CN113330020A - 用于治疗神经变性疾病的2-氟代的胆汁酸 - Google Patents

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Abstract

通式(I)的2‑氟代的胆汁酸化合物，其中R1和R2至少一个代表F，另一个选自H或F，且其中R3如本文所定义；其具有治疗和预防神经变性疾病、包括阿尔茨海默病和帕金森病的用途。

Description

用于治疗神经变性疾病的2-氟代的胆汁酸
本发明涉及具有治疗神经变性疾病的用途的新化合物。特别地，本发明涉及胆汁酸衍生物、包含它们的药物组合物、其制备方法和所述化合物在治疗或预防神经变性疾病中的用途。
神经变性疾病为一组中枢神经系统疾病，并且包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)。神经变性疾病的发生率随年龄而增加，因此这类病症是人群平均年龄增长的社会中逐步增长的问题。目前，尽管存在一些可利用的缓解帕金森病和一些类型的认知障碍和痴呆的症状的药物，但是没有治愈这些疾病的任一种的疗法。
帕金森病的症状是静止性震颤、运动迟缓和僵硬，且这些症状是由神经变性和多巴胺能神经元损失引起的。有大量证据启示线粒体功能障碍与帕金森病之间存在很强的关联性。在帕金森病患者的组织中发现线粒体电子传递链NADH脱氢酶(复合物I)活性轻度缺乏，且许多与帕金森病家族性形式相关的蛋白质为线粒体蛋白质或者与线粒体相关。
阿尔茨海默病导致进行性认知障碍，其特征在于存在细胞外神经炎的斑块和细胞内神经原纤维缠结。认为线粒体功能障碍导致作为神经炎斑块主要成分的β-淀粉样蛋白沉积并形成神经原纤维缠结。
亨廷顿病是一种遗传性进行性神经变性疾病，并且以运动障碍、人格改变和认知能力下降为特征。亨廷顿病的病理学提供了与线粒体功能障碍有关的证据。
肌萎缩性侧索硬化也被认为与线粒体功能障碍有关。这种疾病以中枢神经系统中的运动神经元为目标，导致肌无力、萎缩，并在诊断后2-3年内死亡。
已经尝试寻找能够治疗神经变性疾病的化合物，并且已经开发了几种靶向于线粒体的化合物。例如，众所周知，胆汁酸例如UDCA(熊去氧胆酸)对来自某些患有帕金森病的患者的组织中的线粒体功能障碍发挥有益作用，特别是在parkin突变体帕金森病患者的组织中(Mortiboys等人“Ursocholanic acid rescues mitochondrial function in commonforms of familial Parkinson’s disease”,Brain,136(10),3038-3050(2013))和LRRK2G2019S mutant Parkinson’s disease patients(Mortiboys等人Neurology,85,846-852(2015))。此外，还知晓胆汁酸例如UDCA对来自由于PSEN1突变而患有散发性阿尔茨海默病和家族性阿尔茨海默病的患者的成纤维细胞发挥有益作用(Bell等人“UrsodeoxycholicAcid Improves Mitochondrial Function and Redistributes Drp1 in Fibroblastsfrom Patients with either Sporadic or Familial Alzheimer's Disease.”Journalof Molecular Biology,pii:S0022-2836(18)30987-2.2018)。
WO 2014/036379、WO 2015/061421和WO 2016/145216教导，胆汁酸可具有治疗神经变性疾病例如帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化的用途。WO 2015/061421涉及氘代胆汁酸，且WO 2016/145216涉及氟代胆汁酸，特别是在3-和/或7-位氟代的胆汁酸。
发明人目前已经发现，某些氟代的胆汁酸具有优良的线粒体拯救特性并且在治疗神经变性疾病中特别有效。
在本发明中，提供了通式(I)的化合物：
Figure BDA0003125029820000021
其中
R1和R2之一为F，而R1和R2的另一个为H或F；
Y为价键或C1-20亚烷基、C2-20亚烯基或C2-20亚炔基连接基；
R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13,S(O)2R12、OS(O)2R12、S(O)2OR12、OS(O)2OR12,S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、OP(O)(OR12)2、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16；
R12各自独立地为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、OR10、NR10R11、R16和芳基；
R10和R11各自独立地为H或C1-6烷基；
R13为H、任选地被一个或多个选自卤素和芳基的取代基取代的C1-6烷基；或3-至8-元碳环或杂环，其中所述碳环或杂环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自＝O和R16；或苯基或5-或6-元杂芳基环，其中所述苯基或杂芳基环任选地被取代基R16取代；或
当R3为C(O)NR12R13或S(O)2NR12R13时，R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成3-至8-元杂环，其任选地包含一个或多个另外的选自N、O和S的杂原子；且任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自CH2C(O)OH、C(O)OH、C1-6烷基、C(O)OC1-6烷基、S(O)2OH、＝O和＝N-OH；并且任选地与苯基稠合，所述苯基未被取代或被一个或多个选自卤素和硝基的取代基取代；
n为1、2或3；
R15各自独立地为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、苯基和5-或6-元杂芳基；3-至8-元环烷基；或基团R14，其中R14为氨基酸侧链；或
当n为2或3时，两个R15基团与它们所连接的碳原子和任选地其中存在的居间碳原子一起可以合并形成-(CH2)p-，使得基团[CH(R15)]n为3-至8-元碳环；
p为1、2、3、4、5或6；
R16选自C(O)OH、S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)、OS(O)2OH和P(O)(OH)2；
或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。
通式(I)的化合物具有治疗中枢神经系统的神经变性疾病的用途，包括帕金森病、痴呆和肌萎缩性侧索硬化。
发明详述
在本说明书中，除非上下文因表达语言或必要的暗示而另有要求，否则措词“包含”或变化形式例如“含有”或“包括”用于包含性意义，即指定存在所述特征，但不排除本发明的各种实施方案中存在或添加另外的特征。
在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均通过引用并入本文，就如同各个单独的出版物被具体地和单独地指示为通过引用作为完全举出的方式并入本文一样。
在本申请中，术语“C1-20”烷基是指具有1-20个碳原子的直链或支链完全饱和烃基。该术语包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。其他烷基例如C1-12烷基、C1-10烷基、C1-8烷基、C1-6烷基、C1-5烷基、C1-4烷基、C1-3烷基或C1-2烷基如上文所定义，但包含不同数量的碳原子。
术语“C2-20烯基”是指具有2-20个碳原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃基。烯基实例包括-CH＝CH2、-CH＝CH(CH3)、-CH2CH＝CH2、-CH＝CHCH3、-CH2CH2CH＝CH2、-CH2CH＝CH(CH3)-和-CH2CH＝CH(CH2CH3)。其他烯基例如C2-12烯基、C2-10烯基、C2-8烯基、C2-6烯基、C2-5烯基、C2-4烯基或C2-3烯基如上文所定义，但包含不同数量的碳原子。
术语“C2-20炔基”是指具有2-20个碳原子和至少一个碳-碳叁键的直链或支链烃基。炔基的实例包括-C≡CH、-CH2C≡CH、-C≡C-CH3、-CH2CH2C≡CH、-CH2C≡CCH3和-CH2C≡C-CH2CH3。其他炔基例如C2-12炔基、C2-10炔基、C2-8炔基、C2-6炔基、C2-5炔基、C2-4炔基或C2-3炔基如上文所定义，但包含不同数量的碳原子。
术语“亚烷基”是指直链或支链完全饱和烃基链。适合地，亚烷基为C1-20亚烷基、C1-12亚烷基、C1-10亚烷基、C1-8亚烷基、C1-6亚烷基、C1-5亚烷基、C1-4亚烷基、C1-3亚烷基或C1-2亚烷基。亚烷基的实例包括-CH2-、-CH2CH2-、-CH(CH3)-CH2-、-CH2CH(CH3)-、-CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH2CH3)-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
术语“亚烯基”是指包含至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。适合地，亚烯基为C2-20亚烯基、C2-12亚烯基、C2-10亚烯基、C2-8亚烯基、C2-6亚烯基、C2-5亚烯基、C2-4亚烯基或C2-3亚烯基。亚烯基的实例包括-CH＝CH-、-CH＝C(CH3)-、-CH2CH＝CH-、-CH＝CHCH2-、-CH2CH2CH＝CH-、-CH2CH＝C(CH3)-和-CH2CH＝C(CH2CH3)-。
术语“亚炔基”是指包含至少一个碳-碳叁键的直链或支链烃链。适合地，亚炔基为C2-20亚炔基、C2-12亚炔基、C2-10亚炔基、C2-8亚炔基、C2-6亚炔基、C2-5亚炔基、C2-4亚炔基或C2-3亚炔基。亚炔基的实例包括-C≡C-、-CH2C≡C-、-C≡C-CH2-、-CH2CH2C≡C-、-CH2C≡CCH2-和-CH2C≡C-CH2CH2-。
术语“芳基”和“芳族基团”是指具有6-14个环碳原子(另有指定的除外，例如6-10个环碳原子)且包含至多3个环的具有芳族属性的环状基团。如果芳基包含一个以上的环，则并非所有环必须在属性上为芳族的。实例包括苯基、萘基和蒽基以及部分饱和系统，例如四氢萘基(例如1,2,3,4-四氢萘基)、茚满基和茚基。
术语“杂芳基”和“杂芳族基团”是指具有5-14个环原子(另有指定的除外，例如5-10个环原子)的包含至少一个选自N、O和S的杂原子并且包含至多3个环的具有芳族属性的环状基团。如果杂芳基包含一个以上的环，则并非所有环必须在属性上为芳族的。实例包括吡啶、嘧啶、吡咯、噻吩、呋喃、噻唑、噁唑、稠合系统例如吲哚、苯并咪唑和苯并噻吩；和部分饱和的系统，例如二氢吲哚和二氢苯并呋喃。
术语“碳环”和“碳环基”是指具有3-10个环碳原子的非芳族烃环系(另有指定的除外)，其可以为稠合或桥连环系，并且任选地包含一个或多个碳-碳双键。实例包括环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基；和环烯基，例如环己烯基和环庚烯基；和桥连基团，例如金刚烷基。更适合地，碳环基为单环完全饱和的(环烷基)环。
术语“杂环”和“杂环基”是指具有3-10个环碳原子(另有指定的除外)和至少一个选自N、O和S的杂原子的非芳族环系，其可以为稠合或桥连的环系，并且可以为完全饱和的或可以包含一个或多个碳-碳或碳-氮双键。实例包括哌啶基、吗啉基、硫吗啉基、噻唑烷基(thiozolidinyl)、四氢噻吩基和四氢噻喃基。更适合地，杂环基为单环完全饱和的环。
术语“卤素”是指氟、氯、溴或碘，且术语“卤代”是指氟代、氯代、溴代或碘代基团。
术语“C1-6卤代烷基”是指具有1-6个碳原子并且被一个或多个卤原子取代、直到被全卤代的如上文所定义的直链或支链烷基。实例包括三氟甲基、氯乙基和1,1-二氟乙基。其他卤代烷基，例如C1-5卤代烷基、C1-4卤代烷基、C1-3卤代烷基或C1-2卤代烷基如上文所定义，但包含不同数量的碳原子。
术语“氨基酸侧链”是指天然存在的氨基酸的侧链，其可以为D-氨基酸或L-氨基酸，但更适合地为D-氨基酸。天然存在的氨基酸的实例包括甘氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、精氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。
术语“侧链”是指-Y-R3部分。在UDCA中，-YR3为-CH2CH2-C(O)OH，并且提到的变体侧链是指除它之外的-YR3部分。
涉及的取代基“＝O”是指通过双键连接至相邻原子的氧原子，所述相邻原子适合地为碳或硫原子并且可以为环原子。包括“＝O”取代基的基团实例包括-C(O)-、-S(O)-和-S(O)2-。
通式(I)化合物的适合的药学上可接受的盐包括碱加成盐，例如钠、钾、钙、铝、锌、镁和其他金属盐，以及胆碱、二乙醇胺、乙醇胺、乙二胺、葡甲胺和其他众所周知的碱加成盐，如Paulekuhn等人J.Med.Chem.2007,50,6665-6672所概括的(通过引用并入本文)和/或本领域技术人员公知的。
术语“同位素变体”是指同位素标记的化合物，其与式(I)中所述的化合物相同、但实际上一个或多个原子被原子质量或质量数不同于自然界中最常见的原子质量或质量数的原子替代，或者其中具有在自然界中不太常见的原子质量或质量数的原子的比例已经增加(后一个概念称作“同位素富集”)。可掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、氟、碘和氯的同位素，例如2H(氘)、3H、11C、13C、14C、18F、123I或125I(例如3H、11C、14C、18F、123I或125I)，其可以是天然存在的或非天然存在的同位素。
在一些情况中，通式(I)的化合物可以为式(I’)的化合物：
Figure BDA0003125029820000071
其中
R1和R2之一为F，而R1和R2的另一个为H或F；
Y为价键或C1-20亚烷基、C2-20亚烯基或C2-20亚炔基连接基；
R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13、S(O)2R12、OS(O)2R12,S(O)2OR12、OS(O)2OR12、S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、OP(O)(OR12)2、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16
R12各自独立地为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基；
R13为H、任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基或任选地被取代基R16取代的5-或6-元碳环；或
R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成5-或6-元杂环，所述杂环任选地包含另一个氮原子，任选地被一个或多个选自CH2C(O)OH、C(O)OH、S(O)2OH、＝O或＝N-OH的取代基取代，且任选地与苯基稠合，所述苯基为未取代的或被一个或多个选自卤素和硝基的取代基取代；
R15各自独立地为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基、或基团R14，其中R14为氨基酸侧链；
n为1、2或3；
R16选自C(O)OH、S(O)2OH、OS(O)2OH和P(O)(OH)2；
或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。
通式(I)的化合物可以为通式(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物：
Figure BDA0003125029820000081
其中R1、R2、Y和R3如上述对通式(I)所定义。
本发明的一些特别适合的化合物为通式(IA)的化合物。
本发明的其他适合的化合物为通式(IB)的化合物。
本发明的其他适合的化合物为通式(IC)的化合物。
本发明的其他适合的化合物为通式(ID)的化合物。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，R1和R2均为F。
在其他适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R1为F且R2为H。
在其他适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R1为H和R2为F。
其中R1和R2均为F的化合物是特别适合的。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，Y适合地为价键或C1-15亚烷基连接基或C2-15亚烯基连接基。更适合地，Y为价键或C1-12、C1-10、C1-8、C1-6、C1-4、C1-3或C1-2亚烷基连接基或C2-12、C2-10、C2-8、C2-6、C2-4、C2-3或C2亚烯基连接基，并且是未取代的或被OH基团取代。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，Y为价键或C1-3亚烷基或C2-3亚烯基连接基。适合地，Y为C1-3亚烷基或C2-3亚烯基。
更适合地，Y为价键或C1-3亚烷基连接基。仍然更适合地，Y为C1-3亚烷基连接基。
特别适合的连接基Y的实例包括价键、-CH2-、-CH2CH2-、-CH(OH)-CH2-、-CH＝CH-或–CH＝C(CH3)-，特别是价键、-CH2-、-CH2CH2-、–CH＝CH-或-CH＝C(CH3)-，尤其是-CH2-、-CH2CH2-、–CH＝CH-或-CH＝C(CH3)-，且尤其是-CH2CH2-。
如上所述，在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13、S(O)2R12、OS(O)2R12、S(O)2OR12、OS(O)2OR12、S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、OP(O)(OR12)2、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16。
在一些情况下，在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R3更适合地为C(O)OR12、OS(O)2R12、OS(O)2OR12,S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NR12C(O)NR12S(O)2R13或C(O)NR12[CH(R15)]nR16；其中R12、R13、R15、n和R16如上文所定义。
在此情况下，更适合的化合物为此类化合物，其中R3为C(O)OR12、C(O)NR12CH(R14)C(O)OH或C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH，其中R12和R14如上文所定义，且R15为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基。
在另外的更适合的化合物中，R3为C(O)OR12、(C(O)N(R12)(R13)或C(O)NR12[CH(R15)]nR16；其中R12、R13、R15、R16和n如上文所定义。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R12适合地为H、未被取代或如上所述被取代的C1-6烷基，更适合地为H、苄基或任选被R16或N(R10)(R11)取代的C1-4烷基，尤其是H或甲基或乙基，其任选被R16或N(R10)(R11)取代。
在一些化合物中，其中R3为C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16，R12更适合地为H、甲基或乙基，尤其是H或甲基。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R13当存在时适合地为5-或6-元碳环基或杂环基，其任选地被R16或＝O取代，其中＝O取代基可连接至环C或S原子；或任选地被R16取代的苯基。
或者，在一些适合的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，其中R3为C(O)NR12R13或S(O)2NR12R13，R12和R13与它们所连接的氮原子一起可以形成5-或6-元杂环，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自R16和＝O，并且任选地包含一个或多个选自O、N和S的另外的杂原子。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R16在存在时更适合地为C(O)OH、S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)或OS(O)2OH，尤其是C(O)OH或S(O)2OH。
当R16为C(O)OH、S(O)2OH、OS(O)2OH或P(O)(OH)2时，通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物可以为盐形式。适合的盐如上所述，但金属盐特别适合，例如钠和钾盐，尤其是钠盐。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的一些适合的化合物中，R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13或C(O)NR12[CH(R15)]nR16，其中：
当R3为C(O)OR12时，R12各自独立地为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、OR10、NR10R11、R16和芳基；
R10和R11各自独立地为H或C1-6烷基；或
当R3为C(O)NR12R13时：
R12各自为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、OR10和NR10R11；
R10和R11各自独立地为H或C1-6烷基；且
R13为1,1-四氢噻喃二氧化物或1,1-四氢噻吩二氧化物；或
R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成5-或6-元环，其包含SO2部分或被C(O)OH取代；或
当R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16时，R12为H或甲基，R15为H，且
R16为C(O)OH，且n为1；或
R16为S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)或OS(O)2OH；且n为2或3；
或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。
在一些特别适合的式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，R3为C(O)OR12。
适合地，在这些化合物中，R12为H或甲基或乙基，其任选地被R16取代，且更适合地，R12为H、CH2R16或-CH2CH2R16，其中R16如上文所定义，但尤其是S(O)2OH。更适合地，R12为H。
这类特别适合的化合物是如上所述的其中R3为C(O)OH的化合物及其盐，例如金属盐，例如钠和钾盐，尤其是钠盐。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物中，其中R3为C(O)OR12，且R12为H或被R16取代的C1-6烷基(例如甲基或乙基)，其中R16为C(O)OH、S(O)2OH、OS(O)2OH或P(O)(OH)2，该化合物可以为盐的形式。适合的的盐如上所述，但金属盐特别适合，例如钠和钾盐，尤其是钠盐。
在如上所述的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的另外的特别适合的化合物及其盐中，R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16，例如为金属盐，例如钠和钾盐，尤其是钠盐。
在这类化合物中，R12更适合地为H、甲基或被R16取代的甲基，例如-CH2C(O)OH。在一些这类化合物中，R12为H；在另外的这类化合物中，R12为甲基；在仍然这类另外的化合物中，R12为-CH2R16。在这种情况下，R15适合地为H，且n适合地为1，使得R3为C(O)N(CH2R16)2，且两个R16基团可以相同或不同，但更适合地是相同，并且例如为C(O)OH。
当R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16时，其可以为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH或C(O)NR12[CH(R15)]nR16，其中R12为H或C1-6烷基，更适合地为H或C1-3烷基，尤其是H或甲基；n为2或3；R15各自为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基，更适合地，H或C1-6烷基，且仍然更适合地为H；且R16为S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)或OS(O)2OH，尤其是S(O)2OH、S(O)2(甲基)或OS(O)2OH，尤其是S(O)2OH。
当R3为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH时，R14尤其为氨基酸侧链，所述氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸，即R14为H、CH3、CH(CH3)2或CH(CH3)(C2H5)。更适合地，R14为H。特别适合的R12部分如上文所定义。当R12为H且R14为H时，R3为甘氨酸偶联物；且当R12为甲基且R14为H时，R3为N-甲基甘氨酸偶联物。更适合地，R12为H，且R3为甘氨酸偶联物。
当R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16时，其可以为基团C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH，其中R14为氨基酸侧链，且R15为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基。该化合物可以为如上所述的盐形式，例如金属盐，例如钠和钾盐，尤其是钠盐。
当R3为C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH时，R15各自适合地为H或C1-6烷基。更适合地，R15基团都是H。特别适合的R12基团如上文所定义，但在特别适合的化合物中，R12为H或甲基。当R12为H且R15基团都是H时，R3为牛磺酸偶联物。当R12为甲基且R15部分均为H时，R3为N-甲基牛磺酸偶联物。
在一些适合的化合物中，其中R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16，R15各自独立地为H或如上所述任选地被取代的C1-4烷基。更适合地，R15为H或未取代的C1-4烷基，仍然更适合地为H、甲基或乙基，且尤其是H。
或者，在其中R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16且n为2或3的化合物中，两个R15基团可以与它们所连接的碳原子以及任选地存在的居间碳原子合并形成如上所述的碳环。更适合地，两个R15基团位于相邻碳原子上。由此形成的碳环适合地为5-至7元环，例如6-元环。
在通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的另外的特别适合的化合物中，R3为C(O)NR12R13。
在这类的一些适合的化合物中，R12为H或C1-4烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，例如单一取代基，选自R16和NR10R11，其中R16、R10和R11如上文所定义。R10和R11可以相同或不同，且更适合地选自H和C1-4烷基，尤其是C1-3烷基。更适合的R16基团如上文所定义。
在特别适合的化合物中，其中R3为C(O)NR12R13，R12为H或被单一R16取代基取代的C1-3烷基。更适合的R16基团如上文所定义，且该化合物可以以如上所述的盐的形式存在，例如金属盐，例如钠盐或钾盐，尤其是钠盐。
当R3为C(O)NR12R13时，R13适合地为苯基或5-至7-元环烷基或杂环基，其中的任何基团可以任选地被单一R16取代基取代，且其中环烷基和杂环基可以被一个或多个＝O取代基取代。
更适合地，环烷基为未取代的环戊基、环己基或环庚基。
更适合地，杂环基为5-或6-元含硫基团，例如四氢噻吩和四氢噻喃或其氧化物，例如1,1-二氧代四氢噻吩和1,1-二氧代四氢吡喃。
在其中R3为C(O)NR12R13的其他适合的化合物中，R12各自为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、OR10和NR10R11；
R10和R11各自独立地为H或C1-6烷基；且
R13为1,1-四氢噻喃二氧化物或1,1-四氢噻吩二氧化物；或
R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成5-或6-元环，所述环包含SO2部分或被C(O)OH取代。
在这些化合物中，R12更适合地为H，且R13为1,1-四氢噻喃二氧化物环。或者，R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成包含SO2部分的6-元环，尤其是硫吗啉二氧化物或被C(O)OH取代的哌啶。
特别优选的R3基团包括C(O)OH、C(O)NHCH2C(O)OH、C(O)N(CH3)CH2C(O)OH、C(O)NHCH2CH2S(O)2OH和C(O)N(CH3)CH2CH2S(O)2OH，尤其是C(O)OH、C(O)NHCH2C(O)OH、C(O)NHCH2CH2S(O)2OH和C(O)N(CH3)CH2CH2S(O)2OH。
在一个实施方案中，式(I)的化合物选自：
2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)；
2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)；
2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)；
2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)；
2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)；
2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)；
2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)；
2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)；
2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙基磺酸(化合物10)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸(化合物11)；
N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸(化合物12)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸(化合物13)；
1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸(化合物14)；
3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸(化合物15)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉(化合物16)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸(化合物17)
N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸(化合物18)；
N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)乙磺酸(化合物19)；
3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸(化合物20)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸(化合物21)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸(化合物22)；
O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙基磺酸(化合物23)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸(化合物24)；
N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸(化合物25)；
N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸(化合物26)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜(化合物27)；
N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物28)；
N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物29)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物(化合物30)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺(化合物31)；和
其药学上可接受的盐(在适宜时)，尤其是金属盐，例如钠或钾盐，特别是钠盐或(对于化合物18而言的)二钠盐。
制备式(I)的化合物的方法如下所述。这些方法构成本发明的另一个方面。
通式(IB)和(IC)的化合物，其中R1为F且R3为C(O)OR12a，其中R12a为任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基，可以由通式(II)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000151
其中Y和R3如通式(I)所定义；R12a为任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基；且R21为OH保护基，其为酸不稳定的；
通过如以下通用方法L中所述用酸处理来进行，所述酸例如盐酸。
适合的酸不稳定的保护基R21包括烷基醚，例如甲氧基甲基。
通式(II)的化合物可以作为通式(IIB)和(IIC)的异构体混合物形成：
Figure BDA0003125029820000152
其中Y和R3如通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义；
通过还原通式(III)的化合物来进行：
Figure BDA0003125029820000153
其中Y和R3如通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义。
从如上所述的通式(IIB)和(IIC)的化合物中除去保护基R21分别得到通式(IB)和(IC)的化合物。
用于还原通式(III)化合物的适合的还原剂包括氢化物，例如硼氢化钠。还原可以在有机溶剂例如四氢呋喃中，在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。
通式(III)的化合物可以由通式(IV)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000161
其中Y和R3如通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；且R22为OH保护基；
通过使用试剂例如
Figure BDA0003125029820000162
(1-氯甲基-4-氟-1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷二(四氟硼酸盐)氟化来进行，其具有如下结构：
Figure BDA0003125029820000163
当使用
Figure BDA0003125029820000164
时，反应适合地在15-25℃，通常在室温的温度下，在极性有机溶剂例如乙腈中进行。
适合的保护基R22包括甲硅烷基保护基Si(R23)3，其中R23各自独立地为C1-6烷基或苯基。
R22基团的实例包括三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基(TES)、三苯基甲硅烷基(TPS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔己基(thexyl)二甲基甲硅烷基(TDS)、叔丁基二苯基甲硅烷基(TBDPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS或TBS)、二叔丁基甲基甲硅烷基(DTBMS)、二乙基异丙基甲硅烷基(DEIPS)和二甲基异丙基甲硅烷基(DMIPS)，特别是TMS、TES、TIPS、TBDMS和TBDPS。
通式(IV)的化合物可以由通式(V)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000171
其中Y和R3如通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；
通过与通式(VI)的化合物反应来进行：
(R23)3Si-OR24 (VI)
其中R23各自独立地如上文所定义，且R24为离去基团，例如三氟甲磺酸酯(三氟甲磺酸酯)、甲苯磺酰基(甲苯磺酰基)或甲磺酰基(甲磺酰基)。
该反应适合地在碱性条件下，例如在弱碱例如三乙胺存在下，在约15-25℃的温度下，适合地在室温下进行。
通式(V)的化合物可以由鹅去氧胆酸制备，其通过与醇R12aOH反应而酯化羧酸来进行，例如如以下通用方法A中所述，然后通过与通式(VII)的化合物反应保护7-OH基团：
R21-X (VII)
其中R21如对通式(II)所定义，且X为离去基团，典型地为卤素，例如氯；例如如以下通用方法K中所述。此后可以如以下通用方法M中所述氧化3-OH基团。
通式(I)的化合物，其中R2为F且Y为C(O)OR12a，其中R12a如上文所定义，可以如下所述制备。
通式(IA)和(IC)的化合物，其中R2为F且R3为C(O)OR12a，可以通过还原通式(XIIa)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000181
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a如对通式(II)所定义。
适合地，还原使用氢化物、例如硼氢化钠在氯化铈(III)存在下进行。该反应适合地在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。
得到的产物为通式(IA)和通式(IC)的化合物的混合物，可通过常规方法，例如通过色谱法分离它们。
通式(XIIa)的化合物也可以用于制备通式(IB)和(ID)的化合物，其中R2为F且R3为C(O)OR12a。在这种情况下，通式(XIIa)的化合物可以与通式(XIII)的羧酸在三苯膦和偶氮二甲酸二乙酯(DEAD)存在下，在Mitsunobu型反应中反应：
R25-C(O)OH (XIII)
其中R25为C1-6烷基或苄基，但更适合地为苄基；
得到通式(XIV)的化合物：
Figure BDA0003125029820000182
其中Y如通式(I)所定义；R12a如通式(II)所定义且R25如通式(XIII)所定义。
通式(XIV)的化合物可以使用弱碱水解，例如碳酸钾，得到通式(XIIb)的化合物：
Figure BDA0003125029820000191
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a如对通式(II)所定义。
然后可以使用上述用于还原通式(XIIa)的化合物的条件还原通式(XIIb)的化合物，得到通式(IB)和通式(ID)的化合物的混合物。
通式(XIIa)的化合物可以由通式(XIV)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000192
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a如对通式(II)所定义；
通过与氟化氢吡啶(HF.吡啶)反应来进行。
适合地，该反应在无水有机溶剂例如二氯甲烷(DCM)中进行。
通式(XIV)的化合物可以通过使通式(XV)的化合物环氧化来制备：
Figure BDA0003125029820000193
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a如对通式(II)所定义。
适合的氧化剂为间-氯过苯甲酸(mCPBA)，该反应可在有机溶剂例如DCM中并且在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。
通式(XV)的化合物可以通过消除反应由通式(XVI)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000201
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a如对通式(II)所定义。
三氟甲磺酸酐(三氟甲磺酸酐)为适合的活化的离去基团的实例，其可以与碱例如二甲基氨基吡啶(DMAP)联用。该反应可以在约5-20℃、适合地在10-15℃的温度下进行。
通式(XVI)的化合物可以由7-酮基石胆酸通过如以下通用方法A中所述的酯化制备。7-酮基石胆酸为可商购的。
通式(IA)的化合物，其中R1和R2均为氟且R3为C(O)OR12a，其中R12a如对通式(II)所定义，可以由通式(XXI)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000202
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义；
通过如以下通用方法L中所述与酸例如盐酸反应来进行。
可以使用如下方法将通式(IA)的化合物转化成通式(IB)和(ID)的化合物。
可以氧化通式(IA)的化合物，得到通式(XXII)的化合物：
Figure BDA0003125029820000203
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义。
用于该方法的适合的氧化剂包括戴斯-马丁试剂(Dess-Martin periodinane)，且用于其的反应条件如以下通用方法M中所述。
然后可将通式(XXII)的二酮还原成通式(IB)和(ID)的化合物的混合物。用于该方法的适合的还原剂包括氢化物例如硼氢化钠，在氯化铈(III)存在下，如以下通用方法B中所述。可通过常规方法例如色谱法分离通式(IB)和(ID)的化合物。
通式(XXI)的化合物可以通过氟化通式(XXIII)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000211
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义。
用于该反应的适合的氟化剂包括N,N-二乙基氨基三氟化硫(DAST)。与DAST的反应可以在有机溶剂例如二氯甲烷中，在约15-25℃的温度下、典型地在室温下进行。
通式(XXIII)的化合物可以通过氧化通式(XXIV)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000212
其中Y如对通式(I)所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义.
适合的氧化剂包括如以下通用方法M中所述的戴斯-马丁试剂。
通式(XXIV)的化合物可以通过下列步骤制备：使通式(XXV)的化合物：
Figure BDA0003125029820000221
其中Y如对通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；且R26为碱不稳定的保护基；
与如上所述的通式(VII)的化合物反应，然后与碱反应，以除去保护基R26。
保护基R26的实例包括酰基R25C(O)-，其中R25如上述对通式(XIII)所定义。
通式(XXV)的化合物与通式(VII)的化合物的反应使用如以下通用方法K的方法进行。
可以用碱例如醇盐例如醇钠或醇钾，典型地为醇钠，例如甲醇钠或乙醇钠除去保护基R26。适合地，脱保护在醇溶剂例如甲醇或乙醇中在约15-25℃的温度下、典型地在室温下进行。
通式(XXV)的化合物可以由通式(XXVI)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000222
其中Y如对通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；
其通过环氧化得到通式(XXVIa)的化合物：
Figure BDA0003125029820000223
其中Y如对通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；
随后通过与通式(XXVII)的化合物反应开环：
R26-OH (XXVII)
其中R26如上述对通式(XXV)所定义。
适合的氧化剂为间-氯过苯甲酸(m-CPBA)，且该反应可以在有机溶剂例如DCM中并且在约15-25℃的温度下、适合地在室温下进行。该反应导致产生Δ2β,3β-环氧化物(XXVIa)和Δ3β,4β-环氧化物的不可分离的混合物。用通式(XXVII)的化合物处理该混合物时，通式(XXVIa)的化合物反应，得到所需产物。
在所述开环反应中，当保护基R26为酰基R25C(O)-时，通式(XXVII)的化合物为如上文所定义的通式(XIII)的化合物。通式(XXVIa)的化合物与通式(XIII)的化合物反应可以在升高温度、例如约40-60℃、典型地在约50℃下进行。
通式(XXVI)的化合物可以通过消除反应由通式(XXVIII)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000231
其中Y如对通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义。
三氟甲磺酸酐(三氟甲磺酸酐)适合地为活化的离去基团的实例，其可以与碱例如二甲基吡啶联用。该反应可在约5-20℃、适合地10-15℃的温度下进行。
通式(XXVIII)的化合物可以由通式(XXIX)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000232
其中Y如对通式(I)所定义；R12a和R21如对通式(II)所定义；且R26如对通式(XXV)所定义；
其通过与如上文所定义的通式(XXVII)的化合物反应来进行。
适合地，通式(XXVII)的化合物为通式(XIII)的羧酸，使得R26为式R25C(O)-的酰基。
该反应可以在醇溶剂例如甲醇或乙醇中，在约15-25℃的温度下，典型地在室温下进行。
通式(XXIX)的化合物可以由通式(XXX)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000241
其中Y如对通式(I)所定义；R12a如对通式(II)所定义；且R26如对通式(XXV)所定义；
其通过与通式(VII)的化合物反应来进行。适合的反应条件如以下通用方法K中所述。
通式(XXX)的化合物可以由通式(XXXI)的化合物制备：
Figure BDA0003125029820000242
其中R12a如对通式(II)所定义；
其通过与通式(XXVII)的化合物，或更通常与通式(XXXII)的化合物反应来进行：
(R26)2O (XXXIII)
其中R26如对通式(XXV)所定义。
当R26为酰基R25，通式(XXXIII)的试剂为羧酸酐。
通式(XXXI)的化合物为UDCA的酯，其可以通过由UDCA与醇R12aOH反应、例如如通用方法A中所述制备。
通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，其中R3为C(O)OR12a，其中R12a为任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基，可以转化成通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的其他化合物。
其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，可以通过水解其中R3为C(O)OR12a的相同化合物制备。水解可以为酸或碱水解。碱水解通常为更适合的，且可以例如使用碱金属氢氧化物，例如锂、钠或钾的氢氧化物、更通常为氢氧化锂进行。碱水解如以下通用方法C中所述。
通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12R13，可以通过由羧酸与式H-NR12R13的胺反应制备，其中R12和R13如上述对通式(I)所定义；该反应在适合的溶剂中通过加热进行。适合地，该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺、例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。
适合的偶联试剂包括公知的肽偶联剂，例如O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HBTU)，O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TBTU),O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU),O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(TATU)，(苯并三唑-1-基氧基)三(二甲基氨基)鏻六氟磷酸盐(BOP)，(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基鏻六氟磷酸盐(PyBOP)，碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)和三唑类，例如1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或羟基苯并三唑(HOBt)；以及氯甲酸酯，例如氯甲酸异丁酯。
式H-NR12R13的胺为公知的，且易于得到，或可以通过本领域技术人员公知的方法制备。
通式(I)的化合物，其中R7为C(O)NR12R13或OS(O)2OR12，还可以通过与Festa等人J.Med.Chem.,2014,57,8477-8495(通过引用并入本文)所述方法类似的方法制备。
其中R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，可以由其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物通过与通式(XL)的化合物反应制备：
HNR12[CH(R15)]nR16
(XL)
其中R12、R15、n和R16如上文所定义；
该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述。
例如，其中R3为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，可以由其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物通过与通式(XLI)的氨基酸反应制备：
Figure BDA0003125029820000261
其中R12和R14如上文所定义；
该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述，其中HATU特别适合。
适合地，在通式(XLI)的化合物中，R12为H或甲基，且R14为H。
类似地，其中R3为C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，可以由其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物通过与通式(XLII)的化合物反应制备：
Figure BDA0003125029820000262
其中R12和R15如上文所定义；
该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述，且氯甲酸异丁酯特别适合。
适合地，在式的化合物(XLII)中，R12为H或甲基，且R15各自为H。
通式(XLI)的氨基酸和通式(XLII)的牛磺酸及其衍生物为众所周知的，且易于得到，或可以通过本领域公知的方法合成。
可以将其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物转化成其中R3为C(O)NR12S(O)2R13的化合物，其中R13如上文所定义，其通过与下式的化合物反应来进行：
NHR12S(O)2R13
其中R12和R13如上文所定义，该反应在偶联试剂存在下和碱性条件下进行，例如在胺例如二异丙基乙胺(DIPEA)或三乙胺(TEA)存在下，在有机溶剂例如DMF中，如通用方法Q中所述进行。适合的偶联剂如上所述，其中1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)特别适合。
其中R3为NHC(O)NR12S(O)2R13的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物可以由其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物通过如方案1中所示的方法制备：
方案1
Figure BDA0003125029820000281
i二苯基磷酰基叠氮化物/三乙胺
ii加热
iii R13SO2NHR12
其中R3为S(O)2OR12的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物可以由其中R3为C(O)OH的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物合成。首先可以使该化合物，其中R3为C(O)OH，与C1-6烷酰氯或苯甲酰氯或与C1-6烷酸酐反应，以便保护任何OH基团。然后可将被保护的化合物与还原剂例如氢化物、适合地为氢化铝锂或硼氢化钠反应，以便将羧酸基团还原成OH。可以用卤素例如溴或碘替代醇基，例如使用Classon等人J.Org.Chem.,1988,53,6126-6130(通过引用并入本文)所述的三苯膦/咪唑/卤素方法。然后可以使卤代化合物与亚硫酸钠在醇溶剂中反应，得到带有SO3 -Na+取代基的化合物。
可以通过下列步骤得到其中R3为OS(O)2OR12的通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物：使用任意适合的保护基保护通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物的OH基团，其中R3为C(O)OR12；还原羧酸或酯，得到醇；并且使其与氯磺酸在碱例如三乙胺存在下反应，得到该化合物的被保护的三乙胺盐，其中R3为OS(O)2OR12。可以使用碱水解除去保护基。
所述醇与磺酰氯反应得到通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物，其中R3为OS(O)2R12。
通式(I)、(IA)、(IB)、(IC)和(ID)的化合物，其中R3为S(O)2R12，可以由醇通过与劳森试剂反应、随后将得到的产物氧化来获得。
令人惊奇地，已经证实，本发明的化合物能够恢复线粒体功能，并且可以穿过血脑屏障。因此，它们用于治疗神经变性疾病，包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(运动神经元疾病)。
当与在A和B环上具有略微不同的取代的胆汁酸比较时，本发明的化合物具有令人惊奇的活性。
在本发明的另一个方面，提供了用于药物的通式(I)的化合物。
还提供了用于治疗或预防神经变性疾病的通式(I)的化合物。
本发明还提供了通式(I)的化合物在制备用于治疗或预防神经变性疾病的药物中的用途。
本发明还提供了用于治疗或预防神经变性疾病的方法，该方法包含对有这类治疗需要的患者施用有效量的通式(I)的化合物。
神经变性疾病的实例包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)、进行性核上麻痹和威尔逊病。特别适合使用本发明化合物治疗的疾病包括帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化，且尤其是帕金森病、轻度认知障碍和痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)。
通式(IA)和(ID)的化合物在治疗或预防帕金森病中特别有效，尤其是其中R1和R2均为F的通式(IA)和(ID)的化合物。
用于治疗帕金森病的特别适合的化合物的实例包括通式(IA)的化合物，其为2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)；和通式(ID)的化合物，其为2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)。2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)为特别适合的。
通式(IB)的化合物特别有效地治疗或预防痴呆，例如阿尔茨海默病。这尤其是对于其中R1和R2均为F的通式(IB)的化合物而言。
适合地，当神经变性疾病为痴呆、尤其是阿尔茨海默病时，通式(IB)的化合物为2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)。
通式(I)的化合物通常作为药物组合物的组成部分施用。
因此，在本发明的另一个方面，提供了药物组合物，其包含通式(I)的化合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
可将该组合物配制成用于通过任何途径施用，例如胃肠外，包括静脉内、肌内、皮下或皮内；或口服、直肠、鼻部、局部(包括滴眼液、局部施用于肺、口含和舌下)或阴道施用。
更适合地，将该组合物配制成用于胃肠外施用或用于局部施用于肺(通过吸入)。
该组合物可以通过将上述定义的活性剂与载体混合来制备。通常，通过将活性剂与液体载体或固体载体细粉或它们两者均匀且紧密地混合，然后在需要时使产品成型来制备制剂。本发明扩展到制备药物组合物的方法，包含将通式(I)的化合物与药学上可接受的载体或媒介物结合或混合。
可以将本发明中用于口服施用的制剂提供为：离散单元，例如含有预定量活性剂的胶囊、小药囊或片剂；粉末或颗粒；活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液或混悬液；或水包油型液体乳液或油包水型液体乳液；或推注剂等。
在一些情况中，可以将组合物配制成用于通式(I)的化合物的延迟释放、缓释或控释。
对于口服施用的组合物(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括媒介物，例如常见的赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填充剂和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；和润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅酮流体、滑石蜡、油和胶体二氧化硅。也可以使用矫味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能需要添加着色剂以使剂型易于识别。片剂也可以通过本领域众所周知的方法进行包衣。
片剂可以通过压缩或模制，任选地与一种或多种辅助成分一起制成。压制片可以通过在适合的机器中压制自由流动形式的活性剂来制备，例如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合。模制片可以通过在适合的机器中模压粉末状化合物与惰性液体稀释剂的混合物来制备。片剂可以任选地被包衣或刻痕并且可以被配制以提供活性剂的缓释或控释。
其他适合口服施用的制剂包括含有在调味基质、通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶中的活性剂的锭剂；包含在惰性基质、例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶中的活性剂的软锭剂；以及包含在适合的液体载体中的活性剂的漱口剂。
为了局部施用于皮肤，可以将通式(I)的化合物制成乳膏、软膏、胶冻、溶液或混悬液等。可用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域众所周知的常规制剂，例如，如标准药剂学教科书中所述，例如英国药典(British Pharmacopoeia)。
可以通过使用气雾剂实现对肺的局部施用。气雾剂典型地包含悬浮或溶解在适合的气雾剂推进剂中的活性成分，所述推进剂例如氯氟碳(CFC)或氢氟碳(HFC)。适合的CFC推进剂包括三氯一氟甲烷(推进剂11)、二氯四氟甲烷(推进剂114)和二氯二氟甲烷(推进剂12)。适合的HFC推进剂包括四氟乙烷(HFC-134a)和七氟丙烷(HFC-227)。推进剂典型地占总吸入组合物重量的40％-99.5％，例如40％-90％。该制剂可以包含赋形剂，包括共溶剂(例如乙醇)和表面活性剂(例如卵磷脂、三油酸山梨坦等)。其他可能的赋形剂包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等。将气雾剂包装在罐中，且适合的剂量通过计量阀(例如由Bespak、Valois或3M或由ptar、Coster或Vari提供)递送。
也可以通过使用非加压制剂例如水溶液或混悬液来实现对肺的局部施用。这些可以通过雾化器施用，例如可以手持和便携式或供家庭或医院使用(即非便携式)的雾化器。该制剂可以包含赋形剂例如水、缓冲剂、张力调节剂、pH调节剂、表面活性剂和共溶剂。混悬液和气雾剂(无论是加压的还是未加压的)典型地包含细粉形式的本发明化合物，例如具有0.5-10μm的D50，例如约1-5μm。粒度分布可以使用D10、D50和D90值表示。将粒度分布的D50中值定义为将分布一分为二的以微米计的粒度。将来自激光衍射的测量值更准确地描述为体积分布，因此使用该方法得到的D50值更有意义地称作Dv50值(体积分布的中值)。如本文所用，Dv值是指使用激光衍射测量的粒度分布。类似地，用于上下文中激光衍射的D10和D90值是指Dv10和Dv90值，并且分别是指其中10％的分布低于D10值和90％的分布低于D90值的粒度。
也可通过使用干粉制剂实现对肺的局部施用。干粉制剂包含细粉形式的本公开化合物，其典型地具有1-10μm的质量平均直径(MMAD)或0.5-10μm的D50例如约1-5μm。细粉形式的本发明化合物的粉末可以通过微粉化方法或类似的尺寸减小方法制备。微粉化可以使用气流粉碎机进行，例如由Hosokawa Alpine制造的那些。可以使用激光衍射(例如使用Malvern Mastersizer 2000S仪器)测量所得粒度分布。该制剂典型地包含局部可接受的稀释剂，例如乳糖、葡萄糖或甘露醇(优选乳糖)，通常具有相对较大的粒径，例如质量平均直径(MMAD)为50μm或以上，例如100μm或以上或D50为40-150μm。如本文所用，术语“乳糖”是指含乳糖的成分，包括α-乳糖一水合物、β-乳糖一水合物、无水α-乳糖、无水β-乳糖和无定形乳糖。乳糖成分可通过微粉化、筛分、研磨、压缩、附聚或喷雾干燥进行加工。还包括各种形式的商购乳糖形式，例如
Figure BDA0003125029820000321
(吸入级乳糖；DFE Pharma)、
Figure BDA0003125029820000322
70(用于干粉吸入器的筛分乳糖；Meggle)、
Figure BDA0003125029820000323
(DFE Pharma)和
Figure BDA0003125029820000324
(DFEPharma)(筛分吸入级乳糖；DFE Pharma)产品。在一个实施方案中，乳糖成分选自α-乳糖一水合物、无水α-乳糖和无定形乳糖。优选地，乳糖为α-乳糖一水合物。
干粉制剂还可以包含另外的赋形剂。因此，在一个实施方案中，本公开的干粉制剂包含硬脂酸镁或硬脂酸钙。这类制剂可以具有优良的化学和/或物理稳定性，尤其是在这类制剂还包含乳糖时。
干粉制剂典型地使用干粉吸入器(DPI)装置递送。干粉递送系统的实例包括
Figure BDA0003125029820000325
Figure BDA0003125029820000326
和
Figure BDA0003125029820000327
干粉递送系统的另外的实例包括ECLIPSE、NEXT、ROTAHALER、HANDIHALER、AEROLISER、CYCLOHALER、BREEZHALER/NEOHALER、MONODOSE、FLOWCAPS、TWINCAPS、X-CAPS、TURBOSPIN、ELPENHALER、MIATHALER、TWISTHALER、NOVOLIZER、PRESSAIR、ELLIPTA、ORIEL干粉吸入器、MICRODOSE、PULVINAL、EASYHALER、ULTRAHALER、TAIFUN、PULMOJET、OMNIHALER、GYROHALER、TAPER、CONIX、XCELOVAIR和PROHALER。
在一个实施方案中，通式(I)的化合物作为微粉化的干粉制剂提供，例如其包含适合等级的乳糖。
因此，作为本发明的一个方面，提供了药物组合物，其包含颗粒形式的通式(I)的化合物与颗粒乳糖的组合，该组合物任选地包含硬脂酸镁。
在一个实施方案中，通式(I)的化合物作为包含适合等级的乳糖和硬脂酸镁的微粉化干粉制剂提供，其被填充入装置例如DISKUS。适合地，这类装置为多剂量装置，例如将该制剂填充入用于多单元剂量装置例如DISKUS的泡罩包。
在另一个实施方案中，可以将通式(I)的化合物作为微粉化干粉制剂提供，例如包含适合等级的乳糖。将该制剂填充入用于单剂量装置例如AEROLISER的硬壳胶囊。
在另一个实施方案中，通式(I)的化合物作为包含适合等级的乳糖和硬脂酸镁的微粉化干粉制剂提供，其被填充入用于单剂量装置、例如AEROLISER的硬壳胶囊。
在另一个实施方案中，通式(I)的化合物作为用于吸入剂型的细粉提供，其中粉末为具有0.5-10μm D50的细颗粒，例如约1-5μm，其通过气流粉碎机微粉化以外的减小尺寸的工艺例如喷雾干燥、喷雾冷冻、微流化、高压均化、超临界流体结晶、超声结晶或这些方法的组合，或本领域已知的用于生产精细颗粒的其他适合的颗粒形成方法产生，所述方法用于产生具有空气动力学粒径为0.5-10μm的细颗粒。可以使用激光衍射(例如使用MalvernMastersizer 2000S仪器)测量所得粒度分布。颗粒可以包含单独的化合物或与可有助于加工的其它赋形剂组合。所得细颗粒可形成最终制剂以递送给人，或可任选地与其他适合的赋形剂一起进一步配制以有利于以可接受的剂型递送。
本发明的化合物也可以通过直肠施用，例如以栓剂或灌肠剂的形式，其包括水性或油性溶液以及混悬液和乳液和泡沫体。此类组合物按照本领域技术人员公知的标准方法制备。例如，栓剂可以通过将活性成分与常规栓剂基质(例如可可脂或其他甘油酯)混合来制备。在这种情况下，将药物与适合的无刺激性赋形剂混合，该赋形剂在常温下为固体，而在直肠温度下为液体，因此会在直肠中熔化以释放药物。这种材料为可可脂和聚乙二醇。
胃肠外制剂通常为无菌的。
医生或其他技术人员将能够确定通式(I)的化合物的适合剂量，并因此确定应包含在任何特定药物制剂中的本发明化合物的量(无论是单位剂量形式还是其他形式)。
通式(I)的化合物可以与一种或多种用于治疗或预防神经变性疾病的另外的活性剂联用。
因此，在本发明的另一个方面，提供了产品，其包含通式(I)的化合物和用于治疗或预防神经变性疾病的另外的活性剂，该产品作为组合制剂用于同时、依次或分别用于治疗或预防如上所述的神经变性疾病。
现在将参考以下实施例和附图更详细地描述本发明，其中：
图1(图1A、1B和1C)显示来自对照和6名散发性帕金森病(sPD)患者的成纤维细胞系的数据。将对照与未处理的sPD、成纤维细胞、与UDCA一起温育的sPD成纤维细胞和与化合物7一起温育的sPD成纤维细胞进行比较；图1A：基础耗氧量；图1B：最大呼吸频率；图1C：ATP关联呼吸。
图2显示来自对照和6名散发性帕金森病(sPD)患者的成纤维细胞系的细胞外酸化率。将对照成纤维细胞与未处理的sPD、成纤维细胞、与UDCA一起温育的sPD成纤维细胞和与化合物7一起温育的sPD成纤维细胞进行比较。
图3显示来自未经处理或用化合物7以4mg/kg或12mg/kg的剂量处理的MTPT小鼠匀化物中线粒体呼吸链复合物I的活性。
图4显示来自用溶媒、溶媒+12mg化合物7、MPTP或MTPT+1mg、4mg或12mg化合物7处理的小鼠左侧纹状体小鼠脑匀化物中线粒体呼吸链复合物I活性的比较。
缩写
Figure BDA0003125029820000351
Figure BDA0003125029820000361
通用方法
用于24-甲酸保护为甲酯的通用方法A
使用Pelliciari的方法(ACS Med.Chem.Lett.2012,3,273-277)。将游离胆汁酸(25.0g,64mmol,1当量)溶于HPLC级MeOH(20体积)，然后添加对甲苯磺酸(0.1当量)，在30℃超声处理2h。一旦通过TLC分析认定完成，则真空除去溶剂，然后将残余物溶于EtOAc(16体积)，用饱和NaHCO3(x2)、水和盐水洗涤有机层。然后干燥有机相(Na2SO4)，浓缩，得到甲酯。
使用NaBH4/CeCl3进行3-酮基/7-酮基还原的通用方法B
使用
Figure BDA0003125029820000362
的条件(Steroids 2012,77,1233-1241)。向酮(1当量)和CeCl3(1.2当量)在MeOH(～50体积)和EtOAc(2mL)中的溶液中加入NaBH4(1.1当量)，历时5min期限。将该溶液搅拌30min，此时再加入NaBH4(1当量)。再搅拌30min以驱动反应完成。用冰冷2M HCl使反应淬灭，用EtOAc(x2)洗涤水层。用饱和NaHCO3和水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，然后通过柱色谱法纯化，得到α-OH和β-OH差向异构体。
使用LiOH的MeOH溶液皂化甲酯的通用方法C
向甲酯(43mg,0.11mmol,1当量)在MeOH(～70体积)中的溶液中加入2M LiOH(10当量)，将该溶液在RT下搅拌至完成。真空除去溶剂，用2M HCl酸化粗残余物，然后用EtOAc(x2)萃取。用水和盐水洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到游离酸。
使用LiOH的THF溶液皂化甲酯的通用方法D
将甲酯(1.0当量)溶于THF(～20体积)，加入LiOH(2M在H2O中的溶液，10当量)。在室温下搅拌至完成后，真空减少反应混合物，用2M HCl酸化得到的残余物，用EtOAc(x2)萃取水相。然后用水和盐水洗涤合并的有机相，用Na2SO4干燥，真空还原，得到游离酸。
用于乙酸酯/苯甲酸酯的甲醇解的通用方法E
将乙酸酯/苯甲酸酯保护的胆汁酸(3.1g,6.12mmol,1当量)溶于无水MeOH(～10体积)，然后添加25％NaOMe的MeOH溶液(～6体积)，将RM在RT搅拌。完成时，用2M HCl将该反应体系酸化至pH 4-5，用H2O稀释。用DCM(x2)萃取水相，用NaHCO3洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到脱保护的物质。不经进一步纯化使用。
使用NaOH皂化酯的通用方法F
向圆底烧瓶中加入酯(1.0当量)、NaOH(12.95当量)和MeOH(HPLC级,8.35mL/mol)。将该反应混合物在室温搅拌过夜。通过TLC分析完成时，减压除去溶剂。用水稀释残余物，用HCl水溶液酸化，用EtOAc(×3)萃取。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩，得到期望的化合物(如果必要时，通过快速色谱法纯化)。
使用NaBH4还原酮衍生物的通用方法G
向圆底烧瓶中加入酮(1.0当量)、硼氢化钠(2.4当量)和无水THF(～40体积)。将该反应混合物在室温搅拌过夜，用H2O淬灭，用乙酸乙酯萃取(×3)。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速色谱法且如果必要时通过HPLC纯化粗产物。
将仲醇保护为MOM醚的通用方法K
在0℃向起始仲醇(1当量)在无水DCM(～17体积)中的溶液中加入DIPEA(3当量)和MOM-Cl(5当量)。将该反应混合物温热至室温，然后搅拌过夜。一旦完成，则用水(～3.4mL/mmol)和甲醇(～3.4mL/mmol)使该反应混合物淬灭，然后分离各层，用EtOAc(x4)萃取水层，用盐水(x2)洗涤合并的有机层。然后干燥有机相(Na2SO4)，真空浓缩，得到粗物质。通过快速色谱法(如果必要时通过HPLC)纯化粗产物，得到期望的化合物。
使用HCl切割MOM-基团的通用方法L
将MOM保护的物质(1.5g,1.76mmol,1当量)溶于MeOH(～30体积)和2M HCl(～5.7mL/mmol)，将该混合物温热至70℃ 5小时。冷却反应混合物，真空浓缩，共沸以完全干燥(MeOH×3,CHCl3×1)，得到期望的物质。
使用戴斯-马丁试剂进行仲醇氧化的通用方法M
在0℃向在二氯甲烷中的起始仲醇(1.0当量)逐步加入戴斯-马丁试剂(～1.2当量)，历时10min。温热至RT的18小时后，通过TLC认定反应完成，通过添加饱和Na2S2O3溶液和饱和NaHCO3溶液使该反应混合物淬灭。分离水相，用二氯甲烷萃取(x3)，用饱和NaHCO3溶液、水和盐水洗涤合并的流分，用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到期望的粗产物。通过快速色谱法(如果必要，通过HPLC)纯化粗产物，得到期望的化合物。
使用催化剂进行氢化/氢解的通用方法N
向圆底烧瓶中加入苄基保护的胆汁酸(1.0当量)、催化剂[Pd/C或PtO2](10mol％)和溶剂[MeOH、EtOH等]。用氢气给该反应混合物脱气，然后在大气压下或高压下在H2气氛中搅拌16-72小时。通过硅藻土过滤出催化剂，浓缩滤液，通过快速色谱法纯化。
由酮衍生物制备甲硅烷基烯醇醚的通用方法O
向圆底烧瓶中加入DIPA(12.6当量)和THF(1.25mL/mmol)。将该溶液冷却至-78℃，然后滴加正丁基锂(2.5M的己烷溶液,12当量)，在-78℃搅拌30min。加入TMSCl(10当量)，搅拌20min。然后滴加酮衍生物(1当量)在THF(6.5mL/mmol)中的溶液，历时10min，在该温度下搅拌45min，然后添加三乙胺(18当量)，搅拌1h。将该反应混合物温热至-20℃，用饱和NaHCO3溶液淬灭，温热至室温，历时2h。分离有机层，用乙酸乙酯(x3)萃取水层。用饱和NaHCO3溶液、水、盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，浓缩，得到期望的甲硅烷基烯醇醚中间体，将其不经任何纯化用于下一步反应。
使用在DMF中的Selectfluor对甲硅烷基烯醇醚进行亲电氟化的通用方法P
在0℃向圆底烧瓶中加入甲硅烷基烯醇醚衍生物(1.0当量)、DMF(2mL/mmol)和Selectfluor(1.5当量)在DMF(3mL/mmol)中的溶液。将该反应混合物在室温搅拌过夜，用H2O淬灭，用乙酸乙酯萃取(×4)。用盐水洗涤合并的有机层，用Na2SO4干燥，过滤，真空浓缩。通过快速色谱法且如果必要时通过HPLC纯化粗产物。
用于形成偶联物的通用方法Q
将氟代胆汁酸(1当量)溶于无水DMF(12体积)，同时在氩气气氛中搅拌。加入HATU(1当量)、DIPEA(3.0当量)和氨基酸(1.1当量)，将该反应体系在RT搅拌16h。完成时，将反应混合物直接干燥上硅胶，通过C18色谱法纯化(MeOH的H2O溶液洗脱梯度,0-100％)，得到偶联物，为DIPEA盐或游离酸。然后用钠离子交换柱处理DIPEA盐，得到期望的化合物钠盐，为残余物。
实施例1：2β-氟化合物的合成
A.3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(1A.1)
Figure BDA0003125029820000391
使用Pellicari的方法(ACS Med.Chem.Lett.2012,3,273-277)。将CDCA(25.0g,64mmol,1当量)溶于HPLC级MeOH(500mL)，然后添加对甲苯磺酸(1.21g,6.4mmol,0.1当量)，在30℃超声处理2h。一旦通过TLC分析认定反应完成，则真空除去溶剂，然后将残余物溶于EtOAc(400mL)，用饱和NaHCO3(2×150mL)、水(250mL)和盐水(250mL)洗涤有机物。然后干燥有机相(Na2SO4)，浓缩得到目标化合物，为白色/淡黄色固体(26.0g,定量)(通用方法A)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.84(1H,q,J＝2.4Hz),3.66(3H,s),3.44(1H,tt,J＝10.9,4.5Hz),2.34(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.28-2.15(2H,m),2.12-0.97(26H,m),0.93(3H,d,J＝6.2Hz),0.90(3H,s),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:429.1[M+Na]+.
B.7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1B.1)
Figure BDA0003125029820000401
向3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(10.0g,24.6mmol,1当量)在水(25mL)和叔丁醇(100mL)中的溶液中加入KBr(5.9g,49.0mmol,2当量)、KHCO3(24.6g,246mmol,10当量)和TEMPO(5.0g,32.0mmol,1.3当量)。将该溶液冷却至0℃，然后逐步添加≈11％NaClO溶液(54.2mL,73.2mmol,3.0当量)，历时6h期限。通过缓慢添加硫代硫酸钠溶液(300mL,1.2M,350mmol)使反应停止。用EtOAc(2×300mL)萃取水相，合并，用盐水(300mL)和水(300mL)洗涤，然后干燥(Na2SO4)，真空除去溶剂。使用快速色谱法(PE/EtOAc:80:20→65:35)纯化得到的亮红色浓稠油状残余物(15g)，得到白色固体(6.5g,16.0mmol,66％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.93(1H,br s),3.67(3H,s),3.40(1H,t,J＝14.4Hz),2.46-1.10(30H,m),1.01(3H,s),0.95(3H,d,J＝6.6Hz),0.71(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:422.1[M+NH4]+,427.1[M+Na]+.
C.7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1C.1)
Figure BDA0003125029820000402
在0℃向7α-羟基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(3.0g,7.41mmol,1当量)在无水DCM(50mL)中的溶液中加入DIPEA(3.83mL,22.2mmol,3当量)和MOM-Cl(2.82mL,37.1mmol,5当量)。将该反应混合物温热酯室温，然后搅拌过夜。一旦完成，则用水(25mL)和甲醇(25mL)使该反应混合物淬灭。然后分离各层，用EtOAc(4×75mL)萃取水层，用盐水(2×150mL)洗涤合并的有机层。然后干燥有机相(Na2SO4)，真空浓缩，得到3.8g粗物质，经快速色谱法纯化(PE/EtOAc:75:25)，得到白色固体(3.10g,6.9mmol,93％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.68(1H,d,J＝6.8Hz),4.55(1H,d,J＝6.8Hz),3.72-3.62(4H,m),3.43-3.28(4H,m),2.49-1.05(27H,m),1.03(3H,s),0.94(3H,d,J＝6.4Hz),0.69(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:449.3[M+H]+,471.1[M+Na]+.
D.7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯(1D.1)和7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(ID.2)
Figure BDA0003125029820000411
按照Barlow等人的方法(Eur.J.Med.Chem.2011,46,1545-1554)。在0℃向7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1.0g,2.23mmol,1当量)在无水DCM(20mL)中的溶液中加入Et3N(0.62mL,4.46mmol,2当量)和三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(0.44mL,2.45mmol,1.1当量)。将该反应混合物搅拌1小时，然后进一步用DCM(150mL)稀释，用饱和NaHCO3(100mL)淬灭。分离各层，再用DCM(3×100mL)萃取水层，合并，用盐水洗涤(150mL)，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到无色油状物(1.2g)，其包含7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯(IA.1)和7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(1A.2)，两者之比约为1:1。将该粗物质不经进一步纯化用于随后的步骤。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.80-4.44(3H,m),3.67(3H,s),3.66-3.56(1H,m),3.40(1.5H,s),3.36(1.5H,s),2.51-1.08(31H,m),0.99-0.95(3H,m),0.93(3H,d,J＝6.2Hz),0.66(1.5H,br.s),0.65(1.5H,br.s),0.21-0.15(9H,m)ppm.
E.2β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1E.1)和4β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1E.2)
Figure BDA0003125029820000421
按照Fujimoto等人的方法(Bioorg.Med.Chem.Lett.2011,21,6409-6413)。向7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-2-烯酸酯和7α-甲氧基甲氧基-3-三甲基甲硅烷氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(1.10g,2.2mmol,1当量)在无水乙腈中的溶液中加入
Figure BDA0003125029820000422
(1.20g,3.3mmol,1.5当量)，允许将该反应混合物在室温搅拌4h。真空除去溶剂，然后用EtOAc(100mL)和水(100mL)稀释。分离各层，然后再用EtOAc(2×100mL)萃取水层。然后用盐水(150mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到1.05g淡黄色固体粗品。使用快速色谱法纯化粗物质(PE/EtOAc:80:20)，得到2β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(377mg,0.81mmol,36％，2步)和4β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(321mg,0.69mmol,31％，2步)。
1E.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.05(1H,ddd,J＝49.4,13.5,5.6Hz),4.67(1H,d,J＝6.8Hz),4.54(1H,d,J＝6.8Hz),3.67(4H,s),3.48(1H,t,J＝13.9Hz),3.37(3H,s),2.52(1H,dt,J＝12.7,6.1Hz),2.42-1.12(27H,m),1.08(3H,s),0.95(3H,d,J＝6.6Hz),0.69(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-195.19(ddt,J＝49.2,9.6,6.2Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:484.2[M+NH4]+,489.1[M+Na]+.
1E.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.78(1H,dd,J＝46.8,11.7Hz),4.77(1H,d,J＝6.8Hz),4.59(1H,d,J＝6.8Hz),3.78(1H,q,J＝2.7Hz),3.67(3H,s),3.40(3H,s),2.52(1H,td,J＝14.4,4.9Hz),2.42 1.11(24H,m),1.07(3H,s),0.94(3H,d,J＝6.4Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-200.67(ddd,J＝46.8,12.1,6.9Hz)ppm.
LRMS(ESI+):m/z 484.2(M+NH4)+,489.1(M+Na)+.
F.2β-氟-3α-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.1)和2β-氟-3β-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.2)
Figure BDA0003125029820000431
向2β-氟-7α-甲氧基甲氧基-3-氧代-5β-胆烷酸甲酯(260mg,0.56mmol,1当量)在无水四氢呋喃(20mL)中的溶液中加入硼氢化钠(64mg,1.70mmol,3当量)，将该反应混合物在室温搅拌过夜。一旦通过TLC分析认定完成，则用EtOAc(150mL)稀释该反应体系，用水(100mL)淬灭，分离各层，然后再用EtOAc(2×100mL)萃取水层。然后用水(150mL)和盐水(150mL)洗涤合并的有机层，然后干燥(Na2SO4)，真空浓缩，得到306mg粗的淡黄色油状物。经快速色谱法纯化粗产物(PE/EtOAc:65:35)，得到2β-氟-3α-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(144mg,0.307mmol,55％)，和2β-氟-3β-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为无色树胶状物(88mg,0.19mmol,34％)。
1F.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.68(1H,d,J＝6.8Hz),4.54(1H,d,J＝7.1Hz),4.40(1H,dddd,J＝52.3,12.0,8.6,4.4Hz),3.66(3H,s),3.62-3.47(3H,m),3.37(3H,s),2.48-1.01(27H,m),0.99(3H,s),0.92(3H,d,J＝6.4Hz),0.64(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-187.47(ddq,J＝52.3,12.7,7.1Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:486.1[M+NH4]+,491.2[M+Na]+.
1F.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.72-4.51(3H,m),4.20-4.09(1H,m),3.66(3H,s),3.59(1H,d,J＝2.4Hz),3.38(3H,s),2.45(1H,ddd,J＝15.2,12.4,2.2Hz),2.35(1H,ddd,J＝15.0,10.3,5.1Hz),2.22(1H,ddd,J＝15.6,9.5,6.5Hz),2.06-1.05(25H,m),1.02(3H,s),0.93(3H,d,J＝6.6Hz),0.65(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-187.31(dquin,J＝47.2,7.5Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:486.0[M+NH4]+,491.1[M+Na]+.
G.2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)
Figure BDA0003125029820000441
使用通用方法L，然后按照通用方法C，使2β-氟-3α-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.1；118mg,0.25mmol,1当量)脱保护，得到2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)，为淡黄色固体(72mg,0.18mmol,70％)。
化合物1:1H NMR(400MHz,CD3OD):δ4.32(1H,dddd,J＝52.5,12.5,8.6,4.0Hz),3.78(1H,q,J＝2.3Hz),3.44(1H,tdd,J＝12.0,8.7,5.0Hz),2.43(1H,q,J＝13.2Hz),2.33(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.25-2.11(2H,m),2.04(1H,dt,J＝12.4,2.9Hz),1.99-1.04(22H,m),1.00(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.5Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CD3OD):δ-186.77(ddq,J＝52.2,11.9,7.8Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:393.1[M+H-H2O]+,821.2[2M+H]+,843.3[2M+Na]+.
H.2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)
Figure BDA0003125029820000442
使用通用方法L，然后按照通用方法C，使2β-氟-3β-羟基-7α-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1F.2；25mg,0.053mmol,1当量)脱保护，得到2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)，为树胶状固体(21mg,0.05mmol,96％)。
化合物2:1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ10.42(1H,br.s),4.58(1H,dddd,J＝47.7,12.1,4.4,2.8Hz),4.12-4.00(1H,m),3.80(1H,q,J＝2.4Hz),3.59(1H,br.s),3.29(1H,br.s),2.61(1H,ddd,J＝15.3,12.8,2.3Hz),2.34(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.21(1H,ddd,J＝15.5,9.6,6.4Hz),2.03-1.03(31H,m),1.01(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.5Hz),0.70(3H,s)ppm；
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-186.90(dquin,J＝47.6,7.6Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:393.4[M+H-H2O]+,373.4[M+H-H2O-HF]+,355.5[M+H-2H2O-HF]+.
实施例2：2α-氟化合物的合成
A.7-氧代-5β-胆-2-烯酸甲酯(2A.1)和7-氧代-5β-胆-3-烯酸甲酯(2A.2)
Figure BDA0003125029820000451
将3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(60g,148mmol,1.0当量；由7-酮基石胆酸，使用方法A合成)和DMAP(30g,122mmol,2.0当量)溶于DCM(500mL)，用冰冷却至0℃。然后加入三氟甲磺酸酐(26.1mL,156mmol,1.05当量)，历时15min期限。将该反应体系在0℃搅拌2小时，不过，没有反应进展。然后将反应体系缓慢地温热至10-12℃，通过TLC监测进展。2h后认定完成，用2M HCl(500mL)使RM淬灭，在RT搅拌10min。分离各层，用盐水(500mL)萃取水层，干燥(Na2SO4)并浓缩，得到78g棕色树胶状固体。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:95/5→90:10)，得到烯烃7-氧代-5β-胆-2-烯酸甲酯和7-氧代-5β-胆-3-烯酸甲酯的混合物，为无色树胶状物(37.5g,97mmol,66％)。
2A.1和2A.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.67-5.30(2H,m),3.65(3H,s),2.89-2.79(1H,m),2.58-2.48(1H,m),2.44-1.26(21H,m),1.23(2H,s),1.21(1H,s),0.91-0.88(3H,m),0.65(3H,m)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:387.2[M+H]+,404.2[M+NH4]+.
B.2β,3β-环氧-7-氧代-5β-胆烷甲酸酯(2B.1)和3β,4β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2B.2)
Figure BDA0003125029820000461
将烯烃7-氧代-5β-胆-2-烯酸甲酯和7-氧代-5β-胆-3-烯酸甲酯(20g,51.8mmol,1当量)的混合物在室温溶于DCM(200mL)，然后添加mCPBA(19.1g,77.7mmol,1.5当量)。1.5h后认定反应完成，其中在反应期间该混合物由溶液变成混悬液。用饱和Na2S2O3(150mL)水溶液使反应淬灭，搅拌30min。再加入DCM(200mL)和H2O(150mL)以辅助溶剂化。分离各层，再用DCM(200mL)萃取水层，然后用饱和NaHCO3水溶液(200mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到20.5g淡黄色树胶状固体。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:92.5:7.5→92:8→80:10→88:12→80:20)，得到纯的Δ3β,4β-环氧化物(2.00g)与80％纯的Δ2β,3β-环氧化物(1.85g)和大量混合流分(8.5g)。再纯化混合流分(石油醚/EtOAc:93:7→92:8→91:9→80:10→88:12→85:15→80:20)，得到纯的Δ3β,4β-环氧化物(0.8g)与80％纯的Δ3β,4β-环氧化物(2.15g)和60％纯的Δ2,3-环氧化物(1.30g)。总之，得到2β,3β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯，为白色结晶固体(～2.3g,5.8mmol,11％)，与3β,4β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(～4.5g,11.3mmol,22％)
2B.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.63(3H,s),3.13-3.09(1H,m),2.98(1H,dd,J＝5.3,4.4Hz),2.78(1H,dd,J＝12.3,4.3Hz),2.39-2.11(5H,m),1.91(6H,m),1.61-1.17(10H,m),1.13(3H,m),1.09-0.92(2H,m),0.89(3H,d,J＝6.5Hz),0.63(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:403.1[M+H]+,425.2[M+Na]+,403.1[M+H-MeCN]+.
2B.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.64(3H,s),3.16-3.13(1H,m),2.89(1H,dd,J＝12.6,7.0Hz,),2.82(1H,d,J＝3.8Hz),2.42-1.17(24H,m),1.13(3H,s),0.89(3H,d,J＝6.5Hz),0.64(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:403.2[M+H]+,425.2[M+Na]+.
C.2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2C.1)
Figure BDA0003125029820000471
将2β,3β-环氧-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(830mg,2.06mmol,1当量)在无水DCM(25mL)中的溶液冷却至0℃，然后添加70％HF.吡啶(830μL)，允许温热至RT。2d后认定完成，再将反应体系冷却至0℃，谨慎地通过滴加饱和NaHCO3(20mL)淬灭。分离各层，再用DCM(20mL)萃取水层；用2M HCl和盐水(各30mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩至得到840mg白色泡沫状固体。经快速色谱法纯化粗产物(PE/EtOAc:70:30)，得到2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(700mg,1.66mmol,80％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ.53(1H,dq,J＝47.0,2.6Hz),4.04-3.96(1H,m),3.65(3H,s),2.87(1H,dd,J＝12.7,6.1Hz),2.42-1.25(25H,m),1.22(3H,s),1.20-1.00(3H,m),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.64(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-184.60(tt,J＝48.6,8.7Hz)ppm；.
LRMS(ESI+)m/z:423.1[M+H]+,445.1[M+Na]+,845.5[2M+H]+.
D.2α-氟-3α-苯甲酰氧基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2D.1)
Figure BDA0003125029820000472
向2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(1.05g,2.5mmol,1当量)、PPh3(980mg,3.7mmol,1.5当量)和苯甲酸(450mg,3.7mmol,1.5当量)在无水THF(25mL)中的溶液中加入DEAD(650μL,3.7mmol,1.5当量)。将该溶液在30℃搅拌，历时该周末，此时粗19F NMR显示约40％转化成期望的苯甲酸酯。再加入PPh3、BzOH和DEAD(各1.5当量)，将反应体系搅拌O/N，此时转化率≈60％。再加入PPh3、苯甲酸和DEAD(各0.5当量)，搅拌过夜，转化率达到80％。再加入PPh3、苯甲酸和DEAD(各0.5当量)，再搅拌过夜一次，但是不再注意进展。真空除去溶剂，经快速色谱法纯化粗的亮黄色物质(PE/EtOAc:98:2→95:5→85:15→70:30→0:100)，得到285mg 2α-氟-3α-苯甲酰氧基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(≈90％纯)与1.28g额外的混合流分。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.04(2H,dd,J＝7.8,1.2Hz),7.56(1H,tt,J＝7.6,1.2Hz),7.44(2H,t,J＝7.8Hz),5.12-4.79(2H,m),3.67(3H,s),2.92(1H,dd,J＝12.6,5.9Hz),2.53-1.29(21H,m),1.26(3H,s),1.24-1.04(4H,m),0.93(3H,d,J＝6.4Hz),0.67(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-199.45(tdd,J＝49.9,28.6,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:527.2[M+H]+,544.1[M+NH4]+,549.1[M+Na]+.
E.2α-氟-3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(2E.1)
Figure BDA0003125029820000481
使用Zhao等人的方法(Eur.J.Org.Chem.,2005,2005,4414-4427)。将2α-氟-3α-苯甲酰氧基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(400mg,0.76mmol,1当量)和碳酸钾(20mg,0.15mmol,0.2当量)的混合物混悬于无水MeOH(20mL)，在RT搅拌16h。16h后，该反应混合物形成无色溶液，通过TLC分析认定完成。真空除去溶剂，使粗残余物溶于EtOAc/H2O(各5mL)之间，再用EtOAc(2×5mL)萃取水层。干燥合并的有机层(Na2SO4)，浓缩，得到320mg淡黄色树胶状物。经快速色谱法纯化粗产物(PE/丙酮:70:30)，得到2α-氟-3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(275mg,0.65mmol,86％)，为树胶状固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.71(1H,d,J＝52.0Hz),3.62(3H,s),3.59-3.45(1H,m),2.84(1H,dd,J＝12.5,6.0Hz),2.43(1H,d,J＝8.3Hz),2.39-2.26(3H,m),2.24-2.08(2H,m),2.01-1.20(18H,m),1.18(3H,s),1.14-1.02(3H,m),0.88(3H,d,J＝6.5Hz),0.61(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-202.32(tdd,J＝51.2,29.5,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:423.4[M+H]+.
F.2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2F.1)和2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2F.2)
Figure BDA0003125029820000491
使用通用方法B，还原2α-氟-3β-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(300mg,0.71mmol,1当量)。经快速色谱法纯化粗物质(PE/EtOAc:65:35→55:45)，得到2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(140mg,0.33mmol,46％)和2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(107mg,0.25mmol,35％)。
2F.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.55(1H,dq,J＝47.4,2.8Hz),4.00(1H,dq,J＝7.2,3.4Hz),3.86(1H,q,J＝2.6Hz),3.66(3H,s),2.72(1H,tt,J＝14.3,2.4Hz),2.35(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.22(1H,ddd,J＝15.7,9.4,6.5Hz),2.11-1.06(27H,m),0.97(3H,s),0.92(3H,d,J＝6.5Hz),0.66(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-184.70(tt,J＝48.6,8.7Hz)ppm；
LRMS(ESI+)m/z:447.3[M+Na]+.
2F.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.50(1H,dq,J＝47.3,2.8Hz),3.95(1H,dq,J＝7.2,3.4Hz),3.63(3H,s),3.55(1H,td,J＝9.7,5.1Hz),2.32(1H,ddd,J＝15.4,10.2,5.0Hz),2.19(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.11-1.02(27H,m),0.96(3H,s),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.65(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-184.43(tt,J＝47.7,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:447.2[M+Na]+.
G.2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2G.1)和2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(2G.2)
Figure BDA0003125029820000492
使用通用方法B，还原2α-氟-3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸甲酯(270mg,0.64当量,1当量)。经快速色谱法纯化粗产物(PE/丙酮:75:25)，得到33mg纯的7α-OH类似物与140mg 7α-OH和7β-OH差向异构体的混合物。通过快速色谱法再纯化该混合物(PE/EtOAc:60:40→50:50)，进一步得到纯的2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(总计-74mg,0.17mmol,27％)和纯的2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(45mg,0.11mmol,17％)，两者均为树胶状固体。
2G.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.67(1H,d,J＝52.1Hz),3.78(1H,q,J＝2.4Hz),3.59(3H,s),3.37(1H,dddd,J＝28.5,12.0,4.4,2.5Hz),2.46(1H,q,J＝13.0Hz),2.37-2.23(2H,m),2.20-2.10(1H,m),2.04-0.88(27H,m),0.88-0.83(6H,m),0.59(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-202.71(tdd,J＝52.0,27.7,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:407.4[M+H-H2O]+,387.3[M+H-H2O-HF]+.
2G.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.74(1H,d,J＝52.1Hz),3.66(3H,s),3.63-3.35(2H,m),2.43-2.29(2H,m),2.28-2.14(1H,m),2.08-1.00(29H,m),0.96(3H,s),0.92(3H,d,J＝6.2Hz),0.67(3H,s)ppm.
19F NMR(CDCl3,376MHz):δ-202.49(tdd,J＝52.0,29.5,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z 407.4[M+H-H2O]+,387.3[M+H-H2O-HF]+.
H.2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)
Figure BDA0003125029820000501
使用通用方法C，水解2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(105mg,0.25mmol,1当量)，得到2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)(96mg,0.23mmol,94％)，为淡黄色固体。
1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ10.51(1H,br.s),4.58(1H,dq,J＝48.0,2.7Hz),3.96(1H,dq,J＝7.2,3.4Hz),3.91(1H,q,J＝2.8Hz),2.89(1H,tt,J＝14.2,2.6Hz),2.43(1H,ddd,J＝15.5,10.7,5.3Hz),2.30(1H,ddd,J＝15.0,9.4,6.7Hz),2.20-2.06(4H,m),2.01-1.13(21H,m),1.11-0.97(6H,m),0.78(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-184.37(tt,J＝49.4,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI-)m/z:409.1[M-H]-,819.5[M-H]-.
I.2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)
Figure BDA0003125029820000511
使用通用方法C，水解2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(90mg,0.21mmol,1当量)，得到2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)(80mg,0.19mmol,93％)，为无色固体。
1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ10.43(br.s),4.58(1H,dq,J＝48.0,3.1Hz),3.99(1H,dq,J＝7.1,3.3Hz),3.57(1H,tdd,J＝10.2,5.0,1.0Hz),2.42(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.29(1H,ddd,J＝15.8,9.2,6.8Hz),2.22-2.06(4H,m),2.04-1.14(23H,m),1.07(3H,s),1.05(3H,d,J＝6.6Hz),0.79(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-184.29(tt,J＝49.4,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI-)m/z:409.1[M-H]-,819.5[2M-H]-.
J.2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)
Figure BDA0003125029820000512
使用通用方法C，水解2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(74mg,0.17mmol,1当量)，得到2α-氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)(65mg,0.16mmol,93％)，为无色固体。
1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ4.65(dq,J＝52.3,1.7Hz),3.81(1H,q,J＝2.8Hz),3.40(1H,dddd,J＝29.7,12.0,3.9,2.1Hz),2.69(1H,q,J＝12.6Hz),2.39-2.16(3H,m),2.02-1.01(25H,m),0.98-0.91(6H,m),0.69(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-200.79(tdd,J＝51.2,29.5,8.7Hz)ppm.
LRMS(ESI-)m/z:841.4[2M+H]+,393.4[M+H-H2O]+,375.4[M+H-H2O-HF]+,373.4[M+H-2H2O]+.
K.2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)
Figure BDA0003125029820000521
使用通用方法C，水解2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(44mg,0.10mmol,1当量)，得到2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)(40mg,0.97mmol,97％)，为无色固体。
1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ4.67(1H,dq,J＝52.1,1.7Hz),3.61-3.42(2H,m),2.39-2.15(3H,m),2.02-1.06(29H,m),0.99-0.93(6H,m),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-200.58(tdd,J＝50.7,30.3,6.9Hz)ppm.
LRMS(ESI-)m/z:393.4[M+H-H2O]+,375.4[M+H-H2O-HF]+,373.4[M+H-2H2O]+。
实施例3：2,2-二氟代类似物的合成
A.3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3A.1)
Figure BDA0003125029820000522
使用通用方法A，保护UDCA(100g,250mmol,1当量)，得到3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯，为白色固体(103g,250mmol,定量)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.66(3H,s),3.73-3.63(2H,m),3.58(2H,td,J＝10.4,5.3Hz),2.35(1H,ddd,J＝15.3,10.1,4.8Hz),2.21(1H,ddd,J＝15.6,9.6,6.4Hz),1.99(1H,dt,J＝12.3,2.8Hz),1.95-0.97(26H,m),0.94(3H,s),0.92(3H,d,＝6.4Hz),0.67(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:389.5[M+H-H2O]+,371.5[M+H-2H2O]+.
数据与文献一致性(m.p.除外)；参见J.Ren,Y.Wang,J.Wang,J.Lin,K.Wei、R.Huang,Steroids 2013,78,53-58.
B.3α-乙酰氧基-7β-羟基-5β-胆烷酸甲酯(3B.1)
Figure BDA0003125029820000531
将3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(30.0g,73.8mmol,1当量)、乙酐(35mL,369mmol,1当量)和NaHCO3(37.2g,443mmol,6当量)溶于THF(600mL)，将该反应混合物温热至85℃过夜。冷却反应混合物，过滤，真空浓缩上清液，得到粗残余物。将其溶于EtOAc和盐水(各300mL)，然后分离各层，再用EtOAc(2×200mL)萃取水层。干燥合并的有机层(Na2SO4)，浓缩得到37g澄清树胶状物/液体。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:85:15→80:20→70:30)，得到3α-乙酰氧基-7β-羟基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(25.3g,56.4mmol,76％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.64(1H,tt,J＝10.5,5.5Hz),3.64(3H,s),3.55(1H,ddd,J＝11.5,8.7,5.1Hz),2.33(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.20(1H,ddd,J＝15.6,9.6,6.4Hz),2.00(3H,s),1.97-0.98(24H,m),0.93(3H,s),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:471.5[M+Na]+,371.4[M+H-H2O-HOAc]+.
C.3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3C.1)
Figure BDA0003125029820000532
使用通用方法K，将3α-乙酰氧基-7β-羟基-5β-胆烷酸甲酯(72g,160.5mmol)保护为MOM醚。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:85:15→80:20→70:30→60:40)，得到3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(62g,126mmol,79％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.70-4.61(1H,m),4.60(2H,s),3.64(3H,s),3.39-3.25(4H,m),2.33(ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.19(1H,ddd,J＝15.5,9.6,6.4Hz),2.00(3H,s),1.90-0.98(25H,m),0.94(3H,s),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:515.5[M+Na]+,371.5[M+H-HOCH2OCH3-HOAc]+.
D.3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3D.1)
Figure BDA0003125029820000541
使用通用方法E，水解3α-乙酰氧基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(82g,166mmol,1当量)，得到3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状物(75g,166mmol,定量收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.61(2H,s),3.65(3H,s),3.56(1H,tt,J＝10.5,5.0Hz),3.41-3.25(4H,m),2.34(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.20(1H,ddd,J＝15.5,9.6,6.4Hz),2.02-1.90(1H,m),1.89-1.72(6H,m),1.70-0.97(19H,m),0.94(3H,s),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.66(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:371.5[M+H-HOCH2OCH3-H2O]+.
E.7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯(3E.1)和7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(3E.2)
Figure BDA0003125029820000542
将3α-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(75g,166mmol,1当量)溶于DCM(650mL)，用冰冷却至5℃，然后添加二甲基吡啶(58mL<500mmol,3当量)和Tf2O(31mL,183mmol,1.1当量)。将反应混合物温热至8-10℃ 1h，然而，反应未完成，再加入二甲基吡啶(25mL)和Tf2O(15mL)，将RM再温热至12-14℃再经过1.5h。通过TLC分析认定反应完成。使反应混合物干燥上硅胶，经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:98:2→97:3→95:5)，得到7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯和7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯的不可分离的混合物，为淡黄色树胶状物(64.1g,148mmol,89％)。
3E.1/3E.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.74-5.34(2H,m),4.68-4.62(2H,m),3.66(3H,s),3.37(3H,s),3.13(1H,td,J＝10.2,5.0Hz),2.32(1H,ddd,J＝15.5,10.3,5.0Hz),2.26-2.16(1H,m),2.15-1.00(27H,m),0.98(2H,s),0.92(2H,d,J＝6.4Hz),0.86(2H,d,J＝6.6Hz),0.68(3H s)ppm.
F.2α-乙酰氧基-3β-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3F.1)和3β,4β-环氧-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3F.2)
Figure BDA0003125029820000551
将7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-2-烯酸甲酯和7β-甲氧基甲氧基-5β-胆-3-烯酸甲酯(63.0g,146mmol,1当量)的混合物与mCPBA(54.0g,1.5当量)溶于DCM，在RT搅拌1h。用饱和Na2S2O3水溶液(250mL)使RM淬灭，在RT搅拌20min。分离各层，用DCM(300mL)萃取水层。用饱和NaHCO3水溶液(300mL)洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)，浓缩，得到72g淡黄色树胶状物，其包含Δ2β,3β-和Δ3β,4β-环氧化物的不可分离的混合物(推定为定量收率)。然后将该混合物溶于AcOH(600mL)，温热至50℃ 16小时。真空浓缩该反应混合物，然后共沸(EtOAc×3,DCM×1)，然后经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EA:85:15→80:20→70:30→60:40→50:50)，得到2α-乙酰氧基-3β-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(11.1g,21.9mmol,15％-2步)，和3β,4β-环氧-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(40.5g,90mmol,62％-2步)。
3F.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.74(1H,q,J＝3.9Hz),4.62(2H,s),3.79(1H,q,J＝3.7Hz),3.64(3H,s),3.36-3.31(4H,m),2.33(1JH,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.20(1H,ddd,J＝15.5,9.6,6.4Hz),2.03(3H,s),2.01-0.99(29H,m),0.98(3H,s),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:531.6[M+Na]+,387.4[M+H-HOCH2-OCH3-HOCH2OCH3]+.
3F.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.64(2H,s),3.64(3H,s),3.35(3H,s),3.19(1H,br.s),3.10(1H,td,J＝10.8,4.5Hz),2.88(1H,d,J＝3.7Hz),2.32(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.19(1H,ddd,J＝15.5,9.6,6.4Hz),2.12-2.04(1H,m),2.03-0.95(25H,m),0.90(3H,d,J＝6.4Hz),0.87(3H,s),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:417.4[M,部分-MOM裂解]+,387.4[M+H-HOCH2-OCH3]+。
G.2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3G.1)
Figure BDA0003125029820000561
使用通用方法K，将2α-乙酰氧基-3β-羟基-7β-甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(11.0g,21.6mmol,1当量)保护为MOM衍生物，得到2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色油状物/树胶状物(13.0g,定量)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.83(1H,q,J＝3.1Hz),4.62(2H,s),4.62(2H,s),3.67(1H,q,J＝2.9Hz),3.63(3H,s),3.33(3H,s),3.33(3H,s),3.32-3.30(1H,m),2.32(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.19(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.01(3H,s),1.99-1.25(25H,m),0.95(3H,s),0.89(3H,d,J＝6.4Hz),0.65(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:575.6[M+Na]+,491.6[M-HOCH2OCH3]+,429.5[M-2HOCH2OCH3]+.
H.2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3H.1)
Figure BDA0003125029820000571
使用通用方法E，使2α-乙酰氧基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(13.0g,21.6mmol,1当量)甲醇解，得到2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状物(9.5g,18.3mmol,85％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.65(1H,d,J＝6.8Hz),4.62(1H,d,J＝6.8Hz),4.60(1H,d,J＝6.8Hz),4.57(1H,d,J＝6.8Hz),3.65-3.59(4H,m),3.43-3.36(1H,m),3.34(3H,s),3.33-3.31(1H,m),3.31(3H,s),2.96(1H,br.s),2.29(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.16(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),1.97-1.23(21H,m),1.16-0.96(4H,m),0.92(3H,s),0.86(3H,d,J＝6.4Hz),0.61(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:533.7[M+Na]+,399.5[M-HOCH2OCH3-H2O-OMe]+,387.4[M+H-2HOCH2OCH3].
I.2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3I.1)
Figure BDA0003125029820000572
使用通用方法M，氧化2α-羟基-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(9.2g,18.0mmol 1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:80:20→70:30→65:35)，得到2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯，为淡黄色树胶状够固体(8.5g,16.7mmol,93％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.62(2H,d,J＝7.0Hz),4.58(2H,d,J＝7.0Hz),3.76(1H,t,J＝2.6Hz),3.63(3H,s),3.34(3H,s),3.32(3H,s),3.31-3.23(1H,m),2.64(1H,d,J＝12.8Hz),2.38-2.03(5H,m),2.01-1.25(14H,m),1.21-1.10(2H,m),1.09(3H,s),0.87(3H,d,J＝6.4Hz),0.63(3H,s)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:531.6[M+Na]+,477.6[M-OMe]+,415.5[M-HOCH2-OCH3-OMe]+.
J.2,2-二氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(3J.1)和2-氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆-1-烯酸甲酯(3J.2)
Figure BDA0003125029820000581
将2-氧代-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(8.0g,15.7mmol,1当量)溶于DCM(40mL)，然后添加DAST(1004mL,78.6mmol,5当量)，将该反应混合物在RT搅拌5小时。然后用DCM(100mL)稀释混合物，然后滴加至冰冷NaHCO3的饱和溶液(150mL)中，然后搅拌20min。分离各层，然后用DCM(100mL)萃取水层，然后干燥合并的有机层(Na2SO4)，浓缩，得到7.5g浅棕色树胶状物/油状物。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:90:10→85:15→80:20)，得到2,2-二氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1.75g,3.3mmol,21％)与2-氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆-1-烯酸甲酯(970mg,1.9mmol,12％)，两者均为树胶状固体。
3J.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ4.72(1H,d,J＝6.6Hz),4.66(1H,d,J＝6.6Hz),4.63(2H,s),3.81(1H,br.s),3.66(3H,s),3.38(3H,s),3.36(3H,s),3.31-3.21(1H,s),2.34(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.21(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.12(1H,br.s),2.05-1.08(25H,m),1.04(3H,s),0.92(3H,d,J＝6.4Hz),0.67(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-99.89(d,J＝259.0Hz)、-102.89(ddt,J＝250.6,40.7,5.0Hz)ppm
LRMS(ESI+)m/z:553.5[M+Na]+,437.5[M-HOCH2OCH3-OCH3]+.
3J.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.39(1H,d,J＝17.7Hz),4.71(1H,d,J＝6.8Hz),4.69(1H,d,J＝6.8Hz),4.64(2H,s),4.12-4.08(1H,m),3.66(3H,s),3.40(3H,s),3.36(3H,s),3.27-3.17(1H,m),2.34(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.21(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.12-1.14(24H,m),1.12(3H,s),1.10-0.96(2H,m),0.91(3H,d,J＝6.4Hz),0.68(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-115.57(dt,J＝17.0,8.5Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:448.6[M+H-HOCH2OCH3]+,387.4[M+H-2HOCH2-OCH3]+.
K.2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3K.1)
Figure BDA0003125029820000591
按照通用方法L，使2,2-二氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆烷酸甲酯(1.5g,1.76mmol,1当量)脱保护，得到2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯，为树胶状固体(1.3g,定量收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.89(1H,t,J＝5.7Hz),3.67(3H,s),3.54(1H,ddd,J＝11.6,9.2,5.1Hz),2.36(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.22(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.17-1.07(27H,m),1.05(3H,s),0.93(3H,d,J＝6.4Hz),0.69(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-100.05(d,J＝251.4Hz)、-105.16(ddt,J＝252.1,40.5,7.2Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:425.5[M+H-H2O]+,405.5[M+H-H2O-HF]+.
L.2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯(3L.1)+水合物(3L.2)
Figure BDA0003125029820000601
使用通用方法M，氧化2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(1.0g,2.26mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯+水合物的混合物(900mg,2.05mmol,91％-合并收率)。
3L.1 1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.67(3H,s),2.93(1H,ddd,J＝13.2,5.5,0.8Hz),2.77-2.63(2H,m),2.52-1.38(23H,m),1.37(3H,s),1.35-0.96(6H,m),0.94(3H,d,J＝6.5Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-104.37(ddd,J＝263.6,39.9,12.1Hz)、-111.15(dq,J＝263.6,5.0Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:439.5[M+H]+.
3L.2 LRMS(ESI+)m/z:457.5[M+H]+.
M.2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3M.1)+2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(3M.2)
Figure BDA0003125029820000602
使用通用方法B，还原2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯和水合物的混合物(750mg,1.71mmol,1当量)。经快速色谱法纯化粗产物(石油醚/EtOAc:70:30→60:40→50:50)，得到2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(300mg,0.68mmol,40％)和2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(26mg,0.06mmol,4％)。
3M.1:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.86(1H,q,J＝2.7Hz),3.67(3H,s),3.65-3.56(1H,m),2.54(1H,q,J＝13.2Hz),2.47-2.31(2H,m),2.28-2.17(1H,m),2.05-1.04(19H,m),1.00(3H,s),0.94(3H,d,J＝6.5Hz),0.67(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-101.58(dquin,J＝235.8,5.2Hz)、-119.95(dddd,J＝235.8,39.9,20.8,10.4Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:425.5[M+H-H2O]+.
3M.2:1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.73(1H,ddt,J＝19.7,10.9,5.4Hz),3.67(3H,s),3.57(1H,ddd,J＝11.3,9.5,5.1Hz),2.43-2.30(2H,m),2.22(2H,ddd,J＝15.7,9.4,6.6Hz),2.04-1.05(31H,m),1.02(3H,s),0.93(3H,d,J＝6.4Hz),0.68(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-101.31(dquin,J＝237.6,5.2Hz)、-119.06(dddd,J＝237.6,38.2,19.0,10.2Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:425.5[M+H-H2O]+。
N.2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)
Figure BDA0003125029820000611
使用通用方法C，水解2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)，为淡黄色固体(50mg,0.12mmol,83％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.89(1H,br.s),3.55(1H,ddd,J＝11.4,9.2,5.2Hz),2.39(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.26(1H,ddd,J＝15.8,9.4,6.5Hz),2.18-1.07(26H,m),1.05(3H,s),0.94(3H,d,J＝6.5Hz),0.69(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-100.00(d,J＝253.2Hz)、-105.12(ddt,J＝251.4,41.6,8.0Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:411.5[M+H-H2O]+,391.5[M+H-H2O-HF]+.
O.2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)
Figure BDA0003125029820000621
使用通用方法C，2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(75mg,0.17mmol,1当量)水解，得到2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)，为白色固体(70mg,0.16mmol,96％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ33.86(1H,q,J＝2.0Hz),3.62(1H,ddt,J＝19.7,10.9,5.4Hz),2.54(1H,q,J＝13.0Hz),2.44-2.35(2H,m),2.25(1H,ddd,J＝15.9,9.6,6.5Hz),2.02-1.02(25H,m),0.99(3H,s),0.94(3H,d,J＝6.4Hz),0.67(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-119.67(d,J＝235.8Hz)、-119.67(dddd,J＝235.8,38.2,19.1,10.4Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:411.5[M+H-H2O]+,393.4[M+H-2H2O]+.
P 2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸(对比化合物E)+水合物(3P.1)
Figure BDA0003125029820000622
使用通用方法C，水解2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸甲酯和水合物(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3,7-二氧代-5β-胆烷酸(化合物E)和水合物，为白色固体，为酮/水合物/乙缩醛加合物的混合物(55mg,0.13mmol,93％)。
1H NMR(400MHz,CD3CN):δ2.93(1H,dd,J＝13.1,5.9Hz),2.90-2.84(1H,m),2.70-1.97(9H,m),1.93-0.93(19H,m),0.91(2H,d,J＝6.4Hz),0.89(1H,d,J＝6.4Hz),0.67(2H,s),0.64(1H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CD3CN):δ-103.96(1F,ddd,J＝261.6,38.1,15.0Hz)、-108.59(0.2F,ddd,J＝246.2,39.0,11.3Hz)、-110.91(1F,dq,J＝263.6,5.2Hz)、-113.71--112.69(0.1F,dq,J＝246.2,5.2Hz)、-116.15(0.1F,dq,J＝246.2,5.2Hz)、-117.09(0.2F,dq,J＝246.2,5.2Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:酮:425.5[M+H]+；水合物:443.5[M+H]+；半缩醛:457.7[M+H]+,439.5[M+H-H2O]+；乙缩醛:443.5[M+H]+,439.5[M+H-MeOH]+.
Q.2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)
Figure BDA0003125029820000631
使用通用方法C，水解2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸甲酯(25mg,0.06mmol,1当量)，得到2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)，为树胶状固体(20mg,0.05mmol,78％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ3.69(1H,ddt,J＝21.0,11.0,5.0Hz),3.44(1H,ddd,J＝11.5,9.8,5.0Hz),2.38-2.26(2H,m),2.25-2.14(2H,m),2.08-1.06(32H,m),1.03(3H,s),0.96(3H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CD3OD):δ-101.64(dquin,J＝239.3,5.0Hz)、-120.18(dddd,J＝239.3,38.2,20.8,10.4Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:411.4[M+H-H2O]+,393.3[M+H-2H2O]+.
实施例4：化合物9的偶联物的合成
A.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙磺酸钠(化合物10)
Figure BDA0003125029820000641
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(7.4mg,0.017mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙,磺酸钠，为澄清残余物(7.4mg,77％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.61–3.56(2H,m),3.40(1H,ddd,J＝14.6,9.7,5.2Hz),2.95(2H,app.t.,J＝6.9Hz),2.24(1H,ddd,J＝15.0,10.6,5.2Hz),2.12–1.07(23H,m),1.05(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.5Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-101.00(d,J＝251.4Hz)、-105.55(ddt,J＝250.3,40.3,7.8Hz)ppm.
LRMS(ESI-):[M-Na]-计算值534.2706；测定值534.2709.
B.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸钠(化合物11)
Figure BDA0003125029820000642
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸钠，为澄清残余物(17.66mg,73％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.45-3.35(3H,m),2.40–2.30(2H,m),2.23(1H,m),2.12–1.06(23H,m),1.05(3H,s),0.96(3H,d,J＝6.4Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.62(d,J＝250.4Hz)、-105.55(ddt,J＝250.4,40.8,7.6Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值522.3002；测定值522.3007.
C.N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸(化合物12)
Figure BDA0003125029820000651
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.36mg,0.059mmol)，得到N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸，为澄清残余物(13.3mg,45％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.96(2H,br.d,J＝18.1Hz),3.78(1H,br.s),3.40(1H,m),3.08(1.5H,s),2.94(1.5H,s),2.48(1H,m),2.41-1.06(23H,m),1.05(1.5H,s),1.05(1.5H,s),1.00(1.5H,d,J＝6.5Hz),0.96(1.5H,d,J＝6.5Hz),0.73(1.5H,s),0.71(1.5H,s)ppm；19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.62(d,J＝250.7Hz)、-105.55(ddt,J＝250.0,40.2,7.2Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值522.3002；测定值522.2998.
D.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸钠(化合物13)
Figure BDA0003125029820000652
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸钠，为澄清残余物(18.18mg,68％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.89-3.72(2H,m),3.40(1H,m),2.28-1.06(33H,m),1.05(3H,s),0.96(3H,d,J＝6.5Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F{1H}NMR(376MHz,MeOD)δ-100.61(d,J＝249.4Hz)、-105.55(d,J＝250.2,4Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值554.3652；测定值554.3656.
E.1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸钠(化合物14)
Figure BDA0003125029820000661
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸钠，为残余物(21.88mg,83％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.41(1H,ddd,J＝14.8,9.9,5.2Hz),2.57-1.07(33H,m),1.05(3H,s),0.99(3H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.63(d,J＝250.3Hz)、-105.55(ddt,J＝249.8,40.9,7.8Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值540.3495；测定值540.3507.
F.3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸钠(化合物15)
Figure BDA0003125029820000662
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸钠，为残余物(21.41mg,81％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.90-4.78(0.4H,m),4.77(0.6H,d,J＝9.8Hz),4.71(0.4H,d,J＝8.4Hz),4.60(0.4H,d,J＝8.4Hz),4.59(0.6H,m),4.48(0.6H,d,J＝9.8Hz),3.78(1H,br.s),3.46-3.15(3H,m),2.58-1.07(24H,m),1.04(3H,br.s),0.99(1.2H,d,J＝6.5Hz),0.96(1.8H,d,J＝6.5Hz),0.73(1.2H,s),0.71(1.8H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.63(d,J＝249.1Hz)、-105.52(ddt,J＝250.1,41.4,7.8Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值544.2903；测定值544.2904.
G.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉(化合物16)
Figure BDA0003125029820000671
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉，为澄清残余物(9.83mg,65％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.72-3.59(4H,m),3.59-3.50(4H,m),3.40(1H,ddd,J＝14.8,9.7,5.2Hz),2.42(1H,m),2.30(1H,m),2.13-1.06(22H,m),1.05(3H,s),0.99(3H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-101.64(d,J＝250.3Hz)、-105.55(ddt,J＝249.6,40.6,7.8Hz)ppm
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值498.3389；测定值498.3394.
H.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸钠(化合物17)
Figure BDA0003125029820000672
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸钠，为澄清残余物(18.12mg,77％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.75(2H,s),3.40(1H,ddd,J＝14.8,9.7,5.2Hz),2.30(1H,m),2.13-1.06(23H,m),1.05(3H,s),0.98(3H,d,J＝6.4Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-101.61(d,J＝249.7Hz)、-105.55(ddt,J＝249.6,40.6,7.8Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值486.3026；测定值486.3029.
I.N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸二钠(化合物18)
Figure BDA0003125029820000681
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸二钠，为澄清残余物(14.81mg,59％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.00(4H,d,J＝19.4Hz),3.78(1H,br.s),3.40(1H,ddd,J＝14.8,9.7,5.2Hz),2.42(1H,m),2.23(1H,m),2.14-1.07(22H,m),1.05(3H,s),0.96(3H,d,J＝6.4Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.65(d,J＝250.7Hz)、-105.55(ddt,J＝249.6,40.6,7.8Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值544.3080；测定值544.3081.
J.N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)乙磺酸钠(化合物19)
Figure BDA0003125029820000682
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙,磺酸钠，为澄清残余物(9.49mg,36％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.84-3.68(3H,m),3.40-3.36(1H,m),3.11(1.5H,s)3.08-2.99(2H,m),2.92(1.5H,m),2.57-1.07(23H,m),1.05(3H,s),0.99(1.5H,d,J＝6.5Hz),0.98(1.5H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.64(d,J＝249.4Hz)、-105.54(ddt,J＝250.3,40.3,7.8Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值572.2828；测定值572.2830.
K.3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸钠(化合物20)
Figure BDA0003125029820000691
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.0mg,0.058mmol)，得到3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸钠,，为澄清残余物(25.44mg,76％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.40(1H,ddd,J＝14.6,9.7,5.2Hz),3.33-3.25(2H,m),2.86-2.78(2H,m),2.24(1H,m),2.17-1.07(25H,m),1.05(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.59(d,J＝250.1Hz)、-105.55(ddt,J＝249.4,40.8,7.5Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值594.2647；测定值594.2648.
L.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸钠(化合物21)
Figure BDA0003125029820000692
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(25.0mg,0.058mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸钠，为澄清残余物(27.63mg,87％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.32(1H,d,J＝17.8Hz),4.28(1H,d,J＝17.8Hz),3.78(1H,br.s),3.41(1H,ddd,J＝14.6,9.8,5.1Hz),2.33(1H,m),2.25-1.07(23H,m),1.05(3H,s),0.98(3H,d,J＝6.4Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.61(d,J＝250.8Hz)、-105.55(ddt,J＝249.4,40.8,7.5Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M-2H+D+2Na]+计算值567.2397；测定值567.2387.
M.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸钠(化合物22)
Figure BDA0003125029820000701
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(30.0mg,0.070mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸钠。H NMR(400MHz,MeOD)δ4.04(2H,app.t,J＝5.5Hz),3.78(1H,br.s),3.44(2H,app.t,J＝5.5Hz),3.41(1H,m),2.26(1H,ddd,J＝15.5,10.5,5.2Hz),2.18-1.06(23H,m),1.05(3H,s),0.98(3H,d,J＝6.5Hz),0.71(3H,s)ppm。
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.59(d,J＝250.0Hz)、-105.48(ddt,J＝249.4,40.8,7.5Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值574.2621；测定值574.2620.
N.O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙磺酸钠(化合物23)
Figure BDA0003125029820000702
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙磺酸钠，为澄清残余物(15.06mg,58％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.42(2H,app.t,J＝7.0Hz),3.78(1H,br.s),3.41(1H,ddd,J＝14.8,9.8,5.0Hz),3.12(2H,app.t,J＝7.2Hz),2.39(1H,m),2.26(1H,m),2.14-1.06(22H,m),1.05(3H,s),0.95(3H,d,J＝6.7Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.65(d,J＝250.5Hz)、-105.48(ddt,J＝249.8,40.9,7.6Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值581.2331；测定值581.2332.
O.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸钠(化合物24)
Figure BDA0003125029820000711
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸钠，为白色残余物(24.04mg,85％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.30(1H,d,J＝8.2Hz),7.86(1H,dd,J＝7.9,1.5Hz),7.40(1H,m),7.12(1H,m),3.79(1H,br.s),3.41(1H,ddd,J＝14.8,9.8,5.0Hz),2.50(1H,m),2.34(1H,m),2.15-1.08(22H,m),1.05(3H,s),1.02(3H,d,J＝6.3Hz),0.73(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.62(d,J＝251.2Hz)、-105.49(ddt,J＝249.3,40.6,7.2Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M-H+2Na]+计算值628.2491；测定值628.2494.
P.N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸钠(化合物25)
Figure BDA0003125029820000712
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸钠，为澄清残余物(27.97mg,92％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.17(0.4H,m),3.78(1H,br.s),3.62(0.6H,m),3.45-3.33(3H,m),2.87-2.75(2H,m),2.41(1H,m),2.30(1H,m),2.14-1.07(34H,m),1.05(3H,br.s),1.02-0.97(3H,m),0.73(1.8H,s),0.72(1.2H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.60(d,J＝249.8Hz)、-105.48(ddt,J＝250.1,41.0,7.6Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值654.3610；测定值654.3606.
Q.N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸钠(化合物26)
Figure BDA0003125029820000721
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸钠，为澄清残余物(28.41mg,95％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.73-3.56(3H,m),3.40(1H,ddd,J＝14.7,9.7,5.0Hz),3.09-2.96(2H,m),2.44(1H,m),2.31(1H,m),2.15-1.07(32H,m),1.05(3H,br.s),1.02-0.97(3H,m),0.73(1.8H,s),0.72(1.2H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.57(d,J＝251.0Hz)、-105.49(ddt,J＝250.3,40.9,7.0Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M-H+2Na]+计算值662.3273；测定值662.3285.
R.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜(化合物27)
Figure BDA0003125029820000731
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜，为澄清残余物(22.49mg,90％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.62(2H,app.t,J＝6.7Hz),3.40(1H,ddd,J＝14.7,9.6,4.9Hz),3.29(2H,app.t,J＝6.5Hz),2.99(3H,s),2.26(1H,ddd,J＝15.3,10.4,5.3Hz),2.17-1.06(23H,m),1.05(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.4Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.60(d,J＝249.7Hz)、-105.49(ddt,J＝249.9,41.2,7.1Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+Na]+计算值556.2879；测定值556.2873.
S.N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物28)
Figure BDA0003125029820000732
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物，为澄清残余物(20.71mg,77％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.56(1H,m),3.78(1H,br.s),3.51(4H,m),3.33-3.21(2H,m),3.08(1H,m),2.63-1.06(29H,m),1.05(3H,s),0.99(3H,d,J＝6.5Hz),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.59(d,J＝250.4Hz)、-105.48(ddt,J＝250.4,41.5,7.4Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值574.3372；测定值574.3370.
T.N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物29)
Figure BDA0003125029820000741
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物，为残余物(23.90mg,76％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ3.78(1H,br.s),3.50-0.88(m),0.72(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.56(d,J＝250.5Hz)、-105.49(m)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值673.4420；测定值673.4430.
U.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物(化合物30)
Figure BDA0003125029820000742
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物，为澄清残余物(22.2mg,87％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.09-3.93(4H,m),3.78(1H,br.s),3.40(1H,ddd,J＝14.6,9.6,5.1Hz),3.23-3.04(4H,m),2.52(1H,m),2.38(1H,m),2.14-1.07(22H,m),1.05(3H,s),0.99(3H,d,J＝6.6Hz),0.73(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.63(d,J＝249.3Hz)、-105.54(ddt,J＝250.6,41.6,7.5Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值546.3059；测定值546.3065.
V.N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺(化合物31)
Figure BDA0003125029820000751
使用通用方法Q，偶联2,2-二氟-3a,7a-二羟基-5β-胆烷酸(20.0mg,0.047mmol)，得到N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺，为残余物(22.44mg,88％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ4.26(1H,tt,J＝11.1,3.6Hz),3.78(1H,br.s),3.40(1H,ddd,J＝14.5,10.0,5.1Hz),3.27(1H,m),3.08-2.91(3H,m),2.30-1.06(26H,m),1.05(3H,s),0.97(3H,d,J＝6.5Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,MeOD)δ-100.63(d,J＝250.3Hz)、-105.49(ddt,J＝250.7,41.5,7.9Hz)ppm.
HRMS(ESI+):[M+H]+计算值560.3216；测定值560.3217。
对比实施例5：2-氟烯烃化合物的合成
A.2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(4A.1)
Figure BDA0003125029820000752
使用通用方法L，使来自实施例4J的2-氟-3β,7β-二甲氧基甲氧基-5β-胆-1-烯酸甲酯(900mg,1.76mmol,1当量)脱保护，得到2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯，为白色树胶状固体(750mg,定量收率)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.34(1H,d,J＝17.6Hz),4.20(1H,ddd,J＝7.7,4.7,1.3Hz),3.67(3H,s),3.50(1H,ddd,J＝11.2,9.6,4.8Hz),2.35(1H,ddd,J＝15.6,10.5,5.0Hz),2.22(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.12(1H,td,J＝14.0,5.3Hz),2.04-1.21(23H,m),1.12(3H,d,J＝0.7Hz),0.92(3H,d,J＝6.5Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-117.65(dt,J＝17.0,8.5Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:405.5[M+H-H2O]+,387.5[M+H-2H2O]+.
B.2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯(4B.1)
Figure BDA0003125029820000761
使用通用方法M，氧化2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(600mg,1.42mmol,1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:80:20→70:30→60/40)，得到2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯，为树胶状固体(400mg,0.96mmol,67％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.34(1H,d,J＝14.7Hz),3.66(3H,s),2.89(1H,dd,J＝12.8,5.9Hz),2.61(1H,dtd,J＝13.5,5.8,2.0Hz),2.55-2.11(7H,m),2.07(1H,dd,J＝13.2,2.0Hz),2.04-1.71(5H,m),1.51(3H,s),1.49-0.94(8H,m),0.92 3H,(d,J＝6.4Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-131.67(dd,J＝15.6,3.5Hz),ppm.
LRMS(ESI+)m/z:419.5[M+H]+,460.5[M+H+MeCN]+.
C.2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(4C.1)
Figure BDA0003125029820000762
使用通用方法B，还原2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(400mg,0.96mmol,1当量)，然后经快速色谱法纯化(石油醚/EtOAc:70:30→60:40→50:50)，得到2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯，为树胶状固体(99mg,0.22mmol,25％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ5.25(1H,d,J＝18.2Hz),4.35(1H,t,J＝7.9Hz),3.85(1H,q,J＝1.7Hz),3.67(3H,s),3.65(1H,d,J＝1.8Hz),2.53-2.32(2H,m),2.29-2.17(1H,m),2.04-1.07(29H,m),1.04(3H,d,J＝0.9Hz),0.93(3H,d,J＝6.4Hz),0.68(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-125.36(dd,J＝19.1,6.9Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:405.5[M+H-H2O]+,387.5[M+H-2H2O]+.
D.2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸(对比化合物F)
Figure BDA0003125029820000771
使用通用方法C，水解来自步骤A的2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(60mg,0.14mmol,1当量)，得到2-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆-1-烯酸(化合物F)，为白色固体(40mg,0.10mmol,70％)。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ5.32(1H,d,J＝17.7Hz),4.10(1H,ddd,J＝8.0,4.5,1.0Hz),3.38(1H,td,J＝10.5,4.8Hz),2.40-1.15(29H,m),1.13(3H,s),0.95(3H,d,J＝6.5Hz),0.73(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CD3OD):δ-117.71(dt,J＝15.6,7.6Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:391.5[M+H-H2O]+,373.5[M+H-2H2O]+.
E.2-氟-3,7-二氧代-5β-胆-1-烯酸(对比化合物G)
Figure BDA0003125029820000772
使用通用方法C，水解来自步骤B的2-氟-3,7-二-氧代-5β-胆-1-烯酸甲酯(50mg,0.12mmol,1当量)，得到2-氟-3,7-二氧代-5β-胆-1-烯酸(化合物G)，为白色固体(45mg,0.11mmol,93％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ6.34(1H,d,J＝14.7Hz),2.89(1H,dd,J＝13.0,6.1Hz),2.62(1H,dtd,J＝13.5,5.8,2.0Hz),2.55-1.73(13H,m),1.51(3H,s),1.49-0.95(9H,m),0.93(3H,d,J＝6.4Hz),0.70(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,CDCl3):δ-131.63(dd,J＝13.9,3.5Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:405.4[M+H]+,446.5[M+H+MeCN]+.
F.2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸(对比化合物H)
Figure BDA0003125029820000781
使用通用方法C，水解来自步骤C的2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸甲酯(50mg,0.11mmol,1当量)，得到2-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆-1-烯酸(化合物H)，为浅白色固体(45mg,0.11mmol,97％)。
1H NMR(400MHz,丙酮-D6):δ5.16(1H,d,J＝18.6Hz),4.23(1H,ddd,J＝9.0,7.0,2.5Hz),4.07(1H,br.s),3.82(1H,q,J＝2.7Hz),3.32(1H,br.s),2.54(1H,td,J＝13.7,10.0Hz),2.34(1H,ddd,J＝15.5,11.0,5.0Hz),2.21(1H,ddd,J＝15.6,9.4,6.5Hz),2.02-1.06(25H,m),1.05(3H,d,J＝1.0Hz),0.96(3H,d,J＝6.6Hz),0.71(3H,s)ppm.
19F NMR(376MHz,丙酮-D6):δ-123.32(dd,J＝19.1,6.9Hz)ppm.
LRMS(ESI+)m/z:373.5[M+H-2H2O]+。
生物学实施例
缩写
Figure BDA0003125029820000782
Figure BDA0003125029820000791
实施例6
A.原代成纤维细胞的培养、iNPC的产生和培养
将成纤维细胞在DMEM(Invitrogen)中培养，每3-5天使用胰蛋白酶常规传代一次，以便将它们分离。如前所述产生诱导的神经祖细胞(iNPC)(Meyer等人“Direct conversionof patient fibroblasts demonstrates non-cell autonomous toxicity ofastrocytes to motor neurons in familial and sporadic ALS”Proc Natl Acad SciUSA 2014)。将iNPC维持在纤连蛋白(Millipore)包被的组织培养皿中的DMEM/Ham F12(Invitrogen)；N2、B27补充剂(Invitrogen)和FGFb(Peprotech)中，并且每2-3天使用Accutase常规传代一次，以便使它们脱粘附。
B.iNPC的多巴胺能神经元分化
简言之，将iNPC接种在6孔板中，在含有GlutamaxTM的DMEM/F-12培养基中培养2天，该培养基补充有1％NEAA、2％B27(Gibco)和2.5μM DAPT。在第3天，去除DAPT并在培养基中补充1μM平滑激动剂(SAG)和FGF8(75ng/ml)，再持续10天。将神经元在该阶段重新铺板。随后撤回SAG和FGF8，并用BDNF(30ng/ml)、GDNF(30ng/ml)、TGF-b3(2mM)和dcAMP(2mM,Sigma)替换15天。
C.免疫荧光染色和ELISA
将细胞接种于96孔板中，使用4％多聚甲醛固定30分钟。PBS洗涤细胞后，使用0.1％TritonTM X-100透化细胞10分钟，使用5％山羊血清封闭1小时。将细胞与一抗酪氨酸羟化酶(St John's Laboratory)；DAT(Abcam)；Tuj(Millipore)；Tom20(BD Biosciences)；激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cell Signaling)；α突触核蛋白(Cell Signaling)；磷酸化α突触核蛋白(Millipore)一起在4℃温育16小时。在成像前使用
Figure BDA0003125029820000801
洗涤细胞并与Alexa FluorTM偶联的二抗488和568(Invitrogen)以及Hoescht(Sigma)1μM一起温育。使用Opera PhenixTM高容量成像系统(Perkin Elmer)进行成像。
按照制造商的说明使用多巴胺研究ELISA试剂盒(Labor Diagnostika NordGmbH&Co.KG)进行多巴胺ELISA。多巴胺释放是在37℃下温育细胞获得，每行同时使用三种不同的条件。去除所有孔中的培养基，然后第一个孔在含Ca2+和Mg2+的HBSS(LifeTechnologies的Gibco)中温育30分钟，第二个孔在含Ca2+和Mg2+的HBSS中温育15分钟，然后加入56mM KCl(Fisher化学品)再经过15分钟，第三个孔与不含Ca2+和Mg2+、但含有2mM EDTA的HBSS(Life Technologies的Gibco)一起温育15分钟，然后再加入56mM KCl再经过15分钟。立刻将培养基采集在eppendorf中并使用
Figure BDA0003125029820000802
收获细胞，以400g离心4分钟并重悬于10μl PBS中。将EDTA 1mM和焦亚硫酸氢钠(Sigma)4mM添加到培养基和沉淀物中以保留多巴胺。
MMP方案
培养成纤维细胞并以每孔10000个细胞在Griener黑色384μ
Figure BDA0003125029820000803
板中的50μl培养基体积中铺板。将板在温育箱中放置过夜，使成纤维细胞粘附在板表面。第二天早上，将基于葡萄糖的培养基替换为25μl的基于半乳糖的培养基。然后使用
Figure BDA0003125029820000811
550液体处理系统向板中加入化合物。对各孔进行给药以提供0.06nM-300nM的8个点浓度范围的化合物。给药后，孔中再加入25μl基于半乳糖的培养基，然后在温育箱中放置24小时。24小时后，将培养基从孔中去除并替换为25ul不含苯酚的最小必需培养基，其中含有100nM TMRM(Sigma)和10μM Hoechst染料(Sigma)。将板放回温育箱再放置一小时，然后去除染色培养基并更换为25ul不含苯酚的MEM。然后使用IN Cell高容量显微镜(GE Healthcare)在37℃和CO2下对板成像，每孔以2通道10个视野，Cy3激发542nm，发射604-64nm；DAPI激发350nm，发射450-55nm。对板进行成像处理后使用INCell开发人员工具包(GE Healthcare)对图像进行数据挖掘。
ATP方案
ATP方案一般如Mortiboys等人“Mitochondrial function and morphology areimpaired in parkin-mutant fibroblasts”,Ann Neurol.2008年11月；64(5):555-65中所述进行。简言之，将成纤维细胞培养并接种到白色384孔板中，每孔5000个细胞且培养基体积为50μl。将板在温育箱中放置过夜，使成纤维细胞粘附在板表面。第二天早上，将基于葡萄糖的培养基替换为25μl的基于半乳糖的培养基。使用ECHO 550液体处理系统将化合物添加到板中。对孔进行给药以提供0.06nM-300nM的8个点浓度范围的化合物。给药后，向孔中再加入25μl基于半乳糖的培养基，然后在培养箱中放置24小时。在此温育之后，将培养基从板中除去，并用无菌PBS将孔洗涤两次。向孔中填充25μl无菌PBS，然后加入12.5μl来自ATPliteTM发光ATP检测分析系统(Perkin Elmer)的裂解溶液，包括16个无细胞的孔用作空白对照。然后将板置于旋转振荡器上，以700rpm持续5分钟。振摇后，将12.5μl ATP底物溶液(Perkin Elmer)添加到每个孔中，再振摇5分钟。然后在读数前将板置于黑暗中10分钟。使用
Figure BDA0003125029820000812
读板器，记录发光强度。在ATP检测之后，立即在
Figure BDA0003125029820000813
检测中检测板的DNA含量。
ATP检测后立即用
Figure BDA0003125029820000814
NF细胞增殖检测试剂盒(ThermoFisher)评价DNA含量。
Figure BDA0003125029820000821
缓冲液在测定前立即制备，且每ml x1 HBSS溶液含有1ul
Figure BDA0003125029820000822
染料。向每个孔中加入12.5ul
Figure BDA0003125029820000823
缓冲液。将板在温育箱中放置1小时，然后在
Figure BDA0003125029820000824
板读数器上读取，激发波长为497nm，发射波长为520nm。
使用如下公式确定每个孔的ATP定量：
Figure BDA0003125029820000825
初级筛选试验的数据分析
在每行和每化合物一式三份重复测定后，将数据输入到Graph pad Prism 7软件组中，其中使用默认的“[激动剂]与响应的关系(三个参数)”方程生成剂量响应曲线。
Figure BDA0003125029820000826
根据EC50值，取得最低响应和最大响应并用于计算评价的5个不同行之间的几何平均值。
来自显示为“[激动剂]与响应的关系(三个参数)”方程结果不明确的化合物的结果被排除在几何平均值计算之外，因为包含它们会引入高偏离。
Seahorse试验
将成纤维细胞在Seahorse 24孔板中铺板，每孔有50,000个细胞。使细胞附着2天。将培养基更换为含有葡萄糖和丙酮酸钠的Seahorse DMEM培养基，并在37度正常空气CO2下平衡1小时。将板放入Seahorse仪器中并按照混合(2分钟)、等待(3分钟)和测量(3分钟)的程序运行。经过三次基础呼吸和ECAR测量后；注入0.5μM寡霉素，然后再进行3次测量；然后注入0.5μM FCCP并进行三次测量，最后注射1μM鱼藤酮并进行三次测量。在所有测量完成后，将细胞用10μM Hoescht染色并使用InCell成像以计数每孔的细胞数用于标准化。这种经典的线粒体压力测试实验方案使我们能够计算基础线粒体呼吸、ATP相关呼吸(与ATP生成耦合的量)、最大和备用呼吸容量、非线粒体呼吸率和细胞外酸化速率，其为糖酵解的替代测量值。
复合物I测定
将离体小鼠大脑在250mM蔗糖、20mM HEPES、3mM EDTA、pH 7.5的缓冲液中于4℃匀化。对于皮质样品，使用Dounce匀化器进行匀化，对于分离的纹状体，通过重复通过0.5mm注射器进行匀化。然后将样品与30μl来自AbCam比色复合物I检测试剂盒的洗涤剂一起在冰上温育20分钟。然后将样品以13,000rpm速度离心30min。使用试剂盒封闭缓冲液在AbCam比色复合物I测定试剂盒板上封闭每个条件下的一式三份样品3小时。然后使用试剂盒洗涤缓冲液洗涤样品3次，然后加入含有NADH和比色染料的试剂盒测定缓冲液。将测定板在读板器上以动力学测定程序读取450nm的数值，以30秒的间隔读取50分钟。
D.iNeurons中的线粒体功能和形态测量
将细胞在96孔板中铺板；对于活细胞成像，将细胞与80nM四甲基罗丹明(TMRM)、1μM
Figure BDA0003125029820000831
Green(Invitrogen)和1μM的Hoechst染色溶液(Sigma)在37度下温育一小时，然后使用Opera PhenixTM成像。根据制造商的说明，使用ATPlite试剂盒(PerkinElmer)取得细胞ATP测量值。线粒体的反应性氧物质的生成如下评估：使用20μM线粒体NpFR2(探针；来自澳大利亚悉尼大学的Dr Liz New的赠品)和1μM的Hoechst染色溶液在37℃染色30分钟，然后去除染料并使用Opera PhenixTM使细胞成像。使用
Figure BDA0003125029820000832
(Perkin Elmer软件)分析从活细胞成像实验中生成的图像。我们开发了方法以分割细胞核、细胞边界和过程、线粒体、溶酶体、自体吞噬体。我们只分析了从z组采集的z投射图像。
结果
成纤维细胞
当用本发明的化合物或对比化合物处理时，在来自6(表3)或3(表4)名散发性帕金森病患者的成纤维细胞中测量了线粒体膜电位。结果如表1和表2所示，其中“底部(Bottom)”是指使用最低化合物剂量(0.06nM)时的最大响应值，而“顶部(top)”是指使用最高化合物剂量(300nM)时的最大响应值。
表1：来自6个散发性PD患者成纤维细胞的线粒体膜电位数据
化合物 E F G H 2 7 9
底部(溶媒处理的％) 104.9 110 103.4 99.83 107.3 100.4 109.8
顶部(溶媒处理的％) 111.8 108.1 123.3 109.1 112 114 112.4
EC<sub>50</sub>(nM) 23.29 0.6738 282.1 4.581 20.82 4.066 2.186
表2：来自3个散发性PD患者成纤维细胞的线粒体膜电位数据
化合物 14 17 19 20 22 27 30 31
底部(溶媒处理的％) 94.3 88.9 95.9 99.8 99.3 102.6 98.4 99.6
顶部(溶媒处理的％) 166.8 152.3 143.1 147.1 145.8 158.9 155.6 151.1
EC<sub>50</sub>(nM) 18.9 127.6 104.4 17.7 45.4 171.1 21.01 5.5
NB:与对照相比，sPD患者的MMP平均降低18％；因此，来自溶媒处理的sPD患者MMP水平增加为118％使MMP恢复到对照水平。
当用本发明的化合物或对比化合物处理时，在来自6(表3)或3(表4)名散发性帕金森病患者的成纤维细胞中测量了细胞ATP水平。结果如表3和表4中所示，其中“底部”是指使用最低化合物剂量(0.06nM)时的最大响应值，而“顶部”是指使用最高化合物剂量(300nM)时的最大响应值。
表3：来自6个散发性PD患者成纤维细胞的细胞ATP水平数据
化合物 E F G H 2 7 9
底部(溶媒处理的％) 81.59 99.91 83.3 87.64 79.9 112 99.04
顶部(溶媒处理的％) 135.5 111.9 92.72 120.8 112.6 171.8 102.9
EC<sub>50</sub>(nM) 18.79 1.912 58.35 0.1247 1.078 0.4293 21.32
表4-来自3个散发性PD患者成纤维细胞的细胞ATP水平数据
化合物 14 17 19 20 22 27 30 31
底部(溶媒处理的％) 107 100.7 98.8 102.4 95.9 101.4 96.7 108.1
顶部(溶媒处理的％) 126.9 132.2 122.3 121.7 115.9 113.8 115.3 133
EC<sub>50</sub>(nM) 1.3 17.2 8.9 34.7 6.2 16.6 4.2 13.3
NB:与对照相比，sPD成纤维细胞具有的细胞ATP水平平均降低24％。因此，溶媒处理的sPD成纤维细胞的％为124％是相对于对照ATP水平的增加。
上述的MMP和ATP测定连同毒性测量包含化合物在初级患者成纤维细胞中的初步筛选。当考虑哪些化合物在初级筛选中最具有活性时，所有信息都应考虑在内，包括EC50值，表明两种测定的效力和最大反应％；基于综合活性，生物学专家对每种化合物作出决定。
得自Seahorse测定的6个散发性PD患者成纤维细胞系和6个对照的耗氧数据如图1A、1B和1C所示，从中可以看出，sPD成纤维细胞显示基础线粒体呼吸显著降低42％(***p<0.005)，最大呼吸为48％(*p<0.05)，ATP相关的呼吸为18％(*p<0.05)。其并没有通过用UDCA处理得到改善，但是用化合物7处理显著改善了所有三个线粒体参数。注意，两种化合物均以EC90浓度给药，UDCA为100nM，化合物7为50nM。因此，显然化合物7提供了线粒体功能的更大增加，如通过耗氧量所测量的，并且它在较低浓度下提供了这种作用。
6个散发性成纤维细胞和6个对照的细胞外酸化速率
与对照相比，sPD成纤维细胞的ECAR(糖酵解的替代测量值)显著降低44％(***p<0.005)。如图2所示，用UDCA处理未改变这一点，但用化合物7处理显著改进了这一点。
上述数据显示化合物对来自sPD患者原代成纤维细胞的线粒体保护作用，然而，在PD中主要影响的细胞类型为多巴胺能神经元。下面的数据显示了得自三个sPD患者的多巴胺能神经元的结果；这些培养物约为96％的多巴胺能神经元，且目前这种方法是从患者细胞中产生这种纯多巴胺能培养物的唯一方案(由Mortiboys,University of Sheffield开发的方法)；因此，这是代表最接近PD中受影响的神经元的患者来源的模型。
下表5显示未处理或用UDCA或化合物7处理时，来自sPD患者与对照组iNeurons相比的线粒体功能和神经元形态测量结果。
表5-iNeurons
Figure BDA0003125029820000861
表5中的数据非常清楚地表明，化合物7除了改善神经元形态和降低细胞凋亡水平(如通过激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3水平测定的)之外，还对sPD来源的多巴胺能神经元中的两个线粒体参数提供保护作用。细胞凋亡是培养物中多巴胺能神经元和PD患者中多巴胺能神经元细胞死亡的主要机制。
使用化合物7的小鼠体内数据.
图3显示，在以剂量依赖性方式给予4mg/kg和12mg/kg化合物7后，野生型小鼠全脑匀化物中线粒体呼吸链复合物I活性显著增加。与未处理的对照相比，使用4mg/kg剂量增加了约380％，而使用12mg/kg剂量，复合物I活性增加约800％(*p<0.05)。
图4显示给予如下物质的小鼠的左侧纹状体小鼠脑匀化物中复合物1活性的结果：
·溶媒
·溶媒+12mg化合物7
·MPTP
·MPTP+1mg化合物7
·MPTP+4mg化合物7
·MPTP+12mg化合物7
与未处理的对照相比，单独用化合物7处理导致复合物I活性增加约30％(*p<0.05)。与未处理的对照相比，用MPTP处理导致复合物I活性降低50％(**p<0.01)，但同时使用1mg化合物7和MPTP处理可防止MPTP诱导的复合物I活性丧失并将复合物I保持在正常水平(与单独的MPTP处理相比**p<0.01)，增大剂量的化合物7同时与MPTP组合显然可以防止MPTP对复合物I活性造成的任何损失。
化合物在阿尔茨海默病患者成纤维细胞中的活性
来自sAD和家族性AD(PSEN1突变体)的成纤维细胞使用相同的初步筛选测定法测试总细胞ATP水平。与对照组相比，sAD和PSEN1患者的成纤维细胞减少21％。下表6中显示的数据为用100nM浓度的化合物处理24小时后ATP水平的平均增加值。由于细胞具有的ATP水平平均下降21％，因此，增加21％将恢复到对照水平，任何超过21％的增加都超出对照水平。
表6
化合物 UDCA 2 7 8
相对于溶媒处理增加的％ 12％ 65％ 24％ 65％
数据清楚地表明，与UDCA处理相比，用化合物2、7和8处理具有更有益的细胞ATP水平的恢复。此外，化合物2和8特别有效地显著提高了ATP水平。

Claims (31)

1.通式(I)的化合物：
Figure FDA0003125029810000011
其中
R1和R2之一为F，而R1和R2的另一个为H或F；
Y为价键或C1-20亚烷基、C2-20亚烯基或C2-20亚炔基连接基；
R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13、S(O)2R12、OS(O)2R12,S(O)2OR12、OS(O)2OR12、S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、OP(O)(OR12)2、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16；
R12各自独立地为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、OR10、NR10R11、R16和芳基；
R10和R11各自独立地为H或C1-6烷基；
R13为H、任选地被一个或多个选自卤素和芳基的取代基取代的C1-6烷基；或3-至8-元碳环或杂环，其中所述碳环或杂环任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自＝O和R16；或苯基或5-或6-元杂芳基环，其中所述苯基或杂芳基环任选地被取代基R16取代；或
当R3为C(O)NR12R13或S(O)2NR12R13时，R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成3-至8-元杂环，其任选地包含一个或多个另外的选自N、O和S的杂原子；且任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自CH2C(O)OH、C(O)OH、C1-6烷基、C(O)OC1-6烷基、S(O)2OH、＝O和＝N-OH；并且任选地与苯基稠合，所述苯基未被取代或被一个或多个选自卤素和硝基的取代基取代；
n为1、2或3；
R15各自独立地为H或C1-6烷基，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自卤素、苯基和5-或6-元杂芳基；3-至8-元环烷基；或基团R14，其中R14为氨基酸侧链；或
当n为2或3时，两个R15基团与它们所连接的碳原子和任选地其中存在的居间碳原子一起可以合并形成-(CH2)p-，使得基团[CH(R15)]n为3-至8-元碳环；
p为1、2、3、4、5或6；
R16选自C(O)OH、S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)、OS(O)2OH和P(O)(OH)2；
或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。
2.通式(I’)的化合物：
Figure FDA0003125029810000021
其中
R1和R2之一为F，而R1和R2的另一个为H或F；
Y为价键或C1-20亚烷基、C2-20亚烯基或C2-20亚炔基连接基；
R3为C(O)OR12、C(O)NR12R13、S(O)2R12、OS(O)2R12,S(O)2OR12、OS(O)2OR12、S(O)2NR12R13、C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、OP(O)(OR12)2、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16
R12各自独立地为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基；
R13为H、任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基、或任选地被取代基R16取代的5-或6-元碳环；或
R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成5-或6-元杂环，所述杂环任选地包含另一个氮原子，其任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基选自CH2C(O)OH、C(O)OH、S(O)2OH、＝O或＝N-OH基团，且所述杂环任选地与苯基稠合，所述苯基为未取代的或被一个或多个选自卤素和硝基的取代基取代；
R15各自独立地为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基、或基团R14，其中R14为氨基酸侧链；
n为1、2或3；
R16选自C(O)OH、S(O)2OH、OS(O)2OH和P(O)(OH)2；
或其药学上可接受的盐或同位素变体形式。
3.权利要求1或权利要求2的化合物，其为通式(IA)、(IB)、(IC)或(ID)的化合物：
Figure FDA0003125029810000031
其中R1、R2、Y和R3如上述对通式(I)所定义。
4.权利要求3的化合物，其为通式(IA)的化合物。
5.权利要求3的化合物，其为通式(IB)的化合物。
6.权利要求1-5任一项的化合物，其中R1和R2均为F。
7.权利要求1-6任一项的化合物，其中Y为价键或C1-3亚烷基或C2-3亚烯基连接基。
8.权利要求7的化合物，其中Y为-CH2CH2-。
9.权利要求1-8任一项的化合物，其中：
R3为C(O)OR12、C(O)NR12CH(R14)C(O)OH或C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH，其中R12和R14如权利要求1中所定义，且R15为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基；或
R3为C(O)OR12、(C(O)N(R12)(R13)或C(O)NR12[CH(R15)]nR16；
其中R12、R13、R15、R16和n如权利要求1中所定义。
10.权利要求1-9任一项的化合物，其中
R12为H或甲基或乙基，其任选地被R16或N(R10)(R11)取代；或
R3为C(O)NR12S(O)2R13、NHC(O)NR12S(O)2R13、C(O)NR12[CH(R15)]nR16或C(O)NR12C(O)CH2NR12[CH(R15)]nR16；且R12为H或甲基；和/或
R13当存在时适合地为任选地被R16或＝O取代的5-或6-元碳环或杂环；或任选地被R16取代的苯基；或
R3为C(O)NR12R13或S(O)2NR12R13，且R12和R13与它们所连接的氮原子一起形成5-或6-元杂环，其任选地被一个或多个选自R16和＝O的取代基取代，并且任选地包含一个或多个选自O、N和S的另外的杂原子；和/或
R16当存在时为C(O)OH、S(O)2OH、S(O)2(C1-6烷基)或OS(O)2OH；或
R16当存在时为C(O)OH、S(O)2OH、OS(O)2OH或P(O)(OH)2，且该化合物为药学上可接受的盐的形式。
11.权利要求1-10任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为C(O)OR12。
12.权利要求11的化合物，其中R12为H、CH2R16或-CH2CH2R16，其中R16如上文所定义。
13.权利要求1-10任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16。
14.权利要求13的化合物，其中R12为H、甲基或被R16取代的甲基。
15.权利要求13或权利要求14的化合物，其中R3为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH或C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH，其中R14为氨基酸侧链，且R15为H或任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基。
16.权利要求15的化合物，其中：
R3为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH，其中R12为H或甲基且R14为H；或
R3为C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH，其中R12为H或甲基，并且两个R15基团均为H。
17.权利要求13或权利要求14的化合物，其中：
R15各自独立地为H或C1-4烷基，其如权利要求1所述任选地被取代；或
n为2或3，且两个R15基团与它们所连接的碳原子以及任选地当存在时居间的碳原子一起组合形成5-至7元碳环。
18.权利要求1-10任一项的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3是C(O)NR12R13。
19.权利要求18的化合物，其中R12为H或被单一R16取代基取代的C1-3烷基，其中R16如权利要求1中所定义。
20.权利要求18或权利要求19的化合物，其中R13为苯基或5-至7-元环烷基或杂环基，其中它们任何一个任选地被单一R16取代基取代，且其中环烷基和杂环基被一个或多个＝O取代基取代。
21.权利要求1的化合物，选自：
2β-氟鹅去氧胆酸(化合物1)；
2β-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物2)；
2α-氟-3β,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物3)；
2α-氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物4)；
2α-氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物5)；
2α-氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物6)；
2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)；
2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)；
2,2-二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙基磺酸(化合物10)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-丙酸(化合物11)；
N-(甲基),N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-乙酸(化合物12)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-反式-2-环己烷甲酸(化合物13)；
1-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-哌啶-3-甲酸(化合物14)；
3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-4-噻唑烷-甲酸(化合物15)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-吗啉(化合物16)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)-甲基甲酸(化合物17)
N-(羧甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙酸(化合物18)；
N-(甲基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)乙磺酸(化合物19)；
3-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)氨基-丙磺酸(化合物20)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰胺)甲磺酸(化合物21)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基乙基硫酸(化合物22)；
O-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-羟基乙基磺酸(化合物23)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)苯胺-2-磺酸(化合物24)；
N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-丙磺酸(化合物25)；
N-(环己基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-2-氨基-乙磺酸(化合物26)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)2-氨基乙基甲基砜(化合物27)；
N-(乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物28)；
N-(2-(二异丙基氨基)乙基)-N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-3-氨基-四氢噻吩二氧化物(化合物29)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)-硫吗啉-二氧化物(化合物30)；
N-(2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷-24-酰基)1,1-二氧代四氢-2H-噻喃-3-基胺(化合物31)；和
其药学上可接受的盐(在适宜时)，尤其是金属盐，例如钠或钾盐，特别是钠盐或(对于化合物18而言的)二钠盐。
22.权利要求1-21任一项的化合物，其用于药物，例如用于治疗或预防神经变性疾病。
23.权利要求1-21任一项的化合物在制备用于治疗或预防神经变性疾病的药物中的用途。
24.治疗或预防神经变性疾病的方法，该方法包含对有这类治疗需求的患者施用有效量的权利要求1-21任一项的化合物。
25.用于权利要求22的用途的化合物、权利要求23的用途或权利要求24的方法，其中所述神经变性疾病为帕金森病、轻度认知障碍、痴呆(包括阿尔茨海默病、血管性痴呆和路易体痴呆)、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化(运动神经元病)、进行性核上性麻痹或威尔逊病。
26.权利要求25所述的化合物、用途或方法，其中所述神经变性疾病为帕金森病，且所述化合物选自如权利要求3中所定义的通式(IA)和(ID)的化合物。
27.权利要求26所述的化合物、用途或方法，其中该化合物选自2,2-二氟-3β,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物7)和二氟-3α,7β-二羟基-5β-胆烷酸(化合物9)。
28.权利要求26所述的化合物、用途或方法，其中所述神经变性疾病为阿尔茨海默病，且所述化合物选自如权利要求3所定义的通式(IB)化合物。
29.权利要求28所述的化合物、用途或方法，其中该化合物为2,2-二氟-3α,7α-二羟基-5β-胆烷酸(化合物8)。
30.药物组合物，包含权利要求1-21任一项的化合物和药学上可接受的赋形剂或载体。
31.用于制备权利要求1-21任一项的化合物的方法，其包含：
A.对于如权利要求3中所定义的通式(IB)或(IC)的化合物，其中R1为F且R3为C(O)OR12a：其中R12a为任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基：
用酸处理通式(II)的化合物：
Figure FDA0003125029810000081
其中Y和R3如权利要求1中所定义；R12a为任选地被一个或多个卤素或芳基取代的C1-6烷基；且R21为酸不稳定的OH保护基；
B.对于如权利要求3中所定义的通式(IA)或(IC)的化合物，其中R2为F，且R3为C(O)OR12a，其中R12a如对通式(II)所定义：
还原通式(XIIa)的化合物：
Figure FDA0003125029810000082
其中Y如权利要求1中所定义，且R12a如对通式(II)所定义；
C.对于如权利要求3中所定义的通式(IB)或(ID)的化合物，其中R2为F，且R3为C(O)OR12a，其中R12a如对通式(II)所定义：
还原通式(XIIb)的化合物：
Figure FDA0003125029810000083
其中Y如权利要求1中所定义，且R12a如对通式(II)所定义；
D.对于如权利要求3中所定义的通式(IA)的化合物，其中R1和R2均为F，且R3为C(O)OR12a，其中R12a如对通式(II)所定义：
使通式(XXI)的化合物与酸反应：
Figure FDA0003125029810000091
其中Y如权利要求1中所定义，且R12a和R21如对通式(II)所定义；
E.对于如权利要求3中所定义的通式(IB)或(ID)的化合物，其中R1和R2均为F，且R3为C(O)OR12a，其中R12a如对通式(II)所定义：
还原通式(XXII)的化合物：
Figure FDA0003125029810000092
其中Y如权利要求1中所述，且R12a和R21如对通式(II)所定义；
F.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)OH：
水解其中R3为C(O)R12a的通式(I)的化合物，其中R12a如上述对通式(II)所定义；
G.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12R13：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物在偶联剂和胺存在下与下式的胺反应：
H-NR12R13
其中R12和R13如权利要求1中所定义；
H.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12[CH(R15)]nR16：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物在偶联剂和胺存在下与通式(XL) 的化合物反应：
HNR12[CH(R15)]nR16
(XL)
其中R12、R15、n和R16如权利要求1中所定义；
I.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12CH(R14)C(O)OH：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物通过在偶联剂和胺存在下与通式(XLI)的氨基酸反应来进行：
Figure FDA0003125029810000101
其中R12和R14如权利要求1中所定义；
J.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12CH(R15)CH(R15)S(O)2OH：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物通过在偶联剂和胺存在下与通式(XLII)的化合物反应来进行：
Figure FDA0003125029810000102
其中R12和R15如权利要求1中所定义；
K.对于通式(I)的化合物，其中R3为C(O)NR12S(O)2R13：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物在偶联剂和胺存在下与下式的化合物反应来进行：
NHR12S(O)2R13
其中R12和R13如权利要求1中所定义；
L.对于通式(I)的化合物，其中R3为NHC(O)NR12S(O)2R13：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物如下反应：
Figure FDA0003125029810000111
其中R1、R2、R12和R13如权利要求1中所定义；
M.对于通式(I)的化合物，其中R3为S(O)2OR12：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物与C1-6烷酰氯或苯甲酰氯或与C1-6烷酸酐反应，得到被保护的中间体；和
通过用氢化物还原剂还原，将被保护的中间体的羧酸基团转化成OH，得到还原的中间体；和
卤化还原的中间体，得到卤代中间体，其中用卤素替代OH基团；和
使卤代中间体与亚硫酸钠在醇溶剂中反应；
N.对于通式(I)的化合物，其中R3为OS(O)2R12：
使其中R3为C(O)OH的通式(I)的化合物与C1-6烷酰氯或苯甲酰氯或与C1-6烷酸酐反应，以保护任何OH基团；和
通过用氢化物还原剂还原，将被保护的中间体的C(O)OR12转化成OH，得到还原的中间体；和
使还原的中间体与氯磺酸在碱存在下反应，得到被保护的产物；和
对被保护的产物进行碱水解，以除去保护基；
O.对于通式(I)的化合物，其中R3为S(O)2R12：
使上述(M)或(N)的还原的中间体与劳森试剂反应，然后将所得的产物氧化。
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