说明书。脑片首先用H2O2处理，之后用甲酸进行抗原修复。封闭之后，用Aβ抗体6E10(购自COVANCE公司)敷育过夜，之后用二抗和ABC复合体敷育，最后用DAB(购自VECTOR公司)显色。脑片经过脱水和透明后封片，用Neurolucidar拍片。
8.Aβ定量
细胞的培养基收集后Aβ40和Aβ42水平分别用sandwichELISAkit(购自Invitorgen公司)定量。小鼠前脑解剖分离出来之后用GuHCL匀浆，之后用ELISA检测总Aβ。为了检测TBST(Tris-BufferedSaline和1%TritonX100,1%SDS,1%DOC)可溶和不溶Aβ，小鼠前脑首先用TBST匀浆，离心之后，上清用ELISA检测TBST可溶的Aβ，沉淀则用GuHCL进一步匀浆后用ELISA检测TBST不溶的Aβ。
9.细胞培养和转染
HEK293APP稳定细胞株用10%FBS的DMEM培养液(含200ng/mlG418)培养。COS7C99细胞用5%FBS，1%NEAA和200mMGlutamax的MEM/F12培养液(含0.4ug/mlhygromycinB)培养。所有转染均用Lipofectamin2000(Invitrogen)完成。
10.荧光素酶活性检测
HEK293APP转染了C99-GVP/UAS-Luciferase以及CTRL或TRPC6质粒。24小时后将细胞裂解，用荧光素检测系统(购自Promega公司)检测荧光素酶活性。一起共转的β-gal用来调平转染效率。
11.HEK293APP稳定细胞株的制备
HEK293细胞接种于60mm培养皿。当密度接近80%时，用Lipofectamine2000转染APP质粒4ug，4小时候换液，加入400ng/ml的G418，两天后进行细胞传代，并保持培液中400ng/ml的G418。两三周后，未转染APP的细胞逐渐死亡，活下来的就是表达APP的HEK293细胞。之后将G418改成200ng/ml，并一直保持。
实施例1外周血细胞TRPC6mRNA水平在AD患者中的特异性测定
设置以下组并收集来自多家医院的患者和对照的外周血液样品，提取血细胞RNA，反转录得到cDNA，并通过实时荧光定量PCR进行定量测试：
1.1外周血细胞TRPC6mRNA在以下各组中的水平比较：
a.散发性AD(n=40,平均年龄=80.55±5.25岁)；
b.年龄匹配的非AD对照(n=45,平均年龄=78.69±5.63岁)；
c.年轻的非AD对照(n=45,平均年龄=60.6±6.56岁)。
结果显示：AD患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平显著低于年龄匹配的非AD对照组(***P<0.001；n=40-45)，在年龄匹配和年轻的非AD对照这两组之间，TRPC6mRNA水平没有明显区别(n=45)，见图1a。
当将a、b、c分别放大至如下所示的样本量后，也能得到同样的结果：(见图1d)
a.散发性AD(n=127,平均年龄=80.5±5.7岁)；
b.年龄匹配的非AD对照(n=110,平均年龄=77.1±8.3岁)；
c.年轻的非AD对照(n=73,平均年龄=57.5±5.4岁)。
ROC曲线分析显示AUC=0.8324,敏感度=78.74%，特异度=71.82%，见图1e。
1.2外周血细胞TRPC5mRNA在以下各组中的水平比较：
a.散发性AD(n=28,平均年龄=80.5±5.85岁)；
b.年龄匹配的非AD对照(n=14,平均年龄=70.07±8.25岁)；
c.年轻的非AD对照(n=20,平均年龄=57.45±5.36岁)。
结果显示：TRPC5的mRNA水平在这三组之间没有明显差别(n=14-28)，见图1b。
当将a、b、c分别加大至如下所示的样本量后，也能得到同样的结果：(见1f)：
a.散发性AD(n=50,平均年龄=78.5±3.7岁)；
b.年龄匹配的非AD对照(n=28,平均年龄=75.4±5.3岁)；
c.年轻的非AD对照(n=34,平均年龄=56.5±4.1岁)。
1.3外周血细胞TRPC6mRNA在以下各组中的水平比较：
a.PD(帕金森病，Parkinson'sDisease)患者对照(n=18,平均年龄=60±10.85岁)；
b.年龄匹配的非PD对照(n=62,平均年龄=64.08±8.01岁)。
结果显示：PD患者与非PD对照组的外周血细胞TRPC6mRNA水平没有显著性差异(n=18-62)，见图1c。
当将a、b分别加大至如下所示的样本量后，也能得到同样的结果：(见1g)：
a.PD(帕金森病，Parkinson'sDisease)患者(n=30,平均年龄=65.2±2.5岁)；
b.年龄匹配的非PD对照(n=130,平均年龄=62.1±4.2岁)。
1.4AD患者外周血细胞TRPC6mRNA和其MMSE的相关性：
为了分析AD患者外周血细胞TRPC6mRNA和和其痴呆程度的相关性，对TRPC6mRNA和MMSE进行线性回归分析，结果显示：R2=0.1179,P=0.0002，见图1h。这提示痴呆程度越严重的AD患者，其外周血细胞TRPC6mRNA水平越低。
1.5外周血细胞TRPC6mRNA在以下各组中的水平比较：
a.早期AD患者(n=51,MMSE>15,平均年龄=74.3±3.2岁)；
b.年龄匹配的非AD对照(n=110,平均年龄=77.1±8.3岁)。
结果显示：早期AD患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平显著低于年龄匹配的非AD对照组(P<0.0001)，见图1i。ROC曲线分析显示AUC=0.8235,敏感度=78.43%，特异度=70.91%，见图1j。
1.6外周血细胞TRPC6mRNA在以下各组中的水平比较：
a.MCI(轻度认知下降，Mildcognitiveimpairment)患者(n=46,平均年龄=73.1±2.1岁)；
b.年龄匹配的非MCI对照(n=52,平均年龄=71.1±4.2岁)。
结果显示：MCI患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平显著低于年龄匹配的非MCI对照组(***P<0.0001)，见图1k。ROC曲线分析显示AUC=0.8370,敏感度=76.79%，特异度=84.62%，见图1l。
由上可得出结论：
在AD病人外周血细胞中，TRPC家族成员TRPC6的mRNA水平显著低于正常人群，且并不由于年龄的增长而逐渐降低，并与痴呆指标MMSE有一定相关性；同时其它TRPC成员分子(如TRPC5)的mRNA水平在年龄匹配的非AD对照组和AD患者之间没有显著性差异；此外PD患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平与对照组没有差异。
因此，外周血细胞的TRPC6mRNA在AD（包括早期AD）和MCI患者中表达水平显著低于正常人群，可作为外周血细胞早期预测和辅助诊断AD的特异性的分子生物标记物。
实施例2细胞及动物水平TRPC6mRNA水平与Aβ的相关性测定
2.1细胞转染实验
对HEK293(ATCCCRL-1573)进行Aβ前体蛋白APP转染，按通用方法将HEK293细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ug质粒，48小时后用免疫印迹法检测蛋白的表达情况)，并测定APP过量时，TRPC6或TRPC5的mRNA和蛋白水平。
结果如图2a、b所示：在细胞模型中过量产生Aβ，不影响TRPC6或TRPC5的mRNA和蛋白水平(平均值±标准误，n=3)；其中，微管蛋白为内参蛋白；ns代表无显著性差异。
2.2动物实验
比较WT小鼠与APP/PS1的AD小鼠模型过量产生Aβ后，TRPC6或TRPC5的mRNA水平有无变化。其中，按照通用方法4提取APP/PS1小鼠和WT小鼠的外周血细胞和脑组织总RNA，反转录并进行TRPC6或TRPC5的mRNA检测，并以通用方法5进行TRPC6抗体检测。
结果如图2c,d所示：与WT小鼠相比，APP/PS1小鼠的外周血细胞和脑组织中的TRPC6或TRPC5mRNA水平均没有明显变化(平均值±标准误；n=4-10个小鼠)；脑组织中的TRPC6蛋白水平也没有明显变化，见图2e。
本实施例结果提示，在细胞和小鼠模型中，TRPC6mRNA和蛋白水平并没有随着Aβ的增加而降低，可见AD患者外周血细胞的TRPC6mRNA水平较低，不是由于Aβ的积累而逐渐下降所导致的，而是在发病之前就处于较低的水平。故TRPC6适合作为早期诊断AD的标志物。
实施例3细胞水平及体内表达TRPC对Aβ水平的影响测定
3.1在HEK293APP稳转细胞系里检测过表达TRPC是否可以降低Aβ水平
在HEK293APP稳转细胞系里分别过表达TRPC6和TRPC5(细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ug质粒，48小时后用ELISA检测培液里的Aβ水平)。
结果见表1和图3a。
表1
3.2在原代培养的大鼠皮层神经元里敲除TRPC6和TRPC5是否会导致Aβ水平增加
SD大鼠怀孕后第17天取出胎鼠，分离获得大脑皮层神经元，用AMAXA核酸电转仪电转TRPC6siRNA1如SEQIDNO.：12(正义链)以及SEQIDNO.：13(反义链)所示；TRPC6siRNA2如SEQIDNO.：18(GCUUGACUUUGGAAUGUUATT正义链)以及SEQIDNO.：19(UAACAUUCCAAAGUCAAGCTT反义链)所示；对照siRNA如SEQIDNO.：14(正义链)以及SEQIDNO.：15(反义链)所示；TRPC5siRNA如SEQIDNO.：20(AACGCCUUCUCCACGCUCUUU正义链)以及SEQIDNO.：21(AAAGAGCGUGGAGAAGGCGUU反义链)所示。电转后第7天用ELISA检测神经元培养液里的Aβ水平
结果如表6及图3c显示：
表6
可见，敲除了TRPC6之后，培养液里的Aβ明显增加，而敲除TRPC5则不影响Aβ水平，见图3b-c。
3.3APP/PS1小鼠的神经元中过表达TRPC6对老年斑沉积和Aβ水平的影响
将在前脑兴奋性神经元过表达TRPC6的转基因小鼠和AD的模型小鼠APP/PS1小鼠交配，在子代的APP/PS1和APP/PS1/TRPC6小鼠中检测老年斑和Aβ水平。
老年斑的免疫组化：通用方法7(n=11)
Aβ水平：通用方法8(n=13-14)
TBST可溶Aβ和不可溶Aβ水平：通用方法8(n=13-14)
结果如表2和图4所示。
表2
由此可见，TRPC6在细胞水平明显减少了细胞培养液中Aβ水平，在原代培养的大鼠皮层神经元里敲除了TRPC6，培养液里的Aβ明显增加；另外在神经元中过表达TRPC6可以在APP/PS1小鼠中降低老年斑沉积和Aβ水平。因此，细胞实验和动物实验均表明，TRPC6可降低Aβ水平。
实施例4TRPC6对γ分泌酶切割其底物的影响测定
4.1TRPC6对γ分泌酶切割C99的影响，其中，C99为APP的C端99个氨基酸，是γ分泌酶的直接底物。
使用通用方法9转染细胞，n=5，得到过表达TRPC6的COS7C99细胞，细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ug质粒，48小时后用ELISA检测培液里的Aβ水平。
结果如表3和图5所示：
表3
由表3可见，过表达TRPC6减少了C99被γ分泌酶切割产生的Aβ，也减少了C99被γ分泌酶切割后所激活的luciferase活性。
4.2TRPC6对γ分泌酶切割Notch的影响
将细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ugTRPC6质粒和1ugNotch质粒，48小时后用免疫印迹法检测Notch蛋白的表达情况。其中，NICD(notchintracellulardomain)是由Notch△E-myc被γ分泌酶切割产生的胞内片段，反映了γ分泌酶对Notch切割的多少。
结果显示，过表达TRPC6不会改变NICD水平,即TRPC6不影响γ分泌酶对Notch的切割。
以上结果表明，TRPC6蛋白(包括野生型全长蛋白)可以特异地抑制γ分泌酶切割APP(C99)从而减少Aβ的产生，同时却不影响其切割Notch的功能。
实施例5对起活性作用的TRPC6蛋白跨膜多肽的筛选和锁定
5.1活性跨膜肽段的初步筛选
将TRPC6蛋白分为若干个肽段，并对若干个肽段对Aβ水平的影响进行筛选，分别构建TRPC6以下不同片段的表达质粒：1～405aa，725～930aa,389～930aa,389～510aa,437～633aa,508～633aa。
后将HEK293APP稳转细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ug质粒，48小时后用ELISA检测培液里的Aβ水平，将目标肽段初步锁定于第437-507位氨基酸。
几个显著的肽段对Aβ水平的影响测试结果如表4和图6所示：
表4
由此显示,包含437-507aa的突变体均能下降Aβ，而不包含这一片段的突变体则不能下调Aβ水平，这表明437-507aa对于TRPC6下调Aβ水平是至关重要的。
5.2活性跨膜肽段的锁定
TRPC6的437-508aa包含第一跨膜区（TM1），第一胞外区（Loop1），第二跨膜区（TM2）。为了锁定活性区域，构建了三个TRPC6突变体质粒，分别为C6-mut1：用TM1序列替换TM2；C6-mut2：将TM2序列颠倒；C6-mut3：TM2序列内包含点突变。后将HEK293APP稳转细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ug质粒，48小时后用ELISA检测培液里的Aβ水平，将目标肽段锁定于第487-507位氨基酸。
结果如表7和图6g和图6h所示：
表7
Aβ40 Aβ42
空载 1 1
C6-mut1 1.06±0.04 1.00±0.01
C6-mut2 1.08±0.05 1.00±0.01
C6-mut3 0.96±0.05 0.92±0.06
由此显示,TM2结构域（487-507aa）的突变体质粒均不能下降Aβ水平，表明487-507aa对于TRPC6下调Aβ水平是至关重要的，是抑制γ分泌酶切割APP的核心区。
实施例6包含487-507aa的融合肽的构成及测试
6.1在细胞水平检测融合肽是否降低Aβ水平
6.1.1HEK293APP稳转细胞系及原代培养皮层神经元中检测融合肽段是否可以降低Aβ水平
在本实施例中，选择了第二跨膜区(487-507aa,TM2)与穿膜肽TAT融合进行合成，得到了融合肽TAT-TM2以及突变体肽TAT-TM2-mut，检测了其对HEK293APP稳转细胞系Aβ的水平的影响。其中，肽段由ChinaPeptides公司合成，序列如表12所示。
结果如表8和图9a所示：
表8
Aβ40 Aβ42
TAT 1 1
TAT-TM2 0.39±0.03 0.40±0.06
TAT-TM2-mut 0.89±0.07 0.93±0.09
表12
融合肽 SEQ ID NO.: 序列
TAT 16 GRKKRRQRRRC
TAT-TM2 17 TSCFSWMEMLIISWVIGMIWAGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-mut 22 TSCFSWMEMLIISDDIGMDDAGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-N 23 TSCFSWMEMLGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-C 24 IISWVIGMIWAGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-C-m1 25 DDSWVIGMIWAGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-C-m2 26 IISDDIGMIWAGRKKRRQRRRC
TAT-TM2-C-m3 27 IISWVIGMDDAGRKKRRQRRRC
6.1.2在HEK293APP稳转细胞系检测了不同剂量的融合肽TAT-TM2对Aβ水平的影响。
结果如表5和图6e或图9b所示：
表5
Aβ40 Aβ42
TAT 1 1
TAT-TM2(2uM) 0.6825±0.04980 0.6244±0.03189
TAT-TM2(5uM) 0.4863±0.05919 0.3255±0.02046
TAT-TM2(10uM) 0.2481±0.07630 0.2214±0.01597
由此可见，TAT-TM2可以在HEK293APP细胞上剂量依赖地下调Aβ水平。
6.1.3在原代培养皮层神经元中检测了融合肽TAT-TM2对Aβ水平的影响，结果如图9c所示：
Aβ40：为对照组的83%,n=6,p=0.0072；
Aβ42：为对照组的68%,n=3,p=0.0035
由此可见，TAT-TM2可以在HEK293APP细胞上剂量依赖地下调Aβ水平，而TAT-TM2-mut则不能影响Aβ水平。TAT-TM2在原代培养皮层神经元中也能下调Aβ水平。
6.1.4检测突变体对HEK293APP细胞Aβ水平的影响
为了寻找更短的可以影响Aβ水平的肽段，TM2被分成了N端与C端，分别与TAT融合，检测了TAT-TM2-N，TAT-TM2-C以及TAT-TM2-C突变体对HEK293APP细胞上Aβ水平的影响。肽段由ChinaPeptides公司合成，序列如表12所示。结果如表9和图9d-e所示：
表9
Aβ40 Aβ42
TAT 1 1
TAT-TM2-N 0.97±0.04 0.97±0.04
TAT-TM2-C 0.71±0.07 0.72±0.03
TAT-TM2-C-m1 0.54±0.01 0.33±0.07
TAT-TM2-C-m2 1.09±0.10 1.04±0.15
TAT-TM2-C-m3 1.07±0.11 1.07±0.13
可见，TAT-TM2-C可以在HEK293APP细胞上下调Aβ水平，其突变体TAT-TM2-C-m2和TAT-TM2-C-m3以及TAT-TM2-N则不能影响Aβ水平。TM2-C对于TM2下调Aβ水平至关重要。
6.2在APP/PS1小鼠中检测TAT-TM2是否可以降低Aβ水平
在APP/PS1小鼠中腹腔注射TAT与TAT-TM2，3小时后取小鼠大脑制备样品和检测Aβ水平：通用方法8(n=8)
结果如表10和图9f所示。
表10
Aβ40（pg/mg） Aβ42（pg/mg）
TAT 169.70±61.78 492.60±157.70
TAT-TM2 91.12±43.56 277.40±124.10
可见，TAT-TM2在APP/PS1小鼠中也能下调Aβ的水平。
实施例7化合物筛选
在本实施例中，在mRNA水平进行药物筛选，方法如下：
测试组中，在HEK293细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中TRPC6的表达量(抽提细胞的总RNA，反转录为cDNA；然后通过荧光定量PCR测定表达量)；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中TRPC6的表达量；
其中，如果测试组中细胞的TRPC6的表达量高于对照组，就表明该测试化合物是对TRPC6的表达有促进作用，可用于预防或治疗AD的候选化合物。
结果：
用双盲法测试了5种候选化合物。结果表明，一种候选化合物C可上调TRPC6的表达量。进一步分析表明，该化合物C为CoCl2。
实施例8APOE基因型与TRPC6mRNA水平的相关性测定
8.1外周血细胞的TRPC6mRNA水平与APOE基因型的相关性分析
散发性AD，年龄匹配的非AD对照和年轻的非AD对照都按照APOE的基因型分组，或把所有个体按照APOE的基因型分组，然后分析组间差异。
结果显示：APOE3基因型的个体TRPC6mRNA水平相对较高，APOE4基因型的个体TRPC6mRNA水平相对较低（***P<0.001），见图8a。其中，AD-4*4,AD-3*3，AD-3*4,分别表示AD患者中APOE4纯合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体。Control-2*3,Control-3*3，Control-3*4,分别表示对照中APOE2和3杂合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体。Combined-2*3,Combined-3*3，Combined-3*4,分别表示所有个体中APOE2和3杂合子个体，APOE3纯合子个体，APOE3和4杂合子个体。
结论：AD和对照组中都可以分别看到：APOE3*3的个体，其TRPC6mRNA的平均值水平高于APOE3*4的个体。当把所有个体按照APOE的基因型分组后可以看到，APOE3*3个体的TRPC6mRNA的水平显著高于APOE3*4的个体（P<0.001）。
8.2细胞实验
含有APOE不同isoform的培养液上清加入Jurkat（人的外周血T细胞株）中，5小时后检测TRPC6或TRPC5的mRNA水平(平均值±标准误，n=5)
结果显示：含有APOE3的培养液上清可以增加Jurkat细胞中TRPC6的mRNA水平，但是含有APOE4的培养液上清不影响Jurkat细胞中TRPC6的mRNA水平。含有APOE3或APOE4的培养液上清不影响Jurkat细胞中TRPC5的mRNA水平，见图8b。
含有APOE不同isoform的培养液上清加入体外培养第8天的大鼠神经元细胞中，2小时后检测TRPC6或TRPC5的mRNA水平(平均值±标准误，n=8)
结果显示：含有APOE3的培养液上清可以增加大鼠神经元中TRPC6的mRNA水平，但是含有APOE4的培养液上清不影响大鼠神经元中TRPC6的mRNA水平。含有APOE3或APOE4的培养液上清不影响大鼠神经元中TRPC5的mRNA水平，见图8c。
实施例9TAT-TM2对γ分泌酶切割其底物的影响测定
9.1TAT-TM2对γ分泌酶切割C99的影响
C99为APP的C端99个氨基酸，是γ分泌酶的直接底物。将COS7C99细胞接种于12孔板，密度接近100%。每个孔用5um肽段处理12小时后用ELISA检测培液里的Aβ水平。
结果如表11和图10所示：
表11
由表11可见，TAT-TM2减少了C99被γ分泌酶切割产生的Aβ，也减少了C99被γ分泌酶切割后所激活的荧光素酶活性。
9.2TAT-TM2对γ分泌酶切割Notch的影响
将细胞接种于12孔板，密度接近80%。每个孔用Lipofectamine2000转染1ugNotch质粒，24小时后再用5um肽段处理12小时，用免疫印迹法检测Notch蛋白的表达情况。其中，NICD(notchintracellulardomain)是由Notch△E-myc被γ分泌酶切割产生的胞内片段，反映了γ分泌酶对Notch切割的多少。
结果如图6f或图10c所示，TAT-TM2不会改变NICD水平,即TAT-TM2不影响γ分泌酶对Notch的切割。
以上结果表明，TAT-TM2特异地抑制γ分泌酶切割APP(C99)从而减少Aβ的产生，同时却不影响其切割Notch的功能。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (16)

1.一种经典型瞬时受体电位通道6(transientreceptorpotentialcanonical6，TRPC6)基因或其蛋白的用途，其特征在于，用于制备通过检测而预测或诊断阿尔茨海默病(AD)的试剂或试剂盒。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测是测定外周血细胞中TRPC6mRNA水平。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TRPC6来自哺乳动物。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的TRPC6来自人、小鼠、大鼠。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括：引物、探针、核酸芯片、蛋白芯片、特异性针对TRPC6的抗体。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述的引物如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示的引物对。
7.一种通过测定外周血细胞中TRPC6mRNA进而预测或诊断阿尔茨海默病的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测TRPC6的特异性扩增TRPC6mRNA或cDNA的引物，以及说明书，其中所述说明书包括以下说明：通过测定外周血细胞中TRPC6mRNA来预测或诊断阿尔茨海默病；
其中所述的引物如SEQIDNO.：1和SEQIDNO.：2所示。
8.一种TRPC6mRNA的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备通过检测外周血细胞中TRPC6mRNA的表达水平从而早期预测或诊断阿尔茨海默病的试剂盒。
9.一种TRPC6蛋白的用途，其特征在于，用于(a)制备预防和/或治疗AD的药物；(b)制备降低β-淀粉样蛋白水平的药物；和/或(c)制备γ分泌酶活性的调制剂；
其中，所述的TRPC6蛋白选自下组：
(a)SEQIDNO.:4所示的多肽；或
(b)由多肽(a)与穿膜肽元件形成的融合蛋白。
10.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组：
(a)由SEQIDNO.:4所示的多肽；
(b)由多肽(a)与穿膜肽元件形成的融合蛋白。
11.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求10所述的多肽。
12.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求11所述的多核苷酸。
13.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求12所述的载体，或所述细胞的基因组整合有外源的权利要求11所述的多核苷酸。
14.一种产生权利要求10所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括：
(i)培养权利要求13所述的宿主细胞，从而表达权利要求10所述的多肽；和
(ii)从培养体系中分离出权利要求10所述的多肽。
15.一种药物组合物，其特征在于，含有药学上可接受的载体和权利要求10所述的多肽。
16.一种权利要求10所述的多肽、权利要求11所述的多核苷酸、权利要求12所述的载体或权利要求15所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于(a)制备预防和/或治疗AD的药物；(b)制备降低β-淀粉样蛋白水平的药物；和/或(c)制备γ分泌酶活性的调制剂。
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