KR102256859B1 - 알츠하이머병의 진단용 조성물 - Google Patents

알츠하이머병의 진단용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 특히 상기 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량이 낮은 경우 알츠하이머병의 발병 가능성이 큰 것으로 신속하고 정확하게 진단할 수 있어 의약학 분야에서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

알츠하이머병의 진단용 조성물{Composition for diagnosing Alzheimer's disease}
본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 바이오마커 조성물; 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물; 이를 이용한 알츠하이머병의 진단 또는 발병 가능성에 관한 정보제공 방법; 및 이를 이용한 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
알츠하이머병은 베타아밀로이드 단백질 등이 축적되어 세포독성을 유발함으로써 신경세포가 퇴행되어 인지 능력을 상실하는 퇴행성 뇌질환의 일종이다. 알츠하이머병의 원인은 아직 완전히 밝혀지지 않았지만, 베타아밀로이드 단백질, 타우 단백질 및 아포이(ApoE) 단백질 등의 관련성이 보고되었다. 상기 베타아밀로이드 단백질은 뇌에서 아밀로이드베타전구단백질(APP)이 베타-시크리테이즈(beta-secretase)와 감마시크리테이즈(gamma-secretase)에 의해 절단되어 노인반점(senile plaques)이 형성된다. 또한, 베타아밀로이드가 뇌에 축적되면 타우 단백질의 변성과 축적을 유발하여 신경섬유다발(neurofibrillary tangle)이 형성된다. 노인반점과 신경섬유다발은 알츠하이머병의 특징적인 병변이다.
베타아밀로이드의 축적은 활성산소 생성을 유발하고, 신경세포의 시냅스 형성을 파괴하며, 신경세포사멸을 유발한다고 보고되어 있다. 그러므로, 베타아밀로이드의 생성 및 분해 과정에 관여하는 많은 인자가 알츠하이머병 유발과 진행에 관련되어 있을 것으로 예상되지만, 알츠하이머병이 유발되는 상세한 기작에 대해서는 잘 밝혀지지 않았다.
알츠하이머병의 유전율(Heritability)은 70% 이상으로서, 발병 위험도 예측 검사를 통한 고 위험군 분류 및 이에 대한 집중 관리 시 유병률 감소 효과를 확보하는 것이 가능할 것이다.
또한, 치매환자의 95% 이상을 차지하는 후발성 치매의 주요 유전적 위험인자인 ApoE는 ApoEε2, ApoEε3, ApoEε4 세 가지 동형접합자를 가지는 지질결합단백질로, ApoEε4 type을 가진 사람 중 이형접합자는 2-3배, 동형접합자는 5배 이상 치매 발병률이 높은 것으로 알려져 있다(Reitz et al., 2014, Biochemical Pharmacology; Ba et al, 2016, Translational neurodegeneration).
한편, 74,046명에 대한 대규모 분석을 통해 CR1, BIN1, CD2AP, EPHA1, CLU, MS4A6A, PICALM, ABCA7, CD33, HLA-DRB5, PTK2B, SORL1, SLC24A4, DSG2, INPP5D, MEF2C, NME8, ZCWPW1, CELF1, FERMT2, CASS4 유전자가 노인성 알츠하이머병(late-onset Alzheimer*?**?*s disease)과 연관되어 있음이 밝혀졌다(Lambert et al., Nature Genetics, 2013). 또한, 정상인과 알츠하이머 환자(총 977명)들의 뇌 영상 사진과 유전자들 대한 연관성 연구를 통해서 ABCA7, CLU, DSG2, EPHA1, FERMT2, PICALM, PTK2B, SORL1, ZCWPW1 유전자 상의 변이가 뇌의 아밀로이드 축적과 연관되어 있음이 보고되었다(Apostolova et al., JAMA Neurology, 2018).
하지만, APOE 등 이미 알려진 치매 특이 유전자의 설명률은 유전율을 100%로 가정 시 25% 수준으로, 유전적 요인이 밝혀지지 않은 감추어진 유전율(missing heritability)의 비율은 75% 이상이다. 이러한 감추어진 유전율을 설명할 수 있는 유전인자들을 발굴한다면 알츠하이머병 발병 위험도 예측이 가능할 것으로 기대한다.
한국공개특허 제10-2018-0130060호
본 발명의 목적은 Dynamin 3 또는 AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 진단 또는 발병 가능성에 관한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 발현량이 기준치에 비하여 증가된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1)의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 알츠하이머병의 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트 또는 DNA 칩 키트인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 진단 또는 발병 가능성에 관한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량이 기준치에 비해 낮은 경우 알츠하이머병의 발병 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 측정은 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의하여 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 세포에 후보 물질을 처리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 세포에서 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 발현량이 기준치에 비하여 증가된 후보 물질을 선별하는 단계를 포함하는 알츠하이머병 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 Dynamin 3 또는 AP3D1의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량이 낮은 경우 알츠하이머병의 발병 가능성이 높은 것으로 신속하고 정확하게 진단할 수 있고, 이를 이용하여 알츠하이머병의 치료제를 스크리닝할 수 있어, 알츠하이머병의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 GMR-GAL4 및 UAS-beta-amyloid 가 밸런서 염색체인 CyO (2번 염색체) 및 TM6B (3번 염색체)에 각각 위치하고 있음을 표시한 것이다.
도 2는 UAS 뒤에 Dynamin 3 RNAi를 연결하여 초파리 유전체에 삽입하고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리와 교배하여, Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리 주를 표시한 것이다.
도 3은 UAS 뒤에 AP3D1 RNAi를 연결하여 초파리 유전체에 삽입하고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리와 교배하여, AP3D1 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리 주를 표시한 것이다.
도 4는 초파리의 눈에서 베타아밀로이드 유전자의 발현 또는 Dynamin 3 유전자의 발현 억제(RNAi)를 각각 또는 동시에 일어나게 한 후, 표현형을 비교한 결과이다 (GMR-GAL4: 정상 대조군; GMR-GAL4 UAS-β-amyloid: 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되지 않은 초파리 군; GMR-GAL4 UAS-Dynamin3RNAi: 베타아밀로이드 유전자가 발현되지 않고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제된 초파리 군; 및 GMR-GAL4 UAS-β-amyloid UAS-Dynamin3RNAi: 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제된 초파리 군).
도 5는 초파리의 눈에서 베타아밀로이드 유전자의 발현 또는 AP3D1 유전자의 발현 억제(RNAi)를 각각 또는 동시에 일어나게 한 후, 표현형을 비교한 결과이다 (GMR-GAL4: 정상 대조군; GMR-GAL4 UAS-β-amyloid: 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 AP3D1 유전자의 발현이 억제되지 않은 초파리 군; GMR-GAL4 UAS-AP3D1RNAi: 베타아밀로이드 유전자가 발현되지 않고 AP3D1 유전자의 발현이 억제된 초파리 군; 및 GMR-GAL4 UAS-β-amyloid UAS-AP3D1RNAi: 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 AP3D1 유전자의 발현이 억제된 초파리 군).
본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1(adaptor related protein complex 3 subunit delta 1) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 알츠하이머병의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질의 발현량을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩티드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 의미하고, 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 이들의 조합을 모두 포함한다.
상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체, 재조합 항체 및 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 및 항체 분자의 기능적인 단편, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2및 Fv를 모두 포함한다. 항체 생산은 본 발명이 속하는 분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있고, 제조되어 상업적으로 판매되는 항체를 이용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 단백질의 발현량을 측정하는 제제뿐만 아니라, 항원-항체 복합체의 형성을 정량 또는 정성적으로 측정 가능하게 하는 라벨, 면역학적 분석에 사용되는 통상적인 도구, 시약 등을 더 포함할 수 있다.
상기 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정 가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 산화환원 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈옥시다제와루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트카복실라제, 아스파르테이트아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트데카복실라제, β-라타마제 등이 있다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있다. 발광물에는 아크리디늄에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있다. 산화환원 분자에는 페로센, 루테늄착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+, [RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4- 등이 있다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 도구 또는 시약은 적합한 담체, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표지물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. 담체는 가용성 담체, 불용성 담체가 있고, 가용성 담체는 당 분야에서 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS가 있고, 불용성 담체는 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 결합하는 프라이머 또는 프로브인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "프로브"는 유전자에 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지되어 있어 특정 유전자의 존재 유무 및 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
또한, 본 발명은 (a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 Dynamin 3 또는 AP3D1 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 발현량을 대조군 시료로부터 얻은 기준치와 비교하는 단계를 포함하는 알츠하이머병의 진단 또는 발병 가능성에 관한 정보제공 방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "개체"는 알츠하이머병이 의심되는 개체를 의미하고, 바람직하게는 인간일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리 주(line) 제작
본 발명자들은 인간 알츠하이머병 유사 형질을 보이는 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리를 제작하기 위하여, UAS-GAL4 시스템을 이용하였다. UAS-GAL4 시스템은 효모의 전사조절 시스템을 초파리에 이식하여 유전자 발현을 조절할 수 있게 만든 것이다(Duffy, 2002). GAL4는 전사인자로서 UAS(upstream activation sequence)에 결합하여 UAS 뒤에 연결된 유전자가 발현하게 된다. 이에 본 발명자들은 특정 조직에서 유전자 발현을 조절하는 프로모터(promoter)와 GAL4 유전자를 연결하고, 특정 조직에서 발현시킬 목적 유전자를 UAS 뒤에 연결하여, 특정 조직에서 GAL4 유전자가 발현되고, 발현된 GAL4는 UAS 에 결합하여 목적 유전자를 발현하도록 하였다.
본 발명에서는 초파리의 눈과 시신경에서 베타아밀로이드 유전자를 발현시키기 위하여, 눈에서 발현을 조절하는 GMR(glass multiple reporter) 프로모터를 GAL4 유전자와 연결하여 GMR-GAL4 및 UAS-beta-amyloid를 가진 초파리를 제작하였다. 또한, 상기 초파리 주(line)를 유지하기 위하여, GMR-GAL4 및 UAS-beta-amyloid 는 상동 염색체 사이의 교차가 억제된 밸런서 염색체(CyO, 2번 염색체; 및 TM6B, 3번 염색체)에 각각 위치하게 하였다(도 1).
실시예 2. Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자의 발현되는 초파리 제작
본 발명자들은 Dynamin 3 유전자의 발현이 감소되면 베타아밀로이드의 세포독성에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 베타아밀로이드 유전자가 발현되고, 동시에 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되는 초파리를 제작하였다. Dynamin 3 유전자의 발현 억제는 초파리 생체 내(in vivo)에서 유전자 발현을 억제할 수 있는 RNAi 시스템이 사용되었다(Dietzl et al., 2007).
본 발명에서는 UAS 뒤에 Dynamin 3 RNAi를 연결하여 초파리 유전체에 삽입하였고, 실시예 1에서 제작된 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리와 교배하여, Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리를 제작하였다(도 2).
실시예 3. AP3D1 (Adapter Related Protein Complex 3 Subunit Delta 1) 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리 제작
본 발명자들은 AP3D1 유전자의 발현이 감소되면 베타아밀로이드의 세포독성에 영향을 주는지 알아보기 위하여, 베타아밀로이드 유전자가 발현되고, 동시에 AP3D1 유전자의 발현이 억제되는 초파리를 제작하였다. AP3D1 유전자의 발현 억제는 RNAi 시스템을 이용하였다(Dietzl et al., 2007).
본 발명에서는 UAS 뒤에 AP3D1 RNAi를 연결하여 초파리 유전체에 삽입하였고, 실시예 1에서 제작된 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리와 교배하여, AP3D1 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리를 제작하였다(도 3).
실시예 4. Dynamin 3 또는 AP3D1 유전자의 발현이 억제되고, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리에서 세포독성 결과
본 발명자들은 Dynamin 3 또는 AP3D1 유전자의 발현이 억제되면 베타아밀로이드에 의한 세포독성이 유발되는지 확인하기 위하여, 해부 현미경을 통해 초파리의 눈을 관찰하고 사진 촬영하였다.
그 결과, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리에서 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제된 경우(GMR-GAL4 UAS-β-amyloid UAS-Dynamin3RNAi)에는 정상 대조군(GMR-GAL4)에 비해 홑눈 세포의 파괴 현상이 현저히 증가되었고, 특히, 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제되지 않은 초파리(GMR-GAL4 UAS-β-amyloid) 또는 베타아밀로이드 유전자가 발현되지 않고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제된 초파리(GMR-GAL4 UAS-Dynamin3RNAi)에 비해 홑눈 세포의 파괴 현상이 더욱 증가하였음을 확인하였다.
또한, 베타아밀로이드 유전자가 발현되는 초파리에서 AP3D1 유전자의 발현이 억제된 경우(GMR-GAL4 UAS-β-amyloid UAS-AP3D1RNAi)에도 정상 대조군(GMR-GAL4), 베타아밀로이드 유전자가 발현되고 AP3D1 유전자의 발현이 억제되지 않은 초파리(GMR-GAL4 UAS-β-amyloid) 또는 베타아밀로이드 유전자가 발현되지 않고 AP3D1 유전자의 발현이 억제된 초파리(GMR-GAL4 UAS-AP3D1RNAi)에 비해 현저하게 홑분 세포의 파괴 현상이 증가하였음을 확인하였다.
따라서, 본 발명자들은 Dynamin 3 또는 AP3D1 유전자의 발현이 돌연변이 등으로 감소 또는 억제된 경우 베타아밀로이드에 의한 세포독성이 증가하는 것을 확인하였고, 이에 따라 상기 유전자 또는 단백질의 발현량에 의해 알츠하이머병의 발병 가능성을 예측 또는 진단할 수 있음을 확인하였다. 또한, 상기 유전자 또는 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있는 물질을 스크리닝하여 알츠하이머병의 치료 역시 가능할 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 베타아밀로이드 유전자가 과발현되고 Dynamin 3 유전자의 발현이 억제된 초파리; 또는
    베타아밀로이드 유전자가 과발현되고 AP3D1 유전자의 발현이 억제된 초파리;를 포함하는, 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델.
  2. 제1항에 있어서, 상기 베타아밀로이드 유전자 과발현은, Cy0 밸런서 염색체의 상동염색체인 2번 염색체에 위치시킨 GMR(glass multiple reporter) 프로모터와 연결된 GAL4 유전자를 통해 이루어지는 것인, 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델.
  3. 제2항에 있어서, 상기 GAL4는 TM6B 밸런서 염색체의 상동염색체인 3번 염색체에 위치한 UAS(upstream activation sequence)에 결합된 베타아밀로이드의 유전자(UAS-beta-amyloid)를 과발현시키는 것인, 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 Dynamin 3 유전자 발현의 억제 또는 AP3D1 유전자 발현의 억제는 RNA 간섭방법(RNAi)에 의하여 유전자의 발현이 억제된 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델은 표현형으로 홑눈 세포 파괴가 일어나는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델.
  6. (a) GMR(glass multiple reporter) 프로모터를 GAL4 유전자와 연결하고(GMR-GAL4) 초파리의 Cy0 밸런서 염색체의 상동염색체인 2번 염색체에 위치시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 초파리에 GAL4에 의해 TM6B 밸런서 염색체의 상동염색체인 3번 염색체에 위치한 UAS(upstream activation sequence)에 결합된 베타아밀로이드의 유전자(UAS-beta-amyloid)가 과발현되는 초파리를 제작하는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 초파리의 UAS에 Dynamin 3 RNAi 또는 AP3D1 RNAi 변이주 초파리와 교배하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 자손 중 GMR-GAL4 변이주와 Dynamin 3 RNAi 또는 AP3D1 RNAi를 동시에 갖는 초파리를 선별하는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계에서 초파리 홑눈의 표현형을 확인하는 단계를 포함하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델 제작 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (e)단계의 표현형은, 홑눈 세포의 파괴로 나타나는 것을 특징으로 하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델 제작 방법.
  8. 제1항의 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 동물 모델에, 시험물질을 처리하는 단계;
    상기시험물질이 처리된 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease) 초파리 동물 모델에서, 대조군과 비교하여 베타아밀로이드 유전자의 발현이 억제되고, Dynamin 3 또는 AP3D1 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하는 단계;를 포함하는 알츠하이머 치료제 스크리닝 방법.
  9. 삭제
  10. 제8 항에 있어서,
    상기 유전자의 발현량이 증가하는 것을 확인하는 단계는, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 또는 면역세포화학법(immunocytochemistry)에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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