CN113332383A - 一种高效提取铁皮石斛中生物碱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过酶解高效提取铁皮石斛中生物碱的方法,包括:将铁皮石斛清洗、干燥、切条,球磨粉碎;将粉碎后的铁皮石斛加水溶解,添加纤维素酶和半纤维素酶进行酶解;酶解后再加入氨肽酶和胰酶水解,灭酶、冷却、过滤;滤渣用乙醇和乙酸乙酯重复浸提、过滤,合并滤液,蒸干,即得到铁皮石斛生物碱。本发明通过采用机械和化学结合的球磨、多种酶的水解处理、乙醇和乙酸乙酯浸提的方法,有效地提高了铁皮石斛生物碱的提取率,且该方法的工艺简单,易于控制,便于实施,对铁皮石斛在食品和医药领域的开发具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及通过酶解高效提取铁皮石斛中生物碱的方法。
背景技术
铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科第二大属,为多年生草本植物,是石斛中的上品,具有很高的药用价值,具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抑菌、滋阴、降血糖等药用功效。对铁皮石斛的研究较早,东汉时期《神农本草经》中将其列为上品,唐开元年间又将其列为中华“九大仙草”之首,李时珍也在著作《本草纲目》中评价铁皮石斛“主治胃中虚热,发热自汗,痈疽排脓内塞”。铁皮石斛中活性成分多种多样,主要包括石斛多糖、生物碱、多酚、氨基酸、糖苷类、芪类及其衍生物以及多种挥发性成分。
生物碱是铁皮石斛中重要的活性成分之一,具有降血糖、抗白内障、减轻肝脏脂肪变性、改善胃肠道运动、抗炎、抗肿瘤等药理作用。铁皮石斛中生物碱的含量较低、约为0.02%。虽然铁皮石斛中生物碱含量较低,但就其中所含的特有生物碱成分而言,铁皮石斛的质量要好于其他石斛,如金钗石斛(陈晓梅,等,铁皮石斛与金钗石斛化学成分的比较,《中国医学科学院学报》,2006,28(4):524-529)。
目前,对于铁皮石斛生物碱的提取方法,如专利CN108164541A公开了石灰水处理、微波提取的方法,微波能耗高,设备贵,生物碱的提取率低。专利CN111196865A公开了纤维素酶水解,酸性乙醇提取、二氯甲烷萃取的方法,生物碱的提取率非常低,且二氯甲烷有一定的毒性。专利CN103566195A公开了闪提器中乙醇提取游离和结合生物碱的方法,步骤和操作繁琐、纯度较低。张利等人(铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的纤维素酶法提取研究,《化学研究与应用》,2011,23(3):356-359)利用纤维素酶酶解、90%乙醇浸提和氯仿萃取法制备石斛碱,也存在纯度低和使用有毒性溶剂氯仿的问题。
鉴于目前铁皮石斛生物碱提取方法在提取率、纯度和溶剂等方面存在的问题,需要提供一种高效提取铁皮石斛中生物碱的方法。
发明内容
针对现有技术铁皮石斛生物碱提取方法中存在的不足,本发明提供一种高效提取铁皮石斛中生物碱的方法,该方法包括如下步骤:
(1)将新鲜的原料铁皮石斛茎条,清洗干净、干燥,将干燥后的铁皮石斛切成短条;
(2)将切好的铁皮石斛短条与碱试剂混合,在球磨机中球磨至均匀,取出球磨后的粉末,粉末中加入水搅拌溶解;
(3)在步骤(2)所得的溶液中加入纤维素酶和半纤维素酶,进行酶解;
(4)在步骤(3)所得的酶解液中加入氨肽酶和胰酶,进行酶解,酶解结束后,灭酶、冷却、过滤;
(5)在步骤(4)所得的滤渣在加入乙醇和乙酸乙酯混合液,重复浸提、过滤,合并滤液、蒸干,获得生物碱。
进一步地,步骤(1)所述的干燥为将洗净的铁皮石斛置于75-90℃中干燥2-4h,干燥后切成1-2cm的短条。
进一步地,步骤(2)所述的碱试剂为碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或两种以上组合,铁皮石斛与碱试剂质量比为1:0.5-2。
进一步地,步骤(3)所述的纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.2-0.6,添加量为铁皮石斛质量的1-5%,反应条件为pH=4-7,温度为20-50℃,反应时间为1-5h。
进一步地,所述的纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.3,添加量为铁皮石斛质量的3%,反应条件为pH=5,温度为30℃,反应时间为2h。
进一步地,步骤(4)所述的氨肽酶和胰酶的质量比为1:1-5,添加量为铁皮石斛质量的0.5-2%,反应条件为pH=7-10,温度为20-50℃,反应时间为0.5-3h。
进一步地,所述的氨肽酶和胰酶的质量比为1:2,添加量为铁皮石斛质量的1%,反应条件为pH=8,温度为30℃,反应时间为1h。
进一步地,步骤(5)所述的乙醇和乙酸乙酯的体积比为1:0.1-0.3,重复浸提2-3次。
进一步地,该方法还包括从步骤(4)的滤液中提取铁皮石斛多糖。
与现有技术相比,本发明的有益效果体现在:
(1)本发明是基于机械粉碎和化学反应的球磨技术,在高能机械力的作用下,铁皮石斛细胞壁破裂,生物碱等活性物质释放出来,碱试剂也能够破坏细胞壁中的β-1,4-糖苷键,断开糖与蛋白质之间的结合键,部分多糖等杂质与碱性固相试剂形成复合物,提高多糖和蛋白的溶解度。
(2)进一步采用纤维素和半纤维素酶解,水解铁皮石斛中的多糖;氨肽酶和胰酶分别为蛋白内切酶和外切酶,水解大分子蛋白质,提高多糖和蛋白的溶解度。
(3)本发明浸提试剂选用乙醇和乙酸乙酯,不仅提高铁皮石斛生物碱的溶出率,还避免使用二氯甲烷和氯仿等有毒溶剂,是一种绿色的提取工艺。
(4)本发明的条件温和,操作简单,易于控制和实施,并且铁皮石斛生物碱的提取率和纯度较高。
附图说明
图1:铁皮石斛生物碱标准曲线。
具体实施方式
主要试剂和仪器
铁皮石斛:铁皮石斛野生植株采自云南绿春;
铁皮石斛生物碱标准品:成都格普特生物科技有限公司;
球磨机:湖南弗卡斯实验仪器有限公司,型号F-P400;
纤维素酶、半纤维素酶:北京鸿润宝顺科技有限公司,3000U/g;
胰酶、氨肽酶:夏胜(北京)生物科技开发有限公司;
紫外可见分光光度计756PC:上海仪天科学仪器有限公司;
氢氧化钠、碳酸钙:西安天正药用辅料有限公司;
乙醇、乙酸乙酯、氯仿:上海安谱实验科技股份有限公司;
其他试剂和仪器均为常规国产种类和型号。
实施例1
将新鲜的原料铁皮石斛茎条100g,清洗干净、干燥,置于90℃中干燥2h,干燥后切成2cm的短条。将切好的铁皮石斛短条与氢氧化钠质量比1:0.5混合,在球磨机中球磨至均匀,球磨后的粉末中加入水搅拌溶解,溶液中加入重量比1:0.3的纤维素酶和半纤维素酶,添加量为铁皮石斛质量的3%,在pH=5、30℃下反应为2h。然后调节pH=8,添加重量比1:2的氨肽酶和胰酶,添加量为铁皮石斛质量的1%,在30℃下反应1h。酶解结束后,灭酶、冷却、过滤。所得的滤渣用90%乙醇和10%乙酸乙酯的混合液,重复浸提、过滤三次,合并滤液、蒸干,获得生物碱,称重。
实施例2
将新鲜的原料铁皮石斛茎条100g,清洗干净、干燥,置于85℃中干燥2h,干燥后切成2cm的短条。将切好的铁皮石斛短条与碳酸钙质量比1:1混合,在球磨机中球磨至均匀,球磨后的粉末中加入水搅拌溶解,溶液中加入重量比1:0.6的纤维素酶和半纤维素酶,添加量为铁皮石斛质量的5%,在pH=5、35℃下反应为1.5h。然后调节pH=9,添加重量比1:5的氨肽酶和胰酶,添加量为铁皮石斛质量的1.5%,在35℃下反应1.5h。酶解结束后,灭酶、冷却、过滤。所得的滤渣用80%乙醇和20%乙酸乙酯的混合液,重复浸提、过滤三次,合并滤液、蒸干,获得生物碱,称重。
对比例1
提取方法参照实施例1,浸提溶剂为90%的乙醇水溶液,重复浸提、过滤三次,合并滤液、蒸干,获得生物碱,称重。
对比例2
参照专利CN108164541A的方法,取铁皮石斛100g,粉碎,按料液比为1:12向铁皮石斛中加入水,用饱和石灰水调节pH=9,在功率为310W下微波提取3次,每次提取18min,提取液合并、过滤,滤液分两次进行浓缩,加入3倍量乙醇,在1-4℃下放置11h,过滤,沉淀用乙醇洗涤3-4次,干燥至恒重,即得生物碱,称重。
对比例3
参照张利等人(铁皮石斛中石斛多糖与石斛碱的纤维素酶法提取研究)的方法,干燥的铁皮石斛100g,经粉碎后过80目筛,用石油醚脱脂。脱脂后的铁皮石斛加入温水,加入0.5%的纤维素酶液,在pH=5.0、50℃下酶解1.5h后立即升温至90℃灭酶,迅速冷却过滤。滤渣加入90%乙醇浸提0.5h,过滤,滤渣再加入90%乙醇浸提0.5h,过滤。合并二次过滤滤液,回收乙醇,剩余液中加入氯仿,萃取石斛碱,回收氯仿得生物碱,称重。
表1不同方法制备的生物碱质量及提取率
组别 | 生物碱(mg) | 提取率(mg/g,%) |
实施例1 | 18.3 | 18.3 |
实施例2 | 17.7 | 17.7 |
对比例1 | 14.2 | 14.2 |
对比例2 | 10.6 | 10.6 |
对比例3 | 12.3 | 12.3 |
从表1中可以看出,采用本发明的提取方法,提取生物碱的总量明显高于对比例2-3,并且采用乙醇和乙酸乙酯的混合液浸提生物碱也优于仅采用乙醇浸提。
实施例3
采用酸性染料比色法测定生物碱的纯度。称取生物碱标准品1mg,用氯仿溶解后,用容量瓶定容至100mL,配制成10μg/mL的生物碱标准品溶液。分别取标准品溶液1、2、4、6、8mL,用氯仿稀释至10mL。依次加入pH=4.5的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5mL及0.04%溴甲酚绿溶液1mL,漩涡震荡3min,室温静置30min。将氯仿层用氯仿浸泡过的脱脂棉过滤,取滤液5mL,加入1mL的0.01mol/L氢氧化钠无水乙醇溶液,混合摇匀。用分光光度计在650nm下测定其吸光度,生物碱浓度X,吸光度值Y,根据测定数据绘制铁皮石斛生物碱标准曲线(图1),获得标准曲线方程Y=0.1028X-0.009,R2=0.995。
表2标准品生物碱浓度与吸光度值关系
分别取上述方法制备的生物碱1mg,氯仿溶解、定容至100mL,取5mL、用氯仿稀释至10mL,如上方法依次加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液和溴甲酚绿溶液,漩涡震荡、室温静置。氯仿层用氯仿浸泡过的脱脂棉过滤,滤液加氢氧化钠无水乙醇溶液混合摇匀。在650nm下用分光光度计测定吸光度,计算生物碱的浓度和纯度。
表3不同方法制备的生物碱的纯度
从表2中可以看出,采用本发明的提取方法,提取生物碱的纯度明显高于对比例2-3,同样采用乙醇和乙酸乙酯的混合液浸提生物碱的纯度也优于仅采用乙醇浸提。
Claims (9)
1.一种高效提取铁皮石斛中生物碱的方法,该方法包括如下步骤:
(1)将新鲜的原料铁皮石斛茎条,清洗干净、干燥,将干燥后的铁皮石斛切成短条;
(2)将切好的铁皮石斛短条与碱试剂混合,在球磨机中球磨至均匀,取出球磨后的粉末,粉末中加入水搅拌溶解;
(3)在步骤(2)所得的溶液中加入纤维素酶和半纤维素酶,进行酶解;
(4)在步骤(3)所得的酶解液中加入氨肽酶和胰酶,进行酶解,酶解结束后,灭酶、冷却、过滤;
(5)步骤(4)所得的滤渣在加入乙醇和乙酸乙酯混合液,重复浸提、过滤,合并滤液、蒸干,获得生物碱。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述的干燥为将洗净的铁皮石斛置于75-90℃中干燥2-4h,干燥后切成1-2cm的短条。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述的碱试剂为碳酸钙、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或两种以上组合,优选为氢氧化钠,铁皮石斛与碱试剂质量比为1:0.5-2。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(3)所述的纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.2-0.6,添加量为铁皮石斛质量的1-5%,反应条件为pH=4-7,温度为20-50℃,反应时间为1-5h。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述的纤维素酶和半纤维素酶的质量比为1:0.3,添加量为铁皮石斛质量的1-3%,优选为3%,反应条件为pH=5,温度为30℃,反应时间为2h。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(4)所述的氨肽酶和胰酶的质量比为1:1-5,添加量为铁皮石斛质量的0.5-2%,优选为1-2%,反应条件为pH=7-10,温度为20-50℃,反应时间为0.5-3h。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述的氨肽酶和胰酶的质量比为1:2,添加量为铁皮石斛质量的1%,反应条件为pH=8,温度为30℃,反应时间为1h。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(5)所述的乙醇和乙酸乙酯的体积比为1:0.1-0.3,重复浸提2-3次。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,进一步包括从步骤(4)的滤液中提取铁皮石斛多糖。
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