CN113264904A - 检测HOCl/ClO-的荧光探针、其制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测HOCl/ClO‑的荧光探针、其制备方法及其应用，检测HOCl/ClO‑的荧光探针的结构式如下：
Figure DDA0003013744390000011
本发明引入亚甲基蓝作为荧光团，具有激发波长和发射波长较长的特点。本发明所述荧光探针制备方法简便，光谱变化明显，可快速、专一地响应HOCl/ClO‑，细胞毒性较小，可以用于测试体内外HOCl/ClO‑。本发明荧光探针MB‑ML制备方法方便，易于生产。

Description

检测HOCl/ClO-的荧光探针、其制备方法及其应用
技术领域
本发明对HOCl/ClO-具有特异性响应，涉及一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
在单核细胞和嗜中性粒细胞中，H2O2与Cl-可在髓过氧化物酶(MPO)作用下产生像次氯酸(HOCl)一类的强氧化剂，而佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)可促进这一过程进行。次氯酸(HOCl)和次氯酸根离子(ClO-)在生理pH条件下可平衡存在于水溶液中，并且具有良好的抑菌作用，使其具有先天免疫效果，一旦体内的HOCl含量超过平衡值则会导致细胞内作为次氯酸介导的特异性氧化应激标志物3-氯酪氨酸含量增高，引起DNA损伤，破坏体内的蛋白质结构，导致细胞死亡，组织损伤，进而引发诸如炎症反应、儿童哮喘、败血症、心血管疾病、囊性纤维化、阿兹海默症等疾病。然而，生物系统内的次氯酸存在半衰期短、能与多种生物活性物种反应等缺陷，因此能够提供一种快速、特异性检测体内HOCl/ClO-含量的方法具有重要意义。近年来，小分子荧光探针由于具有高度灵敏性，非侵入性，易制备等特点逐渐引起人们的关注，此外，有机小分子探针可与遗传编码的荧光蛋白探针实现优势互补，将荧光分子用于生物成像还可达到目标分析物原位检测的目的。
发明内容
为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足引入亚甲基蓝作为荧光团，提供一种检测HOCl/ClO-的荧光探针、其制备方法及其应用。本发明所述荧光探针制备方法简便，光谱变化明显，可快速、专一地响应HOCl/ClO-，细胞毒性较小，可以用于测试体内外HOCl/ClO-。
为达到上述目的，本发明采用发明构思：
本发明检测HOCl/ClO-的荧光探针的合成路线如下：
Figure BDA0003013744370000021
本发明引入亚甲基蓝(MB)作为荧光团，亚甲基蓝(MB)是一种已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证的药物，在染色剂和药物领域具有广泛应用，利用其氧化形式(LMB)产生蓝色和还原形式(RMB)产生白色之间的荧光差别，设计一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针MB-ML。亚甲基蓝(MB)水溶液在293nm、664nm处有两个主要吸收带，使得探针激发波长和发射波长都较长，而且，该探针可快速、专一地响应HOCl/ClO-，细胞毒性较小。此外，该探针还将经典的溶酶体靶向基团吗啉修饰到亚甲基蓝骨架中，用以定位溶酶体。
根据上述方面构思，本发明采用如下技术方案：
一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针，其化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000022
简称MB-ML。
一种本发明检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其步骤如下：
a.制备化合物HMB：
采用亚甲基蓝(MB)作为原料，溶于水和二氯甲烷，加入碳酸钠，在氮气保护条件下搅拌并回流，再加入连二亚硫酸钠溶液，进行化学反应，得到HMB溶液，其中HMB化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000023
b.制备化合物MBOCl：
冰浴条件下，向在所述步骤a中制备的HMB溶液中加入碳酸钠，在氮气保护下搅拌，缓慢注射加入二(三氯甲基)碳酸酯(TPG)溶液，常温下进行反应；
在反应结束后，直至产物溶液呈黄色，然后将产物溶液进行稀释，萃取，分离得到有机相，然后进行洗涤，干燥，浓缩纯化，得到MBOCl溶液，其中MBOCl化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000031
c.制备化合物MB-ML：
冰浴条件下，在两颈烧瓶中依次加入无水二氯甲烷、N-(2-氨基乙基)吗啉、三乙胺，在氮气保护下进行搅拌，注射滴加在所述步骤b中得到的MBOCl溶液，常温下反应，在反应结束后，将最终产物溶液倒入分液漏斗中进行过滤，洗涤，然后将有机相进行干燥处理后抽滤，然后真空除去溶剂，粗产物用柱色谱法纯化，得到白色固体MB-ML，即为用于检测HOCl/ClO-的荧光探针材料。
优选地，在所述步骤a中，制备化合物HMB采用如下步骤：
采用亚甲基蓝(MB)作为原料，在两颈瓶中将0.5mmol亚甲基蓝三水合物溶于至少6mL水和至少4mL二氯甲烷中，加入不少于2.0mmol碳酸钠，在氮气保护条件下搅拌并回流，注射滴加含有至少2.0mmol连二亚硫酸钠的水溶液，反应至少15分钟，当反应液由蓝色变为黄色，得到HMB溶液。
优选地，在所述步骤b中，制备化合物MBOCl采用如下步骤：
在冰浴条件下，向在所述步骤a中制备的HMB溶液中加入至少2.0mmol碳酸钠，在氮气保护下搅拌，缓慢注射加入至少含有0.3mmol的二(三氯甲基)碳酸酯(TPG)的二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，在常温下反应至少2h，在反应结束后，溶液呈黄色；然后将产物溶液倒入分液漏斗中，加入至少10mL水，并用二氯甲烷进行萃取，分离得到有机相，加入至少15mL饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠干燥；然后减压浓缩溶液，得到MBOCl溶液。
优选地，在所述步骤c中，制备化合物MB-ML采用如下步骤：
在冰浴条件下，在两颈烧瓶中依次加入至少5mL无水二氯甲烷、至少27μL的N-(2-氨基乙基)吗啉和至少180μL三乙胺，在氮气保护下搅拌，注射滴加在所述步骤b中得到的MBOCl溶液，在常温下反应至少12h，在反应结束后，将最终产物溶液倒入分液漏斗中，加入至少30mL乙酸乙酯，并用水洗涤至少3次，然后用饱和食盐水继续洗涤，将有机相进行无水硫酸钠干燥处理后抽滤；然后利用真空除去溶剂，将得到的粗产物用柱色谱法纯化，得到白色固体MB-ML。
优选地，在进行对粗产物用柱色谱法纯化时，洗脱剂采用石油醚和乙酸乙酯的体积比为6:1的试剂。
一种本发明检测HOCl/ClO-的荧光探针的应用，进行体外的HOCl/ClO-测试，或进行体内的HOCl/ClO-测试。
本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
1.本发明探针引入亚甲基蓝作为荧光团，荧光探针MB-ML激发波长和发射波长较长，光谱变化明显；
2.本发明荧光探针MB-ML可快速、专一地响应HOCl/ClO-，细胞毒性较小，可以用于测试体内外HOCl/ClO-；
3.本发明荧光探针MB-ML制备方法方便，易于生产。
附图说明
图1是用于表征本发明荧光探针MB-ML的1H-NMR图。
图2是用于表征本发明荧光探针MB-ML的13C-NMR图。
图3是用于表征本发明荧光探针MB-ML的高分辨质谱图。
图4是本发明荧光探针MB-ML对HOCl/ClO-的浓度响应图。
图5是本发明荧光探针MB-ML对活性氧、还原剂、阴离子、阳离子、氨基酸等分析物的响应光谱图。
图6是本发明荧光探针MB-ML的荧光随时间的变化图。
图7是本发明荧光探针MB-ML的细胞毒性图。
图8是本发明荧光探针MB-ML检测内源HOCl/ClO-的细胞成像图。
图9是本发明荧光探针MB-ML与溶酶体绿色探针的共定位图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
实施例一：
在本实施例中，一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针，其化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000051
简称MB-ML。
一种本实施例检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，步骤如下：
a.制备化合物HMB：
采用亚甲基蓝(MB)作为原料，在两颈瓶中将0.5mmol亚甲基蓝三水合物溶于6mL水和4mL二氯甲烷中，加入2.0mmol碳酸钠，在氮气保护条件下搅拌并回流，注射滴加含有2.0mmol的连二亚硫酸钠的水溶液，反应15分钟，当反应液由蓝色变为黄色，得到HMB溶液，其中HMB化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000052
b.制备化合物MBOCl：
在冰浴条件下，向在所述步骤a中制备的HMB溶液中加入2.0mmol碳酸钠，在氮气保护下搅拌，缓慢注射加入含有0.3mmol的二(三氯甲基)碳酸酯(TPG)的二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，在常温下反应2h，在反应结束后，溶液呈黄色；然后将产物溶液倒入分液漏斗中，加入10mL水，并用二氯甲烷进行萃取，分离得到有机相，加入15mL饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠干燥；然后减压浓缩溶液，得到MBOCl溶液，其中MBOCl化学结构式如下：
Figure BDA0003013744370000053
c.制备化合物MB-ML：
在冰浴条件下，在容积为25mL的两颈烧瓶中依次加入5mL无水二氯甲烷、27μL的N-(2-氨基乙基)吗啉和180μL三乙胺，在氮气保护下搅拌，注射滴加在所述步骤b中得到的MBOCl溶液，在常温下反应12h，进行TLC检测；在反应结束后，将最终产物溶液倒入分液漏斗中，加入30mL乙酸乙酯，并用水洗涤3次，然后用饱和食盐水继续洗涤，将有机相进行无水硫酸钠干燥处理后抽滤；然后利用真空除去溶剂，将得到的粗产物用柱色谱法纯化，洗脱剂采用石油醚和乙酸乙酯的体积比为6:1的试剂，得到白色固体MB-ML，即为用于检测HOCl/ClO-的荧光探针材料。
结合本实施例，图1是荧光探针MB-ML的1H-NMR图。图2是荧光探针MB-ML的13C-NMR图。由图1、图2可对化合物MB-ML进行结构表征。图3是荧光探针MB-ML的高分辨质谱图。图3对化合物MB-ML的结构进行进一步确认。
本实施例引入亚甲基蓝(MB)作为荧光团，亚甲基蓝(MB)是一种已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证的药物，在染色剂和药物领域具有广泛应用，利用其氧化形式(LMB)产生蓝色和还原形式(RMB)产生白色之间的荧光差别，设计了一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针MB-ML。亚甲基蓝(MB)水溶液在293nm、664nm处有两个主要吸收带，使得探针激发波长和发射波长都较长。
实施例二：
在本实施例中，用DMSO将探针MB-ML配制成10mmol·L-1的储备溶液。测试前，需将10mmol·L-1的储备溶液用PBS(10mmol·L-1，pH 7.40)调整为10μmol·L-1，放入石英比色皿中进行荧光检测，之后，连续滴加ClO-并扫描光谱，得到探针MB-ML与ClO-反应的浓度依赖性荧光光谱。
结果如图4所示，当ClO-浓度在0～10μmol·L-1区间时，所加ClO-的浓度与680nm左右的荧光强度之间具有较好的线性关系，R2＝0.994，随着ClO-浓度持续增加，680nm左右的荧光强度变化逐渐变缓，最终趋于稳定。
实施例三：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，用纯水配制多种分析物的储备液，并将其稀释至使用液后加入至荧光探针中，通过荧光光谱反映反应结果。
结果如图5所示，其中图a为探针MB-ML与活性氧的荧光响应，图b为探针MB-ML与还原性类化合物的荧光响应，图c为探针MB-ML与离子化合物的荧光响应，图d为探针MB-ML与氨基酸类化合物的荧光响应，其中，1为单独荧光染料MB-ML的荧光强度，2为荧光染料MB-ML与HOCl/ClO-的荧光响应。结果发现，加入ClO-后的MB-ML荧光强度明显增强，约是空白组的40倍。除此之外，还原性类化合物、氨基酸类、离子化合物类均未引起探针明显的荧光强度变化。
实施例四：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，先在比色皿中加入探针溶液，利用荧光光谱仪的Time Scan模式测试荧光强度随时间的变化，随后，快速加入10μmol·L-1的ClO-，再次测试。此外，还测定了探针本身以及加入ClO-之后的荧光强度的稳定性。
结果显示，参见图6，探针本身的荧光并不强，但随着ClO-的加入，荧光迅速增强，并于几秒内迅速达到稳定，此外，这一反应在之后的20min内一直保持稳定。
实施例五：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，将从液氮罐中取出的HeLa细胞解冻，接种至含10％FBS的DMEM中，于5％CO2，95％空气，37℃条件下孵育24h。用胰酶消化已经贴壁的细胞并将其种在96孔板中培养24h。加入含探针溶液的DMEM溶液染毒24h。然后，用含MTT溶液的DMEM溶液替代旧液，在细胞培养箱中培养4h。最后，用DMSO溶解已经形成的甲瓒产物，通过酶标仪定量测试490nm处的吸光度来反映活细胞数量。
如图7所示，探针自身具有较小的细胞毒性，即使将探针浓度达到100μmol·L-1，细胞存活率依旧在80％左右，而后续生物实验所需的探针浓度均为1μmol·L-1，根据细胞毒性结果，该浓度探针对应的细胞存活率接近100％，适用于生物实验。
实施例六：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，将HeLa细胞先与探针MB-ML共同孵育30min，随后，用PBS溶液清洗两遍，分别用完全培养基稀释后的终浓度为0、2μg/mL的PMA继续孵育1h。最后，在使用共聚焦拍摄前需用PBS溶液清洗。拍摄时使用的激光波长为630nm，收集波段为650～750nm。
如图8所示，仅孵育探针的通道内几乎没有荧光，而经过PMA处理后的实验组能够看到有红色荧光产生。由此我们可以得出结论，我们在HeLa细胞中观察到的红色荧光是由探针MB-ML与ClO-响应所得。
实施例七：
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
在本实施例中，将HeLa细胞先与探针MB-ML共同孵育30min，用PBS清洗后，加入终浓度为2μg/mL的PMA孵育1h，最后，加入终浓度为50nmol·L-1的溶酶体绿色探针孵育15min。拍摄时使用的红光激光波长为630nm，收集波段为650～750nm，绿光激光波长为505nm，收集波段为500～540nm。
如图9所示，探针MB-ML具有较好的共定位效果。皮尔逊相关系数(PCC)为0.719，重合系数(ROIs)为0.993，探针与溶酶体绿色荧光探针的出峰位置基本上也能重叠，表明探针MB-ML能对溶酶体进行靶向标记成像。
综上所述，上述实施例检测HOCl/ClO-的荧光探针引入亚甲基蓝作为荧光团，具有激发波长和发射波长较长的特点，且是一种已被美国食品药品监督管理局(FDA)认证的药物。上述实施例荧光探针制备方法简便，光谱变化明显，可快速、专一地响应HOCl/ClO-，细胞毒性较小，可以用于测试体内外HOCl/ClO-。上述实施例探针作为荧光化学传感器可以用于测试体外HOCl/ClO-，也适用于体内测试，制备方法简便，光谱变化明显，特异性效果好，细胞毒性小，成像效果好。
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于检测HOCl/ClO-的荧光探针，其特征在于，其化学结构式如下：
Figure FDA0003013744360000011
简称MB-ML。
2.一种权利要求1所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
a.制备化合物HMB：
采用亚甲基蓝(MB)作为原料，溶于水和二氯甲烷，加入碳酸钠，在氮气保护条件下搅拌并回流，再加入连二亚硫酸钠溶液，进行化学反应，得到HMB溶液，其中HMB化学结构式如下：
Figure FDA0003013744360000012
b.制备化合物MBOCl：
冰浴条件下，向在所述步骤a中制备的HMB溶液中加入碳酸钠，在氮气保护下搅拌，缓慢注射加入二(三氯甲基)碳酸酯(TPG)溶液，常温下进行反应；
在反应结束后，直至产物溶液呈黄色，然后将产物溶液进行稀释，萃取，分离得到有机相，然后进行洗涤，干燥，浓缩纯化，得到MBOCl溶液，其中MBOCl化学结构式如下：
Figure FDA0003013744360000013
c.制备化合物MB-ML：
冰浴条件下，在两颈烧瓶中依次加入无水二氯甲烷、N-(2-氨基乙基)吗啉、三乙胺，在氮气保护下进行搅拌，注射滴加在所述步骤b中得到的MBOCl溶液，常温下反应，在反应结束后，将最终产物溶液倒入分液漏斗中进行过滤，洗涤，然后将有机相进行干燥处理后抽滤，然后真空除去溶剂，粗产物用柱色谱法纯化，得到白色固体MB-ML，即为用于检测HOCl/ClO-的荧光探针材料。
3.根据权利要求2所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤a中，制备化合物HMB采用如下步骤：
采用亚甲基蓝(MB)作为原料，在两颈瓶中将0.5mmol亚甲基蓝三水合物溶于至少6mL水和至少4mL二氯甲烷中，加入不少于2.0mmol碳酸钠，在氮气保护条件下搅拌并回流，注射滴加含有至少2.0mmol的连二亚硫酸钠的水溶液，反应至少15分钟，当反应液由蓝色变为黄色，得到HMB溶液。
4.根据权利要求2所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤b中，制备化合物MBOCl采用如下步骤：
在冰浴条件下，向在所述步骤a中制备的HMB溶液中加入至少2.0mmol碳酸钠，在氮气保护下搅拌，缓慢注射加入至少含有0.3mmol的二(三氯甲基)碳酸酯(TPG)的二(三氯甲基)碳酸酯的二氯甲烷溶液，在常温下反应至少2h，在反应结束后，溶液呈黄色；然后将产物溶液倒入分液漏斗中，加入至少10mL水，并用二氯甲烷进行萃取，分离得到有机相，加入至少15mL饱和食盐水进行洗涤，用无水硫酸钠干燥；然后减压浓缩溶液，得到MBOCl溶液。
5.根据权利要求2所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：在所述步骤c中，制备化合物MB-ML采用如下步骤：
在冰浴条件下，在两颈烧瓶中依次加入至少5mL无水二氯甲烷、至少27μL的N-(2-氨基乙基)吗啉和至少180μL三乙胺，在氮气保护下搅拌，注射滴加在所述步骤b中得到的MBOCl溶液，在常温下反应至少12h，在反应结束后，将最终产物溶液倒入分液漏斗中，加入至少30mL乙酸乙酯，并用水洗涤至少3次，然后用饱和食盐水继续洗涤，将有机相进行无水硫酸钠干燥处理后抽滤；然后利用真空除去溶剂，将得到的粗产物用柱色谱法纯化，得到白色固体MB-ML。
6.根据权利要求5所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的制备方法，其特征在于：在进行对粗产物用柱色谱法纯化时，洗脱剂采用石油醚和乙酸乙酯的体积比为6:1的试剂。
7.一种权利要求1所述的检测HOCl/ClO-的荧光探针的应用，其特征在于：进行体外的HOCl/ClO-测试，或进行体内的HOCl/ClO-测试。
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