CN113265349A - 用于提高哺乳动物成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

用于提高哺乳动物成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提高哺乳动物成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制备方法和应用，所述微生态制剂由4种益生菌组成，分别为Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens。本发明的微生态制剂制作过程简单，生产成本较低，具有较好的应用前景。该微生态制剂具有显著的促进小鼠卵泡发育，提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的效果。

Description

用于提高哺乳动物成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生态制剂，具体涉及一种用于提高哺乳动物成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
近交系小鼠存在繁殖力低，即窝产仔数少。在模式动物小鼠繁殖生产中，近交系小鼠的繁殖效率显著低于远交系小鼠。相对于远交系小鼠，近交系小鼠具有遗传背景高度一致，在与遗传背景相关的科学研究中有着不可替代的优势作用。
目前常用营养干预等非遗传措施改善近交系小鼠的繁殖性能，但效果有限。如补充维生素(叶酸)及微量元素硒，外源激素促进排卵，胚胎移植等其他辅助的生殖技术。营养干预措施存在影响实验数据及效果有限等问题；外源激素促进排卵往往会损害母鼠的利用年限及健康；胚胎移植等其他辅助的生殖技术因不具有性价比而无法广泛开展。近年来研究发现肠道微生物参与生殖激素的调控，提示肠道微生物可作为新的靶点用于提高近交系小鼠的繁殖性能。
我国地方猪品种梅山母猪以繁殖性能优异著名，其窝产仔数高于国外引进的母猪品种。具有遗传属性的肠道微生物被视为宿主的第二基因组，有望作为传统遗传育种的补充用于提高母猪繁殖性能。肠道微生物作为共生总基因组(E.罗森伯格于2008年提出)的重要组成部分，参与宿主对营养物质的消化代谢及调控宿主的生理功能。肠道微生物具有内分泌器官的功能，其与宿主内分泌系统的互作提示其可能参与母猪繁殖性能的调控。最近，Shao等(2020)和Uryu等(2020)分别采用高通量的微生物组学研究发现：高繁殖性能与低繁殖性能母猪的肠道微生物存在显著差异。梅山母猪属于我国以高繁殖性能和产仔数著称的太湖母猪(保持猪的最高窝产仔数纪录42头)。Jiang等(2019)在梅山猪保种场研究发现：单个繁殖周期内饲喂粗饲料(粗纤维含量高)可显著提高由长期饲喂精饲料(粗纤维含量低)降低的梅山母猪繁殖性能，其中肠道微生物可能参与调控梅山母猪的繁殖性能改善。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂及其制备方法和应用；该微生态制剂由Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株制备而成，用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数，具有显著的效果，从而可以提高小鼠的繁殖效率。
为实现上述目的，本发明所设计一种用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；所述微生态制剂由4种益生菌组成，分别为Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcusflavefaciens。
进一步地，所述微生态制剂中，总活菌数量为103～1020个/ml。
再进一步地，所述微生态制剂中，总活菌数量为108～1010个/ml。
再进一步地，所述微生态制剂中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillusmucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:0.1～10:0.1～10:0.1～10。
再进一步地，所述微生态制剂中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillusmucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:1:1:1。
本发明还提供了一种上述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacteriumthermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到细菌悬液；
2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，将活菌悬液的活菌数量比混合均匀，得到微生态制剂；其中，每毫升微生态制剂中总活菌数量为103～1020个。
作为优选方案，所述微生态制剂中，总活菌数量为108～1010个/ml。
本发明还提供了一种上述提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂在提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的中的应用。所述应用方法如下：
将微生态制剂灌服至14日龄仔鼠胃内，灌服剂量为200微升/次，隔日服一次。
上述Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae和Bifidobacteriumthermophilum菌株购于德国微生物菌种保藏中心(DSMZ)；Ruminococcus flavefaciens菌株购于美国ATCC细胞库。Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株也可从猪粪便中或大肠中分离得到，然而这些细菌至今尚未被报道有提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的效果。
如需长途运输或者长期存放，为了保持微生态制剂中菌的活性，可以使用以下方法：
向制得的菌液中加入甘油得到细菌冻存液(甘油的体积分数为10％)，置于液氮中低温保存。使用前通过37℃水浴快速解冻菌液，然后将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细菌沉淀得到微生态制剂。其中，每毫升微生态制剂中活菌数量为103～1020个，优选为108～1010个。
本发明的原理：
本发明以高产梅山母猪和相对低产商品长白×大白(长×大)母猪为研究对象，采用粪便微生物移植技术和多组学联合分析筛选出4种与繁殖相关的关键菌株(Fibrobacterintestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcusflavefaciens)；进一步验证表明：灌服这4种菌株可显著促进小鼠的卵泡发育。
本发明的有益效果：
本发明的微生态制剂制作过程简单，生产成本较低，具有较好的应用前景。试验结果表明：该微生态制剂具有显著的促进小鼠卵泡发育，提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的效果。
附图说明
图1为灌服微生态制剂(四种菌株悬液)对小鼠卵泡发育及成熟卵泡数的影响；
图中，图1A为卵巢形态(H&E染色)，图1B为各级卵泡的密度统计结果；
图2为灌服微生态制剂(四种菌株悬液)对小鼠产仔数的影响；
图中，对照组灌服等量PBS，处理组分别灌服Fibrobacter intestinalis(FI)、Lactobacillus mucosae(LM)、Bifidobacterium thermophilum(BT)和Ruminococcusflavefaciens(RF)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1
以高产梅山母猪和相对低产商品长白×大白(长×大)母猪为研究对象，采用粪便微生物移植技术和多组学联合分析方法筛选出4种与繁殖相关的关键菌株(Fibrobacterintestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcusflavefaciens)；
上述任意一种菌株的菌液制备方法如下：
1)复苏：将Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens任意一种的液氮冻存菌液于37℃水浴快速复苏，并接种到新鲜的液态培养基中富集培养，待液态培养基变浑浊，用接种环沾取适量菌液划线接种于固态培养基中；
2)富集及鉴定：固态培养基中长出单菌落后，挑取单菌落接种到新鲜的液态培养基中富集培养。待液态培养基变浑浊，提取菌液中细菌基因组DNA，PCR扩增16S rDNA全长并纯化回收。将回收的16S rDNA片段送至测序公司进行测序，经测序结果与NCBI数据库进行比对，验证挑取的单菌落是否为Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株中任意一种；
3)扩大培养：将经测序比对验证成功的菌液接种到新鲜的液态培养基扩大培养。采用活菌计数法对菌液中的活菌计数，并根据计数结果将菌液中的活菌数量调整为103～1020个/毫升，向菌液中加入甘油得到细菌冻存液(甘油的体积分数为10％)，置于液氮中低温保存；
按上述方法得到Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的四种菌液，冻存，备用。
用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂1的制备方法，包括以下步骤：
1)将Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacteriumthermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到细菌悬液；
2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，按活菌数量比为1:1:1:1将活菌悬液混合均匀，得到微生态制剂1；其中，每毫升微生态制剂1中总活菌数量为108～1010个。
上述微生态制剂1的应用：
在仔鼠日龄第14-35天，将制备的微生态制剂灌服至仔鼠胃中，灌服剂量为200微升/次，隔日服一次，与实施磷酸盐缓冲液(PBS)灌服的对照组相比，单种差异菌(Fibrobacter intestinalis(FI)、Lactobacillus mucosae(LM)、Bifidobacteriumthermophilum(BT)和Ruminococcus flavefaciens(RF)或4种差异菌的混合物(Mix)可显着增加次级卵泡和有腔卵泡的密度，以及次级卵泡与原始卵泡的比例；但是，只有微生态制剂1(4种差异菌的混合物Mix灌服组)灌服增加了有腔卵泡相对于次级卵泡的比例(图1)。进一步，微生态制剂1灌服显著提高小鼠产仔数(图2)。
实施例2
本实施例2制备微生态制剂2的方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
微生态制剂2中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:0.1:0.1：0.1。
实施例3
本实施例3制备微生态制剂3的方法与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
微生态制剂3中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:10:10:10。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；其特征在于：所述微生态制剂由4种益生菌组成，分别为Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens。
2.根据权利要求1所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；其特征在于：所述微生态制剂中，总活菌数量为103～1020个/ml。
3.根据权利要求2所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；其特征在于：所述微生态制剂中，总活菌数量为108～1010个/ml。
4.根据权利要求2或3所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；其特征在于：所述微生态制剂中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:0.1～10:0.1～10:0.1～10。
5.根据权利要求4所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂；其特征在于：所述微生态制剂中，Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacterium thermophilum和Ruminococcus flavefaciens的活菌数量比为1:1:1:1。
6.一种权利要求1所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将Fibrobacter intestinalis、Lactobacillus mucosae、Bifidobacteriumthermophilum和Ruminococcus flavefaciens菌株分别接种到新鲜的液态培养基中进行培养，得到细菌悬液；
2)将制得的细菌悬液离心获取细菌沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS重悬细菌沉淀，将活菌悬液的活菌数量比混合均匀，得到微生态制剂；其中，每毫升微生态制剂中总活菌数量为103～1020个。
7.根据权利要求1所述用于提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述微生态制剂中，总活菌数量为108～1010个/ml。
8.一种权利要求1所述微生态制剂在提高小鼠成熟卵泡数及产仔数的中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述应用方法如下：将微生态制剂灌服至14日龄仔鼠胃内，灌服剂量为200微升/次，隔日服一次。
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