CN113318118B - 罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了罗汉果甜苷提取物具有缓解热应激小鼠肠道损伤的作用。研究表明，在小鼠热应激的过程中，通过灌胃600mg/kg的罗汉果甜苷提取物，能有效缓解热应激引起的肠道损伤。试验数据显示，罗汉果甜苷提取物能显著升高肠道绒毛高度，提升绒毛/隐窝比值，显著升高绒毛上的杯状细胞数量，显著提高了热应激小鼠肠道细胞增殖能力。因此，罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤治疗预防方面具有深入开发的潜力。

Description

罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤中的应用
技术领域
本发明属于罗汉果甜苷技术领域，尤其涉及罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤中的应用。
背景技术
恒温动物都存在着适合生长发育的等温区，当环境温度超过这个等温区间上限时，机体难以通过体温调节中枢自主调节，使得动物机体出现行为异常、采食量减少、饮水量减少，严重时会导致个体死亡。在畜牧生产过程中，随着集约化养殖的大力发展，热应激成为了影响热带、亚热带地区夏季生产效率的主要因素。肠道作为动物机体消化吸收最主要的器官，在机体免疫中也起着重要作用。同时也是在热应激发生过程中最主要的靶器官。在热应激条件下，动物机体肠道发生缺血、缺氧，导致肠道屏障完整性受损。进而引起肠道形态结构损伤，肠道通透性增加，有害物质迁移引物机体炎症等。
罗汉果(Siraitia grosvenorii)是葫芦科多年生藤本植物，主要分布在我国南方亚热带地区，是广西重要的特色经济作物。罗汉果民间主要作为一种凉茶、甜味剂、或用于治疗喉咙肿痛、感冒、咳嗽以及肠胃不适的民间草药。它的主要生物活性物质是罗汉果甜苷(英文名为mogrosides)。近年来，罗汉果甜苷提取物已被美国食品和药物管理局(FDA)批准为一种普遍认可的安全物质(GRAS)，并在中国和日本被批准为食品添加剂。药理学研究发现罗汉果甜苷具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、抗肿瘤以及抗炎症的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
罗汉果甜苷提取物在制备缓解热应激肠道损伤药物中的应用。
缓解热应激肠道损伤包括缓解体重降低，恢复肠道绒毛高度、隐窝深度及其比值，提高绒毛上杯状细胞的细胞回肠细胞增殖能力增强。
药物为口服剂型。
罗汉果甜苷提取物含有罗汉果甜苷V。
罗汉果甜苷提取物中罗汉果甜苷V的含量达50％。
热应激肠道损伤源于高温、高湿对小鼠进行的热应激处理。
高温为40℃、高湿为55％。
为进一步开发罗汉果的保健功用和药用价值，发明人对罗汉果甜苷提取物进行了研究，发现罗汉果甜苷提取物具有缓解热应激小鼠肠道损伤的作用。研究表明，在小鼠热应激的过程中，通过灌胃600mg/kg的罗汉果甜苷提取物，能有效缓解热应激引起的肠道损伤。试验数据显示，罗汉果甜苷提取物能显著升高肠道绒毛高度，提升绒毛/隐窝比值，显著升高绒毛上的杯状细胞数量，显著提高了热应激小鼠肠道细胞增殖能力。因此，罗汉果甜苷提取物在热应激肠道损伤治疗预防方面具有深入开发的潜力。
附图说明
图1是罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道组织结构的影响结果图，图中：A-C分别为CON组、HS组、HS+ME组回肠HE染色切片(Bar＝100μm)。
图2是罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道杯状细胞数量的影响结果图，图中：A-C分别为CON组、HS组、HS+ME组回肠AB-PAS染色切片(Bar＝100μm)；D为回肠绒毛上杯状细胞的平均数数量(*p<0.05,n＝8)。
图3是罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道细胞增殖能力的影响结果图，图中：A-C分别为CON组、HS组、HS+ME组免疫组化染色切片(Bar＝50μm)；D为PCNA阳性细胞的IOD值(*p<0.05,n＝8)。
具体实施方式
1.实验方法
1.1实验动物
选取24只8周龄雌性健康C57BL/6小鼠，体重为20±1g作为实验动物。按饲养标准在实验动物房饲养，光照周期为12h，室内温度22℃±2℃，湿度50-60％，自由采食和饮水。
1.2主要试剂
维持鼠粮购自江苏协同生物工程有限公司。
罗汉果甜苷提取物购自桂林莱茵生物科技股份有限公司(产品型号：罗汉果甜苷V50％(MOV04)，生产批号：MOV04-18022504)。
PCNA抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(货号：bs-2006R)。
1.3试验分组
将小鼠分为三个组别(n＝8)：对照组(CON组)、热应激组(HS组)、热应激+罗汉果甜苷提取物组(HS+ME组)，实验开始前，将小鼠分组后适应性饲养3d。实验开始后，每天上午9：00对各组小鼠进行给药处理，CON组和HS组每天灌胃等剂量的蒸馏水(5μl/g)，HS+ME组每天灌胃600mg/kg的罗汉果甜苷提取物。每天灌胃结束后，将HS组和ME组放置于恒温恒湿培养箱中进行热应激处理，每天10：00-12：00处理2h，设置温度为40℃，湿度为55％，此间小鼠能够自由采食和饮水，连续处理7d。其间定期记录小鼠直肠温度和体质量。
试验第7d，热处理后立即将小鼠二氧化碳处死，分离出回肠部分，切去中段1cm用生理盐水洗净后放入10％福尔马林溶液中固定24h，其余样品置于-80℃冰箱冻存。
1.4测定指标及方法
1.4.1小鼠肠道组织形态结构观察
将放置在10％福尔马林固定液中的小鼠回肠组织经酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片后进行HE染色，然后在显微镜下观察并测量每只鼠的肠道绒毛长度、隐窝深度，并计算其比值。
1.4.2小鼠肠道杯状细胞数量
按上述方法对肠道组织包埋切片后，按照说明书进行AB-PAS染色，然后在显微镜下观察并拍照，随后在每个视野中挑选5个完整绒毛统计在其上面的杯状细胞数量。
1.4.3免疫组化染色
将肠道组织切片进行脱蜡、复水、抗原修复后，用单克隆兔抗小鼠的PCNA(1:500；Abcam，Cambridge，MA，USA)一级抗体在4℃下孵育过夜。随后将切片与山羊抗兔IgG二抗(1:200；Sigma)在25℃下孵育2小时。将切片放在含DAB显色液孵育10分钟，使免疫活性可视化。细胞核用苏木精进行反染色。封片后在显微镜下观察并拍照，采用ImageJ软件测定各组阳性细胞的平均积分光密度(IOD)并进行比较。
1.5数据分析
所有数据均用均数±SEM表示。应用GraphPad 8.0统计软件处理，统计采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示差异有统计学意义。
2.结果
2.1罗汉甜苷对热应激小鼠体重的影响
表1列出了初始体重、最终体重和平均日增重。在初始体重中各组之间无差异，与对照组相比，热应激组降低了最终体重，减少了平均日增重(P)。而与热应激组相比，补充罗汉果甜苷有增加最终体重，增加平均日增重的趋势，但无显著性差异。
表1ME对热应激小鼠体重的影响
Figure BDA0003125036380000041
Figure BDA0003125036380000042
注：同一列相比，肩标上小写字母不同为差异显著(P<0.05)，字母相同表示为差异不显著(P>0.05)。
2.2罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道组织结构的影响
如图1所示，经HE染色发现，CON组肠道绒毛完整、绒毛之间排列整齐(图1A)，HS组肠绒毛顶端破裂，粘膜上皮脱落，固有层裸露，且伴有水肿现象，整个肠道形态结构损伤严重(图1B)，经罗汉果甜苷处理的小鼠肠道绒毛在一定程度上得到了缓解，未见明显结构损伤(图1C)。
罗汉果甜苷对肠道绒毛高度、隐窝深度及两者比值的影响见图1，与CON组相比，HS组肠绒毛高度极显著降低(P<0.01)，且绒毛高度和隐窝深度之间的比值显著降低，而与HS组相比，HS+ME组的绒毛高度极显著升高，绒毛高度和隐窝深度之间的比值也显著升高(P<0.05)。隐窝深度各组间无显著差异(P＞0.05)。
表2ME对热应激小鼠肠道绒毛高度、隐窝深度及其比值的影响
Figure BDA0003125036380000043
注：同一列相比，肩标上小写字母不同为差异显著(P<0.05)，字母相同表示为差异不显著(P>0.05)。
2.3罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道杯状细胞数量的影响
如图2所示，经AB-PAS染色发现，与CON组相比，HS组肠道绒毛上杯状细胞数量显著降低(P<0.01)，而与HS组相比，HS+ME组在一定程度上恢复了肠道绒毛上的杯状细胞数量(P<0.01)。
2.4罗汉果甜苷对热应激小鼠肠道细胞增殖能力的影响
如图3所示，PCNA阳性细胞散布在肠腺周围的组织和基底层细胞中。与CON组相比，HS组的肠道中PCNA阳性细胞的IOD值显著下降(P<0.01)，与HS组相比，HS+ME组在肠道中PCNA阳性细胞的IOD值显著升高(P<0.05)。
3.结论
在本研究中，将24只小鼠随机分为三组(n＝8)：室温处理+灌胃蒸馏水组、热应激处理+灌胃蒸馏水组、热应激处理+灌胃罗汉果甜苷提取物(600mg/kg)处理组。热应激组每天处理40℃处理2h，连续7d。结果显示，热应激处理后的小鼠体重显著下降；肠道绒毛高度、隐窝深度及其比值均有所下降；绒毛上杯状细胞数量显著降低；回肠细胞增殖能力减弱。而添加罗汉果甜苷提取物添加后缓解小鼠体重降低的趋势，恢复了肠道绒毛高度、隐窝深度及其比值；提高了绒毛上杯状细胞的细胞，回肠细胞增殖能力增强。可见，罗汉果甜苷提取物具有改善热应激小鼠肠道损伤的积极作用。

Claims (4)

1.罗汉果甜苷提取物在制备缓解热应激肠道损伤药物中的应用，其特征在于：所述罗汉果甜苷提取物中罗汉果甜苷V的含量达50％；所述罗汉果甜苷提取物来自桂林莱茵生物科技股份有限公司，产品型号：罗汉果甜苷V 50％MOV04。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述缓解热应激肠道损伤包括缓解体重降低，恢复肠道绒毛高度、隐窝深度及其比值，提高绒毛上杯状细胞的数量，增强回肠细胞增殖能力。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为口服剂型。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述热应激肠道损伤源于高温、高湿对小鼠进行的热应激处理；所述高温为40℃、高湿为55％。
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