CN113272442A - 寡核苷酸的集合的一锅合成 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在同一反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法，并且在一些实施方案中涉及在这样的反应容器中在基于寡核苷酸的测定中使用所合成的寡核苷酸的方法。在一些实施方案中，本发明的方法通过以下步骤实施：(a)提供附接至一种或更多种支持物的多于一种不同的起始子，每种不同的起始子具有带有不同的3’‑O‑封闭基团的末端核苷酸；(b)对于每种不同的起始子，通过无模板酶促添加3’‑O‑封闭的核苷三磷酸的重复循环来合成多核苷酸，其中3’‑O‑封闭的核苷三磷酸的封闭基团可在解封闭条件下去除，所述解封闭条件与用于去除其他起始子的封闭基团的解封闭条件正交；以及(c)使寡核苷酸从多核苷酸和一种或更多种固体支持物释放。

Description

寡核苷酸的集合的一锅合成

寡核苷酸合成是医学和生物科学的基础技术。一定浓度和纯度水平范围内的廉价寡核苷酸的易获得性对于许多技术而言是重要的，所述技术包括大规模DNA测序、DNA扩增和检测技术、诊断等。

目前，使用化学方法诸如亚磷酰胺方法产生寡核苷酸用于这样的应用，所述方法要求苛刻的条件，排除了用于酶促过程诸如DNA扩增的寡核苷酸的原位产生。此外，这样的方法中使用的试剂对环境有害并且呈现出处理和处置问题。

如果可获得以下的DNA合成方法，那么这将是高度期望的，特别是对于各种DNA扩增技术而言是高度期望的：该DNA合成方法允许在同一反应环境中或处于同一反应环境时容易地制造多种寡核苷酸，所述寡核苷酸可以直接用于扩增或其他寡核苷酸依赖的测定中，而不需要繁琐的碱基去保护、纯化等步骤，或者不具有等待邮购运送到达时的延迟。

发明概述

本发明涉及用于在单个反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法和装置(包括微流体装置)。

在一些实施方案中，本发明涉及用于在同一反应容器中合成多于一种寡核苷酸并进行一种或更多种基于寡核苷酸的测定的方法，这样的方法包括以下步骤：(a)在反应容器中重复以下(i)和(ii)的循环：(i)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子(initior)或具有游离3’-O-羟基的延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸而延长，以形成3’-O-封闭的延长片段，和(ii)使延长片段解封闭(deblocking)以形成具有游离3’-羟基的延长片段，所述循环被重复直到形成各自包含通过可裂解核苷酸彼此分离和与起始子分离的多于一种寡核苷酸的延长片段；(b)裂解可裂解核苷酸以释放多于一种寡核苷酸中的至少一种；(c)添加用于基于寡核苷酸的测定的试剂；以及(d)进行基于寡核苷酸的测定，诸如聚合酶链式反应(PCR)。

在一些实施方案中，本发明涉及在同一反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供一种或更多种支持物，所述支持物具有起始子的两种或更多种群体，其中每种群体的起始子的末端是具有群体特异性3’-O-封闭基团的可裂解连接(cleavable linkage)或可裂解核苷酸，所述群体特异性3’-O-封闭基团可通过与起始子的每一种其他群体的3’-O-封闭基团的解封闭条件正交的解封闭条件去除；(b)使起始子的群体或延长片段的群体特异性封闭基团解封闭，以形成具有游离3’-羟基的起始子或延长片段；(c)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子的群体或其延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，从而通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸使起始子或延长片段延长以形成3’-O-封闭的延长片段；和(d)对起始子的每种群体重复步骤(b)和(c)直到形成具有多于一种寡核苷酸的核苷酸序列的延长片段。在一些实施方案中，上文的方法还包括以下步骤：(e)使延长片段解封闭；和(f)裂解可裂解核苷酸或可裂解连接以释放延长片段和/或多于一种寡核苷酸。在一些实施方案中，上文的方法还包括以下步骤：(g)添加用于基于寡核苷酸的测定的试剂；和(h)进行基于寡核苷酸的测定。

在上文的实施方案的一些变化形式中，步骤(b)至(d)可以针对起始子的不同群体中的每一种连续实施，使得多于一种寡核苷酸中的每一种被连续合成。在上文的实施方案的其他变化形式中，步骤(b)至(d)可以针对起始子的不同群体中的每一种交替地实施，使得多于一种寡核苷酸中的每一种被平行合成。

本发明的这些上述特征方面以及其他方面在许多经说明的实现方式和应用中被举例说明，其中一些在附图中示出，并且在随后的权利要求部分中被表征。然而，上文的概述并不旨在描述本发明的每个经说明的实施方案或每个实现方式。

附图简述

图1A图示了使用过滤室在单个合成反应中酶促合成多于一种寡核苷酸的一种实施方案。

图1B图示了图1A的实施方案的一种实现方式。

图2A图示了使用珠在单个合成反应中酶促合成多于一种寡核苷酸的另一种实施方案。

图2B图示了图2A的实施方案的一种实现方式。

图3图示了本发明的一种实施方案，其中多于一种寡核苷酸在相同支持物上连续或交替合成。

图4A-图4E图示了用Taqman探针进行定量PCR的实施方案的步骤。

图5图示了预定序列的多核苷酸的无模板酶促合成的基本步骤。

发明详述

本发明的一般原理在本文更详细地公开，特别是通过示例的方式，诸如通过在附图中示出并详细描述的那些进行公开。然而，应理解的是，本发明并非将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明适合于各种修改和替代形式，其细节在若干实施方案中示出。本发明将覆盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等效物和替代物。

除非另外指出，否则本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域技术人员的技术内。这样的常规技术可包括但不限于合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体的制备和使用、核酸克隆、扩增、测序和分析以及相关技术。这样的常规技术的方案可在制造商的产品文献和标准实验室手册中找到，诸如在Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)；PCR Primer:A Laboratory Manual；和Molecular Cloning:A Laboratory Manual(都来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Lutz和Bornscheuer,Editors,ProteinEngineering Handbook(Wiley-VCH,2009)；Hermanson,Bioconjugate Techniques,SecondEdition(Academic Press,2008)；以及类似的参考文献中找到。

本发明涉及在单个反应容器中合成和使用多于一种寡核苷酸。在一些实施方案中，合成的寡核苷酸直接用于基于寡核苷酸的反应，包括但不限于扩增反应，诸如聚合酶链式反应(PCR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、不对称PCR、巢式PCR、定量PCR和类似技术。本发明部分地是这样的认知：通过酶促合成所需的寡核苷酸并在同一反应容器中运行基于寡核苷酸的测定，可以实现显著的时间和材料效率。这样的时间和材料效率是化学合成的寡核苷酸不可得的。

本发明的示例性实施方案在图1A和图1B中进行图示。如下文更全面讨论的，用无模板聚合酶(诸如末端脱氧核苷酸转移酶(TdT))酶促合成寡核苷酸需要称为起始子的起始寡核苷酸。因此，在该实例中，起始子(102)使用常规技术(例如，如在Hermanson(上文引用的)中公开的)经由其5’末端附接至固体支持物(110)，或通过与经由其3’末端附接的互补寡核苷酸进行杂交而附接至固体支持物(110)。如下文描述地以期望的顺序进行重复的核苷酸添加，直到获得含有多于一种期望寡核苷酸的合成产物(100)。在该实施方案中，每种期望寡核苷酸(104a和104b)在邻近其5’末端处具有可裂解核苷酸“Z”(103)。示例性的可裂解核苷酸是脱氧尿苷，脱氧尿苷可以通过用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)处理以将尿嘧啶从核苷酸切下，然后用AP核酸内切酶诸如核酸内切酶VIII处理以将糖切下，在起始子的下游或近端链上留下3’-羟基，从而在下游链上留下可延伸的末端。这样的裂解释放(108)寡核苷酸(104a和104b)，用于基于寡核苷酸的测定，诸如PCR(112)。在一些实施方案中，在释放后，可以加热含有释放的寡核苷酸的混合物以使裂解试剂失活，之后可以添加靶核酸和扩增试剂进行扩增。在该实例中，寡核苷酸(104b)是退火至引物结合位点(114)的正向引物，并且寡核苷酸(104a)是退火至引物结合位点(116)的反向引物，从而扩增靶多核苷酸(117)以产生扩增子(118)。

图1B图示了在反应容器中进行本发明的实施方案，该反应容器包括用于选择性去除试剂的过滤室。反应容器(125)具有过滤壁(128)，所述过滤壁被选择为允许例如真空驱动从容器(125)去除反应溶剂(126)，包括溶解的盐、蛋白质、单体等，并保留珠(127)及其附接的多核苷酸(129)。在该实施方案中，起始子附接至悬浮在反应溶剂(126)中的珠(127)。在合成期间，起始子被延长，形成图1A中图示的延长产物。在每个延长循环中，起始子或先前延长的片段被预定种类的单种3’-封闭的核苷酸延长，之后通过施加真空驱动它们通过过滤器(128)来去除延长试剂，所述延长试剂可以包括未掺入的受保护的dNTP、聚合酶和聚合酶反应缓冲液。在含有期望寡核苷酸的多核苷酸的合成完成后，通过施加真空将最终合成试剂(130)通过过滤器(128)去除，在容器(125)中留下附接有多核苷酸的珠(132)。将用于裂解每个寡核苷酸上游的可裂解核苷酸(图1A的Z)的裂解试剂添加(134)到反应容器(125)，并孵育以从珠释放(136)寡核苷酸引物，之后如果裂解试剂可能干扰随后的扩增反应，可以使其变性或去除(138)。在寡核苷酸释放和可能的裂解试剂失活后，扩增试剂和含靶多核苷酸的样品被直接添加到反应容器(125)，在那里发生扩增，例如通过热循环来发生扩增。在一些实施方案中，在扩增后，扩增子序列可以通过使用常规技术例如Millipore

过滤器板系统(Billerica,MA)的尺寸排阻色谱法分离。

图2A图示了来自本发明的另一种实施方案的产物。起始子序列(202)附接至固体支持物(210)，并且已经合成了包含多于一种(在这种情况下两种)寡核苷酸(204a和204b)的多核苷酸(200)，所述寡核苷酸(204a和204b)在每个末端处具有可裂解核苷酸(210和212)。在一些实施方案中，可裂解核苷酸(210)(显示为“Y”)在与用于裂解可裂解核苷酸(212)(显示为“Z”)不同的条件下被裂解。根据基于寡核苷酸的测定，多核苷酸(200)可以包括区段(206)，例如，以提供用于与捕获寡核苷酸杂交的互补序列。在一些实施方案中，末端核苷酸(208)包括捕获部分“x”，所述捕获部分“x”可以是(例如)生物素或类似部分，允许在多核苷酸(200)从固体支持物(210)释放后捕获多核苷酸(200)。例如，这样的捕获部分可以作为多核苷酸的最后一个核苷酸通过掺入生物素化的双脱氧核苷三磷酸来添加，在掺入多核苷酸并从第一固体支持物(如下文指出的)释放后，可以通过用链霉亲和素包被的第二固体支持物来捕获该捕获部分。根据本发明的方法，在合成完成后，通过裂解可裂解核苷酸“Y”(210)使多核苷酸(200)从固体支持物(210)释放，之后通过捕获部分“x”与附接至第二固体支持物的互补剂诸如链霉亲和素的相互作用将它们捕获。捕获的多核苷酸可以被洗涤，并且可裂解核苷酸“Z”(212)可以被裂解以释放寡核苷酸(204a和204b)，用于基于寡核苷酸的测定。图2B进一步图示了产物的合成和加工步骤。与图1B的容器(125)不同，反应容器(225)不是通过真空过滤去除流体，而是通过抽吸去除试剂，并且产物通过附接至珠而保留，所述珠诸如可以通过使用磁体从通过抽吸去除的流体排除的磁珠。珠(227)上的起始子序列随着无模板掺入3’-O-封闭的dNTP的循环而延伸，随后解封闭，如下文描述的，其中每个这样的循环伴随着添加试剂和通过抽吸去除试剂，直到期望的多核苷酸(229)或合成产物是完整的。在该实施方案中，在合成完成后，使用第一裂解反应使多核苷酸(229)从珠(227)裂解，使得它们被释放(231)到反应混合物(226)中。在一些实施方案中，这样的裂解可以通过在起始子和多核苷酸(229)之间插入可裂解核苷酸来实现，如图2A中图示的。在其他实施方案中，可以使用多种多样的剪切连接(scissile linkages)，其中一些剪切连接可以在释放的多核苷酸上留下基团或修饰，诸如在释放的多核苷酸的3’-羟基上的修饰。释放的多核苷酸(231)然后通过添加到容器(225)中的珠(233)经由捕获部分“x”(208)或区段(206)被捕获。捕获部分(208)可以包括许多种常规基团，诸如生物素等，其可以是3’-O-保护或封闭基团或附接至3’-O-保护或封闭基团。可选地，可以使用常规化学方法使捕获部分附接至末端核苷酸(208)的其他位置，诸如碱基。在一些实施方案中，选择捕获部分，使得它可以从多核苷酸裂解(从而使多核苷酸从捕获珠(233)释放)，留下游离的3’-羟基，并且不在末端核苷酸上的其他位点或多核苷酸上的其他地方留下修饰。在仍其他实施方案中，多核苷酸(231)可以通过与捕获寡核苷酸杂交的方式被捕获珠(233)捕获，捕获寡核苷酸附接至珠(233)并与区段(206)互补。在捕获珠(235)捕获(234)释放的多核苷酸(231)之后，分离(236)捕获珠(235)，例如，通过磁场保留珠(235)同时抽吸容器(225)的试剂并用第二裂解试剂替换来捕获。第二裂解试剂裂解(238)可裂解核苷酸“Z”(212)以释放多于一种寡核苷酸，在添加(240)扩增试剂和靶后，这些寡核苷酸可直接用作引物或扩增反应的其他组分。扩增(242)后，扩增子(244)可在容器(225)中获得并可任选地通过例如尺寸排阻色谱法纯化。

用于合成多于一种寡核苷酸并进行一种或更多种基于寡核苷酸的测定(诸如上文描述的那些)的本发明的实施方案，可以通过以下步骤实现：(a)在反应容器中重复以下(i)和(ii)的循环：(i)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子或具有游离3’-O-羟基的延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸而延长，以形成3’-O-封闭的延长片段，和(ii)使延长片段解封闭以形成具有游离3’-羟基的延长片段，所述循环被重复直到形成各自包含通过可裂解核苷酸或可裂解位点彼此分离和与起始子分离的多于一种寡核苷酸的延长片段；(b)裂解可裂解核苷酸以释放多于一种寡核苷酸中的至少一种；(c)添加用于基于寡核苷酸的测定的试剂；以及(d)进行基于寡核苷酸的测定。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的测定可以是聚合酶链式反应(PCR)，从而添加步骤还包括添加聚合酶、聚合酶反应缓冲液、核苷三磷酸，并且从而一种或更多种靶多核苷酸具有与寡核苷酸中的至少两种互补的区段，使得互补区段之间的靶多核苷酸的序列在PCR中被扩增。在一些实施方案中，PCR是多重PCR，其中多于一种靶多核苷酸被扩增。在一些实施方案中，这样的多重PCR能够扩增2种至1000种范围中的数量的靶多核苷酸；在另一种实施方案中，这样的多重PCR能够扩增2种至100种范围中的数量的靶多核苷酸；这样的多重PCR能够扩增2种至10种范围中的数量的靶多核苷酸。在一些实施方案中，裂解步骤包括用酶活性处理可裂解核苷酸，并在裂解后使酶活性失活。在一些实施方案中，基于寡核苷酸的测定是基于核酸序列的扩增(NASBA)，并且添加步骤还包括添加RNA聚合酶、RNA酶H、逆转录酶、NASBA反应缓冲液、核苷三磷酸和一种或更多种单链靶核酸，所述单链靶核酸中的至少一种具有与寡核苷酸中的至少一种互补的区段，使得互补区段之间的序列在NASBA反应中被扩增。在一些实施方案中，起始子和延长片段附接至支持物，并且裂解步骤留下附接至支持物的多于一种寡核苷酸中的至少一种寡核苷酸。在其他实施方案中，基于寡核苷酸的测定可以包括巢式PCR、不对称PCR、逆转录酶PCR、定量PCR等。

在采用支持物进行合成和扩增的上述和其他实施方案中，可以采用许多种支持物，包括固体支持物、可溶性聚合物支持物、膜等。在一些实施方案中，固体支持物用于合成步骤；并且在其他实施方案中，这样的固体支持物是磁性支持物。

在一些实施方案中，诸如图2A和图2B中图示的，在合成步骤中可以使用多于一种支持物。例如，采用多于一种支持物的一些实施方案可以通过以下步骤实现：(a)在反应容器中提供附接至第一支持物的起始子，该起始子具有游离的3’-羟基；(b)在反应容器中重复以下(i)和(ii)的循环：(i)在延长条件下，使具有游离3’-O-羟基的起始子或延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得起始子或延长片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸而延长，以形成3’-O-封闭的延长片段，和(ii)使延长片段解封闭以形成具有游离3’-羟基的延长片段，所述循环被重复直到形成各自包含通过可裂解核苷酸或可裂解连接彼此分离的寡核苷酸并且各自具有3’-末端捕获部分的延长片段；(c)使延长片段从第一支持物释放；(d)通过捕获部分与第二支持物上的互补部分的特异性结合，将释放的延长片段捕获在第二支持物上；(e)裂解可裂解核苷酸或可裂解连接以释放多于一种寡核苷酸；以及(f)进行基于寡核苷酸的测定。如上文的，在一些实施方案中，基于寡核苷酸的测定包括一个或更多个聚合酶链式反应。在一些实施方案中，捕获步骤还包括在进行裂解步骤之前，例如通过洗涤去除步骤b)和c)的反应成分。在一些实施方案中，裂解可裂解核苷酸或可裂解连接的步骤产生具有游离3’-羟基的寡核苷酸。

在一些实施方案中，由合成步骤，例如上文的步骤(a)-(d)形成的延长片段或多核苷酸由下式定义：

SS₁-I-Z-[[N]_ij-Z-]_m-[N]_k-x

其中：

SS₁是第一支持物；

I是起始子；

Z是可裂解核苷酸或可裂解连接；

[N]ij是在延长片段或多核苷酸中具有j个核苷酸的第i种寡核苷酸，所述延长片段或多核苷酸包含m种寡核苷酸中的多于一种；

[N]_k是k个核苷酸的寡核苷酸；和

x是附接至[N]_k的核苷酸的所述捕获部分。

在一些实施方案中，j具有范围为4到50的值；或者范围为9到40的值。在一些实施方案中，i是2或更大；在其他实施方案中，i具有范围为2到10的值；在其他实施方案中，i具有范围为2到4的值；在仍其他实施方案中，i是2或3。在一些实施方案中，x是生物素。

图2A-图2B图示了其中多于一种寡核苷酸被串联合成的一种实施方案。也就是说，多于一种不同的寡核苷酸均串联包含在单个多核苷酸中，其中在合成后，多核苷酸被裂解以产生多于一种寡核苷酸。图3图示了其中预定比率的多于一种寡核苷酸(300)在一种或更多种固体支持物上平行合成的实施方案。普通技术人员将认识到，本发明包括在单个反应容器中进行串联合成和平行合成二者。具有预定比率的寡核苷酸的平行合成特别适用于诸如不对称PCR或者诸如定量PCR的技术，在不对称PCR中一种引物的提供量超过另一种引物以使扩增偏向靶多核苷酸的一条链，在定量PCR中两种引物以一种浓度提供并且探针以不同的浓度提供。在不对称PCR中，引物的比率可以是10:1或更大；或者在其他实施方案中，这样的比率可以是100:1或更大。这些比率可以通过使用常规化学技术，例如Hermanson(上文引用的)，使不同寡核苷酸的起始子以期望比率附接至固体支持物来实现。可选地，可以提供固体支持物的多于一种群体，诸如珠的不同群体，所述群体各自附接有不同的起始子，从而可以通过将相应比率的不同珠置于用于合成的反应容器中来合成期望比率的多核苷酸。在一些实施方案中，可以使用3’-O-封闭的dNTP的不同的集合，其中对于每个不同的集合，通过正交的解封闭条件去除封闭基团。因此，如果将平行合成三种不同的多核苷酸，那么在第一多核苷酸的起始子的3’末端的封闭基团1会通过解封闭条件1去除，解封闭条件1不会去除用于第二多核苷酸的起始子上的封闭基团2或用于第三多核苷酸的起始子上的封闭基团3。然后，第一多核苷酸使用3’-封闭基团1-dNTP合成。在完成第一多核苷酸后，解封闭条件2用于去除用于第二多核苷酸的起始子上的封闭基团2，该条件不会去除封闭基团1或封闭基团3。在这样的解封闭后，第二多核苷酸使用3’-封闭基团2-dNTP合成。在完成第二多核苷酸后，解封闭条件3用于将封闭基团3从用于第三多核苷酸的起始子去除，该条件不会去除封闭基团1或封闭基团2。然后，第三多核苷酸使用3’-封闭基团3-dNTP合成。在一些实施方案中，用于一种封闭基团(例如，封闭基团1)的解封闭条件不仅可以使封闭基团1解封闭，还可以使封闭基团2解封闭。在这样的情况下，可以选择多核苷酸的合成顺序，使得封闭基团2不受解封闭条件1的影响。例如，在这种情况下，在解封闭条件1不完全正交时，第二多核苷酸可以被首先合成并用不可延伸的部分加帽(capped)，之后可以合成第一多核苷酸和第三多核苷酸。

在其他实施方案中，需要正交去除条件的不同封闭基团仅附接至起始子。因此，在这样的实施方案中，如果待平行合成三种不同的多核苷酸，那么在第一多核苷酸的起始子的3’末端处的封闭基团1用解封闭条件1去除，并且第一多核苷酸使用3’-封闭基团1-dNTP合成并用不可延伸的部分加帽。接下来，用于第二多核苷酸的起始子的3’末端处的封闭基团2用解封闭条件2去除，之后第二多核苷酸使用3’-封闭基团1-dNTP合成并用不可延伸的部分加帽。第三多核苷酸遵循类似的程序。该实施方案的优点是仅需要制备3’-封闭基团-dNTP的单个集合。

这样的平行合成的一种实施方案在图3中图示，其中合成了两种不同的寡核苷酸。对应于不同寡核苷酸的两种不同起始子(301)以一定比率附接至固体支持物(302)，该比率导致合成期望比率的寡核苷酸。在一些实施方案中，起始子的最接近3’的(3’-most)核苷酸可以是可裂解核苷酸。不同的3’-O-封闭基团表示为“x”(304)和“y”(306)。两种寡核苷酸可以一次合成一种(如图3中图示的)，或者它们可以通过在每隔一个延长步骤中交替延长的寡核苷酸而同时合成。如图3中示出的，使用“y”封闭基团的寡核苷酸以其整体被延长(308)以产生其3’-羟基仍被封闭的延长产物(310)，之后(312)使用“x”封闭基团的寡核苷酸被延长以产生延长产物(314)。在两次合成完成后，两种封闭基团可以通过裂解可裂解核苷酸“Z”去除，并且寡核苷酸从固体支持物(302)释放。在一些实施方案中，可以采用其中两种封闭基团中的一种的解封闭条件会将两种封闭基团都去除的封闭基团。在这样的情况下，如果解封闭步骤被排序使得非正交解封闭条件被最后使用，则两种封闭基团仍然可以一起使用。

用于在同一反应容器中合成多于一种寡核苷酸的本发明的一些实施方案，诸如图3的实施方案，可以通过以下步骤实现：(a)提供一种或更多种支持物，所述支持物具有起始子的两种或更多种群体，其中每种群体的起始子的末端是具有群体特异性3’-O-封闭基团的可裂解连接或可裂解核苷酸，所述群体特异性3’-O-封闭基团可通过与起始子的每一种其他群体的3’-O-封闭基团的解封闭条件正交的解封闭条件去除；(b)使起始子的群体或延长片段的群体特异性封闭基团解封闭，以形成具有游离3’-羟基的起始子或延长片段；(c)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子的群体或其延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，从而通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸使起始子或延长片段延长，以形成3’-O-封闭的延长片段；和(d)对起始子的每种群体重复步骤(b)和(c)直到形成具有多于一种寡核苷酸的核苷酸序列的延长片段。在一些实施方案中，上文的方法还包括以下步骤：(e)使延长片段解封闭；和(f)裂解可裂解核苷酸或可裂解连接，以释放延长片段和/或多于一种寡核苷酸。在一些实施方案中，上文的方法还包括以下步骤：(g)添加用于基于寡核苷酸的测定的试剂；和(h)进行基于寡核苷酸的测定。在上文的实施方案的一些变化形式中，步骤(b)至(d)可以针对起始子的不同群体中的每一种连续实施，使得多于一种寡核苷酸中的每一种被连续合成。在上文的实施方案的其他变化形式中，步骤(b)至(d)可以针对起始子的不同群体中的每一种交替地实施，使得多于一种寡核苷酸中的每一种被平行合成。在上文的方法的一些实施方案中，一种或更多种支持物是固体支持物。

在一些实施方案中，在单个反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法可以通过以下步骤实施：(a)提供附接至一种或更多种支持物的多于一种不同的起始子，其中所述多于一种起始子中的至少一种起始子具有游离的3’-羟基，并且其中所述多种起始子中的至少一种起始子具有3’-O-封闭的末端核苷酸；(b)通过无模板酶促核苷酸添加3’-O-封闭的核苷三磷酸到每种不同起始子或其延伸产物的重复循环来合成多于一种寡核苷酸，其中3’-O-封闭的核苷三磷酸具有可在解封闭条件下去除的封闭基团，所述解封闭条件与去除多于一种起始子中的其他起始子的封闭基团的解封闭条件正交；以及(c)使寡核苷酸从延伸产物和一种或更多种固体支持物释放。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸等于或大于所述多于一种不同的起始子。也就是说，在一些情况下，多于一种不同的寡核苷酸中的每一种寡核苷酸可以由不同的起始子合成，在这种情况下，多于一种起始子与多于一种寡核苷酸相同。在其他情况下，各自包括多于一种寡核苷酸的一种或更多种多核苷酸可以由不同的起始子合成，使得多于一种寡核苷酸可以大于多于一种起始子。不同的起始子可以具有不同的核苷酸序列和/或长度，只要它们的封闭基团可以通过与用于其他起始子的解封闭条件正交的解封闭条件来去除。示例性的正交解封闭条件可以包括光裂解、酶促裂解、弱酸处理、碱处理等，其可用于一种起始子上的封闭基团而基本上不影响其他类型起始子上的封闭基团。

寡核苷酸的无模板酶促合成

通常，无模板(或等同地，“不依赖模板的”)酶促DNA合成的方法包括步骤的重复循环，诸如图5中图示，其中预定的核苷酸在每个循环中与起始子或增长链偶联。以下参考文献描述了无模板酶促合成的一般要素：Ybert等人,国际专利公布WO/2015/159023；Ybert等人,国际专利公布WO/2017/216472；Hyman,美国专利5436143；Hiatt等人,美国专利5763594；Jensen等人,Biochemistry,57:1821-1832(2018)；Mathews等人,Organic&Biomolecular Chemistry,DOI:0.1039/c6ob01371f(2016)；Schmitz等人,Organic Lett.,1(11):1729-1731(1999)。

提供了例如附接至固体支持物(520)的起始子多核苷酸(500)，所述起始子多核苷酸(500)具有游离的3’-羟基基团(530)。在有效地将3’-O-保护的-dNTP经酶促掺入到起始子多核苷酸(500)(或延长的起始子多核苷酸)的3’末端上的条件(540)下，向起始子多核苷酸(500)(或在随后的循环中延长的起始子多核苷酸)添加3’-O-保护的dNTP和无模板聚合酶，诸如TdT或其变体(例如Ybert等人,WO/2017/216472；Champion等人，WO2019/135007)。该反应产生延长的起始子多核苷酸，其3’-羟基受到保护(560)。如果延长序列不是完整的，则实施另一个添加循环(580)。如果延长的起始子多核苷酸包含完整的序列，那么3’-O-保护基团可以被去除或者去保护，并且期望的序列可以从原始的起始子多核苷酸裂解(582)。这样的裂解可以使用各种单链裂解技术中的任何一种来进行，例如，通过在原始的起始子多核苷酸内的预定位置插入可裂解核苷酸来进行。示例性的可裂解核苷酸可以是被尿嘧啶DNA糖基化酶裂解的尿嘧啶核苷酸。如果延长的起始子多核苷酸不包含完整的序列，那么去除3’-O-保护基团以暴露游离的3’-羟基(530)，并且对延长的起始子多核苷酸进行核苷酸添加和去保护的另一个循环。

如本文使用的，“起始子”(或等效术语，诸如，“起始片段”、“起始子核酸”、“起始子寡核苷酸”等)通常是指具有游离3’-末端的短寡核苷酸序列，可以被无模板聚合酶诸如TdT进一步延长。在一种实施方案中，起始片段是DNA起始片段。在替代实施方案中，起始片段是RNA起始片段。在一些实施方案中，起始片段具有3个和100个之间的核苷酸，特别是具有3个和20个之间的核苷酸。在一些实施方案中，起始片段是单链的。在替代实施方案中，起始片段是双链的。在一些实施方案中，起始子可以包含具有游离羟基的非核酸化合物，TdT可以将3’-O-保护的dNTP偶联到其上，例如如Baiga，美国专利公布US2019/0078065和US2019/0078126中描述的。

回到图5，在一些实施方案中，在每个合成步骤中，在存在3’-O-保护的dNTP的情况下，使用无模板聚合酶诸如TdT将一系列有序的核苷酸偶联到起始子核酸。在一些实施方案中，合成寡核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3’-羟基的起始子；(b)在延伸条件下，在存在3’-O-保护的核苷三磷酸的情况下，使具有游离3’-羟基的起始子或延伸中间体与无模板聚合酶反应，以产生3’-O-保护的延伸中间体；(c)使延伸中间体去保护以产生具有游离3’-羟基的延伸中间体；和(d)重复步骤(b)和(c)直到多核苷酸被合成。(有时术语“延伸中间体”和“延长片段”可互换使用)。在一些实施方案中，起始子作为附接至(例如通过其5’末端附接至)固体支持物的寡核苷酸提供。上文的方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括去除未掺入的核苷三磷酸的子步骤，例如通过在预定的孵育时间段或反应时间后洗涤来去除的子步骤。这样的预定的孵育时间段或反应时间可以是几秒钟，例如30秒，至几分钟，例如30min。

当合成支持物上的多核苷酸序列包括反向互补子序列时，可以通过在反向互补区域之间形成氢键来产生二级分子内或分子间结构。在一些实施方案中，选择用于外环胺的碱基保护部分，使得被保护的氮的氢不能参与氢键合，从而防止这样的二级结构的形成。也就是说，可以使用碱基保护部分来防止氢键的形成，所述氢键诸如在正常碱基配对中形成的氢键，例如在核苷A和T之间以及在核苷G和C之间形成的氢键。在合成结束时，可以去除碱基保护部分，并且多核苷酸产物可以从固体支持物裂解，例如通过从其起始子裂解。

没有碱基保护的3’-O-封闭的dNTP可以从商业供应商处购买，或者使用公开的技术合成，所述公开的技术例如美国专利7057026；Guo等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,105(27):9145-9150(2008)；Benner,美国专利7544794和8212020；国际专利公布WO2004/005667、WO91/06678；Canard等人,Gene(本文引用的)；Metzker等人,Nucleic Acids Research,22:4259-4267(1994)；Meng等人,J.Org.Chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公布2005/037991。具有碱基保护的3’-O-封闭的dNTP可以如下文描述地进行合成。

当采用碱基保护的dNTP时，上文的图5的方法还可以包括去除碱基保护部分的步骤(e)，在酰基或脒保护基团的情况下，该步骤可以(例如)包括用浓氨处理。

上文的方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及去保护步骤之后的一个或更多个加帽步骤以及洗涤步骤。如上文提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中未延伸的游离3’-羟基与阻止加帽的链进一步延伸的化合物进行反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3’-羟基的非延伸链可以通过用3’-核酸外切酶活性例如Exo I处理它们来降解。例如，参见Hyman,美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，未能解封闭的链可以被处理以去除该链或使其对进一步的延伸呈惰性。

在一些实施方案中，用于延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下：2.0μM经纯化的TdT；125-600μM 3’-O-封闭的dNTP(例如3’-O-NH₂-封闭的dNTP)；约10mM至约500mM的二甲基砷酸钾缓冲液(6.5和7.5之间的pH)和约0.01mM至约10mM的二价阳离子(例如CoC1₂或MnC1₂)，其中延长反应可以在50μL的反应体积中在RT至45℃范围内的温度进行3分钟。在其中3’-O-封闭的dNTP是3’-O-NH₂-封闭的dNTP的实施方案中，用于解封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mM NaNO₂；1M乙酸钠(用乙酸调节至4.8-6.5的范围中的pH)，其中解封闭反应可以在50μL体积中在RT至45℃的范围内的温度进行30秒至几分钟。

根据具体的应用，解封闭和/或裂解的步骤可以包括各种化学或物理条件，例如光、热、pH、特定试剂诸如酶的存在，其能够裂解指定的化学键。选择3’-O封闭基团和相应的解封闭条件的指导可以在以下参考文献中找到，这些文献通过引用并入本文：Benner，美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公布WO91/06678；和下文引用的参考文献。在一些实施方案中，裂解剂(有时也称为解封闭试剂或剂)是一种化学裂解剂，诸如例如二硫苏糖醇(DTT)。在替代实施方案中，裂解剂可以是酶裂解剂，诸如例如磷酸酶，所述磷酸酶可以裂解3’-磷酸封闭基团。本领域技术人员应当理解，解封闭剂的选择取决于所用的3’-核苷酸封闭基团的类型，使用一个还是多个封闭基团，起始子是否附接至活细胞或生物体或附接至需要温和处理的固体支持物等。例如，膦诸如三(2-羧乙基)膦(TCEP)可以用于裂解3’O-叠氮甲基基团，钯络合物可以用于裂解3’O-烯丙基基团，或亚硝酸钠可以用于裂解3’O-氨基基团。在特定实施方案中，裂解反应涉及TCEP、钯络合物或亚硝酸钠。

如上文指出的，在一些实施方案中，期望使用两种或更多种可以使用正交解封闭条件去除的封闭基团。以下示例性的封闭基团对可以用于平行合成实施方案中。应当理解，在本发明的这些实施方案中，可以使用其他的封闭基团对，或者包含多于两种的组。

3’-O-NH2	3’-O-叠氮甲基
		3’-O-NH2	3’-O-烯丙基
3’-O-NH2	3’-O-磷酸
		3’-O-叠氮甲基	3’-O-烯丙基
3’-O-叠氮甲基	3’-O-磷酸
		3’-O-烯丙基	3’-O-磷酸

在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的解封闭或去保护条件，即不会破坏细胞膜、使蛋白质变性、干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在这样的实施方案中，酶促去保护是期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与用于将其去除的特定酶关联。例如，基于酯或酰基的封闭基团可以用酯酶诸如乙酰酯酶或类似的酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶诸如T4多核苷酸激酶去除。举例来说，3’-O-磷酸可以通过用100mMTris-HCl(pH 6.5)、10mM MgC1₂、5mM 2-巯基乙醇和一个单位T4多核苷酸激酶的溶液处理来去除。反应在37℃的温度进行1分钟。

“3’-磷酸封闭的”或“3’-磷酸保护的”核苷酸是指其中3’-位置处的羟基基团通过含磷酸部分的存在而被封闭的核苷酸。根据本发明的3’-磷酸封闭的核苷酸的实例是核苷酸-3’-磷酸单酯/核苷酸-2’,3’-环磷酸酯、核苷酸-2’-磷酸单酯和核苷酸-2’或3’-烷基磷酸二酯、以及核苷酸-2’或3’-焦磷酸酯。也可以使用硫代磷酸酯或这样的化合物的其他类似物，只要这种取代不阻止磷酸酶去磷酸化产生游离的3’-OH。

3’-O-酯保护的dNTP或3’-O-磷酸保护的dNTP的合成和酶促去保护的其他实例在以下参考文献中描述：Canard等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,92:10859-10863(1995)；Canard等人,Gene,148:1-6(1994)；Cameron等人,Biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；Rasolonjatovo等人,Nucleosides&Nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；Ferrero等人,Monatshefte fur Chemie,131:585-616(2000)；Taunton-Rigby等人,J.Org.Chem.,38(5):977-985(1973)；Uemura等人,Tetrahedron Lett.,30(29):3819-3820(1989)；Becker等人,J.Biol.Chem.,242(5):936-950(1967)；Tsien,国际专利公布WO1991/006678。

在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括含有嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖糖部分的经修饰的核苷酸或核苷分子，所述核糖或脱氧核糖部分具有与其共价地附接的可去除的3’-OH封闭基团使得3’碳原子已附接以下结构：

-O-Z

其中-Z是-C(R’)₂-O-R”、-C(R’)₂-N(R”)₂、-C(R’)₂-N(H)R”、-C(R’)₂-S-R”和-C(R’)₂-F中的任何一种，其中每个R”是可去除的保护基团或是可去除的保护基团的一部分；每个R’独立地是氢原子、烷基、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环、酰基、氰基、烷氧基、芳基氧基、杂芳基氧基或酰胺基团，或通过连接基团附接的可检测标记；条件是在一些实施方案中，这样的取代基具有至多10个碳原子和/或至多5个氧或氮杂原子；或(R’)₂代表式＝C(R”’)₂的基团，其中每个R”’可以是相同的或不同的，并且选自包括氢和卤素原子以及烷基基团的组，条件是在一些实施方案中，每个R’”的烷基具有1个至3个碳原子；并且其中分子可以反应以产生中间体，所述中间体中每个R”被交换为H，或其中Z是-(R’)₂-F，F被交换为OH、SH或NH₂，优选地交换为OH，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3'-OH的分子；条件是当Z是-C(R’)₂-S-R”时，两个R’基团均不是H。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的R’是烷基或取代的烷基，条件是这样的烷基或取代的烷基具有1个至10个碳原子和0个至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-Z具有式-C(R’)₂-N₃。在某些实施方案中，Z是叠氮基甲基基团。

在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小的分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小的分子量的可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小的分子量的可裂解有机部分。在一些实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有200或更小的分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有100或更小的分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有或不具有杂原子的具有50或更小的分子量的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，Z是具有200或更小的分子量的酶促可裂解酯基团。在其他实施方案中，Z是可被3’-磷酸酶去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3’-磷酸酶中的一种或更多种可以与制造商推荐的方案一起使用：T4多核苷酸激酶、牛小肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如，可从New England Biolabs,Beverly,MA获得)。

在另一种实施方案中，3’-封闭的核苷酸三磷酸被3’-O-叠氮甲基、3’-O-NH₂或3’-O-烯丙基基团封闭。

在又其他实施方案中，本发明的3’-O-封闭基团包括3’-O-甲基、3’-O-(2-硝基苄基)、3’-O-烯丙基、3’-O-胺、3’-O-叠氮甲基、3’-O-叔丁氧基乙氧基、3’-O-(2-氰乙基)和3’-O-炔丙基。

在一些实施方案中，3’-O-保护基团是电化学不稳定基团。也就是说，保护基团的去保护或裂解通过改变保护基团附近的电化学条件使其导致裂解来实现。电化学条件的这样的变化可以通过改变或施加物理量来产生，所述物理量诸如电压差或光，激活辅助物质，这继而引起保护基团位置处的电化学条件的变化，诸如pH的增加或降低。在一些实施方案中，电化学不稳定基团包括例如pH敏感的保护基团，所述pH敏感的保护基团每当pH改变到预定值时被裂解。在其他实施方案中，电化学不稳定基团包括这样的保护基团，所述保护基团每当还原或氧化条件改变时，例如通过增加或减少保护基团位置处的电压差来改变时，被直接裂解。

在一些实施方案中，酶促合成方法采用显示出增加的关于3’-O-修饰的核苷三磷酸的掺入活性的TdT变体。例如，这样的TdT变体可以使用Champion等人的美国专利10435676中描述的技术产生，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，使用了具有与SEQ ID NO:2至少60％相同的氨基酸序列并且在位置207处具有第一精氨酸的取代和在位置325处具有第二精氨酸的取代或它们的功能等同残基的TdT变体。在一些实施方案中，使用了具有以下氨基酸序列的末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)变体，所述氨基酸序列与选自SEQID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的氨基酸序列至少60％相同，在关于SEQ IDNO 2、3、4、6、7、9、12和13的位置207处、在关于SEQ ID NO 5的位置206处、在关于SEQ ID NO8和10的位置208处、在关于SEQ ID NO 11的位置205处、在关于SEQ ID NO 14的位置216处和在关于SEQ ID NO 15的位置210处具有精氨酸(“第一精氨酸”)的取代；和在关于SEQ IDNO 2、9和13的位置325处、在关于SEQ ID NO 3和4的位置324处、在关于SEQ ID NO 5的位置320处、在关于SEQ ID NO 6和8的位置331处、在关于SEQ ID NO11的位置323处、在关于SEQID NO 12和15的位置328处和在关于SEQ ID NO 14的位置338处具有精氨酸(“第二精氨酸”)的取代；或它们的功能等同残基；其中该TdT变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3’-O-修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3’-羟基上。在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是与所指示的SEQ ID NO的至少80％同一性；在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是与所指示的SEQ ID NO的至少90％同一性；在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是与所指示的SEQ ID NO的至少95％同一性；在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是至少97％同一性；在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是至少98％同一性；在一些实施方案中，上文的同一性百分比值是至少99％同一性。如本文使用的，用于比较参考序列和变体序列的同一性百分比值不包括含有变体序列的取代的明确指定的氨基酸位置；也就是说，同一性百分比关系是在参考蛋白的序列和变体中含有取代的明确指定位置之外的变体蛋白的序列之间。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸，并且变体序列在位置25和81处具有突变，那么同源性百分比是关于序列1-24、26-80和82-100。

关于(ii)，这样的3’-O-修饰的核苷酸可以包括3’-O-NH₂-核苷三磷酸、3’-O-叠氮甲基-核苷三磷酸、3’-O-烯丙基-核苷三磷酸、3’-O-(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3’-O-炔丙基-核苷三磷酸。

在一些实施方案中，如表1中示出的，上文的TdT变体在第一精氨酸和第二精氨酸处具有取代。

表1：TdT变体的取代的实例

在一些实施方案中，用于本发明的方法的其他TdT变体包括甲硫氨酸、半胱氨酸或谷氨酸的一个或更多个其他取代，如表1中示出的。

可用于本发明的方法的其他特定TdT变体列于表2。表2的TdT变体DS1001至DS1018中的每一个包含与SEQ ID NO 2至少60％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代。在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少80％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少90％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少95％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ IDNO2至少97％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少98％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代；在一些实施方案中，TdT变体DS1001至DS1018包含与SEQ ID NO 2至少99％相同的氨基酸序列，并且包含所指示的位置处的取代。

表2：用于本发明的方法的特定TdT变体

如上文描述的本发明的TdT变体各自包含与指定的SEQ ID NO具有序列同一性百分比、具有所指示的取代的存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的TdT变体和指定的SEQ ID NO之间的序列差异的数量和类型可以是由于取代、缺失和/或插入，并且取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包括任何氨基酸。在一些实施方案中，这样的缺失、取代和/或插入仅包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包含保守的或同义的氨基酸变化，如Grantham,Science,185:862-864(1974)中描述的。也就是说，氨基酸的取代只能发生在其同义氨基酸的集合的成员之间。在一些实施方案中，表3A列出了可以使用的同义氨基酸的集合。

表3A：氨基酸的同义集合I

在一些实施方案中，表3B列出了可以使用的同义氨基酸的集合。

表3B：氨基酸的同义集合II

可裂解的连接和核苷酸

各种各样的可裂解连接，或者更具体地，可裂解核苷酸，可以用于本发明的实施方案。如本文使用的，术语“可裂解位点”是指单链核酸序列中可在预定条件下被切下或裂解从而使单链核酸序列分成两部分的核苷酸或主链连接。在一些实施方案中，裂解可裂解核苷酸或可裂解连接的步骤在裂解的链上留下游离的3’-羟基，从而例如允许裂解的链被聚合酶延伸。裂解步骤可以通过化学、热、酶或基于光的裂解来进行。在一些实施方案中，可裂解核苷酸可以是核苷酸类似物，诸如脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷，它们被特定的糖基化酶(例如尿嘧啶脱氧糖基化酶，随后分别是核酸内切酶VIII和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)识别。在一些实施方案中，糖基化酶和/或核酸内切酶的裂解可能需要双链DNA底物。

在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括含有可被核酸内切酶III裂解的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于尿素、胸腺嘧啶二醇、甲基酒石酸脲、四氧嘧啶、尿嘧啶二醇、6-羟基-5,6-二氢胞嘧啶、5-羟基乙内酰脲、5-羟基胞嘧啶、反式-1-氨基甲酰基-2-氧代-4,5-二氢氧基咪唑烷、5,6-二氢尿嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶、5-羟基-6-氢尿嘧啶、5-羟基-6-氢胸腺嘧啶、5,6-二氢胸腺嘧啶。在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括含有可被甲酰胺基嘧啶DNA糖基化酶裂解的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤、7,8-二氢-8-氧代肌苷、7,8-二氢-8-氧代腺嘌呤、7,8-二氢-8-氧代水粉蕈素(7,8-dihydro-8-oxonebularine)、4,6-二氨基-5-甲酰胺基嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-N-甲酰胺基嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶。在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括含有可被hNeil1裂解的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于胍基乙内酰脲、螺亚氨基二乙内酰脲、5-羟基尿嘧啶、胸腺嘧啶二醇。在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括含有可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶裂解的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括含有可被人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶裂解的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于3-甲基腺嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-(2-氯乙基)-鸟嘌呤、7-(2-羟基乙基)-鸟嘌呤、7-(2-乙氧基乙基)-鸟嘌呤、1,2-双-(7-鸟嘌呤)乙烷、1,N⁶-亚乙烯基腺嘌呤、1,N²-亚乙烯基鸟嘌呤、N²,3-亚乙烯基鸟嘌呤、N²,3-亚乙基鸟嘌呤、5-甲酰基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、次黄嘌呤。在一些实施方案中，可裂解核苷酸包括可被5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶裂解的5-甲基胞嘧啶。

用于本文描述的方法的示例性可化学裂解的核苷酸间连接包括，例如，-氰基醚、5′-脱氧-5′-氨基氨基甲酸酯、3′-脱氧-3′-氨基氨基甲酸酯、脲、2′氰基-3′,5′-磷酸二酯、3′-(S)-硫代磷酸酯、5′-(S)-硫代磷酸酯、3′-(N)-氨基磷酸酯、5′-(N)-氨基磷酸酯、-氨基酰胺、邻二醇、核糖核苷插入、2′-氨基-3′,5′-磷酸二酯、烯丙基亚砜、酯、甲硅烷基醚、二硫缩醛、5′-硫代-甲缩醛、-羟基-甲基-膦酸双酰胺、乙缩醛、3′-硫代-甲缩醛、甲基膦酸酯和磷酸三酯。核苷间甲硅烷基基团诸如三烷基甲硅烷基醚和二烷氧基硅烷通过用氟离子处理来裂解。碱可裂解位点包括-氰基醚、5′-脱氧-5′-氨基氨基甲酸酯、3′-脱氧-3′-氨基氨基甲酸酯、脲、2′-氰基-3′,5′-磷酸二酯、2′-氨基-3′,5′-磷酸二酯、酯和核糖。含硫核苷酸间键诸如3′-(S)-硫代磷酸酯和5′-(S)-硫代磷酸酯通过用硝酸银或氯化汞处理来裂解。酸可裂解位点包括3′-(N)-氨基磷酸酯、5′-(N)-氨基磷酸酯、二硫缩醛、乙缩醛和膦酸双酰胺。-氨基酰胺核苷酸间键可通过用异硫氰酸酯处理来裂解，并且钛可以用于裂解2′-氨基-3′,5′-磷酸二酯-O-邻-苄基核苷酸间键。邻二醇键可通过用高碘酸盐处理来裂解。可热裂解的基团包括烯丙基亚砜和环己烯，而光不稳定连接包括硝基苄基醚和胸苷二聚体。合成和裂解含有可化学裂解、可热裂解和光不稳定基团的核酸的方法描述于例如美国专利第5,700,642号中。

在以下参考文献中公开了另外的可裂解连接：Pon,R.,Methods Mol.Biol.20:465-496(1993)；Verma等人,Ann.Rev.Biochem.67:99-134(1998)；美国专利第5,739,386号、第5,700,642号和第5,830,655号；以及美国专利公布第2003/0186226和2004/0106728号，Urdea等人,美国专利5367066。

可裂解位点可以沿着寡核苷酸主链定位，例如，修饰的3′-5′核苷酸间连接(代替磷酸二酯基团中的一个)，诸如核糖、二烷氧基硅烷、硫代磷酸酯和氨基磷酸酯核苷酸间连接。可裂解的寡核苷酸类似物还可以包括在一个碱基或糖上的取代基或代替一个碱基或糖，诸如7-去氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶、肌苷、尿苷等。

可化学裂解的寡核苷酸的合成和裂解条件在美国专利第5,700,642号和第5,830,655号中描述。硫代磷酸酯核苷酸间连接可以在温和的氧化条件下选择性地裂解。氨基磷酸酯键的选择性裂解可以在弱酸条件诸如80％乙酸下进行。核糖的选择性裂解可以通过用稀氢氧化铵处理来进行。在另一种实施方案中，可裂解的连接部分可以是氨基接头。通过亚磷酰胺连接与接头结合的所得寡核苷酸可以用80％乙酸裂解，产生3′-磷酸化寡核苷酸，其可以(如果需要)被磷酸酶去除。

在一些实施方案中，可裂解的连接部分可以是可光裂解的接头，诸如邻硝基苄基可光裂解的接头。固体支持物上的光不稳定寡核苷酸的合成和裂解条件在例如以下中描述：Venkatesan等人,J.Org.Chem.61:525-529(1996)，Kahl等人,J.Org.Chem.64:507-510(1999)，Kahl等人,J.Org.Chem.63:4870-4871(1998)，Greenberg等人,J.Org.Chem.59:746-753(1994)，Holmes等人,J.Org.Chem.62:2370-2380(1997)，以及美国专利第5,739,386号。基于邻硝基苄基的接头，诸如羟甲基、羟乙基和Fmoc-氨基乙基羧酸接头，也可以商购地获得。

在一些实施方案中，核糖核苷酸可以用作可裂解核苷酸，其中裂解步骤可以使用核糖核酸酶诸如RNA酶H来实施。在其他实施方案中，裂解步骤可以通过用切口酶处理来进行。

试剂盒

本发明包括用于进行本发明的方法的试剂盒。在一些实施方案中，本发明的试剂盒用于串联合成用于实施PCR的多于一种寡核苷酸，其中该试剂盒包括用于在多核苷酸产物的预定位置处插入可裂解核苷酸的3’-O-封闭的可裂解核苷三磷酸。在一些实施方案中，这样的试剂盒还包括附接有起始子的固体支持物。在另外的实施方案中，这样的试剂盒包括多于一种固体支持物，其中多于一种固体支持物中的每种不同的固体支持物附接有起始子，该起始子附接有不同的3’-O-封闭基团，使得每种不同的封闭基团可通过正交解封闭条件去除。在另外的实施方案中，这样的试剂盒包括固体支持物，该固体支持物具有以预定比率附接的多于一种不同的起始子，其中每种不同的起始子附接有不同的3’-O-封闭基团，使得每种不同的封闭基团可通过正交解封闭条件去除。在每种前述试剂盒中，不同的起始子可以具有相同或不同的核苷酸序列。

在前述试剂盒的一些实施方案中，提供固体支持物和起始子用于实施不对称PCR，使得多于一种起始子为两种，并且不同起始子的预定比率为至少10:1；并且在其他实施方案中，为至少100:1。在前述试剂盒的一些实施方案中，提供固体支持物和起始子用于实施巢式PCR，从而当合成多核苷酸产物时，可以释放两组正向引物和反向引物用于进行扩增反应。在该实施方案的一种形式中，提供了两种固体支持物，其中在一种固体支持物上连续合成两种引物，并且在另一种固体支持物上连续合成两种引物，并且其中不同固体支持物上的起始子具有不同的3’-O-封闭基团，所述3’-O-封闭基团可以通过正交解封闭条件去除。在这些实施方案的另一种形式中，提供了一种或更多种3’-O-封闭的可裂解核苷三磷酸。

在一些实施方案中，试剂盒提供固体支持物和3’-O-封闭的可裂解核苷三磷酸，用于实施基于核酸序列的扩增(NASBA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)或定量PCR。

实施例1：用于qPCR的引物和Taqman探针的平行合成

合成了引物和探针，并且定量PCR按照Holland等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,88:7276-7280(1991)中描述的用于扩增单链噬菌体M13mp10的350bp片段的程序进行，并做了一些修改。方法的步骤在图4A-图4C中图示。在同一反应孔中放置各自包含磁性琼脂糖树脂的第一合成支持物(402)和第二合成支持物(404)，其中第一支持物(402)已经附接了具有末端脱氧尿苷(408)的第一起始子寡核苷酸(403)，所述末端脱氧尿苷(408)具有游离的3’-羟基，并且距离末端脱氧尿苷(408)的第4和第5核苷酸之间具有5’-硫代磷酸酯连接(406)。第二支持物(404)附接了具有末端脱氧尿苷(408)的第二起始子寡核苷酸(405)，所述末端脱氧尿苷(408)在末端具有3’-O-叠氮甲基封闭基团(410)并且距离末端脱氧尿苷(408)的第4和第5核苷酸之间具有5’-硫代磷酸酯连接(406)。两种起始子(403和405)通过其5’-末端使用常规连接化学共价附接至固体支持物(分别为402和404)。在第二支持物(404)上合成(414)第二多核苷酸(427)，第二多核苷酸(427)包含串联的(从固体支持物的近端到远端方向)(i)正向引物BW36(28-mer，噬菌体M13mp10上的位置5241-5268)(415)和(ii)反向引物BW42(30-mer，噬菌体M13mp10上的位置5591-6662)(在上文引用的Holland等人中公开)(417)，其中引物通过脱氧尿苷(416)分隔开。紧接着BW42的3’的是脱氧尿苷(419)，一段五个脱氧胸苷的区段(419)，并且最后是生物素化的ddU(420)。这样的合成使用如Benner的美国专利7544794和Benner等人的美国专利8034923和8212020中所公开地进行制备和使用的3’-O-氨基-dNTP进行。引物合成完成后，在第一支持物(402)上合成(422)包含探针BW31(30-mer)(424)的第一多核苷酸(428)，其中BW31的5’-末端胞嘧啶用FAM(425)标记(FAM-标记的3’-O-叠氮甲基-dCTP如Liu等人的美国专利7795454所公开地进行制备，该专利通过引用并入本文)，并且BW31的3’-末端C用TAMRA(426)标记(TAMRA-标记的3’-O-叠氮甲基-dCTP如Liu等人(上文引用的)所公开地进行制备)。另外，在合成中使用了未标记的3’-O-叠氮甲基-dNTP，其可商购获得(Jena)或可如Liu等人(上文引用的)所描述地进行制备。如同第二多核苷酸(427)，紧接着BW31的3’的是脱氧尿苷(432)，一段五个脱氧胸苷的区段(434)，并且最后是生物素化的ddU(436)。选择第一固体支持物和第二固体支持物的量，使得裂解的探针在50μL反应体积中具有0.04-0.4μM的浓度，并且引物以探针浓度的大约两倍存在。合成反应通过解封闭、洗涤、基于TdT掺入核苷三磷酸和洗涤的循环进行，其中试剂添加和去除步骤使用常规的流体递送和抽吸系统与磁性支持物的磁性固定化相配合来实施。当第一多核苷酸(428)的合成完成时，第一多核苷酸和第二多核苷酸(428和427)两者都通过用硝酸银溶液处理硫代磷酸酯连接(406)而从第一支持物(402)和第二支持物(404)裂解，如Mag等人,Nucleic Acids Research,19(7):1437-1441(1991)和Monforte等人,美国专利5830655所公开的，其通过引用并入本文。在这样的裂解之后，将包被有链霉亲和素的第三支持物(442)(例如，磁性琼脂糖珠)添加到反应混合物中，从而捕获释放的第一和第二多核苷酸(438)。捕获的多核苷酸(438)可以被洗涤，其中磁性支持物(442、402和404)通过施加磁场保持在反应容器中，之后探针(424)以及正向(415)引物和反向(417)引物通过使用常规尿嘧啶脱氧糖基化酶反应随后用核酸内切酶VIII在脱氧尿苷位点(408、416、418和432)处裂解多核苷酸并且用3’-磷酸酶处理来释放(450)。在裂解酶的热失活后，添加(460)靶和扩增试剂，并进行(470)使用Taq聚合酶的常规定量PCR，使FAM分子(425)从探针(424)释放。

图4D中图示了仅采用第一支持物(402和404)的替代实施方案。代替使用第二支持物(442)来捕获完整的多核苷酸(427和428)(例如，为了便于去除用过的试剂)，在图4D的实施方案中，第二多核苷酸(427)被加帽以防止在第一多核苷酸(428)的合成过程期间的错误延伸，消除了起始子内可裂解的连接“W”(406)；并且消除了第一多核苷酸和第二多核苷酸二者的末端核苷酸上的捕获部分。探针多核苷酸(475)上的加帽部分(482)被附接以防止扩增期间探针序列的假延伸。在合成完成(472)后，合成试剂可以被去除或失活，而第一多核苷酸和第二多核苷酸(475和477)保持附接至支持物(402和404)，之后期望的正向引物(415)和反向引物(417)和探针(424)可以在单个裂解反应中释放。在本实施例中，单个裂解反应用常规UDG/核酸内切酶VIII处理在脱氧尿苷(474、476、478和480)处裂解第一多核苷酸和第二多核苷酸(475和477)，以释放引物和探针。释放的引物用3’-磷酸酶处理以产生游离的可延伸的3’-羟基，之后裂解酶和磷酸酶可以失活，例如通过热失活而失活，并且靶和扩增试剂被添加以进行qPCR。

实施例2：用于qPCR的引物和Taqman探针的连续合成

在本实施例中，与图4D的那些类似的引物和探针在单种支持物(图4E的489)上连续合成。如上文的，起始子(488)具有末端dU(491a)，以允许探针(491)和引物(492和493)从支持物(489)裂解。可选地，可以提供可光裂解的连接来代替在裂解后留下游离3’-羟基的dU(例如Urdea等人的美国专利5367066，其通过引用并入本文)。另外的可裂解核苷酸(例如，如所示的dU，490c和490a)或可裂解连接使正向引物(492)、反向引物(493)和探针(491)分隔开。如上文描述地合成支架，探针(491)的3’末端用加帽剂诸如双脱氧U部分终止，以防止在PCR中使用时的假延伸。荧光报告物(495)和猝灭剂(496)可以如上文描述地直接或间接加入。在合成完成后(497)，合成试剂可以被去除或失活，并用常规UDG/核酸内切酶VIII处理释放引物和探针。用3’-磷酸酶处理释放的引物以产生游离的可延伸的3’-羟基，之后裂解酶和磷酸酶可以失活，例如通过热失活而失活，并且靶和扩增试剂被添加以进行qPCR。

定义

除非本文另有明确定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准专著和教科书的那些，例如，Kornberg和Baker,DNAReplication,第二版(W.H.Freeman,New York,1992)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Strachan和Read,Human Molecular Genetics,第二版(Wiley-Liss,New York,1999)。

如本文使用的“扩增(amplify)”、“扩增(amplifies)”、“扩增(amplified)”、“扩增(amplification)”通常是指制造靶多核苷酸或其一部分的一个或更多个拷贝的任何过程。扩增多核苷酸(例如DNA和/或RNA)的各种方法是可获得的，本文描述了其中的一些实例。扩增可以是线性的、指数的，或者在多阶段扩增过程中包括线性和指数两个阶段。扩增方法可以涉及温度变化，诸如热变性步骤，或者可以是不需要热变性的等温过程。“扩增子”是指多核苷酸扩增反应的产物；即多核苷酸的克隆群体，其可以是单链或双链的，从一个或更多个起始序列复制而来。“扩增”意指通过进行扩增反应产生扩增子。一个或更多个起始序列可以是相同序列的一个或更多个拷贝，或者它们可以是不同序列的混合物。优选地，扩增子从单个起始序列的扩增形成。扩增子可以通过各种扩增反应产生，其产物包括一种或更多种起始核酸或靶核酸的复制物。在一方面，产生扩增子的扩增反应是“模板驱动的”，因为反应物(核苷酸或寡核苷酸)的碱基配对在产生反应产物所需的模板多核苷酸中具有互补序列。在一方面，模板驱动的反应是用核酸聚合酶进行引物延伸或用核酸连接酶进行寡核苷酸连接。这样的反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、线性聚合酶反应、基于核酸序列的扩增(NASBA)、滚环扩增等，这些反应在以下参考文献中公开，这些文献通过引用并入本文：Mullis等人,美国专利4,683,195；4,965,188；4,683,202；4,800,159(PCR)；Gelfand等人,美国专利5,210,015(使用“taqman”探针的实时PCR)；Wittwer等人,美国专利6,174,670；Kacian等人,美国专利5,399,491(“NASBA”)；Lizardi,美国专利5,854,033；Aono等人,日本专利公布JP 4-262799(滚环扩增)；等等。在一方面，本发明的扩增子由PCR产生。如果检测化学是可用的，允许随着扩增反应的进行测量反应产物，扩增反应可以是“实时”扩增，例如下文描述的“实时PCR”，或在Leone等人,Nucleic Acids Research,26:2150-2155(1998)和类似的参考文献中描述的“实时NASBA”。如本文使用的，术语“扩增”意指进行扩增反应。“反应混合物”意指含有进行反应所需的所有反应物的溶液，其可以包括但不限于在反应期间将pH维持在选定水平的缓冲剂、盐、辅因子、清除剂等。

“捕获部分”通常是特异性结合对的一个成员。“特异性结合”是指同时存在于异质(非同质)样品中的两种分子的相互结合优先于与样品中的其他分子结合的能力。通常，特异性结合相互作用在反应中以至少两倍，更通常以至少10倍，通常至少100倍与偶然的结合相互作用相区别。通常，特异性结合反应的亲和力或亲合力为至少约10⁷M^-1，使用至少10⁸M^-1到至少约10⁹M^-1，并且通常更大，包括亲和力或亲合力高达10¹⁰M^-1至10¹²M^-1。短语“特异性结合对”是指表现出特异性结合的分子对，通常是生物分子对。可用于捕获寡核苷酸的各种特异性结合对成员是本领域已知的。其中有小的捕获部分，俗称“半抗原”，而不论它们的抗原性如何。这样的半抗原包括生物素、地高辛，和二硝基苯基。生物素可以使用抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、captavidin、中性抗生物素蛋白或抗生物素抗体来捕获。地高辛和二硝基苯基可以使用对各自半抗原有特异性的抗体来捕获。

关于在两种或更多种不同的TdT中的氨基酸位置的“功能等同”意指(i)在相应位置处的氨基酸在TdT的活性中发挥相同的功能作用，和(ii)氨基酸出现在相应TdT的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模鉴定两种或更多种不同的TdT的氨基酸序列中的在位置上等同或同源的氨基酸残基是可能的。在一些实施方案中，功能等同的氨基酸位置属于序列基序，该序列基序在进化有亲缘的物种(例如属、科等)的TdT的氨基酸序列之间是保守的。这样的保守序列基序的实例在Motea等人,Biochim.Biophys.Acta.1804(5):1151-1166(2010)；Delarue等人,EMBO J.,21:427-439(2002)；以及类似的参考文献中描述。

“试剂盒”是指用于递送用于实施本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。在反应测定的情况下，这样的递送系统包括允许反应试剂(例如，适当的容器中的荧光标记，诸如相互猝灭的荧光标记、荧光标记连接剂、酶、猝灭剂等)和/或支持材料(例如，缓冲液，用于进行测定的书面说明等)从一个位置到另一个位置的储存、运输或递送的系统和/或化合物(诸如稀释剂、表面活性剂、载体等)。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持材料的一种或更多种外罩(例如盒子)。这样的内容物可以一起或单独地被递送到预期的接收者。例如，第一个容器可以包含用于测定的酶，而第二个或更多个容器包含相互猝灭的荧光标记和/或猝灭剂。

在本文可互换使用的“微流体”装置或“纳米流体”装置，均意指用于捕获、移动、混合、分散或分析小体积流体的集成系统，所述流体包含样品(其继而可含有或包括感兴趣的细胞或分子分析物)、试剂、稀释剂、缓冲液等等。通常，提及“微流体”和“纳米流体”表示装置尺寸和处理的流体体积的不同尺度。在一些实施方案中，微流体装置的特征具有小于几百平方微米的横截面尺寸，并且具有毛细管尺寸的通路或通道，例如具有约500μm至约0.1μm的最大横截面尺寸。在一些实施方案中，微流体装置具有范围为1μL至几nL，例如10-100nL的体积容量。纳米流体装置中对应特征或结构的尺寸通常比用于微流体装置的那些的尺寸小1个至3个数量级。本领域技术人员将从特定应用的情况知道哪种维度是相关的。在一些实施方案中，微流体或纳米流体装置具有一个或更多个室、端口和通道，所述室、端口和通道互连并且处于流体连通，并且被设计用于单独或与提供支持功能的设备或仪器合作进行一种或更多种分析反应或过程，所述支持功能诸如样品引入、流体和/或试剂驱动装置诸如正压或负压、声能等、温度控制、检测系统、数据收集和/或集成系统等。在一些实施方案中，微流体和纳米流体装置还可以包括阀、泵、过滤器和内壁上的专门功能涂层，例如以防止样品组分或反应物的吸附、促进通过电渗的试剂移动等。这样的装置可以作为在固体基底中的集成装置进行制造，所述固体基底可以是玻璃、塑料或其他固体聚合物材料，并且可具有易于检测和监测(特别是通过光学或电化学方法)样品和试剂移动的平面形式。在一些实施方案中，这样的装置在一次使用之后即可丢弃。在一些实施方案中，微流体装置和纳米流体装置包括形成和控制液滴的移动、混合、分散和分析的装置，所述液滴诸如浸没在不混溶流体(诸如轻油)中的水滴。微流体和纳米流体装置的制造和操作是本领域熟知的，如以下参考文献所举例说明的，这些文献通过引用并入本文：Ramsey,美国专利6,001,229；5,858,195；6,010,607；和6,033,546；Soane等人,美国专利5,126,022和6,054,034；Nelson等人,美国专利6,613,525；Maher等人,美国专利6,399,952；Ricco等人,国际专利公布WO 02/24322；Bjornson等人,国际专利公布WO 99/19717；Wilding等人,美国专利5,587,128；5,498,392；Sia等人,Electrophoresis,24:3563-3576(2003)；Unger等人,Science,288:113-116(2000)；Enzelberger等人,美国专利6,960,437；Cao,“Nanostructures&Nanomaterials:Synthesis,Properties&Applications,”(Imperial College Press,London,2004)；Haeberle等人,LabChip,7:1094-1110(2007)；Cheng等人,BiochipTechnology(CRC Press,2001)；等等。

可互换使用的“突变体”或“变体”，是指来源于本文描述的天然或参考TdT多肽并且在一个或更多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性包括对蛋白的序列中或者在本发明的情况下对聚合酶的序列中的一个或若干氨基酸进行的缺失、插入或取代。以下术语用于表示取代：L238A表示，参考或野生型序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)被改变为丙氨酸((A)。A132V/I/M表示，亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸中的一种取代：缬氨酸(V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守取代或非保守取代。保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、和丝氨酸)的组内。

“基于核酸序列的扩增”或“NASBA”是基于逆转录酶(通常是禽成髓细胞血症病毒(avian myeloblastosis virus，AMV)逆转录酶)、RNA酶H和RNA聚合酶(通常是T7 RNA聚合酶)的同时活性的扩增反应，使用两种寡核苷酸引物，并且在常规条件下，可以在90分钟至120分钟内以10⁹至10¹²的范围中的倍数扩增靶序列。在NASBA反应中，只有当核酸是单链的并且含有引物结合位点时，核酸才是扩增反应的模板。因为NASBA是等温的(通常用上文的酶在41℃进行)，如果在样品制备程序中防止双链DNA变性，单链RNA的特异性扩增就可以完成。也就是说，与其他技术诸如RT-PCR相比，可以在双链DNA背景中检测单链RNA靶，而不会获得由复杂基因组DNA引起的假阳性结果。通过使用与反应相容的荧光指示物，诸如分子信标，NASBA可以用扩增子的实时检测进行。分子信标是茎-环结构的寡核苷酸，在一个末端具有荧光标记并且在另一个末端具有猝灭剂，例如5’-荧光素和3’-(4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(即3’-DABCYL)，如Tyagi和Kramer(上文引用的)所公开的。示例性的分子信标可以具有六个核苷酸(例如4个G或C和2个A或T)的互补茎链，以及约20个核苷酸的靶特异性环，使得分子信标可以在反应温度例如41℃与靶序列形成稳定的杂交体。典型的NASBA反应混合物是30％DMSO中80mM Tris-HCl[pH 8.5]、24mM MgCl₂、140mM KCl、1.0mM DTT、2.0mM的各种dNTP、各自4.0mM的ATP、UTP和CTP、3.0mM GTP和1.0mM ITP。引物浓度为0.1μM，并且分子信标浓度为40nM。酶混合物是375山梨糖醇、2.1μg BSA、0.08U RNA酶H、32U T7 RNA聚合酶和6.4U AMV逆转录酶。反应可以包含5μL样品、10μL NASBA反应混合物和5μL酶混合物，总反应体积为20μL。进行实时NASBA反应的另外指导在以下参考文献中公开，这些文献通过引用并入本文：Polstra等人,BMC Infectious Diseases,2:18(2002)；Leone等人,NucleicAcids Research,26:2150-2155(1998)；Gulliksen等人,Anal.Chem.,76:9-14(2004)；Weusten等人,Nucleic Acids Research,30(6)e26(2002)；Deiman等人,Mol.Biotechnol.,20:163-179(2002)。巢式NASBA反应的进行类似于巢式PCR；即，第一个NASBA反应的扩增子成为使用一组新引物的第二个NASBA反应的样品，其中至少一种引物与第一扩增子的内部位置结合。

“聚合酶链式反应”或“PCR”意指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。换句话说，PCR是一种制造侧翼为引物结合位点的靶核酸的多个拷贝或复制物的反应，这样的反应包括以下步骤的一次或更多次重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火至引物结合位点，和(iii)在存在核苷三磷酸的情况下，通过核酸聚合酶使引物延伸。通常，在热循环仪器中，反应循环通过为每个步骤优化的不同温度。特定的温度、每个步骤的持续时间以及步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员熟知的许多因素，例如由以下参考文献举例说明的：McPherson等人编辑,PCR:A Practical Approach andPCR2:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,分别是1991和1995)。例如，在使用TaqDNA聚合酶的常规PCR中，双链靶核酸可以在>90℃的温度变性，引物在范围50-75℃的温度退火，并且引物在范围72-78℃的温度延伸。术语“PCR”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR等。反应体积的范围从几百纳升，例如200nL，到几百μL，例如200μL。在一些实施方案中，采用10-100μL反应体积；在一些实施方案中，采用20-50μL反应体积。“实时PCR”意指随着反应的进行，对反应产物即扩增子的量进行监测的PCR。存在许多形式的实时PCR，它们主要在用于监测反应产物的检测化学方面有差异，例如Gelfand等人,美国专利5,210,015(“taqman”)；Wittwer等人,美国专利6,174,670和6,569,627(插入染料)；Tyagi等人,美国专利5,925,517(分子信标)；这些专利通过引用并入本文。用于实时PCR的检测化学在Mackay等人,Nucleic Acids Research,30:1292-1305(2002)中综述，该文献也通过引用并入本文。“巢式PCR”是指两阶段PCR，其中第一次PCR的扩增子成为使用一组新引物的第二次PCR的样品，其中至少一种引物与第一扩增子的内部位置结合。如本文使用的，关于巢式扩增反应的“初始引物”意指用于产生第一扩增子的引物，并且“次级引物”是指用于生成第二扩增子或巢式扩增子的一种或更多种引物。“多重PCR”意指在相同反应混合物中同时进行多于一种靶序列(或单种靶序列和一种或更多种参考序列)的PCR，例如Bernard等人,Anal.Biochem.,273:221-228(1999)(双色实时PCR)。通常，对每种被扩增的序列使用不同的引物组。通常，多重PCR中靶序列的数量在2种至10种，或2种至6种，或更通常在2种至4种的范围内。“定量PCR”意指设计用于测量样品或样本中一种或更多种特定靶序列的丰度的PCR。定量PCR包括这样的靶序列的绝对定量和相对定量二者。使用一种或更多种参考序列进行定量测量，这些参考序列可以单独测定或与靶序列一起测定。参考序列可以是样品或样本的内源或外源序列，并且在后一种情况下，可以包含一种或更多种竞争模板。典型的内源参考序列包括以下基因的转录物的区段：β-肌动蛋白、GAPDH、β₂-微球蛋白、核糖体RNA等。用于定量PCR的技术是本领域普通技术人员熟知的，如以下参考文献中所举例说明的，这些文献通过引用并入本文：Freeman等人,Biotechniques,26:112-126(1999)；Becker-Andre等人,Nucleic Acids Research,17:9437-9447(1989)；Zimmerman等人,Biotechniques,21:268-279(1996)；Diviacco等人,Gene,122:3013-3020(1992)；Becker-Andre等人,Nucleic Acids Research,17:9437-9446(1989)；等等。“逆转录PCR”或“RT-PCR”意指在其之前是将靶RNA转化为互补的单链DNA的逆转录反应，然后扩增互补的单链DNA的PCR，例如Tecott等人的美国专利5,168,038，该专利通过引用并入本文。将RNA模板给予反应混合物，第一引物在其5’末端具有T7启动子区，在模板的3’末端附接至其互补位点。在RT-PCR中，逆转录酶合成相对的互补DNA链(“第一DNA链”)，使引物的3’末端延伸，沿着RNA模板向上游移动。RNA酶H从DNA-RNA复合物破坏RNA模板(RNA酶H只破坏RNA-DNA杂交体中的RNA，但不破坏单链RNA)。第二引物附接至(反义)DNA链的5’末端。逆转录酶再次从附接的引物合成另一条DNA链(“第二DNA链”)，产生双链DNA。T7 RNA聚合酶与双链上的启动子区结合。由于T7 RNA聚合酶只能在3’至5’方向转录，有义DNA被转录，并且产生反义RNA。重复这一过程，并且聚合酶不断产生该模板的互补RNA链，从而导致扩增。现在可以开始类似于前面步骤的循环阶段。然而，在这里，第二引物首先与(-)RNA结合。逆转录酶现在产生(+)cDNA/(-)RNA双链体。RNA酶H再次降解RNA，并且第一引物，即具有T7启动子区的引物，结合到现在的单链+(cDNA)。逆转录酶现在产生互补的(-)DNA，产生dsDNA双链体。与步骤(上文)完全一样，T7聚合酶与启动子区结合，产生RNA，并且循环完成。

“多核苷酸”或“寡核苷酸”被可互换地使用并且各自意指核苷酸单体的线性聚合物或其类似物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的常规模式(诸如Watson-Crick类型的碱基配对、碱基堆积、Hoogsteen或反向Hoogsteen类型的碱基配对等)与天然多核苷酸特异性结合。这样的单体及其核苷间连接可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括PNA、硫代磷酸核苷间连接、含有允许标记物(诸如荧光团或半抗原等)附接的连接基团的碱基。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用要求酶促加工，例如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等，普通技术人员将理解，在那些实例中，寡核苷酸或多核苷酸在任何或某些位置处不含有核苷间键、糖部分或碱基的某些类似物。多核苷酸的大小范围通常为几个单体单元例如5-40个(此时多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”)到数千个单体单元。除非另有说明或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以一串字母(大写或小写)表示时，诸如以“ATGCCTG”表示时，应理解的是该核苷酸从左到右是5’至3’的顺序，并且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，并且“T”表示胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。除非另有说明，术语和原子编号惯例遵循在Strachan和Read，Human Molecular Genetics 2(Wiley-Liss,New York,1999)或类似参考文献中公开的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，对于DNA，为脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷，或对于RNA，为它们的核糖对应物)；然而，它们还可以包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连接。本领域技术人员清楚，在酶的活性对特定的寡核苷酸或多核苷酸底物有要求的情况下，例如单链DNA、RNA/DNA双链体等，则选择用于寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成完全是在普通技术人员的知识范围内，特别是在来自专著的指导下完全是在普通技术人员的知识范围内，所述专著诸如Sambrook等人，Molecular Cloning，第二版(ColdSpring Harbor Laboratory，New York，1989)以及类似的参考文献。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其各自的互补物的双链体)。普通技术人员从术语使用的上下文将清楚哪种形式是意图的或者是否两种形式都是意图的。

“引物”意指这样的天然或合成的寡核苷酸，所述寡核苷酸能够在与多核苷酸模板形成双链体后作为核酸合成的起始点并且从其3'末端沿模板延伸，从而形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶例如DNA或RNA聚合酶进行。在延伸过程中添加的核苷酸的顺序由模板多核苷酸的序列决定。引物通常通过DNA聚合酶延伸。引物通常具有14个至40个核苷酸的范围内或者18个至36个核苷酸的范围内的长度。引物用于各种核酸扩增反应，例如使用单种引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员熟知的，如由以下参考文献证明的，这些文献通过引用并入本文：Dieffenbach,编辑,PCR Primer:A LaboratoryManual,第二版(Cold Spring Harbor Press,New York,2003)。

“序列同一性”是指两个序列诸如两个多肽序列或两个多核苷酸序列之间匹配(例如，相同氨基酸残基)的数目(或通常以百分比表示的分数)。序列同一性通过在对齐时使重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化而对序列进行比较来确定。特别地，序列同一性可以根据两个序列的长度使用多种数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定。相似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如，Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970)进行比对，该全局比对算法在整个长度上最佳地对齐序列，而实质上不同长度的序列优选地使用局部比对算法(例如，Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981)或Altschul算法(Altschul等人,1997；Altschul等人,2005)进行比对。出于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用互联网网站诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上可得的公众可得计算机软件实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是指使用成对序列比对程序EMBOSS Needle生成的值，该程序使用Needleman-Wunsch算法创建两个序列的最佳全局比对，其中所有搜索参数被设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10，且末端空位延伸＝0.5。

“序列标签”(或“标签”)或“条形码”意指附接至多核苷酸或模板分子的寡核苷酸，并且用于在一个反应或一系列反应中鉴定和/或追踪多核苷酸或模板。序列标签可以附接至多核苷酸或模板的3’-或5’-末端，或者它可以插入到这样的多核苷酸或模板的内部以形成线性缀合物，有时在本文中称为“加标签的多核苷酸”或“加标签的模板”或“标签-多核苷酸缀合物”、“标签-分子缀合物”等。序列标签的大小和组成可以有很大差异；通过引用并入本文的以下参考文献为选择适合特定实施方案的序列标签组提供了指导：Brenner,美国专利第5,635,400号；Brenner和Macevicz,美国专利第7,537,897号；Brenner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:1665-1670(2000)；Church等人,欧洲专利公布0 303 459；Shoemaker等人,Nature Genetics,14:450-456(1996)；Morris等人,欧洲专利公布0799897A1；Wallace,美国专利第5,981,179号；等等。序列标签的长度和组成可以有很大差异，并且特定长度和/或组成的选择取决于若干因素，包括但不限于标签如何用于生成读出(readout)，例如通过杂交反应还是通过酶促反应，诸如测序；它们是否被标记，例如用荧光染料等标记；明确鉴定一组多核苷酸所需的可区分的寡核苷酸标签的数量等，以及为了确保可靠的鉴定，一组标签必须具有多少差异，例如没有交叉杂交或由测序错误引起的错误鉴定。在一方面，序列标签可以各自具有分别在2个至36个核苷酸，或4个至30个核苷酸，或8个至20个核苷酸，或6个至10个核苷酸的范围内的长度。在一方面，使用这样的序列标签组，其中一组中的每种序列标签具有独特的核苷酸序列，该核苷酸序列与同一组中的每一种其他标签的核苷酸序列相差至少两个碱基；在另一方面，使用这样的序列标签组，其中一组中每种标签的序列与同一组中每一种其他标签的序列相差至少三个碱基。

“取代”意指一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自以下的另一个氨基酸残基替代：天然存在的标准的20种氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基(例如，羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟基赖氨酸、6-N-甲基赖氨酸、N-乙基甘氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、别-异亮氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)，以及通常经合成制备的非天然存在的氨基酸残基(例如，环己基丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指一个氨基酸残基被选自天然存在的标准的20种氨基酸残基的另一个氨基酸残基替代。符号“+”指示取代的组合。在本文中，氨基酸由根据以下命名法的其单字母或三字母代码代表：A：丙氨酸(Ala)；C：半胱氨酸(Cys)；D：天冬氨酸(Asp)；E：谷氨酸(Glu)；F：苯丙氨酸(Phe)；G：甘氨酸(Gly)；H：组氨酸(His)；I：异亮氨酸(Ile)；K：赖氨酸(Lys)；L：亮氨酸(Leu)；M：甲硫氨酸(Met)；N：天冬酰胺(Asn)；P：脯氨酸(Pro)；Q：谷氨酰胺(Gln)；R：精氨酸(Arg)；S：丝氨酸(Ser)；T：苏氨酸(Thr)；V：缬氨酸(Val)；W：色氨酸(Trp)和Y：酪氨酸(Tyr)。在本申请的文件中，使用以下术语指示取代：L238A表示，亲本序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，L)被改变为丙氨酸((A)。A132V/I/M表示，亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，A)被以下氨基酸中的一种取代：缬氨酸((V)、异亮氨酸(I)或甲硫氨酸(M)。取代可以是保守取代或非保守取代。保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、和丝氨酸)的组内。

序列表

<110> DNA斯克瑞普特公司

<120> 寡核苷酸的集合的一锅合成

<130> B2924PC00

<160> 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 510

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> TdT

<400> 1

Met Asp Pro Leu Gln Ala Val His Leu Gly Pro Arg Lys Lys Arg Pro

1 5 10 15

Arg Gln Leu Gly Thr Pro Val Ala Ser Thr Pro Tyr Asp Ile Arg Phe

20 25 30

Arg Asp Leu Val Leu Phe Ile Leu Glu Lys Lys Met Gly Thr Thr Arg

35 40 45

Arg Ala Phe Leu Met Glu Leu Ala Arg Arg Lys Gly Phe Arg Val Glu

50 55 60

Asn Glu Leu Ser Asp Ser Val Thr His Ile Val Ala Glu Asn Asn Ser

65 70 75 80

Gly Ser Asp Val Leu Glu Trp Leu Gln Leu Gln Asn Ile Lys Ala Ser

85 90 95

Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Ile Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met Gly

100 105 110

Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Met Gly Arg His Gln Leu Val Val Asn

115 120 125

Arg Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala

130 135 140

Pro Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr

145 150 155 160

Leu Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala

165 170 175

Glu Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met

180 185 190

Arg Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met

195 200 205

Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile

210 215 220

Ile Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val

225 230 235 240

Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe

245 250 255

Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg

260 265 270

Thr Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met

275 280 285

Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn

290 295 300

Arg Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val

305 310 315 320

Thr Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg

325 330 335

Gly Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu

340 345 350

Ala Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe

355 360 365

Trp Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr

370 375 380

Phe Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His

385 390 395 400

Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His

405 410 415

Ser Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg

420 425 430

Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu

435 440 445

Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala

450 455 460

Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg

465 470 475 480

Thr Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala

485 490 495

His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

500 505 510

<210> 2

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的TdT

<400> 2

Asn Ser Ser Pro Ser Pro Val Pro Gly Ser Gln Asn Val Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Tyr Asn Gln Leu Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Asp Glu Leu Arg Glu Asn Glu Gly Ser Cys Leu Ala Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ser Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Thr Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Ser Ile Ile

85 90 95

Glu Gly Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Ala Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Ser Lys Ile Gln Ser Asp Lys Ser Leu Arg Phe Thr Gln Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Asn Arg

165 170 175

Pro Glu Ala Glu Ala Val Ser Met Leu Val Lys Glu Ala Val Val Thr

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Met Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala

210 215 220

Thr Glu Asp Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr Asp Phe Trp

225 230 235 240

Lys Gln Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Lys Phe Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Asp His Gly Arg Val His Ser

275 280 285

Glu Lys Ser Gly Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala Ile Arg Val

290 295 300

Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Asp Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly

305 310 315 320

Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr

325 330 335

His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Arg Thr

340 345 350

Lys Arg Val Phe Leu Glu Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His

355 360 365

Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 3

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的牛TdT

<400> 3

Asp Tyr Ser Ala Thr Pro Asn Pro Gly Phe Gln Lys Thr Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Tyr Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Ser Glu Phe Lys Glu Asn Glu Val Ser Tyr Val Thr Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Ile Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser

130 135 140

Leu Ser Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Phe Thr Lys Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg

165 170 175

Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser

210 215 220

Ala Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp Glu

225 230 235 240

Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu

245 250 255

Lys Phe Lys Leu Pro Ser Arg Gln Val Asp Thr Leu Asp His Phe Gln

260 265 270

Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Ser Ser

275 280 285

Lys Ser Asn Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp

290 295 300

Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Asn Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp

305 310 315 320

Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Ile Arg Arg Tyr Ala Thr His

325 330 335

Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys

340 345 350

Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu

355 360 365

Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 4

<211> 380

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的人类TdT

<400> 4

Asp Tyr Ser Asp Ser Thr Asn Pro Gly Pro Pro Lys Thr Pro Pro Ile

1 5 10 15

Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Cys Asn Gln Ile Phe Thr Asp Ala Phe Asp Ile Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Cys Val Thr Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Ser Lys Val Lys Gly Ile Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Ser Lys Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Arg Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg

165 170 175

Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser

210 215 220

Thr Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Gln Lys Val Met Asn Leu Trp Glu

225 230 235 240

Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu

245 250 255

Lys Leu Arg Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln

260 265 270

Lys Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Pro Arg Gln Arg Val Asp Ser Asp

275 280 285

Gln Ser Ser Trp Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp

290 295 300

Leu Val Leu Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp

305 310 315 320

Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His

325 330 335

Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys

340 345 350

Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu

355 360 365

Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 5

<211> 376

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的鸡TdT

<400> 5

Gln Tyr Pro Thr Leu Lys Thr Pro Glu Ser Glu Val Ser Ser Phe Thr

1 5 10 15

Ala Ser Lys Val Ser Gln Tyr Ser Cys Gln Arg Lys Thr Thr Leu Asn

20 25 30

Asn Cys Asn Lys Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Met Ala Glu Asn

35 40 45

Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Glu Ile Phe Cys Leu Glu Phe Leu Arg Ala

50 55 60

Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Val Thr Arg Met Lys Asp

65 70 75 80

Ile Gln Gly Leu Pro Cys Met Gly Asp Arg Val Arg Asp Val Ile Glu

85 90 95

Glu Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Arg Ala Lys Asp Val Leu Asn

100 105 110

Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Glu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val

115 120 125

Gly Val Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Leu Arg Thr Val

130 135 140

Glu Glu Val Lys Ala Asp Lys Thr Leu Lys Leu Ser Lys Met Gln Arg

145 150 155 160

Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ser Lys Ala

165 170 175

Glu Ala Asp Ala Val Ser Ser Ile Val Lys Asn Thr Val Cys Thr Phe

180 185 190

Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys

195 200 205

Lys Ile Gly His Asp Ile Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Gln Arg

210 215 220

Glu Asp Asp Glu Leu Leu His Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Ile

225 230 235 240

Ile Glu Ser Thr Phe Val Lys Glu Gln Ile Pro Ser Arg His Val Asp

245 250 255

Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Leu Tyr Gln

260 265 270

Pro Arg Val Asp Asn Ser Ser Tyr Asn Met Ser Lys Lys Cys Asp Met

275 280 285

Ala Glu Val Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Ile Thr

290 295 300

Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg

305 310 315 320

Gln Phe Gly Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met

325 330 335

Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Arg Lys Arg Val Phe Leu

340 345 350

Lys Ala Gly Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr

355 360 365

Val Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375

<210> 6

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 负鼠截短的

<400> 6

Ser Ala Asn Pro Asp Pro Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ile Leu Pro Pro

1 5 10 15

Thr Thr Lys Thr Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Ile

20 25 30

Asn Asn His Asn Gln Arg Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys

35 40 45

Asn Tyr Glu Phe Lys Glu Asn Asp Asp Thr Cys Leu Thr Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Glu Val Val Ser Leu Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Leu Pro Trp Ile Gly Asp Glu Val Lys Gly Ile Met

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Gln Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ala Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Asn Lys Ile Arg Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Lys Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Leu Cys Tyr Tyr Glu Asp Leu Ile Asp Cys Val Ser Lys

165 170 175

Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Leu Leu Val Gln Asp Ala Val Trp Thr

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Glu Phe Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala

210 215 220

Glu Lys Glu Gln Glu Asp Gln Leu Leu Gln Lys Val Thr Asn Leu Trp

225 230 235 240

Lys Lys Gln Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Asp Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ile Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr His His Lys Glu Asp Lys

275 280 285

Arg Lys Trp Glu Met Pro Thr Gly Ser Asn Glu Ser Glu Ala Lys Ser

290 295 300

Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Asp Arg Tyr

305 310 315 320

Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Ser Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp

325 330 335

Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His

340 345 350

Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Lys Ser Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Gln Pro Ser Glu

370 375 380

Arg Asn Ala

385

<210> 7

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 新截短的地鼠

<400> 7

Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser Ala

1 5 10 15

Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg

165 170 175

Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Ala

210 215 220

Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe Trp

225 230 235 240

Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp Asp

275 280 285

Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val

290 295 300

Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly

305 310 315 320

Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr

325 330 335

His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr

340 345 350

Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His

355 360 365

Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 8

<211> 387

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 巨蟒截短的

<400> 8

Glu Lys Tyr Gln Leu Pro Glu Asp Glu Asp Arg Ser Val Thr Ser Asp

1 5 10 15

Leu Asp Arg Asp Ser Ile Ser Glu Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr

20 25 30

Leu Lys Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala

35 40 45

Glu Asn Tyr Glu Phe Asn Glu Asn Lys Gly Phe Cys Thr Ala Phe Arg

50 55 60

Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Gln Val

65 70 75 80

His Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Met Gly Lys Gln Val Lys Gly Ile

85 90 95

Ile Glu Asp Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Lys Val Lys Ala Val

100 105 110

Leu Asp Asn Glu Asn Tyr Arg Ser Val Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe

115 120 125

Gly Val Gly Leu Lys Thr Ser Asp Lys Trp Tyr Arg Met Gly Leu Arg

130 135 140

Thr Leu Glu Glu Val Lys Arg Asp Lys Asn Leu Lys Leu Thr Arg Met

145 150 155 160

Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Asp Asp Leu Thr Ser Cys Val Ser

165 170 175

Lys Ala Glu Ala Asp Ala Ala Ser Leu Ile Val Gln Asp Val Val Trp

180 185 190

Lys Ile Val Pro Asn Ala Ile Val Thr Ile Ala Gly Gly Phe Arg Arg

195 200 205

Gly Lys Gln Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Val Pro Gly

210 215 220

Ser Lys Gln Glu Glu Glu Glu Leu Leu His Thr Val Ile Asp Ile Trp

225 230 235 240

Lys Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Asp Thr Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Ala Ile Leu Lys Val His Lys Glu Arg Glu Asp Lys

275 280 285

Gly Asn Ser Ile Arg Ser Lys Ala Phe Ser Glu Glu Glu Ile Lys Asp

290 295 300

Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val Val Val Pro Phe Glu Gln Tyr

305 310 315 320

Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Thr Gln Phe Glu Arg Asp

325 330 335

Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys Lys Met Met Leu Asp Asn His

340 345 350

Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile Phe Leu Asn Ala Ala Ser Glu

355 360 365

Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Leu Glu Pro Trp Glu

370 375 380

Arg Asn Ala

385

<210> 9

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的犬

<400> 9

Asp Tyr Thr Ala Ser Pro Asn Pro Glu Leu Gln Lys Thr Leu Pro Val

1 5 10 15

Ala Val Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Tyr Asn Asn Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Val Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Phe Ser Leu Thr Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Gln Val Lys Cys Ile Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Ser Lys Ile Lys Ser Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Pro Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr Arg

165 170 175

Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Phe Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Met Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser

210 215 220

Thr Asp Glu Asp Glu Glu Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Leu Trp

225 230 235 240

Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly

275 280 285

Gly Lys Cys Ser Gln Gln Glu Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg Val

290 295 300

Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala Leu Leu Gly

305 310 315 320

Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser

325 330 335

His Glu Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr

340 345 350

Lys Lys Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile Phe Ala His

355 360 365

Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 10

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的鼹鼠

<400> 10

Gly Asp Cys Pro Ala Ser His Asp Ser Ser Pro Gln Lys Thr Glu Ser

1 5 10 15

Ala Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr

20 25 30

Leu Asn Asn His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala

35 40 45

Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ser Tyr Val Thr Tyr Met

50 55 60

Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Ser Ile Ile Ser Met

65 70 75 80

Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Cys Leu Ala Asp Lys Val Lys Cys Val

85 90 95

Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val

100 105 110

Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe

115 120 125

Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Lys Trp Phe Arg Leu Gly Phe Arg

130 135 140

Thr Leu Ser Gly Ile Met Asn Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr His Met

145 150 155 160

Gln Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Thr

165 170 175

Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Trp

180 185 190

Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ile Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg

195 200 205

Gly Lys Lys Val Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu

210 215 220

Ala Thr Glu Glu Gln Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Ile Thr Phe

225 230 235 240

Trp Glu Lys Glu Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Tyr Glu Ser Thr

245 250 255

Phe Glu Lys Leu Lys Met Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His

260 265 270

Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Arg Glu Cys Val Asp

275 280 285

Asp Gly Thr Ser Ser Gln Leu Gln Gly Lys Thr Trp Lys Ala Ile Arg

290 295 300

Val Asp Leu Val Val Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala Leu Leu

305 310 315 320

Gly Trp Thr Gly Ser Pro Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala

325 330 335

Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys

340 345 350

Thr Lys Arg Lys Phe Leu Ser Ala Asp Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala

355 360 365

His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 11

<211> 379

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 鼠兔截短的

<400> 11

Glu Tyr Ser Ala Asn Pro Ser Pro Gly Pro Gln Ala Thr Pro Ala Val

1 5 10 15

Tyr Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu Asn Asn

20 25 30

His Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Glu Asn Tyr

35 40 45

Glu Phe Lys Glu Asn Glu Gly Cys Tyr Val Thr Tyr Met Arg Ala Ala

50 55 60

Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Val Ser Met Lys Asp Thr

65 70 75 80

Glu Gly Ile Pro Cys Leu Glu Asp Lys Val Lys Ser Ile Met Glu Glu

85 90 95

Ile Ile Glu Glu Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Val Leu Ser Asp

100 105 110

Glu Arg Tyr Gln Cys Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly Val Gly

115 120 125

Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Ser Leu Ser

130 135 140

Asn Ile Arg Leu Asp Lys Ser Leu Lys Phe Thr Gln Met Gln Lys Ala

145 150 155 160

Gly Phe Arg Tyr Tyr Glu Asp Ile Val Ser Cys Val Thr Arg Ala Glu

165 170 175

Ala Glu Ala Val Asp Val Leu Val Asn Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu

180 185 190

Pro Asp Ala Phe Ile Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys

195 200 205

Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Glu Leu Thr Glu

210 215 220

Glu Asp Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Met Asn Leu Trp Glu Lys

225 230 235 240

Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys

245 250 255

Leu Lys Gln Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe Gln Lys

260 265 270

Cys Phe Leu Ile Phe Lys Leu Tyr His Glu Arg Val Gly Gly Asp Arg

275 280 285

Cys Arg Gln Pro Glu Gly Lys Asp Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu

290 295 300

Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys His Ala Phe Ala Leu Leu Gly Trp Thr

305 310 315 320

Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Ser His Glu

325 330 335

Arg Lys Met Ile Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Arg

340 345 350

Val Phe Leu Gln Ala Glu Asn Glu Glu Glu Ile Phe Ala His Leu Gly

355 360 365

Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375

<210> 12

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的刺猬

<400> 12

Asp Ala Ser Phe Gly Ser Asn Pro Gly Ser Gln Asn Thr Pro Pro Leu

1 5 10 15

Ala Ile Lys Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Ser Leu

20 25 30

Asn Asn Cys Asn His Ile Phe Thr Asp Ala Leu Asp Ile Leu Ala Glu

35 40 45

Asn His Glu Phe Arg Glu Asn Glu Val Ser Cys Val Ala Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Thr Ile Ile Ser Met Lys

65 70 75 80

Asp Thr Lys Gly Ile Pro Cys Leu Gly Asp Lys Ala Lys Cys Val Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys Ala Ile Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Gln Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Asn Lys Ile Met Ser Asp Lys Thr Leu Lys Leu Thr Arg Met Gln

145 150 155 160

Lys Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys

165 170 175

Ala Glu Ala Asp Ala Val Ser Val Leu Val Gln Glu Ala Val Trp Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Met Val Thr Met Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Leu Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ala

210 215 220

Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu Pro Lys Val Ile Asn Phe Trp

225 230 235 240

Glu Arg Lys Gly Leu Leu Leu Tyr His Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Lys Leu Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His Leu Gln His Val Asn Gly

275 280 285

Val Gly Asn Ser Lys Thr Gly Gln Gln Glu Gly Lys Asn Trp Lys Ala

290 295 300

Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg Arg Ala Phe Ala

305 310 315 320

Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg

325 330 335

Phe Ala Thr His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr

340 345 350

Asp Lys Thr Lys Arg Ile Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile

355 360 365

Phe Ala His Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Asp Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 13

<211> 381

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的树鼩

<400> 13

Asp His Ser Thr Ser Pro Ser Pro Gly Pro Gln Lys Thr Pro Ala Leu

1 5 10 15

Ala Val Gln Lys Ile Ser Gln Tyr Ala Cys Gln Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Cys Asn Arg Val Phe Thr Asp Ala Phe Glu Thr Leu Ala Glu

35 40 45

Asn Tyr Glu Phe Arg Glu Asn Glu Asp Ser Ser Val Ile Phe Leu Arg

50 55 60

Ala Ala Ser Val Leu Arg Ser Leu Pro Phe Thr Ile Thr Ser Met Arg

65 70 75 80

Asp Thr Glu Gly Leu Pro Cys Leu Gly Asp Lys Val Lys Cys Val Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Asn Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser Val Phe Gly

115 120 125

Val Gly Leu Lys Thr Ser Glu Lys Trp Phe Arg Met Gly Phe Arg Thr

130 135 140

Leu Ser Arg Val Arg Ser Asp Lys Ser Leu His Leu Thr Arg Met Gln

145 150 155 160

Gln Ala Gly Phe Leu Tyr Tyr Glu Asp Leu Ala Ser Cys Val Thr Arg

165 170 175

Ala Glu Ala Glu Ala Val Gly Val Leu Val Lys Glu Ala Val Gly Ala

180 185 190

Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Thr Ile Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly

195 200 205

Lys Lys Thr Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser Pro Gly Ser

210 215 220

Thr Glu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Leu Gln Lys Val Leu Asn Leu Trp

225 230 235 240

Glu Lys Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Tyr Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe

245 250 255

Glu Lys Leu Lys Thr Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu Asp His Phe

260 265 270

Pro Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu His His Gln Arg Val Asp Gly

275 280 285

Asp Lys Pro Ser Gln Gln Glu Gly Lys Ser Trp Lys Ala Ile Arg Val

290 295 300

Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Arg His Ala Phe Ala Leu Leu Gly

305 310 315 320

Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr

325 330 335

His Glu Arg Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr

340 345 350

Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Ala His

355 360 365

Leu Gly Leu Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

370 375 380

<210> 14

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的鸭嘴兽

<400> 14

Leu Thr Asn Ser Ala Pro Ile Asn Cys Met Thr Glu Thr Pro Ser Leu

1 5 10 15

Ala Thr Lys Gln Val Ser Gln Tyr Ala Cys Glu Arg Arg Thr Thr Leu

20 25 30

Asn Asn Cys Asn Gln Lys Phe Thr Asp Ala Phe Glu Ile Leu Ala Lys

35 40 45

Asp Phe Glu Phe Arg Glu Asn Glu Gly Ile Cys Leu Ala Phe Met Arg

50 55 60

Ala Ile Ser Val Leu Lys Cys Leu Pro Phe Thr Ile Val Arg Met Lys

65 70 75 80

Asp Ile Glu Gly Val Pro Trp Leu Gly Asp Gln Val Lys Ser Ile Ile

85 90 95

Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Ser Val Lys Ala Val Leu

100 105 110

Asn Asp Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Gln Leu Phe Asn Ser Val Phe Glu

115 120 125

Val Gly Leu Thr Asp Asn Gly Glu Asn Gly Ile Ala Arg Gly Phe Gln

130 135 140

Thr Leu Asn Glu Val Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ser Leu Thr Lys Thr

145 150 155 160

Thr Leu Ser Thr Ser Leu Trp Asn Tyr Leu Pro Gly Phe Leu Tyr Tyr

165 170 175

Glu Asp Leu Val Ser Cys Val Ala Lys Glu Glu Ala Asp Ala Val Tyr

180 185 190

Leu Ile Val Lys Glu Ala Val Arg Ala Phe Leu Pro Glu Ala Leu Val

195 200 205

Thr Leu Thr Gly Gly Phe Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val

210 215 220

Asp Phe Leu Ile Ser Asp Pro Glu Ser Gly Gln Asp Glu Gln Leu Leu

225 230 235 240

Pro Asn Ile Ile Lys Leu Trp Glu Lys Gln Glu Leu Leu Leu Tyr Tyr

245 250 255

Asp Leu Val Glu Ser Thr Phe Glu Lys Thr Lys Ile Pro Ser Arg Lys

260 265 270

Val Asp Ala Met Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu

275 280 285

His His Gln Lys Val Asp Ser Gly Arg Tyr Lys Pro Pro Pro Glu Ser

290 295 300

Lys Asn His Glu Ala Lys Asn Trp Lys Ala Ile Arg Val Asp Leu Val

305 310 315 320

Met Cys Pro Phe Glu Gln Tyr Ala Tyr Ala Leu Leu Gly Trp Thr Gly

325 330 335

Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg Tyr Ala Thr His Glu Lys

340 345 350

Lys Met Met Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr Asp Lys Thr Lys Lys Ile

355 360 365

Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Thr His Leu Gly Leu

370 375 380

Asp Tyr Ile Glu Pro Trp Glu Arg Asn Ala

385 390

<210> 15

<211> 384

<212> PRT

<213> 人工序列(ARTIFICIAL SEQUENCE)

<220>

<223> 截短的跳鼠

<400> 15

Ser Ser Glu Leu Glu Leu Leu Asp Val Ser Trp Leu Ile Glu Cys Met

1 5 10 15

Gly Ala Gly Lys Pro Val Glu Met Thr Gly Arg His Gln Leu Val Lys

20 25 30

Gln Thr Phe Cys Leu Pro Gly Phe Ile Leu Gln Asp Ala Phe Asp Ile

35 40 45

Leu Ala Glu Asn Cys Glu Phe Arg Glu Asn Glu Ala Ser Cys Val Glu

50 55 60

Phe Met Arg Ala Ala Ser Val Leu Lys Ser Leu Pro Phe Pro Ile Ile

65 70 75 80

Ser Val Lys Asp Thr Glu Gly Ile Pro Trp Leu Gly Gly Lys Val Lys

85 90 95

Cys Val Ile Glu Glu Ile Ile Glu Asp Gly Glu Ser Ser Glu Val Lys

100 105 110

Ala Leu Leu Asn Asp Glu Arg Tyr Lys Ser Phe Lys Leu Phe Thr Ser

115 120 125

Val Phe Gly Val Gly Leu Lys Thr Ala Glu Arg Trp Phe Arg Met Gly

130 135 140

Phe Arg Thr Leu Ser Thr Val Lys Leu Asp Lys Ser Leu Thr Phe Thr

145 150 155 160

Arg Met Gln Lys Ala Gly Phe Leu His Tyr Glu Asp Leu Val Ser Cys

165 170 175

Val Thr Arg Ala Glu Ala Glu Ala Val Ser Val Leu Val Gln Gln Ala

180 185 190

Val Val Ala Phe Leu Pro Asp Ala Leu Val Ser Met Thr Gly Gly Phe

195 200 205

Arg Arg Gly Lys Lys Ile Gly His Asp Val Asp Phe Leu Ile Thr Ser

210 215 220

Pro Glu Ala Thr Glu Glu Glu Glu Gln Gln Leu Leu His Lys Val Thr

225 230 235 240

Asn Phe Trp Glu Gln Lys Gly Leu Leu Leu Tyr Cys Asp His Val Glu

245 250 255

Ser Thr Phe Glu Lys Cys Lys Leu Pro Ser Arg Lys Val Asp Ala Leu

260 265 270

Asp His Phe Gln Lys Cys Phe Leu Ile Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Arg

275 280 285

Val Asp Ser Val Lys Ser Ser Gln Gln Glu Gly Lys Gly Trp Lys Ala

290 295 300

Ile Arg Val Asp Leu Val Met Cys Pro Tyr Glu Cys Arg Ala Phe Ala

305 310 315 320

Leu Leu Gly Trp Thr Gly Ser Arg Gln Phe Glu Arg Asp Leu Arg Arg

325 330 335

Tyr Ala Thr His Glu Arg Lys Met Arg Leu Asp Asn His Ala Leu Tyr

340 345 350

Asp Lys Thr Lys Arg Val Phe Leu Lys Ala Glu Ser Glu Glu Glu Ile

355 360 365

Phe Ala His Leu Gly Leu Glu Tyr Ile Glu Pro Leu Glu Arg Asn Ala

370 375 380

Claims (19)

1.一种在单个反应容器中合成多于一种寡核苷酸并进行基于寡核苷酸的测定的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在反应容器中重复以下(i)和(ii)的循环：(i)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子或具有游离3’-O-羟基的延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，使得所述起始子或延长片段通过掺入3’-O-封闭的核苷三磷酸而延长以形成3’-O-封闭的延长片段，和(ii)使所述延长片段解封闭以形成具有游离3’-羟基的延长片段，所述循环被重复直到形成各自包含通过可裂解核苷酸彼此分离和与所述起始子分离的多于一种寡核苷酸的延长片段；

b)裂解所述可裂解核苷酸以释放所述多于一种寡核苷酸中的至少一种；

c)添加用于所述基于寡核苷酸的测定的试剂；以及

d)进行所述基于寡核苷酸的测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于寡核苷酸的测定是聚合酶链式反应(PCR)，并且其中所述添加步骤还包括添加聚合酶、聚合酶反应缓冲液、核苷三磷酸和一种或更多种靶多核苷酸，所述靶多核苷酸中的至少一种具有与所述寡核苷酸中的至少两种互补的区段，使得互补区段之间的序列在PCR中被扩增。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述裂解步骤包括应用酶活性，并且其中在裂解后使所述酶活性失活。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述基于寡核苷酸的测定是基于核酸序列的扩增(NASBA)，并且其中所述添加步骤还包括添加RNA聚合酶、RNA酶H、逆转录酶、NASBA反应缓冲液、核苷三磷酸和一种或更多种单链靶核酸，所述单链靶核酸中的至少一种具有与所述寡核苷酸中的至少一种互补的区段，使得互补区段之间的序列在NASBA反应中被扩增。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述起始子和所述延长片段附接至支持物，并且其中所述裂解步骤使所述多于一种寡核苷酸中的一种所述寡核苷酸保持附接至所述支持物。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述不依赖模板的DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶。

7.一种在单个反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供一种或更多种支持物，所述一种或更多种支持物具有起始子的两种或更多种群体，其中每种群体的所述起始子的末端是具有群体特异性3’-O-封闭基团的可裂解连接或可裂解核苷酸，所述群体特异性3’-O-封闭基团能够通过与起始子的每一种其他群体的3’-O-封闭基团的解封闭条件正交的解封闭条件去除；

b)使起始子的群体或延长片段的群体特异性封闭基团解封闭，以形成具有游离3’-羟基的起始子或延长片段；

c)在延长条件下，使具有游离3’-羟基的起始子的群体或其延长片段与3’-O-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的DNA聚合酶接触，从而通过掺入所述3’-O-封闭的核苷三磷酸使所述起始子或延长片段延长，以形成3’-O-封闭的延长片段；

d)对起始子的每种群体重复步骤b)和c)，直到形成具有所述多于一种寡核苷酸的核苷酸序列的延长片段。

8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括以下步骤：e)使所述延长片段解封闭，和f)裂解所述可裂解连接或可裂解核苷酸以释放所述延长片段。

9.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括以下步骤：g)添加用于所述基于寡核苷酸的测定的试剂，和h)进行所述基于寡核苷酸的测定。

10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述步骤b)至d)针对起始子的所述群体中的每种群体连续实施，使得所述多于一种寡核苷酸中的每种所述寡核苷酸被连续合成。

11.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述步骤b)至d)针对起始子的所述群体中的每种群体交替地实施，使得所述多于一种寡核苷酸中的每种所述寡核苷酸被平行合成。

12.根据权利要求7至11中任一项所述的方法，其中所述支持物是固体支持物。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述不依赖模板的DNA聚合酶是末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述TdT是具有以下氨基酸序列的TdT变体，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15中的一种具有至少90％同一性，具有以下的取代：关于SEQ ID NO:2、3、4、6、7、12和14的位置63处的甲硫氨酸；或关于SEQ ID NO:9的位置73处的甲硫氨酸；或关于SEQ ID NO:10的位置64处的甲硫氨酸；或关于SEQ ID NO:11的位置61处的甲硫氨酸；或关于SEQ ID NO:15的位置66处的甲硫氨酸；和关于SEQ ID NO:2、3、4、6、7、9、12和13的位置207处的第一精氨酸；或关于SEQ ID NO:5的位置206处的第一精氨酸；或关于SEQ ID NO:8或10的位置208处的第一精氨酸；或关于SEQ IDNO:11的位置205处的第一精氨酸；或关于SEQ ID NO:14的位置216处的第一精氨酸；或关于SEQ ID NO:15的位置210处的第一精氨酸。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述TdT变体还具有以下的取代中的一个或更多个：在关于SEQ ID NO:2、3、4、6、7、9、12和13的位置173处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:5的位置172处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:8和10的位置174处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:11的位置171处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:15的位置176处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:14的位置182处的半胱氨酸；或在关于SEQ ID NO:2、9和13的位置325处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO 3和4的位置324处的第二精氨酸；或在关于SEQ IDNO:5的位置320处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO:6和8的位置331处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO:11的位置323处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO:12和15的位置328处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO:14的位置338处的第二精氨酸；或在关于SEQ ID NO:2、7、9和13的位置328处的谷氨酸；或在关于SEQ ID NO:3和4的位置327处的谷氨酸；或在关于SEQ ID NO:6和8的位置334处的谷氨酸；或在关于SEQ ID NO:10的位置329处的谷氨酸；或在关于SEQ ID NO:11的位置326处的谷氨酸；或在关于SEQ ID NO:12和15的位置331处的谷氨酸。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述甲硫氨酸的所述取代是R或Q；所述半胱氨酸的所述取代是G或R；所述第一精氨酸的所述取代是L或N；所述第二精氨酸的所述取代是P、N、A或V；并且所述谷氨酸的所述取代是N、L、T、S或K。

17.一种用于在单个反应容器中合成多于一种寡核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供附接至一种或更多种支持物的多于一种不同的起始子，其中所述多于一种起始子中的至少一种起始子具有游离的3’-羟基，并且其中所述多于一种起始子中的至少一种起始子具有3’-O-封闭的末端核苷酸；

(b)通过无模板酶促核苷酸添加3’-O-封闭的核苷三磷酸到每种不同起始子或其延伸产物进行的重复循环来合成所述多于一种寡核苷酸，其中所述3’-O-封闭的核苷三磷酸具有能够在解封闭条件下去除的封闭基团，所述解封闭条件与去除所述多于一种起始子中的其他起始子的封闭基团的解封闭条件正交；以及

(c)使寡核苷酸从所述延伸产物和所述一种或更多种固体支持物释放。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸等于或大于所述多于一种不同的起始子。

19.根据权利要求17或18所述的方法，所述方法还包括以下步骤：(d)添加用于基于寡核苷酸的测定的试剂，和(e)进行所述基于寡核苷酸的测定。

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