CN113288874B - 一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体及其制法 - Google Patents

一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体及其制法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体及其制法，涉及难溶性药物纳米制剂领域。以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物为共喷载体，溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂，通过静电喷雾法制备具有快速释放特征的虾青素非晶固体分散体。各组分的质量比为虾青素：双亲性嵌段共聚物：亲水性高分子聚合物＝1:6‑24:4‑8，其中虾青素在混合溶剂中的质量体积浓度为0.05％‑0.3％(w/v)，双亲性嵌段共聚物在混合溶剂中的浓度为0.3％‑4.8％(w/v)，亲水性高分子聚合物在混合溶剂中的浓度为0.2％‑2.4％(w/v)。该制剂能够提高虾青素的溶解度，促进药物释放，提高虾青素口服生物利用度。本发明工艺简单，具有较好的应用前景。

Description

一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体及其制法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别是涉及难溶性活性成分虾青素非晶固体分散体及其制法。
背景技术
静电喷雾技术(Electrospray Technology)是指利用电流体动力学技术将聚合物载体溶液制成微米、纳米颗粒或纤维(参见：D.-G.Yu,J.-J.Li,G.R.Williams,etal.Electrospun amorphous solid dispersions of poorly water-soluble drugs:Areview[J].Journal of Controlled Release,2018,292:91-110.)。静电喷雾技术简单易操作，通过调节装置的参数(如电压、接收距离、液体流速)可以制备不同的微米级/纳米级颗粒或纤维材料，通常这些产品具有形态饱满、外表光滑、粒径均一、载药量和包封率较高等优点(蔡汉须,杨晔,王飞.静电喷雾技术制备载药微/纳米粒子研究进展[J].广州化工,2013,41(24):4-5+23)。
固体分散体是药物的一种存在形式，具体指药物在合适的载体材料中以分子、微晶、胶体或非晶态均匀高度分散(司俊仁,叶小强,李新月等.固体分散体的发展及制备工艺研究进展[J].吉林医药学院学报,2015,36(04):300-303.)。作为一种制剂中间体，固体分散体很大程度地改善了难溶性药物的溶出并提高了药物的生物利用度。狭义上可认为固体分散体即为非晶固体分散体(L.M.d.Mohac,A.V.Keating,M.d.F.Pina,et al.Engineeringof Nanofibrous Amorphous and Crystalline Solid Dispersions for Oral DrugDelivery[J].Pharmaceutics,2018,11(1):7.)
由于静电喷雾技术可将药物和载体系统纳米化，增加了活性药物成分的表面积从而促进其溶解，因此该技术被广泛应用于制备固体分散体。利用液体与电场的相互作用，静电喷雾技术通过在聚合物/药物溶液从金属尖端注射器向收集器喷射过程中向两极施加高电位差，使流体射流雾化成小液滴，而后在极短时间内凝固成纳米级微粒，得到固体分散体(怡婧,黄桂婷,郑琴等.药物固体分散体技术回顾与展望[J].中国药学杂志,2020,55(17):1401-1408.)利用静电喷雾技术，结合使用脂溶性高分子材料和水溶性高分子材料制备疏水药物核壳粒子型固体分散体，可以使大多数疏水性药物存在于粒子内部，使其在释放过程中壳层材料保护内层药物，延长药物的生物半衰期，保持药物完整的结构与活性。水溶性高分子材料在体液中发生溶胀，延长药物作用时间，达到缓释的目的(杨晔,尹登科.一种静电喷法制备疏水药物核壳粒子型固体分散体的方法[P].安徽：CN103099785A,2013-05-15.)。
虾青素作为一种类胡萝卜素，具有强抗氧化性。但却因其水溶性差(M.Shakeri,S.H.Razavi,S.Shakeri.Carvacrol and astaxanthin co-entrapment in beeswax solidlipid nanoparticles as an efficient nano-system with dual antioxidant andanti-biofilm activities[J].LWT-Food Science and Technology,2019,107:280-290.)，难以被机体吸收而造成口服后生物利用度低。本发明通过结合使用双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物，以静电喷雾技术制备虾青素非晶固体分散体，使虾青素在聚合物基质中均匀分布，并有效抑制其分子运动(D.-G.Yu,J.-M.Yang,C.Branford-White,etal.Third generation solid dispersions of ferulic acid in electrospuncomposite nanofibers[J].International Journal of Pharmaceutics,2010,400(1):158-164.)，使其长时间保持非晶态物理形式，显著提高难溶性药物虾青素的溶解度，溶出速率和生物利用度，不涉及核壳双层概念。其中，双亲性嵌段共聚物载体通过胶束形成药物疏水包埋以增加载药量及溶解度，使用亲水性高分子聚合物进一步实现难溶性虾青素的高度分散及其水化效果，因此本发明以两种不同类型的高分子材料为共喷载体，通过静电喷雾法制备非晶虾青素固体分散体，达到增溶、速释、提高生物利用度的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体。以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物作为共喷载体，提高虾青素的溶解度、溶出速率和生物利用度，抑制虾青素结晶析出，制备一种虾青素非晶固体分散体。
本发明的另一目的是提供这种虾青素非晶固体分散体的制备方法。以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子材料作为共喷载体利用静电喷雾法制备上述制剂，达到活性成分的增溶、抑晶作用，促进虾青素口服生物利用度的提高，开发虾青素非晶固体分散体，也为类似性质的活性成分制剂开发提供技术创新。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物为共喷载体，各组分的质量比为虾青素：双亲性嵌段共聚物：亲水性高分子聚合物＝1:6-24:4-8，其中虾青素在混合溶剂中的质量体积浓度为0.05％-0.3％(w/v)，双亲性嵌段共聚物在混合溶剂中的浓度为0.3％-4.8％(w/v)，亲水性高分子聚合物在混合溶剂中的浓度为0.2％-2.4％(w/v)。
一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体的方法，按照下述步骤进行：
(1)虾青素溶解于一定体积二氯甲烷中，超声5-20min使均匀，得到A溶液；双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，超声5-20min使均匀，得到B溶液。其中，溶液间的体积比例A:B等于1:1-5。
(2)上述A溶液分散到B溶液中，超声20-40min使混合均匀，得到总有机相。
(3)上述总有机相装入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压10-18KV、接收距离10-20cm、液体流速0.2-1.0mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
所述的双亲性嵌段共聚物为聚乙烯已内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物(Soluplus)、普朗尼克F68、普朗尼克F127等。
所述的亲水性高分子聚合物为共聚维酮VA64(PVPVA64)、聚维酮K12(PVP K12)、聚维酮K17(PVP K17)、聚维酮K 25(PVP K25)、聚维酮K 30S(PVP K30S)等。
所述的虾青素：双亲性嵌段共聚物：亲水性高分子聚合物的的质量比为1:6-24:4-8。
所述的二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中二氯甲烷的体积含量(v％)为50％-75％。
上述一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体呈橘色或者橘红色干燥粉末状，在水中再分散后粒径为120-210nm，呈规则球形。
上述一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体中固体分散体可灌装于胶囊中制成胶囊剂或压制成片剂。
有益效果
本发明具有以下的有益效果：
1、本发明提供了一种具有前景的虾青素非晶固体分散体制备方法，以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物作为共喷载体，利用静电喷雾法制得的虾青素非晶固体分散体呈干燥橘红色粉末状，非晶固体分散体溶于水后平均粒径为120-210nm，扫描电镜显示其微粒分布均匀且呈球形结构。
2、本发明解决了虾青素的难溶性问题，制备能够均匀分散在水体系的虾青素无定形纳米微粒，能够实现虾青素的快速释放。体外实验研究表明，该虾青素非晶固体分散体在超纯水中2h内的释放最高可达到88.33％。该法制得的虾青素非晶固体分散体在水中分散性好、体外迅速释放。
3、本发明通过联用双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物，发挥复合载体的增溶、促吸作用，提高虾青素在水中的溶解度(原料药在水中仅仅87.35ng/mL)，大鼠体内药物动力学特征评价其体内生物利用度。结果表明：与原料药组相比，该虾青素非晶固体分散体的体内生物利用度显著提高，表现为大鼠口服给药后2h的最高血药浓度为248.18ng/mL，约为原料药吸收的4.2倍。药动学参数显示制剂组的半衰期较原料药组降低3.7倍，药时曲线下面积提高1.1倍；与原料药相比，虾青素非晶固体分散体的相对生物利用度高达212.11％，说明虾青素非晶固体分散体在大鼠体内口服吸收迅速，显著提高虾青素的体内生物利用度。
4、本发明解决了虾青素体内生物利用度低，难以发挥抗氧化作用的问题。Caco-2细胞ROS清除率评价其抗氧化作用，结果表明：虾青素非晶固体分散体组的活性氧清除效率最高，约为原料药组清除效率的1.72倍。说明虾青素非晶固体分散体比原料药更易被细胞摄取，使得单位质量的虾青素能够在细胞内部清除更多的由过氧化氢损伤而产生的活性氧，发挥其强的抗氧化作用。
附图说明
图1为虾青素非晶固体分散体外观形态图(A:锡箔纸上虾青素非晶固体分散体；B：粉末状虾青素非晶固体分散体；C：虾青素非晶固体分散体水溶液)；
图2为虾青素非晶固体分散体扫描电镜图；
图3为虾青素非晶固体分散体体外释放曲线图；
图4为虾青素非晶固体分散体大鼠体内生物利用度药时曲线图；
图5为虾青素非晶固体分散体对Caco-2细胞内活性氧清除率柱状图。
具体实施方式
以下所列实施例有助于本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
以下实施例所用主要仪器和材料
实验材料：
虾青素(中国南京多隆生物科技有限公司)；Soluplus(BASF，德国)；PVPVA64(BASF，德国)；二氯甲烷(成都市科隆化学品有限公司)；甲醇(成都市科隆化学品有限公司)；丙酮(国药集团化学试剂有限公司)；正己烷(GC级)(阿拉丁)；DME/F12(Hyclone)；胎牛血清(Gibco，澳洲)
实验仪器：
静电纺丝机(江苏大学药学院自组装)；LSP01-1A型微量注射泵(河北保定兰格恒流泵有限公司)；高效液相色谱(SHIMADZU(岛津)，日本)；电子天平(赛多利斯，德国SartoriusBSA124S-CW)；90Plus PALS激光粒度仪(美国Brookhaven公司)；MS-H-S加热磁力搅拌器(北京大龙兴创实验仪器有限公司)；XH-2800快速混匀器(江苏金怡仪器科技有限公司)；数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；恒温振荡器(江苏金坛市中大仪器厂)；JEM-7001F扫描电镜(日本电子株式会社JEOL)；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(上海予申仪器有限公司)；QB-128旋转培养混合器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)；HH-S2数显恒温水浴锅(江苏金怡仪器科技有限公司)；荧光酶标仪(SpectraMax Gemini)
实施例1虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素5mg溶解于1.5mL二氯甲烷中，超声5min使均匀。精密称取Soluplus 30mg和PVPVA64 20mg溶解于7.5mL的甲醇的混合溶剂中，超声5min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声20min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压18KV、接收距离15cm、液体流速0.6mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例2虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素5mg溶解于2.0mL二氯甲烷中，超声5min使均匀。精密称取F6850mg和PVPVA64 30mg溶解于8.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声10min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声20min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压14KV、接收距离10cm、液体流速0.2mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例3虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素10mg溶解于3.0mL二氯甲烷中，超声10min使均匀。精密称取Soluplus 120mg和PVP K17 60mg溶解于7.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声5min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声25min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压10KV、接收距离15cm、液体流速1.0mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例4虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素10mg溶解于5.0mL二氯甲烷中，超声10min使均匀。精密称取F127 240mg和PVP K30S 80mg溶解于5.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声10min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声30min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压18KV、接收距离20cm、液体流速0.6mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例5虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素20mg溶解于4.0mL二氯甲烷中，超声20min使均匀。精密称取Soluplus 400mg和PVP K25 140mg溶解于6.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声15min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声40min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压14KV、接收距离10cm、液体流速0.2mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例6虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素20mg溶解于5.0mL二氯甲烷中，超声10min使均匀。精密称取Soluplus 267mg和PVPVA64 133mg溶解于5.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声10min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声20min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压18KV、接收距离15cm、液体流速0.6mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例7虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素20mg溶解于3.0mL二氯甲烷中，超声5min使均匀。精密称取Soluplus 440mg和PVP K12 80mg溶解于7.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声20min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声40min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压10KV、接收距离15cm、液体流速0.6mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例8虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素30mg溶解于5.0mL二氯甲烷中，超声20min使均匀。精密称取F68 180mg和PVPVA64 120mg溶解于5.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声20min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声35min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压18KV、接收距离20cm、液体流速1.0mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例9虾青素非晶固体分散体的制备
(1)精密称取虾青素30mg溶解于2.0mL二氯甲烷中，超声15min使均匀。精密称取Soluplus 480mg和PVPVA64 240mg溶解于8.0mL的甲醇的混合溶剂中，超声15min使均匀。将虾青素溶液分散到Soluplus和PVPVA64的混合溶液中，超声25min使充分分散。
(2)再将此溶液入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压10KV、接收距离15cm、液体流速0.2mL/h、温度(25℃)、湿度(35％)进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
实施例10实施例6所制备的虾青素非晶固体分散体形态学研究
(1)形态观察选取实施例6制备的虾青素非晶固体分散体，观察接收于锡箔纸上固体的外观形态，发现呈橘红色椭圆形固体状。可用刮刀轻轻将其刮下，所得固体极易碎裂成粉末状，色泽均匀，易溶于水，形态良好，水溶液为橘红色澄清液体，其结果见图1。
(2)SEM形态选取实施例6制备的固体沉淀物，置于扫描电镜下观察，发现虾青素非晶固体分散体在不同视野中均为规则的球形颗粒，呈微球状，分布均匀，粒径较小，约为120-210nm。50μm的最大视野发现固体分散体具有极大的比表面积，说明虾青素高度分散于复合载体辅料中，促进了制剂的溶解。
实施例11实施例6所制备的虾青素非晶固体分散体体外释药实验
精密称取50.0mg实施例6下制备的虾青素非晶固体分散体，分别投入装有250mL水和pH为1.2、4.5、6.8的缓冲盐释放介质的锥形瓶中，放置在37±1℃恒温加热磁力搅拌器中，200rpm恒温振荡，于5min、10min、15min、30min、45min、60min、120min每个时间点分别吸取1mL样品，为保证体积不变同时补1mL相同介质。所得样品均过0.45μm MCE混合纤维素酯水系针头式微孔滤膜，弃去初滤液后用50％二氯甲烷-甲醇溶液稀释十倍，混匀后再过0.22μm NY尼龙有机系针头式微孔滤膜，所得续滤液进行HPLC定量分析，测定虾青素含量，以时间为横坐标，以累积释放百分率为纵坐标，绘制虾青素释放曲线，其结果如图3所示。由图3可以看出，不同介质中虾青素固体分散体的体外释放差异较大，水溶液中制剂释放百分率最高，最高值达到了88.33％。在pH 1.2介质中，刚投入制剂时虾青素的释放速度最快，略快于水溶液，但其释放百分率低于水溶液，最高值为73.58％；而pH 4.5介质中虾青素的溶出速率极低，释放百分率最高值仅为0.65％；pH 6.8介质中虾青素的溶出速率明显低于水溶液和pH 1.2介质，最高释放百分率为7.97％。由此可得，制剂的溶出速率明显受到介质种类的影响，考虑pH 4.5和6.8介质中大量的磷酸盐限制了虾青素非晶固体分散体中复合辅料的溶解，使虾青素不能有效溶出。但是制剂在水中的高溶出度成功解决了虾青素原料药难溶性的问题，说明静电喷雾制备的虾青素非晶固体分散体符合处方设计目的。
实施例12实施例6所制备的虾青素非晶固体分散体体内生物利用度初步评价
对实施例6制备所得的虾青素非晶固体分散体的体内生物利用度进行评价，进行大鼠体内药动学研究，考察大鼠分别口服虾青素非晶固体分散体和虾青素原料药后的血药浓度随时间变化的关系。以眼眶取血的方式收集经灌胃给药后的大鼠血样，经系列处理后评价虾青素非晶固体分散体的口服生物利用度和体内药物动力学特征。
(1)动物给药
将6只健康雄性SD大鼠(200±20g)禁食不禁水处理12小时后随机分为虾青素原料药组和虾青素非晶固体分散体给药组，每组3只并做好标记。由于虾青素原料药不溶于水，为保证大鼠的口服吸收效率，精密称取30.0mg原料药并均匀分散于0.5％的羧甲基纤维素钠，而制剂则直接溶于超纯水。按照50mg/kg·BW的给药剂量精密称量静电喷雾制备的最优处方虾青素非晶固体分散体760.07mg，并均匀溶于10mL超纯水。实验过程中每只大鼠的灌胃剂量为3.0mL，在0.5、1、2、4、6、8、10、12、24h七个时间点分别取0.5mL血样。
(2)样品处理
将经大鼠眼眶取血的0.5mL血样加入到含20μL肝素钠的1.5mL EP管中，静置30min后以3700rpm的转速离心10min，所得上清即为血浆样品。然后进行血浆样品处理：首先分别向10mL EP管中加入1.6mL的丙酮，充分涡旋后置于旋转培养混合器振摇40min，接着加入1.6mL正己烷，待涡旋混合均匀后避光静置1h，吸取上清液于新10mL EP管中，置于37℃恒温水浴锅中加热处理，辅以N2将其吹干。最后，向干燥的EP管中加入100μL 50％的二氯甲烷-甲醇混合溶剂，使虾青素复溶。在12000rpm的条件下离心10min后取上清进行高效液相色谱定量分析，计算血药浓度，绘制药时曲线，其结果如图4所示。
(3)结果
虾青素原料药和虾青素非晶固体分散体的达峰时间相同，均为2h，但是虾青素原料药的最高血药浓度则远低于虾青素固体分散体的最高血药浓度。虾青素原料药达峰时的血药浓度仅为(59.56±7.12)ng/mL，而虾青素非晶固体分散体达峰时的血药浓度高达(248.18±23.36)ng/mL，约为原料药吸收的4.2倍。为考察虾青素及AST-ASDs经SD大鼠口服给药后的药动学参数，使用BAPP 2.3软件拟合隔室模型药动学参数，所得结果见表一。
表1药动学参数拟合(n＝3)
Figure GDA0003502086990000101
根据表一，虾青素非晶固体分散体的半衰期为3.19h，相较于原料药T1/2的14.96h，制剂的半衰期减少约3.7倍，说明制剂进入体内可被迅速吸收，无缓释作用。虾青素非晶固体分散体的平均驻留时间为8.64h，也明显低于原料药的25.24h，也说明了制剂的增溶作用较好，进入机体后迅速被吸收。另外，AST-ASDs的药时曲线下面积AUC为1545.11h·ng·mL-1，虾青素原料药的AUC为728.46h·ng·mL-1，制剂的AUC明显高于原料药。根据相对生物利用度公式(Fr＝(AUCT·DR)/(AUCR·DT)，T为受试制剂、R为参比制剂)计算得到制剂的相对生物利用度高达212.11％，说明静电喷雾制备的AST-ASDs极大程度上提高了虾青素的口服生物利用度，促进了虾青素进入机体后的迅速吸收。
实施例13实施例6所制备的虾青素非晶固体分散体抗氧化作用评价
对实施例6制备所得的虾青素非晶固体分散体的抗氧化作用进行评价，进行Caco-2细胞ROS清除率的测定。利用细胞活性氧的荧光定量法检测经虾青素非晶固体分散体给药后细胞的活性氧清除率RSE(ROS scavenging efficiency，％)，以虾青素原料药作为对照，以维生素C作为阳性对照，探究虾青素非晶固体分散体对Caco-2细胞抗氧化能力改善作用大小。
(1)ROS清除率检测过程
分别对虾青素原料药、虾青素非晶固体分散体、空白制剂和维生素C进行活性氧清除率的测定。先将DME/F12、FBS和PBS置于37℃恒温水浴锅中预热，配制培养液(DME/F12+10％FBS)后将Caco-2细胞种在96孔微孔板中，每孔1×105个细胞，加入100μL培养液恒温孵育24h。孵育期间分别配制2μg/mL的虾青素原料药、AST-ASDs(含辅料50.67μg/mL)和维生素C以及50.67μg/mL空白制剂。其中虾青素原料药和制剂每mL溶液含药物3.35nM，水溶性维生素C每mL溶液含VC 10.58nM。以不加样品只加DME/F12培养液为对照组，以上述四种样品为实验组，每孔加入100μL，置于细胞培养箱中孵育24h。待孵育结束，将每个孔内的Caco-2细胞用PBS洗涤2次，然后向每个孔内加入100μL的DCFH-DA(10μM)，孵育1h。精密称取48.72mgDCFH-DA溶于10mL DMSO，再用PBS稀释1000倍即得10μmol/L荧光探针溶液。孵育结束，移去上清液，用150μL/孔的PBS洗涤细胞2次。再向每孔中加入100μL H2O2溶液(10μM)处理1h。将10μL浓度为5.8mM的H2O2溶液加入5.79mL DME/F12中得10μM的H2O2溶液。处理完毕，用荧光酶标仪检测各个孔内的荧光强度(激发波长λex＝466nm，发射波长λem＝504nm)。
(2)ROS清除率检测结果
虾青素非晶固体分散体对Caco-2细胞抗氧化能力的改善作用以活性氧的清除率表示，RSE(％)＝(1-Fs/Fc)×100％，其中Fs与Fc分别为荧光酶标仪测得的实验样品和阴性对照的荧光强度，所得结果见图5。由于虾青素本身具有强大的抗氧化作用，能够清除体内的活性氧，因此若虾青素进入细胞内部则会清除由H2O2引起的活性氧ROS。根据图5可知，虾青素非晶固体分散体的活性氧清除效率最高，为35.65％，而虾青素原料药的ROS清除效率较低，为20.67％。说明相较于游离虾青素，虾青素非晶固体分散体更易进入细胞发挥抗氧化作用。而阳性对照组维生素C的活性氧清除率为32.59％，说明虾青素非晶固体分散体的ROS清除能力与维生素C相当，甚至略低于制剂，但是大大高于虾青素原料药，说明虾青素原料药难以进入细胞发生抗氧化作用，而制剂和维生素C均易于进入细胞清除细胞内部活性氧。空白制剂组的活性氧清除率仅为18.39％，说明辅料对细胞内的活性氧基本无清除作用，即辅料无抗氧化能力。上述结论说明虾青素非晶固体分散体能比虾青素原料药更快更多地进入Caco-2细胞内部，发挥虾青素本身强的抗氧化作用，清除由H2O2引起的活性氧ROS。

Claims (5)

1.一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，其特征在于：以双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物为共喷载体，溶于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂；各组分的质量比为虾青素：双亲性嵌段共聚物：亲水性高分子聚合物＝1:6-24:4-8，其中虾青素在混合溶剂中的质量体积浓度为0.05％-0.3％(w/v)，双亲性嵌段共聚物在混合溶剂中的浓度以质量与体积比计为0.3％-4.8％，亲水性高分子聚合物在混合溶剂中的浓度以质量与体积比计为0.2％-2.4％；
所述的双亲性嵌段共聚物为聚乙烯已内酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物Soluplus、普朗尼克F68、普朗尼克F127；
上述的亲水性高分子聚合物为共聚维酮VA64(PVPVA64)、聚维酮K12(PVP K12)、聚维酮K17(PVP K17)、聚维酮K 25(PVP K25)、聚维酮K 30S(PVP K30S)。
2.根据权利要求1所述的一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，其特征在于混合溶剂为二氯甲烷、甲醇混合溶剂，其中二氯甲烷的体积含量为50％-75％。
3.根据权利要求1所述的一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，其特征在于上述的虾青素非晶固体分散体为橘色或者橘红色干燥粉末状，在水中再分散后粒径为120-210nm，呈规则球形。
4.根据权利要求1所述的一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，其特征在于上述的虾青素非晶固体分散体灌装于胶囊中制成胶囊剂或压制成片剂。
5.根据权利要求1所述的一种静电喷雾法制备的虾青素非晶固体分散体，其制备工艺步骤为：
(1)虾青素溶解于一定体积二氯甲烷中，超声5-20min使均匀，得到A溶液；双亲性嵌段共聚物和亲水性高分子聚合物溶解于二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中，超声5-20min使均匀，得到B溶液；其中，溶液间的体积比例A:B等于1:1-5；
(2)上述A溶液分散到B溶液中，超声20-40min使混合均匀，得到总有机相；
(3)上述总有机相装入10mL注射器，喷雾针头选择23G，电场电压10-18KV、接收距离10-20cm、液体流速0.2-1.0mL/h、在温度为25℃、湿度为35％的条件下进行静电喷雾，得到固体状虾青素非晶固体分散体粉末。
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