CN113292547A - 2-芳杂环基喹唑啉酮类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

2-芳杂环基喹唑啉酮类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物技术领域，公开了2‑芳杂环基喹唑啉酮类化合物及其制备方法与应用。该化合物的化学结构式如式(I)所示，式(I)中，R2选自呋喃基团、噻吩基团或吡咯基团，可以拮抗艾滋病病毒潜伏激活，维持艾滋病病毒转录沉默状态，可用于作为和//或制备艾滋病病毒潜伏感染促进剂，同时，该化合物无明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性，可以作为治疗艾滋病的药物，实现对艾滋病的“功能性治愈”。

Description

2-芳杂环基喹唑啉酮类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及2-芳杂环基喹唑啉酮类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
获得性免疫缺陷综合征，即艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，是一类由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染人体所导致的以全身免疫系统损害为主要特征的单一病因性疾病。HIV感染人体后，人体免疫系统中的CD4+T细胞作为主要靶标被病毒攻击，因而极大损害了人体的免疫系统(包括体液免疫及细胞免疫)，引起人体机会性感染，如恶性肿瘤等，增高了患者的病死率。艾滋病作为严重慢性传染性疾病之一，目前尚无法彻底治愈，因此其对于全球人类的卫生健康系统仍具有严重威胁。
目前，高效抗逆转录病毒疗法(Highly activate anti-retroviral therapy,HAART)或称联合抗逆转录病毒疗法(Combination antiretroviral therapy,cART)在临床上得到广泛应用，即治疗艾滋病的“鸡尾酒疗法”。该疗法采用联合三种(含三种)以上的不同种类的抗逆转录病毒药物ARV进行协同治疗，在大大增强抗HIV的疗效的同时，还降低了单一用药容易造成的耐药性，显著改善了患者的生活质量和预后。据联合国艾滋病规划署报告显示，截至2019年06月，全球艾滋病感染患者中有2450万人正在接受HAART的治疗，这也是导致每年因HIV感染死亡的人数急剧下降的最为主要的原因。HAART疗法已经成功地将艾滋病转变为一种可药物控制的慢性疾病。该疗法能有效抑制HIV病毒复制，控制疾病恶化，从而较为显著地延长了感染患者的生存期。但遗憾的是，其也存在局限性。主要体现在以下几个因素：(1)病毒耐药性：有报道表明，分布在亚洲、拉丁美洲、非洲等许多国家已经发生了接受HAART治疗的患者产生HIV普遍耐药性的现象，病毒耐药性的出现易导致患者的治疗失效从而延误病情造成重大隐患，或者迫使患者接受更加昂贵的二线治疗方案；(2)严重毒副作用：HAART疗法长期用药情况下，易导致肝功能损伤、糖尿病、脂质代谢障碍、脂肪流失等严重副作用，严重影响患者的用药依从性，影响患者的生活质量；(3)HIV无法被彻底治愈：艾滋病目前尚未被医学领域所攻克，感染患者需要保持终生的药物治疗，否则一旦停药，病毒血症随后即会出现反弹，危害患者生命健康。因此，亟需开发新的HIV治疗策略，以期治愈HIV。
艾滋病为何不能彻底治愈呢？究其原因，HIV无法被彻底清除的主要障碍是病毒可以在被其感染的某些细胞亚群中保持潜伏状态，形成HIV潜伏储存库。这部分潜伏感染细胞的基因组整合了HIV前病毒后发生基因沉默，从而能成功躲过病毒所引起的宿主免疫应答，且无法被免疫系统识别和清除。同时，由于潜伏感染细胞群中没有病毒复制和病毒蛋白表达，cART药物也无法发挥抗病毒作用，因而导致该群细胞能在体内长期存活。更为重要的是，患者体内潜伏的静息记忆性CD4+T细胞存活时间长，有些甚至可以存活数年之久，这也是造成HIV体内潜伏储存库长期存在的重要原因。此外，HIV还能在巨噬细胞、星形胶质细胞、幼稚CD4+T细胞以及自然杀伤细胞等细胞中形成潜伏，伺机引起病毒爆发感染。HIV潜伏储存库的存在是造成临床上抗病毒治疗不能彻底清除机体HIV的主要原因。
近年来，学术界普遍采用“激活并杀灭”(Shock and Kill)或“阻断并锁定”(Blockand Lock)的药物治疗方法，以期达到HIV功能性治愈。“Shock and Kill”，即选用潜伏逆转剂(LRAs)诱导潜伏感染细胞中的HIV前病毒的转录活化，再选用抗病毒药物将活化的病毒彻底杀灭。活化的病毒颗粒使得潜伏感染细胞失去了免疫逃避效应，因而被宿主免疫系统识别清除，从而实现HIV“功能性”治愈。但遗憾的是，截至目前LRAs类药物仅处于临床试验阶段，尚未取得临床意义上的突破进展，它们或多或少存在着一定的缺陷。主要问题如下：1)不良反应；某些HDAC抑制剂被报道有恶心、呕吐、血液系统异常及影响基因正常功能等不良反应；2)T细胞活化：PKC激活剂可造成T细胞广泛活化，从而导致潜伏病毒库的机体免疫及化学药物清除复杂化；3)特异性差：某些药物作用广泛，毒副作用较大，不适于长期应用等。迄今为止，尚无一种候选LRAs被批准入市！“Block and Lock”，即通过潜伏促进剂(LPAs)阻断潜伏HIV重新激活，进而深度锁定潜伏病毒库来实现HIV治愈。该疗法可在降低HIV病毒载量的基础上，进一步阻止潜伏HIV病毒的繁殖，驱使潜伏HIV锁定在“持久的潜伏状态”，是对传统艾滋病治疗方法的一大突破。目前潜伏促进剂的开发尚处于临床前研究阶段，而且一些潜伏促进剂已经在阻止病毒反弹等方面显示出了良好的治疗效果，且与传统的cATR药物有异曲同工之处，其普遍被认为较潜伏逆转剂临床易于耐受。因此，“阻断并锁定”策略近年来逐渐取得了广泛的关注，期望协同或取代cART疗法，实现HIV“功能性”治愈。
目前，针对上述研究所发现的不同潜伏感染机制所开发的LPAs的主要有以下几类：1)BRD4蛋白调节剂：ZL0580，ZL0580通过调节BRD4的表观遗传抑制，与Tat蛋白竞争结合p-TEFb，从而抑制HIV的转录和潜伏HIV的活化，ZL0580在多种细胞模型中均能抑制HIV复制，且与cART药物具有协同作用，停用cART后能显著延缓病毒血症的反弹；2)病毒蛋白Tat抑制剂：didehydro-cortistatin A(dCA)、Nullbasic和HT1等，Tat抑制剂主要通过直接结合Tat蛋白或干扰Tat蛋白与TAR-RNA的相互作用从而抑制HIV的转录，延缓病毒反弹；3)其他类：①mTOR抑制剂：Torin 1、Triptolide，抑制mTOR，下调CDK9磷酸化并阻止NF-κB信号转导或者通过自噬导致Tat蛋白降解，从而进一步抑制潜伏感染细胞中PMA依赖性病毒的激活；②HSP90抑制剂：GV1001、AUY9992、17-AAG。通过抑制HSP90-NF-κB轴，从而抑制J-Lat和ACH-2细胞系中NF-κB刺激性化合物的HIV激活作用；③JAK-STAT抑制剂：Ruxolitinib，Tofacitinib。JAK抑制剂的抗炎作用阻断原发性CD4+T细胞中的HIV活化，从而限制了HIV向其他细胞的传播。
遗憾的是，目前潜伏促进剂的开发尚处于起步阶段，已开发的LPA候选药物种类少，且也存在活性与毒性的问题有待克服，达到临床实验阶段还有很长的一段路要走，“阻断并锁定”的相关理论基础也较为薄弱。因此，发现和开发高效、安全的新型潜伏促进剂(LPA)是必要和迫切的。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种化合物。
本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物的制备方法。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物在作为和/或制备产品中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的化合物的产品。
本发明第五方面的目的，在于提供一种体外阻断潜伏艾滋病病毒激活的方法。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种化合物，其化学结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003091640000000031
式(I)中，R2选自呋喃基团
Figure BDA0003091640000000032
噻吩基团
Figure BDA0003091640000000033
和吡咯基团
Figure BDA0003091640000000034
本发明的第二方面，提供本发明第一方面的化合物的制备方法，其合成路线为：
Figure BDA0003091640000000041
上述结构式中，R2选自呋喃基团
Figure BDA0003091640000000042
噻吩基团
Figure BDA0003091640000000043
和吡咯基团
Figure BDA0003091640000000044
包括如下步骤：
(1)将2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸与氨气混合，反应，得到化合物1；
(2)将化合物1和化合物2混合，反应，得到化合物3。
优选地，步骤(1)中所述反应在有机溶剂、缩合剂及碱存在下进行。
优选地，步骤(1)中所述2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸与氨气的摩尔比为1：(1～2)。
优选地，所述有机溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种。
优选地，所述缩合剂为下列物质中的一种与HOBt(1-羟基苯并三唑)的组合：EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、HBTU(O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐)、TBTU(O-苯并三唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸酯)和HATU(2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯)。
优选地，所述碱为二乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉、碳酸钾和碳酸钠中的至少一种。
优选地，步骤(1)中所述反应在常温下进行。
优选地，步骤(1)中所述反应后还包括如下步骤：去除有机溶剂、萃取、清洗、干燥、分离。
优选地，步骤(2)中所述化合物1和化合物2的摩尔比为1：(1～2)。
优选地，步骤(2)中所述反应在有机溶剂及催化剂存在下进行。
优选地，所述有机溶剂为氯仿、二甲基亚砜和乙醇中的至少一种。
优选地，所述催化剂为溴化亚铜和无水氯化铜中的至少一种。
优选地，步骤(2)中所述反应的温度为60～90℃。
优选地，步骤(2)中所述反应后还包括如下步骤：去除有机溶剂、萃取、清洗、干燥、分离。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的化合物或其衍生物在作为和/或制备产品中的应用。
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)治疗艾滋病的药物；
(2)艾滋病病毒潜伏感染促进剂；
(3)艾滋病病毒激活抑制剂。
优选地，所述艾滋病病毒包括HIV-1。
优选地，所述衍生物包括所述化合物在药学上可以接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
本发明第四方面的目的，在于提供一种包含本发明第一方面的化合物或其衍生物的产品。
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)治疗艾滋病的药物；
(2)艾滋病病毒潜伏感染促进剂；
(3)艾滋病病毒激活抑制剂。
优选地，所述艾滋病病毒包括HIV-1。
优选地，所述衍生物包括所述化合物在药学上可以接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、多晶型物、互变异构体或前药。
一种药物，包含：
(1)本发明第一方面的化合物或其衍生物；和
(2)药学上可接受的辅料。
所述药学上可接受的辅料为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
所述药物的剂型包括口服给药剂型和非口服给药剂型。
所述口服给药剂型为片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂和糖浆剂中的至少一种。
所述非口服给药制剂为注射剂。
本发明第五方面的目的，在于提供一种体外阻断潜伏艾滋病病毒激活的方法，将本发明第一方面的化合物和/或本发明第四方面的产品与艾滋病病毒潜伏感染的细胞混合，培养。
优选地，所述艾滋病病毒包括HIV-1。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种式(I)所示的化合物，该化合物可以拮抗艾滋病病毒潜伏激活，维持艾滋病病毒转录沉默状态，可用于作为和/或制备艾滋病病毒潜伏感染促进剂及艾滋病病毒激活抑制剂，同时，该化合物无明显的细胞毒性，具有良好的生物相容性，可以作为治疗艾滋病的药物，实现对艾滋病的“功能性治愈”。
附图说明
图1是不同浓度的6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6细胞受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性结果图；其中，***表示p＜0.001。
图2是不同浓度的6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat A2细胞受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性结果图；其中，*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
图3是不同浓度的6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)对HIV-1潜伏感染细胞模型ACH2受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性结果图；其中，*表示p＜0.05；**表示p＜0.01。
图4是不同浓度的6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)对HIV-1潜伏感染细胞模型U1受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性结果图；其中，***表示p＜0.001。
图5是不同浓度的6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)对人外周血单核细胞PBMCs的细胞存活率的影响图。
图6是6,7,8-三甲氧基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q301)、2-(苯并呋喃-2-基)-6,7,8-三甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(Q306)对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat10.6细胞受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性结果图：其中，A是HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat10.6细胞受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活后GFP阳性细胞的比率图；B是受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6细胞经2-(苯并呋喃-2-基)-6,7,8-三甲氧基喹唑啉-4(3H)-酮(Q306)处理后GFP阳性细胞的比率图；C是受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6细胞经6,7,8-三甲氧基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q301)处理后GFP阳性细胞的比率图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所采用的原料，除特殊说明外，均通过常规手段制备或者通过商业渠道购买。
实施例1 6,7,8-三甲氧基-2-(1H-吡咯-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q308)的合成
取1.13g(5.0mmol)2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸于双颈瓶中，加入50mL四氢呋喃，再加入1.44g(7.50mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，1.01g(7.50mm ol)1-羟基苯并三唑(HOBT)和829μL(7.50mmol)N-甲基吗啉，室温下搅拌3.5h；再通入7.46mM氨气(将氨水逐滴加入固体氢氧化钠中，室温下搅拌制备，并用氢氧化钾干燥)到反应液中，室温下通1h，加入20mL蒸馏水，减压旋蒸除去大部分四氢呋喃溶剂，用二氯甲烷萃取(每次50mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，用蒸馏水洗(每次40mL蒸馏水，洗3次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯＝1:2,V/V)分离得到白色固体中间体(1.07g，产率94.8％)。ESI-MS(m/z):249.64[M+Na]+；取113.1mg(0.50mmol)中间体和52.3mg(0.55mmol)1H吡咯-2-甲醛于反应瓶中，74.1mg(0.70mmol)无水氯化铜于反应瓶中，加入20mL乙醇，70℃下搅拌，薄层层析法(TLC)监测反应，反应结束后，减压旋蒸除去溶剂(乙醇)，加30mL二氯甲烷和30mL蒸馏水，分液分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(每次20mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，蒸馏水洗(每次20mL蒸馏水，洗2次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚:乙酸乙酯＝1:2,V/V)分离得到白色固体Q308(98.2mg,产率65.2％)。mp 205～206℃；HRMS for C15H14O4N3([M-H]+)Calcd:300.0990,Fo und:300.0991；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.48(s,1H),10.18(s,1H),7.52(s,1H),7.24(s,1H),7.04(s,1H),6.36(s,1H),4.10(s,3H),4.05(s,3H),4.01(s,3H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6)δ:161.74,151.61,147.96,147.61,144.43,139.32,124.92,123.95,116.87,112.24,109.99,101.77,62.71,61.27,56.28。
实施例2 6,7,8-三甲氧基-2-(5-甲基呋喃-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q301)的合成
取1.13g(5.0mmol)2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸于双颈瓶中，加入50mL四氢呋喃，再加入1.44g(7.50mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，1.01g(7.50mm ol)1-羟基苯并三唑(HOBT)和829μL(7.50mmol)N-甲基吗啉，室温下搅拌3.5h；再通入7.46mM氨气(将氨水逐滴加入固体氢氧化钠中，室温下搅拌制备，并用氢氧化钾干燥)到反应液中，室温下通1h，加入20mL蒸馏水，减压旋蒸除去大部分四氢呋喃溶剂，用二氯甲烷萃取(每次50mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，用蒸馏水洗(每次40mL蒸馏水，洗3次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯＝1:2,V/V)分离得到白色固体中间体(1.07g，产率94.8％)。ESI-MS(m/z):249.64[M+Na]+；取114.5mg(0.51mmol)中间体和53.8mg(0.56mmol)糠醛于反应瓶中，61.9mg(0.46mmol)无水氯化铜于反应瓶中，加入20mL乙醇，70℃下搅拌，薄层层析法(TLC)监测反应，反应结束后，减压旋蒸除去溶剂(乙醇)，加30mL二氯甲烷和30mL蒸馏水，分液分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(每次20mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，蒸馏水洗(每次20mL蒸馏水，洗2次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚:乙酸乙酯＝1:2,V/V)分离得到白色固体Q301(140.5mg,产率91.9％)。mp208～209℃；HRMS for C15H13O5N2([M+H]+)Calcd:303.0975,Found:303.0976；1H NMR(400MHz,DMS-O-d6)δ:10.07(s,1H),7.61(d,J＝1.0Hz,1H),7.49(s,1H),7.44(d,J＝3.5Hz,1H),6.63(dd,J＝3.5,1.7Hz,1H),4.14(s,3H),4.05(s,3H),3.99(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:161.26,152.66,148.12,147.89,146.62,144.73,141.18,139.17,117.07,113.10,112.90,101.70,62.43,61.37,56.22。
实施例3 6,7,8-三甲氧基-2-(噻吩-2-基)喹唑啉-4(3H)-酮(Q306)的合成
取1.13g(5.0mmol)2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸于双颈瓶中，加入50mL四氢呋喃，再加入1.44g(7.50mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，1.01g(7.50mmol)1-羟基苯并三唑(HOBT)和829μL(7.50mmol)N-甲基吗啉，室温下搅拌3.5h；再通入7.46mM氨气(将氨水逐滴加入固体氢氧化钠中，室温下搅拌制备，并用氢氧化钾干燥)到反应液中，室温下通1h，加入20mL蒸馏水，减压旋蒸除去大部分四氢呋喃溶剂，用二氯甲烷萃取(每次50mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，用蒸馏水洗(每次40mL蒸馏水，洗3次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂:石油醚：乙酸乙酯＝1:2,V/V)分离得到白色固体中间体(1.07g，产率94.8％)。ESI-MS(m/z):249.64[M+Na]+；取90mg(0.40mmol)中间体和49.3mg(0.44mmol)噻吩-2-甲醛于反应瓶中，48.6mg(0.36mmol)无水氯化铜于反应瓶中，加入20mL乙醇，70℃下搅拌，薄层层析法(TLC)监测反应，反应结束后，减压旋蒸除去溶剂(乙醇)，加30mL二氯甲烷和30mL蒸馏水，分液分出有机层，水层用二氯甲烷萃取(每次20mL二氯甲烷，萃取3次)，合并有机层，蒸馏水洗(每次20mL蒸馏水，洗2次)，无水硫酸钠干燥，硅胶柱层析(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝1：2,V/V)分离得到白色固体Q306(120.4mg,产率94.6％)。mp217～219℃；HRMS for C15H13O4N2S([M-H]+)Calcd:317.0602,Found:317.0598；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:11.95(s,1H),8.12(d,J＝3.6Hz,1H),7.56(d,J＝5.0Hz,1H),7.50(s,1H),7.22–7.15(m,1H),4.20(s,3H),4.07(s,3H),4.01(s,3H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ:152.55,148.20,147.82,144.73,139.42,137.95,130.76,128.07,127.22,116.54,101.45,62.63,61.45,56.20。
效果实施例
1.通过流式细胞术检测Q308对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6和J-Lat A2细胞(由复旦大学姜世勃教授和陆路教授所馈赠，已公开于文献中：Zhang XX,Lin J,LiangTZ,et al.The BET bromodomain inhibitor apabetalone induces apoptosis oflatent HIV-1reser voir cells following viral reactivation[J].Acta PharmacolSin,2019.40(1):98-110.)受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性，具体实验过程如下：
(1)收集J-Lat 10.6和J-Lat A2细胞液于离心管，1200rpm离心2min，弃上清，留细胞沉淀；
(2)加3mL1640培养基，吹匀细胞后吸取20μL细胞液于细胞计数板中，计数；
(3)调整细胞浓度至5×105个/mL，以0.5mL/孔铺于48孔板中；
(4)分别加入系列稀释的不同浓度Q308(溶剂为DMSO，终浓度分别为0、5、10、20μM)与PMA(终浓度为10ng/mL)共同处理细胞并在37℃，每种处理重复3次，含5％CO2的培养箱中孵育24h，同时，设置DMSO空白对照(仅含DMSO和细胞)和单纯的PMA对照组(仅含DMSO、PMA和细胞)；
(5)收集细胞培养液于流式管中，1200rpm离心2min；
(6)弃上清液，用移液枪向各流式管分别加入300μLPBS并缓慢吹打混匀，1200rpm离心2min，重复该步骤一次；
(7)再分别向各流式管加入300μLPBS，立即使用流式细胞仪中的FITC通道检测每个样品GFP阳性细胞的百分比，比较各浓度梯度Q308给药组与单纯的PMA对照组GFP阳性细胞的百分比的变化，该百分比的变化代表化合物Q308拮抗PMA诱导HIV潜伏感染激活的程度，结果如图1、图2所示：J-Lat 10.6和J-Lat A2细胞中加入Q308 24h后，PMA诱导增加的GFP阳性细胞比率均能被Q308显著抑制，且呈浓度梯度依赖性。
2.通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Q308对HIV-1潜伏感染细胞模型ACH2和U1(由复旦大学姜世勃教授和陆路教授所馈赠，已公开于文献中：Zhang XX,Lin J,Liang TZ,et al.The BET bromodomain inhibitor apabetalone induces apoptosis of latentHIV-1res ervoir cells following viral reactivation[J].Acta Pharmacol Sin,2019.40(1):98-110.)受PMA诱导激活的拮抗活性，具体试验过程如下：
(1)收集ACH2和U1细胞液于离心管，1200rpm离心2min，弃上清，留细胞沉淀；
(2)加3mL1640培养基，吹匀细胞后吸取20μL细胞液于细胞计数板中，计数；
(3)调整细胞浓度至1×106个/mL，以500μL/孔铺于48孔板中；
(4)分别加入系列稀释的不同浓度Q308(溶剂为DMSO，终浓度分别为0、5、10、20μM)与PMA(终浓度为10ng/mL)共同处理细胞并在37℃，每种处理重复3次，含5％CO2的培养箱中孵育48h，同时，设置DMSO空白对照(仅含DMSO和细胞)和单纯的PMA对照组(仅含DMSO、PMA和细胞)；
(5)离心并收集300μL细胞上清液置于1.5mL离心管中，并于每管中加入等体积的即300μL的TritonX-100(浓度为5％)，于4℃裂解12h，采用ELISA法检测各处理组中p24抗原含量，具体操作如下：
1)抗体包被：在p24抗体母液中加入相应体积的pH＝9.6的碳酸钠/碳酸氢钠包被液，使其终浓度为2μg/mL，加入96孔酶标板中，50μL/孔，4℃孵育过夜；
2)洗涤：在各孔中加入PBST洗液，200μL/孔，震荡洗涤1次，轻轻拍干；
3)封闭：加入PBST配置的5％脱脂牛奶，150μL/孔，37℃孵育1h，洗板1次；
4)样品的配制和孵育：用PBS溶液将样品按10倍的比例稀释，同时设置PBS空白对照，每个样品设三个复孔，50μL/孔，37℃孵育1h后，洗板5次；
5)一抗孵育：用PBST配置的2％脱脂牛奶按照1:2000稀释Anti-p24兔多抗(购自英国Abcam公司)，50μL/孔，37℃孵育1h，洗板5次；
6)二抗孵育：用PBST配置的2％脱脂牛奶按照1:3000稀释HRP-羊抗兔IgG(购自美国CST公司)，50μL/孔，37℃孵育1h，洗板5次；
7)显色：每孔加入50μL显色液3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)，室温孵育10min，待PBS空白对照组变为浅蓝色时，立即向各处理组加入20μL硫酸(浓度为1M)以终止显色；
8)读取吸光度值：将板置于Tecan酶标仪中读取各处理组的吸光度值(参考波长为570nm，检测波长为450nm)；将扣除本底即PBS空白对照组吸光度值后的PMA处理组进行归一化处理，分别计算各浓度Q308处理组相对于PMA对照组诱导产生的p24抗原含量百分比，结果如图3、图4所示：ACH2和U1细胞中加入Q308 48h后，其病毒的p24含量比单纯的PMA处理组明显减少，并且在5～20μM范围内随着Q308浓度的增高病毒的p24含量也逐渐降低，表明Q308可呈浓度依赖性地拮抗PMA对潜伏感染细胞ACH2、U1的HIV-1的表达。
3.通过MTT法分析Q308对人外周血单核细胞PBMCs的细胞毒性，具体操作如下：
(1)健康人PBMCs的分离：
1)在15mL离心管中加入4mL人外周血淋巴细胞分离纯化液(购自北京索莱宝科技有限公司)；
2)用移液枪吸取4mL稀释血液(生理盐水：全血＝1:1，V/V)慢慢滴入离心管中，将离心管放置于离心机中以400rpm/min离心30min；
3)离心完成后可观察到离心管中间出现白色细胞层，即为淋巴细胞，用1mL移液枪头缓慢吸取该液体层至另一无菌的离心管中；
4)再向管中加入4mL体积的生理盐水，充分吹匀，400rpm/min离心10min；
5)离心后吸掉上清液，将细胞用生理盐水吹洗干净，400rpm/min离心10min，重复该步骤一次，去上清后用新鲜的1640培养基重悬PBMCs细胞即分离过程完成。
(2)MTT实验：
1)收集人外周单核细胞PBMCs细胞液于离心管，以1×106个/mL，100μL/孔加入至96孔细胞培养板中；
2)加入系列稀释的1640空白培养基配制的Q308(终浓度分别为0、0.6、1.3、2.5、5、10、20、40、80、160μM)，100μl/孔，每种处理重复3次；
3)在37℃，5％CO2培养箱中孵育48h后，加入MTT溶液(5mg/mL，PBS配制，pH＝7.4)20μL/孔，继续37℃，5％CO2孵育4h，3000rpm离心5min，小心吸弃孔内培养上清，每孔加入100μLDMSO，振荡15min，使结晶物溶解；
4)使用酶标仪检测每孔570nm处吸光度。
结果如图5所示：Q308在0～160μM内对人外周血单核细胞PBMCs的细胞活力无明显影响，表明说明当Q308的工作浓度选取在0～20μM范围内对细胞是安全的。
4.通过流式细胞术检测Q301、Q306对HIV-1潜伏感染细胞模型J-Lat 10.6细胞受丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)诱导激活的拮抗活性，具体实验过程如下：
(1)收集J-Lat 10.6细胞液于离心管，1200rpm离心2min，弃上清，留细胞沉淀；
(2)加3mL1640培养基，吹匀细胞后吸取20μL细胞液于细胞计数板中，计数；
(3)调整细胞浓度至5×105个/mL，以0.5mL/孔铺于48孔板中；
(4)分别终浓度为10μM Q301、Q306与PMA(终浓度为10ng/mL)共同处理细胞并在37℃，每种处理重复3次，含5％CO2的培养箱中孵育24h，同时，设置单纯的PMA对照组(仅含DMSO、PMA和细胞)；
(5)收集细胞培养液于流式管中，1200rpm离心2min；
(6)弃上清液，用移液枪向各流式管分别加入300μLPBS并缓慢吹打混匀，1200rpm离心2min，重复该步骤一次；
(7)再分别向各流式管加入300μLPBS，立即使用流式细胞仪中的FITC通道检测每个样品GFP阳性细胞的百分比，比较Q301、Q306给药组与单纯的PMA对照组GFP阳性细胞的百分比的变化，该百分比的变化代表化合物Q301、Q306拮抗PMA诱导HIV潜伏感染激活的程度，结果如图6所示：J-Lat 10.6细胞中加入Q301、Q306 24h后，PMA诱导增加的GFP阳性细胞比率均能被Q301、Q306抑制，GFP阳性细胞的百分比由65％下降至54.8％及57％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种化合物，其特征在于：所述化合物的化学结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003091639990000011
式(I)中，R2选自
Figure FDA0003091639990000012
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，合成路线为：
Figure FDA0003091639990000013
上述结构式中，R2选自
Figure FDA0003091639990000014
包括如下步骤：
(1)将2-氨基-3,4,5-三甲氧基苯甲酸与氨气混合，反应，得到化合物1；
(2)将化合物1和化合物2混合，反应，得到化合物3。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述反应在有机溶剂、缩合剂及碱存在下进行。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述有机溶剂为甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷和乙酸乙酯中的至少一种；
优选地，所述缩合剂为下列物质中的一种与1-羟基苯并三唑的组合：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、O-苯并三唑-N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸酯和2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N,N-四甲基脲六氟磷酸酯；
优选地，所述碱为二乙胺、三乙胺、N-甲基吗啉、碳酸钾和碳酸钠中的至少一种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述反应在有机溶剂及催化剂存在下进行。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
所述有机溶剂为氯仿、二甲基亚砜和乙醇中的至少一种；
优选地，所述催化剂为溴化亚铜和无水氯化铜中的至少一种。
7.权利要求1所述的化合物或其衍生物在作为和/或制备产品中的应用，
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)治疗艾滋病的药物；
(2)艾滋病病毒潜伏感染促进剂；
(3)艾滋病病毒激活抑制剂。
8.一种产品，包含权利要求1所述的化合物或其衍生物；
优选地，所述产品为(1)～(3)中任一种：
(1)治疗艾滋病的药物；
(2)艾滋病病毒潜伏感染促进剂；
(3)艾滋病病毒激活抑制剂。
9.一种药物，包含：
(1)权利要求1所述的化合物或其衍生物；和
(2)药学上可接受的辅料。
10.一种体外阻断潜伏艾滋病病毒激活的方法，将权利要求1所述的化合物和/或权利要求8所述的产品与艾滋病病毒潜伏感染的细胞混合，培养。
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