CN113274420A - 一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，包括以下步骤：以茅苍术或茅苍术粗提取物为原料采用细胞膜色谱法提取活性成分。采用该方法提取茅苍术抗乳腺癌活性成分，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点，适用于天然来源的混合成分中的抗肿瘤潜在活性成分的筛选。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、天然产物化学、分析化学领域，尤其涉及一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法。
背景技术
癌症，因其高发病率和高死亡率，严重危害人民群众的身心健康。仅以乳腺癌为例，我国每年大约新增乳腺癌患者27.9万例，位居女性肿瘤发病率首位。其中三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer，TNBC)占所有乳腺癌的15-20％，并由于组织分级高，易产生远端转移，且缺乏除传统手术、放化疗外的有效治疗药物，而成为病死率最高的一类乳腺癌亚型。天然药物在癌症治疗中做出巨大的贡献，在抗癌药物中的占比高达27％左右，如紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯等等。虽然，已发现诸多具有抗肿瘤活性的成分，但其作用机制和抑制靶点的研究存在极大的不足。因此，急需建立一种可特定靶向筛选抗乳腺癌潜在药物的方法。
细胞膜色谱(cell membrane chromatography，CMC)是一种基于亲和层析原理而衍生的新型色谱技术。其具有较好的色谱分离能力，还兼顾了操作的简便性及灵敏性。但值得注意的是，其制备工艺和方式是其能否完成筛选分离工作的关键之一。目前，其制备流程因所需耦合的细胞的类型和来源而呈现差异化。目前，尚未有针对乳腺癌细胞系的细胞膜色谱柱的耦合制备工艺。
茅苍术属菊科植物，以江苏省茅山地区为道地产地。其药用历史悠久，最早记载于《神农本草经》，被列为上品，具有燥湿健脾、祛风散寒、明目的功效，味辛、苦、性温。苍术化学成分主要类型为倍半萜类、聚炔类、芳香苷类等，现代药理活性研究表明，苍术具有促进胃肠道蠕动、抗溃疡、抗肿瘤等作用。虽然，茅苍术抗肿瘤作用已被证实，但其抗肿瘤活性成分以及对某种特定肿瘤的防治效果如何尚不清楚，仍需深入研究。
发明内容
鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，该方法将特定乳腺癌细胞，与硅胶结合，装柱，经高效液相、质谱检测，筛选具有抗乳腺癌作用的活性成分，该方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点，适用于天然来源的混合成分中的抗肿瘤潜在活性成分的筛选。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，包括以下步骤：以茅苍术或茅苍术粗提取物为原料采用细胞膜色谱法提取活性成分。
采用上述技术方案的有益效果包括：本发明使用细胞膜色谱柱，将茅苍术的分离与抗肿瘤检测相结合，实现了茅苍术抗肿瘤活性成分的一次性的“精准”靶向分离和鉴定，具有灵敏度高、特异性强、快速，适用于乳腺癌抑制剂的筛选等优点，适用于天然来源的混合成分中的抗肿瘤潜在活性成分的筛选。
进一步，还包括将以茅苍术为原料采用细胞膜色谱法提取的活性成分进行检测的步骤，检测的步骤包括高效液相检测和/或质谱检测。
采用上述技术方案的有益效果包括：通过上述的高效液相检测和/或质谱检测可以进一步确定活性成分。
进一步，高效液相检测的条件包括：采用C18柱，流动相为甲醇和水，检测波长为203nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min。
和/或质谱检测的条件包括：电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，调谐方式为标准调谐，扫描范围为10-500amu，电子倍增器电压1341V。
采用上述技术方案的有益效果包括：减少茅苍术中有效成分的分离工艺和流程；缩短茅苍术有效成分的分离时间；将茅苍术有效成分的分离、功能发现和结构鉴定有机结合，精准筛选茅苍术中潜在抗肿瘤活性成分。
进一步，以茅苍术或茅苍术粗提取物为原料采用细胞膜色谱法提取活性成分包括以下步骤：用乳腺癌细胞制备细胞膜色谱柱，加入茅苍术粗提取物，使用去离子水洗涤，随后采用pH3.3的50％甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
采用上述技术方案的有益效果包括：使用去离子水洗涤可以去除非特异性结合的杂质，采用pH3.3的50％甲醇溶液进行洗脱，有利于乳腺癌细胞(例如：MCF-7细胞)所含蛋白的变性，从而有利于有效活性成分与乳腺癌细胞(例如：MCF-7细胞)所含蛋白的快速分离。
进一步，在细胞膜色谱法中，细胞膜色谱柱的装柱方法为湿法装柱法，包括以下步骤：将细胞膜悬液测定蛋白含量，按蛋白含量：硅胶粉10mg：1g的比例，向细胞膜悬液中加入硅胶粉，搅拌均匀后静置过夜，湿法装柱得到用于筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的色谱柱。
采用上述技术方案的有益效果包括：采用蛋白含量与硅胶粉10mg：1g的比例可以避免蛋白质过量，如果蛋白含量过高，将导致后续筛选过程中出现假阳性结果，如果硅胶粉含量过高将导致后续筛选过程出现假阴性结果。
进一步，在细胞膜色谱法中，采用的细胞膜为乳腺癌细胞的细胞膜，优选的，采用的细胞膜为乳腺癌细胞MCF-7的细胞膜。
采用上述技术方案的有益效果包括：本发明使用MCF-7细胞膜色谱柱，将茅苍术的分离与抗肿瘤检测相结合，实现了茅苍术抗肿瘤活性成分的一次性的“精准”靶向分离和鉴定，，具有灵敏度高、特异性强、快速，有利于乳腺癌抑制剂的筛选等优点，适用于天然来源的混合成分中的抗肿瘤潜在活性成分的筛选。本发明采用的MCF-7细胞具有广谱、典型的优点。
进一步，细胞膜色谱法中，细胞膜的制备方法包括以下步骤：收集细胞悬液1000g4℃离心10min，弃上清，得到细胞沉淀；生理盐水清洗细胞沉淀2-3遍，加入50mM Tris-Hcl，超声30min破碎细胞；将悬液于1000g 4℃离心5min，细胞膜悬浮在上清液中，收集上清液于12000g 4℃离心20min，所得沉淀即为细胞膜。
进一步，茅苍术粗提取物为茅苍术的乙醇提取物；粗提取物与细胞膜色谱法过程中使用的细胞膜的蛋白含量的质量比为1g：10mg。
采用上述技术方案的有益效果包括：采用上述方法可以最大限度的获得茅苍术中的成分。
进一步，茅苍术的粗提取物的制备方法包括以下步骤：取茅苍术干燥根茎，打粉后过40目筛，用10倍量的90％乙醇，50℃超声提取多次，每次40分钟，提取液抽滤后混合，浓缩获得浸膏，即为茅苍术的粗提取物。
采用上述技术方案的有益效果包括：最大限度的获得茅苍术中的成分。
本发明提供茅苍术活性成分在制备预防和/或治疗乳腺癌药物中的应用，茅苍术活性成分采用上述方法制备。
采用上述技术方案的有益效果包括：发明人在研究中意外发现，本发明制备的茅苍术活性成分可以有效的预防、治疗乳腺癌，用于制备预防、治疗乳腺癌的药物，具有效果好等优点。
附图说明
图1为高效液相检测洗脱后茅苍术抗乳腺癌活性成分的检测结果。
图2为质谱检测洗脱后茅苍术抗乳腺癌活性成分的分子量的检测结果。
图3为MTT比色法检测各组分的抗MCF-7细胞活性的实验结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例采用细胞色谱柱以乳腺癌细胞系MCF-7为材料，从茅苍术中筛选抗乳腺癌活性成分，其在茅苍术的抗肿瘤临床应用中具有较好的参考价值和指导意义。下面通过具体实施例进行介绍。
实施例1
一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，包括以下步骤：
利用细胞培养手段，体外培养MCF-7细胞(中国科学院细胞中心)，收集细胞膜，按蛋白含量与硅胶粉的质量比为10mg：1g的比例，加入硅胶粉，搅拌均匀后静置过夜，湿法装柱得到乳腺癌细胞膜色谱柱。向色谱柱(大连日普利科技仪器有限公司，4.6mm*250mm的空柱管)中，加入茅苍术粗提取物(粗提取物与蛋白含量的质量比为1g：10mg)，使用去离子水洗涤，以去除非特异性结合的杂质，随后采用洗脱缓冲液(pH3.3的50％甲醇溶液)进行洗脱，收集洗脱液。经高效液相色谱、质谱检测，所得物质即为茅苍术抗乳腺癌潜在活性成分。
发明人在研究中筛选了多组蛋白含量与硅胶粉的质量比、粗提取物与蛋白含量的质量比，最终筛选出了蛋白含量与硅胶粉的质量比为10mg：1g、粗提取物与蛋白含量的质量比为1g：10mg等条件，在该条件下可以最大限度的获得的活性成分，可以有效的避免假阴性、假阳性结果，获得活性成分对乳腺癌的防治效果好，采用该方法具有灵敏度高、特异性强、快速等优点。
上述中，体外培养MCF-7细胞的方法，包括以下步骤：培养基(Gibco公司的RPMI1640培养基+10％胎牛血清)，在5％CO2，37℃的细胞培养箱中进行培养。
收集细胞膜的方法，包括以下步骤：收集MCF-7的细胞悬液1000g 4℃离心10min，弃上清，所得沉淀即为MCF-7细胞。生理盐水清洗细胞沉淀2-3遍，加入50mM Tris-Hcl，超声30min破碎细胞。将悬液于1000g 4℃离心5min，细胞膜悬浮在上清液中，收集上清液于12000g 4℃离心20min，所得沉淀即为细胞膜。
可以采用BCA法测定蛋白浓度，包括以下步骤：
(1)加2μl待测蛋白浓度的样品到96孔板的样品孔中,使用标准品(标准品为BSA——牛白蛋白(国药基团，69003431)稀释液补足到20μl。
(2)加入200μl BCA工作液，37℃条件下放置20-30分钟。
(3)用酶标仪测定570nm波长的吸光度。
(4)以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据标准曲线计算蛋白浓度。
茅苍术粗提取物可以通过以下方法制备：取500g茅苍术干燥根茎，打粉后过40目筛，用10倍质量的90％乙醇溶液，50℃超声提取3次，每次超声提取40分钟，提取液抽滤后混合，浓缩获得浸膏，即为茅苍术的粗提取物。
高效液相的检测条件：C18柱(150mm*4.6mm，5μm)；流动相为甲醇：水(80：20)——甲醇：水(20：80)；检测波长为203nM；柱温为30℃；流速为1.0ml/min。图1为高效液相检测洗脱后茅苍术抗乳腺癌活性成分的检测结果，从图1中可以看出，洗脱后所收集的即为茅苍术中具有抗乳腺癌作用的有效活性成分。
质谱检测条件：电离方式：EI，电子能量：70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，调谐方式：标准调谐，扫描范围：10-500amu，电子倍增器电压：1341V。图2为质谱检测洗脱后茅苍术抗乳腺癌活性成分的分子量的检测结果，图2展示了茅苍术中具有抗乳腺癌作用的有效活性成分的可能分子量。比对质谱数据库后，发现茅苍术抗乳腺癌活性成分，如表1所示。
表1茅苍术中抗乳腺癌活性成分表
从表1中可以看出，经检测茅苍术中潜在抗乳腺癌活性成分。
实施例2
为检验所分离的产物是否具有抗肿瘤活性。使用MTT比色法检测洗脱组分、各物质的抗乳腺癌细胞MCF-7的能力，β-谷甾醇、β-榄香稀、苍术内酯III、角鲨烯等化合物(购自Sigma公司)。MTT的检测原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
操作步骤如下：
(1)收集对数期MCF-7细胞，注入96孔板，每孔总体积100ul,细胞数量5000个/孔。
(2)待细胞生长至铺满孔底时,加入洗脱组分、β-谷甾醇、β-榄香稀、苍术内酯III、角鲨烯等化合物，各组分的加入终浓度为0μg/ml,2μg/ml,4μg/ml,8μg/ml,16μg/ml。各浓度设3个重复孔。
(3)5％CO2，37℃孵育24小时后。每孔加入20ul MTT(国药基团)溶液(5mg/ml)，继续培养4h。
(4)终止培养，小心吸去孔内培养液。
(5)每孔加入150ul二甲基亚砜(国药基团)，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪(TECAN，F50)OD490nm处测量各孔的吸光值。
实验结果如图3所示，图3中每组样品从左至右分别为洗脱组分、β-谷甾醇、β-榄香稀、苍术内酯III、角鲨烯，从图3的实验结果可以看出洗脱组分对乳腺癌细胞MCF-7细胞的抑制率显著高于β-谷甾醇、β-榄香稀、苍术内酯III、角鲨烯对MCF-7细胞的抑制率，证明了通过MCF-7细胞膜色谱柱所分离的成分是抗乳腺癌潜在活性成分。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，包括以下步骤：以茅苍术或茅苍术粗提取物为原料采用细胞膜色谱法提取活性成分。
2.根据权利要求1所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，还包括将以茅苍术为原料采用细胞膜色谱法提取的活性成分进行检测的步骤，检测的步骤包括高效液相检测和/或质谱检测。
3.根据权利要求2所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，高效液相检测的条件包括：采用C18柱，流动相为甲醇和水，检测波长为203nm，柱温为30℃，流速为1.0ml/min；和/或质谱检测的条件包括：电离方式EI，电子能量70eV，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，调谐方式为标准调谐，扫描范围为10-500amu，电子倍增器电压1341V。
4.根据权利要求1-3任一项所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，以茅苍术或茅苍术粗提取物为原料采用细胞膜色谱法提取活性成分包括以下步骤：用乳腺癌细胞制备细胞膜色谱柱，加入茅苍术粗提取物，使用去离子水洗涤，随后采用pH3.3的50％甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液。
5.根据权利要求1-3任一项所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，在细胞膜色谱法中，细胞膜色谱柱的装柱方法为湿法装柱法，包括以下步骤：将细胞膜悬液测定蛋白含量，按蛋白含量：硅胶粉10mg：1g的比例，向细胞膜悬液中加入硅胶粉，搅拌均匀后静置过夜，湿法装柱得到用于筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的色谱柱。
6.根据权利要求1-3任一项所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，在细胞膜色谱法中，采用的细胞膜为乳腺癌细胞的细胞膜，优选的，采用的细胞膜为乳腺癌细胞MCF-7的细胞膜。
7.根据权利要求1-3任一项所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，细胞膜色谱法中，细胞膜的制备方法包括以下步骤：收集细胞悬液1000g 4℃离心10min，弃上清，得到细胞沉淀；生理盐水清洗细胞沉淀2-3遍，加入50mM Tris-Hcl，超声30min破碎细胞；将悬液于1000g 4℃离心5min，细胞膜悬浮在上清液中，收集上清液于12000g 4℃离心20min，所得沉淀即为细胞膜。
8.根据权利要求1-3任一项所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，茅苍术粗提取物为茅苍术的乙醇提取物；粗提取物与细胞膜色谱法过程中使用的细胞膜的蛋白含量的质量比为1g：10mg。
9.根据权利要求8所述一种靶向筛选茅苍术抗乳腺癌活性成分的方法，其特征在于，茅苍术的粗提取物的制备方法包括以下步骤：取茅苍术干燥根茎，打粉后过40目筛，用10倍量的90％乙醇，50℃超声提取多次，每次40分钟，提取液抽滤后混合，浓缩获得浸膏，即为茅苍术的粗提取物。
10.茅苍术活性成分在制备预防和/或治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于，茅苍术活性成分采用权利要求1-9任一项所述方法制备。
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